KR20090109193A

KR20090109193A - 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조방법, 상기 방법에의해 제조된 항체 파지 표면제시 라이브러리, 상기 항체파지 표면제시 라이브러리 유전자를 포함한 파지미드 벡터

Info

Publication number: KR20090109193A
Application number: KR1020080034516A
Authority: KR
Inventors: 심현보
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2008-04-15
Filing date: 2008-04-15
Publication date: 2009-10-20
Also published as: KR100961392B1

Abstract

본 발명은 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 항체 파지 표면제시 라이브러리, 상기 항체 파지 표면제시 라이브러리 유전자를 포함한 파지미드 벡터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 V_H3-23/V_L1g 유전자를 골격으로 하여 상보성 결정부위 (complementarity determining regions, CDR)에 인공적 다양성을 도입한 후, 라이브러리의 기능적 다양성을 향상시키기 위해 유전선택 과정을 통해 적절한 서열의 항체유전자만을 선별하는 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 높은 다양성을 가지는 인간항체 라이브러리 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 항체 파지 표면제시 라이브러리를 제공한다.

파지 표면제시, 항체, 라이브러리, 베타락타메이즈, 유전선택

Description

항체 파지 표면제시 라이브러리 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 항체 파지 표면제시 라이브러리, 상기 항체 파지 표면제시 라이브러리 유전자를 포함한 파지미드 벡터 {PRODUCTION METHOD OF ANTIBODY PHAGE DISPLAY LIBRARY, THE ANTIBODY PHAGE DISPLAY LIBRARY PRODUCED THEREBY AND THE PHAGEMID VECTOR COMPRISING SAID ANTIBODY PHAGE DISPLAY LIBRARY}

본 발명은 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 항체 파지 표면제시 라이브러리, 상기 항체 파지 표면제시 라이브러리 유전자를 포함한 파지미드 벡터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유전선택 기법에 의한 검열을 통해 기능적 다양성이 향상된 단일사슬 단편항체 파지 표면제시 라이브러리의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 항체 파지 표면제시 라이브러리, 상기항체 파지 표면제시 라이브러리 유전자를 포함한 파지미드 벡터에 관한 것이다.

파지 표면제시 (phage display) 기법은 박테리아를 숙주로 하는 박테리오파지(bacteriophage)를 유전적으로 조작하여 유전형(유전자)과 표현형(단백질)이 하나의 파지 입자를 통해 연결되도록 만드는 기법이다. 이 경우 유전형으로서의 유전자는 파지 유전자의 일부로 삽입되며, 표현형으로서의 단백질은 그 단백질의 유전자가 들어있는 파지 입자의 표면에 제시된다. 이러한 유전형과 표현형의 물리적 결합은 단백질 공학에서 매우 중요한 개념이며, 표현형으로 나타나는 성질에 의해 선택된 단백질 클론의 유전자를 쉽게 획득하여 복제, 증폭, 분석 및 조작할 수 있도록 해 준다.

항체는 특별히 파지 표면제시 기법이 매우 유용하게 적용된 예이다. 매우 높은 다양성을 가지는 항체 라이브러리를 파지의 표면에 제시한 후 표면흡착된 항원과 결합시키면, 항원에 선택적으로 결합하는 항체 클론의 유전자를 획득할 수 있다. 이는 실험동물을 거치지 않고 항체를 얻는 매우 효과적인 방법이며, 특히 임의의 항원에 대한 인간항체를 얻을 수 있으므로 인체에서의 면역반응이 적은 치료용 항체 신약 등의 개발에 매우 높은 활용성을 가진다. 높은 결합친화도를 가지는 좋은 항체를 획득하기 위해서는 라이브러리의 품질이 중요하며, 특히 라이브러리의 크기와 기능적 다양성 및 클론의 품질이 중요하다.

라이브러리의 크기는 그로부터 선택되는 항체의 품질을 결정하는 가장 중요한 요소 중 하나이다. 항체 라이브러리의 항원 결합부위는 이론적으로 어떤 특정 항원에도 경도되지 않은 무작위적 다양성을 가지며, 순전히 우연에 의해 특정 항원에 선택적으로 결합하는 항체가 무작위적 다양성 중에서 나타나게 된다. 따라서 라이브러리의 크기가 커질수록, 즉 라이브러리 내의 서로 다른 항체의 숫자가 증가할수록, 우연에 의해 높은 선택성 및 친화도를 가지는 항체가 발견될 확률이 높아지는 것이다. 일반적으로 최소 10⁸ 이상의 크기가 필요한 것으로 인식되고 있으며, 많은 수의 항체 라이브러리가 10⁹ - 10¹¹ 정도의 크기를 가지고 있다.

라이브러리의 기능적 다양성은, 라이브러리를 이루는 클론들 중 실제로 항체를 발현할 수 있는 클론의 비율이다. 라이브러리의 크기가 크더라도 기능적 다양성이 낮으면 실질적인 라이브러리 크기는 줄어들게 된다. 기능적 다양성이 낮아지는 이유는 대부분 라이브러리 구축 과정에서 DNA 합성 및 증폭의 오류로 인한 것이다. 항체 라이브러리는 여러 단계의 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 구축되는데, 이 때 효소 및 반응의 특성상 필연적으로 낮은 빈도의 오류가 발생하게 되며 이러한 오류가 축적이 되면 최종 라이브러리의 기능적 다양성이 떨어지게 된다. 또한 특히 합성 라이브러리의 경우, 염기 합성반응의 효율성 문제 때문에 오류가 도입될 가능성이 높아지기도 한다. 이렇듯 기능적 다양성의 문제는 특히 합성 라이브러리에서 두드러지는 경향이 있으며 대부분의 합성 라이브러리는 이러한 문제점을 회피하기 위한 설계상의 고려를 해야만 한다.

라이브러리를 이루는 개별 클론들의 품질, 즉 발현성과 안정성 및 면역유발성(immunogenicity) 등도 항체 라이브러리의 성능을 결정하는 요소 중 하나이다. 항체공학적으로 우수한 클론을 선별하기 위해서는 합성 항체라이브러리의 설계단계에서부터 이러한 요소들이 고려되어야 한다. 특히 인공적 다양성을 기존의 항체유전자에 도입하는 단계에서, 생성된 다양성이 항체 골격과의 적합성(compatibility)을 가지도록 설계하여야 하며, 자연 항체(natural antibody)의 아미노산 서열로부터의 급격한 변화는 인공합성 항체의 적합성과 안정성 등을 저해할 위험이 있다. 따라서 인공적 다양성을 설계할 때 자연적 다양성을 효율적으로 모방하는 기법이 보고된 바 있다 (Lee, C. V. et al. Journal of Molecular Biology, 2004, 340, 1073-1093).

합성 라이브러리의 구축을 위해서는 라이브러리 서열의 설계가 선행되어야 한다. 비교적 높은 골격 다양성을 가지는 B세포 유래 항체 라이브러리 혹은 자연항체 라이브러리(natural antibody library)와 달리, 합성 항체라이브러리는 한 개 혹은 제한된 개수의 골격 서열을 기반으로 구축된다. 그런데, 합성 항체라이브러리의 경우 화학적 합성과정의 오류로 인해 돌연변이 및 염기의 첨가/삭제가 빈번하게 발생하게 되며 따라서 기능적 다양성(전체 클론 중 정상적인 항체를 발현할 수 있는 클론의 비율)이 낮아지게 된다.

따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 기능적 다양성이 높은 합성 라이브러리 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 합성 라이브러리 및 상기 라이브러리 유전자를 포함한 파지미드 벡터를 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 V_H3-23/V_L1g 유전자를 골격으로 하여 상보성 결정부위 (complementarity determining regions, CDR)에 인공적 다양성을 부여하는 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조 방법에 있어서, ⅰ)베타락타메이즈 유전자를 선택마커(selection marker)로 가지는 플라스미드 벡터에서 베타락타메이즈 유전자의 리더서열 직후에 제한효소 절단서열들을 도입하여 pFDV 플 라스미드 벡터를 제조하는 단계; ⅱ) 상기 제한효소를 사용하여 pFDV 플라스미드 벡터를 절단하는 단계; ⅲ)상기 절단된 pFDV 벡터 사이에 표 2와 같이 연쇄적인 중합을 거쳐 얻어지고 각각 도 2의 염기서열 또는 아미노산 서열을 갖는 AE, BE, CF 및 DF 서브라이브러리로 구성된 scFv 유전자 라이브러리를 삽입하는 단계; ⅳ)상기 scFv 유전자 라이브러리를 포함한 pFDV 벡터를 숙주 균주에 트랜스폼한 후 항생제를 포함한 배지에서 배양하는 단계; v)배양 후 상기 scFv 유전자 라이브러리를 포함한 pFDV 플라스미드 벡터를 분리정제하는 단계; ⅵ)분리정제된 상기 scFv 유전자 라이브러리를 포함한 pFDV 플라스미드 벡터를 주형으로 하여 표 1의 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로 중합효소연쇄반응을 통해 CDR-H3를 이식하는 단계 및 ⅶ)상기 CDR-H3이 이식된 scFv 라이브러리 유전자 및 pComb3X 벡터를 각각 제한효소로 절단하여 라이게이션하고 숙주 균주에 트랜스폼하여 배양하는 단계를 포함하는 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제한효소가 SfiI 인 것을 특징으로 하는 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조방법으로 제조된 항체 파지 표면제시 라이브러리를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 베타락타메이즈 유전자를 선택마커로 가지는 플라스미드 벡터가 pET17b 플라스미드 벡터인 것을 특징으로 하는 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 pComb3X 벡터에 각각 도 2의 염기서열 또는 아미노산 서열 을 갖는 AE, BE, CF 및 DF 서브라이브러리로 구성된 scFv 유전자 라이브러리가 삽입된 파지미드 벡터 조합을 제공한다.

또한, 본 발명은 pComb3X 벡터에 각각 도 2의 염기서열 또는 아미노산 서열을 갖는 AE, BE, CF 및 DF 서브라이브러리로 구성된 scFv 유전자 라이브러리가 삽입된 파지미드 벡터를 포함한 박테리오파지(기탁번호:KCCM10938P)를 제공한다.

본 발명은 효율적이고 빠른 과정을 통해 기능적 다양성이 높은 고품질의 합성 인간항체 라이브러리 및 그 제조방법을 제공할 수 있다.

이하에서, 본 명세서에 첨부된 도면을 참고하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

A. 정의

"파지표면제시 (phage display)"는 M13 박테리오파지의 유전자를 조작하여 그 표면단백질 중 하나의 유전자에 외부단백질의 유전자를 융합하고, 생산된 파지의 표면단백질에 외부단백질이 융합되어 파지의 표면에 제시되는 기법이다. 단백질을 표면제시하는 경우 흔히 gIII 유전자의 5' 쪽에 외부유전자를 융합한다.

"항체"는 목표항원에 특이적으로 결합하는 당단백질이다. 경쇄(light chain)과 중쇄(heavy chain)이 각각 2개씩 모여 이루어지는 헤테로테트라머이며 각각의 사슬은 아미노산 서열이 가변적인 가변도메인(variable domain)과 일정한 서열을 가지는 고정도메인(constant domain)으로 이루어져 있다. 가변도메인의 3차 원구조 말단에 항원이 결합하는 부위가 위치하며 이 부위는 경쇄와 중쇄에 각각 3개씩 존재하는 상보성결정부위(complementarity determining region)들이 모여서 형성된다. 상보성결정부위는 가변도메인 중에서도 아미노산 서열의 가변성이 특히 높은 부분이며 이러한 높은 가변성에 의해 다양한 항원에 대해 특이적 항체가 찾아질 수 있다.

"면역글로불린"은 항체와 구조적 특성이 동일하며, 항원특이성이 없는 항체유사분자와 항체를 포함하는 개념이다.

"단일사슬단편항체(single-chain Fv, scFv)"는 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변도메인을 15개 내외의 아미노산이 연결된 펩타이드 사슬로 이루어진 연결부위(linker)로 연결한 단백질이다. 경쇄가변도메인 - 연결부위 - 중쇄가변도메인, 또는 중쇄가변도메인 - 연결부위 - 경쇄가변도메인의 순서 모두 가능하며, 원 항체와 동일 혹은 유사한 항원특이성을 가진다. 연결부위는 주로 글리신(glycine)과 세린(serine)으로 이루어진 친수성의 유연한 펩타이드 사슬로서 "(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃"의 15개의 아미노산 서열 혹은 유사한 서열이 주로 사용된다.

"항체라이브러리"는 서로 다른 서열을 가지는 다양한 항체 유전자들의 집합이다. 항체라이브러리로부터 임의의 항원에 대해 특이적 항체를 분리하기 위해서는 매우 높은 다양성이 요구되며, 일반적으로 10⁹ - 10¹¹ 개의 서로 다른 항체 클론들로 이루어진 라이브러리가 구축되어 사용된다. 이러한 항체라이브러리를 이루는 항체 유전자는 파지미드(phagemid) 벡터에 클로닝되어 대장균에 트랜스폼 된다.

"파지미드(phagemid)" 벡터는 파지복제시작점(phage origin of replication)을 가지는 플라스미드 DNA이다. 통상적으로 항생제내성유전자를 선택 마커(selection marker)로 가지고 있다. 파지표면제시에 사용되는 파지미드 벡터의 경우 M13 파지의 gIII 유전자 혹은 그 일부가 포함되어 있으며, 라이브러리 유전자는 gIII 유전자의 5' 말단에 라이게이션(ligation)되어 대장균에서 융합단백질로서 발현된다. 본 발명에서 사용된 pComb3X 벡터는 파지미드 벡터의 예이다.

"보조파지(helper phage)"는 파지미드가 파지 입자로 조립되도록 필요한 유전정보를 제공하는 파지이다. 파지미드에는 파지 유전자 중 gIII 혹은 그 일부만이 존재하므로 파지미드로 트랜스폼된 대장균을 보조파지로 감염시켜 나머지 파지 유전자를 공급하게 된다. M13K07 혹은 VCSM13 등의 종류가 있으며 대부분 카나마이신(kanamycin) 등 항생제 내성 유전자를 포함하여 보조파지에 감염된 대장균을 선택할 수 있도록 하고 있다. 또한 조립신호(packaging signal)에 결함이 있으므로 보조파지 유전자보다 파지미드 유전자가 선별적으로 파지입자 속으로 조립된다.

"베타락타메이즈(beta lactamase)"는 페니실린, 암피실린, 카르베니실린 등 베타락탐 계열의 항생제를 분해함으로써 항생제 내성을 부여하는 효소이다.

"리더서열(leader sequence)"은 유전자의 5' 말단부분에 위치하여, 유전자로부터 발현된 단백질이 외부로 분비될 때 필요한 신호로 기능하는 염기서열 혹은 그에 상응하는 아미노산 서열이다.

염기의 표기는 다음과 같다. A = 아데닌; T = 티민; G = 구아닌; C = 시토신; M = A 또는 C; R = A 또는 G; S = C 또는 G; W = A 또는 T; Y = C 또는 T; K = G 또는 T; B = C, G 또는 T; D = A, G, 또는 T; H = A, C 또는 T; V = A, C 또는 G, N = A, T, G 또는 C.

B. 라이브러리의 설계, 구축 및 검증

본 발명에 기술된 방법을 이용해 인간항체 라이브러리를 구축하고 그로부터 임의의 항원에 대한 인간항체를 얻을 수 있다. 항체 라이브러리는 골수, 비장, 혈액 등에 포함된 B 세포로부터 그 다양성을 얻는 방법과 인공적인 설계와 합성을 통해 다양성을 얻는 방법으로 구축될 수 있으며 본 발명은 합성 인간항체 라이브러리의 구축 및 검증에 대해 기술한다.

파지 표면제시 항체라이브러리는 면역 글로불린 분자의 일부인 Fab 혹은 scFv 단편의 형태로 구축되어진다. 이들 단편은 150 kDa 크기의 면역 글로불린보다 작기 때문에 단백질 공학적인 조작의 효율성을 기할 수 있으며, 면역 글로불린 분자와 동일한 항원선택성을 가진다. 본 발명에서는 25 kDa 크기를 가지는 scFv 단편을 이용한 라이브러리를 구축하였으며, 구체적으로 면역 글로불린의 V_H 도메인과 V_L 도메인을 15개의 아미노산으로 이루어진 사슬 즉 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃로 연결한 하나의 폴리펩티드 사슬이다.

합성 라이브러리의 구축을 위해서는 라이브러리 서열의 설계가 선행되어야 한다. 비교적 높은 골격 다양성을 가지는 B세포 유래 항체 라이브러리 혹은 자연 항체 라이브러리(natural antibody library)와 달리, 합성 항체라이브러리는 한 개 혹은 제한된 개수의 골격 서열을 기반으로 구축된다. 본 발명을 통해 제작된 항체라이브러리는 한 개의 골격을 가진다. 구체적으로 라이브러리를 이루는 모든 클론들이 인간 면역글로불린의 V_H3-23 유전자와 V_L1g 유전자를 골격으로 가지며, 이 중 상보성 결정부위에 인공적 다양성을 도입하여 라이브러리를 구축하였다.

라이브러리의 구축은 하기 표 1에 제시된 올리고뉴클레오티드들을 중합효소 연쇄반응을 통해 도 1에 나온 대로 조합하여 이루어졌다. 하기 표 1은 본 발명의 항체 파지 표면제시 라이브러리 구축에 사용된 DNA 올리고뉴클레오티드의 목록이다.

이름/번호		염기서열
골격부위 합성을 위한 올리고뉴클레오티드
FR-H1-f	1	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG
FR-H1-b	2	GCTAAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCTG
FR-H2-b	3	TGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTGGCGGACCCA
FR-H3-b	4	GGCTGTTCATTTGCAGATACAGCGTGTTCTTGGAATTGTCTCTGGAGATGGTGAACCG
FR-H3-f	5	GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCG
JH-15-f	6	TTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
JH-6-f	7	ATGGACTGCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
FR-L1-f	8	CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCC
FR-L1-b	9	ACAAGAGATGGTGACCCTCTGCCCGGGGGTCCCAGACGCTGAG
FR-L2-b	10	ATAGATGAGGAGTTTGGGGGCCGTTCCTGGGAGCTGCTGGTACCAG
FR-L3-b	11	GATGGCCAGGGAGGCTGAGGTGCCAGACTTGGAGCCAGAGAATCGGTCAGGGACCCC
FR-L3-f	12	TCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTG
JL-f	13	TATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGC
FRH3-short-b	14	CGCACAGTAATACACGGCC
JH15-short-f	15	TTCGACTACTGGGGCCAG
JH6-short-f	16	ATGGACGTCTGGGGCCAGGGTACACTG
pC3X-f	17	GCACGACAGGTTTCCCGAC
pC3X-b	18	AACCATCGATAGCAGCACCG
H1-b	19	GCTAAAGGTGAATCCAGAG
H2-f	20	CTGGGTCCGCCAGGCTCCAG
H2-b	21	TGAGACCCACTCCAGCCC
H3-f	22	CGGTTCACCATCTCCAGAG
L1-b	23	CAAGAGATGGTGACCCTC
L2-f	24	CTGGTACCAGCAGCTCCCAG
L2-b	25	ATAGATGAGGAGTTTGGG
L3-f	26	GGGGTCCCTGACCGATTC
L3-b	27	CACAGTAATAATCAGCCTC
JL-short-f	28	TATGTCTTCGGCGGAGGC
상보성결정부위 합성을 위한 올리고뉴클레오티드
CDR-H1-f	29	CTCTGGATTCACCTTTAGCRRTTATKMTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAG
CDR-H2-f	30	GGGCTGGAGTGGGTCTCAKBGATCTMTYMTRRTRRTRGTARTAHATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAG
CDR-H3-9-b	31	CTGGCCCCAGTAGTCGAAMNNMNNMNNMNNTYTCGCACAGTAATACACGGC
CDR-H3-14-b	32	CTGGCCCCAGTAGTCGAAMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNAVSAYCTYTCGCACAGTAATACACGGC
CDR-H3-20-b	33	CTGGCCCCAGACGTCCATASCATHAKMAKAAKAMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNAMBAVBANVTYTCGCACAGTAATACACGGC
CDR-H3-20SS-b	34	CTGGCCCCAGACGTCCATASCATHAKMAKAAKAACAMNNMNNMNNMNNACAMNNAMBAVBANCTYTCGCACAGTAATACACGGC
CDR-L1-f	35	GAGGGTCACCATCTCTTGTASTGGCTCTTCATCTAATATTGGCARTAATDMTGTCWMCTGGTACCAGCAGCTCCCAG
CDR-L2-f	36	CCCAAACTCCTCATCTATKMTRATARTMAKCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTC
CDR-L3-b	37	GAGGCTGATTATTACTGTGSTDCTTGGGATKMTAGCCTGARTGSTTATGTCTTCGGCGGAGGC
V_H-V_L 결합부위를 위한 올리고뉴클레오티드
linker-b	38	CTGAGTCAGCACAGACTGCGATCCGCCACCGCCGGATCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGCTCACGGTGACCAG
단일사슬단편항체 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드
VH-f	39	AATTCGGCCCAGGCGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAG
VL-b	40	TTAAGGGCCGGCCTGGCCTAGGACCGTCAGCTTG
pET-bla-f	41	AAATGTGCGCGGAACCCC
pET-bla-b	42	CCCACTCGTGCACCCAAC
VH-short-f	43	AATTCGGCCCAGGCGGCC
VL-short-b	44	TTAAGGGCCGGCCTGGCC
pET17b 벡터에 SfiI 제한효소 절단서열을 도입하기 위한 올리고뉴클레오티드
bla-f	45	GAGGAGGAGGAGGGCCGCCTGGGCCAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGG
bla-b	46	GAGGAGGAGGAGGGCCAGGCCGGCCAGCACCCAGAAACGCTGGTG
염기서열분석을 위한 올리고뉴클레오티드
ompseq	47	AAGACAGCTATCGCGATTGCAG

이 중 여섯 개의 상보성 결정부위에 해당하는 올리고뉴클레오티드들은 합성단계에서 일부 염기위치를 무작위화하여 제작하였으며, 이러한 무작위화의 결과 인공적 다양성이 라이브러리에 도입되었다. CDR-H3를 제외한 다섯 개의 상보성 결정부위는 인간항체 유전자의 다양성을 모방한 제한적 무작위화를 도입하였기 때문에 (Lee et al. Journal of Molecular Biology 2004, 340, 1073-1093) 이로부터 도출되는 다양성은 자연적으로 인체에서 생성되는 인간항체의 다양성과 유사할 것으로 기대되었다. 예를 들어 제한적 무작위화 코돈 중 KMT (K = G or T, M = A or C)은 GCT, GAT, TCT, TAT의 혼합 코돈으로서 Ala, Asp, Ser, Tyr 라는 네 개의 아미노산을 나타내며, 자연 항체의 특정 위치에 상기한 네 개의 아미노산 혹은 그 일부가 자주 관찰되는 경우 KMT 코돈을 도입함으로 해서 자연 항체의 서열을 모방할 수 있다. 구체적인 예는 하기 실시예 1과 같다.

실시예 1(중합효소연쇄반응에 의한 단일사슬단편항체 클론 제조)

도 1에 나온 것과 같이 올리고뉴클레오티드를 혼합한다. 두 개의 혼합물이 필요하며, 하나는 올리고뉴클레오티드 (43, 39, 1, 2, 29, 3, 30, 4, 5, 14)가 혼합되고 다른 하나는 올리고뉴클레오티드 (15, 6, 38, 8, 9, 35, 10, 36, 11, 12, 37, 13, 40, 44)가 혼합된다. 이를 각각 V_H 단편, J_H-V_L 단편으로 칭한다. 최종반응혼합물에서 각각의 올리고뉴클레오티드의 농도는 12.5nM이며 가장 바깥쪽의 올리고뉴클레오티드 (표1 및 도1의 43, 14, 15, 44)의 농도는 600nM이 되도록 한다. 여기에 중합효소(Taq) 완충액과 중합효소, dNTP 0.8mM을 가하고 전체 부피가 100마이크로리터가 되도록 뉴클레아제가 제거된 물(nuclease-free water)를 첨가한다. 위의 혼합물에 다음의 프로그램으로 중합효소연쇄반응을 진행한다. 94^oC, 2분; (94^oC, 30초 - 54^oC, 30초 - 72^oC, 90초) 30회 반복; 72^oC, 10분. 반응물을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동으로 분리한 후 젤로부터 DNA 결과물을 추출 정제한다. 정제된 V_H 단편을 주형으로 사용하여 올리고뉴클레오티드 43, 31번을 프라이머로 다시 중합효소 연쇄반응을 위와 동일한 프로그램으로 진행하여 정제한다. 이를 V_H-CDRH3 단편으로 칭한다. V_H-CDRH3 단편과 J_H-V_H 단편을 주형으로 하고 43, 44 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 위와 동일한 프로그램으로 중합효소연쇄반응을 통해 증폭, 정제하여 단일사슬단편항체 유전자를 얻는다. 이를 SfiI 제한효소로 절단한 후 pComb3X 벡터(Scott and Barbas III, 2000, Phage display vectors, In: Phage Display Laboratory Manual, 1st ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA, pp. 2.1-2.19)에 라이게이션하고 ER2537 대장균에 트랜스폼하여 카르베니실린을 함유하는 배지에서 배양한다.

위와 같이 올리고뉴클레오티드의 조합을 통해 얻어진 단일사슬단편항체 클론들은 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성과정의 오류로 인해 돌연변이 및 염기의 첨가/삭제가 빈번하게 발생하게 되며 따라서 기능적 다양성(전체 클론 중 정상적인 항체를 발현할 수 있는 클론의 비율)이 낮아지게 된다. 이러한 영향을 줄이기 위해 조합된 클론들 중 염기서열분석을 통해 선별된 돌연변이가 없는 클론들(M-로 칭함)을 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 통해 골격부위에 돌연변이가 없는 라이브러리를 다시 구축하였다. 하기 표 2는 단일사슬단편항체 라이브러리로부터 돌연변이를 제거하기 위한 중합효소연쇄반응의 목록이다.

중합효소연쇄반응 주형	결과물	정방향 프라이머 번호(표1)	역방향 프라이머 번호(표1)
M-	#1	20	18
M-	#2	22	18
M-	#5	24	18
M-	#6	26	18
M-	#7	28	18
M-	a	17	19
M-	b	17	23
M-	c	17	23
#1	d	29	18
#2	e	30	18
#5	f	35	18
#6	g	36	18
#7	h	37	18
a + d	ad	17	21
b + f	bf	17	25
c + f	cf	17	25
ad + e	ade	17	14
ade	A	17	31
ade	B	17	32
ade	C	17	33
ade	D	17	34
bf + g	bfg	17	27
cf + g	cfg	17	27
bfg + h	E	15	18
cfg + h	F	16	18
A + E	AE	17	18
B + E	BE	17	18
C + F	CF	17	18
D + F	DF	17	18

상기 표 2의 "중합효소 연쇄반응 주형"은 주형으로 사용되는 DNA 단편을 칭하며 "결과물"은 중합효소 연쇄반응으로부터 증폭되어 얻어지는 DNA 단편을 칭한다. "정방향 프라이머"와 "역방향 프라이머"는 각각 중합효소 연쇄반응 결과물의 5' 말단과 3' 말단 부분의 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 칭하며 중합효소연쇄반응의 프라이머로 사용되었다. 구체적인 중합반응은 아래 실시예 2와 같다.

실시예 2(라이브러리 합성)

M-를 주형으로 하여 표 2에 나온 프라이머들을 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 반응 프로그램은 94^oC, 2분; (94^oC, 30초 - 54^oC, 30초 - 72^oC, 90초) 30회 반복; 72^oC, 10분이며 이로부터 나온 DNA 단편 결과물 #1, #2, #3, #5, #7, a, b, c를 각각 1% 아가로즈 젤 전기영동으로 분리, 추출, 정제하였다. 그 다음, #1, #2, #3, #6, #7 DNA 단편을 주형으로 표 2에 기재된 프라이머를 사용하여 위와 동일하게 중합효소연쇄반응을 수행하고 결과물을 아가로즈 젤 전기영동으로 정제하여 DNA 단편 d, e, f, g, h를 얻었다. 또한, 3' 말단에 상보적 서열을 가지는 DNA 단편쌍인 a와 d, b와 f, c와 f를 각각 주형으로 하는 중복확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR)을 표 2에 기재된 프라이머를 사용하여 위와 동일하게 수행하여 DNA단편 ad, bf, cf를 결과물로 얻어 아가로즈 젤 전기영동으로 정제하였다. 연속적으로 ad와 e, bf와 g, cf와 g를 주형으로 위와 같은 중복확장 중합효소연쇄반응을 통해 ade, bfg, cfg를 표 2에 기재된 프라이머를 이용하여 얻어 정제하였다. ade를 주형으로 표 2에 기재된 프라이머를 사용하여 DNA 단편 A, B, C, D를 중합효소연쇄반응을 통해 얻고 아가로즈 젤 전기영동으로 정제하였다. bfg와 cfg를 주형으로터 표 2에 기재된 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 각각 E, F를 얻어 아가로즈 젤 전기영동으로 정제하였다. 계속하여 A와 E, B와 E, C와 F, D와 F를 주형으로 중복확장 중합효소연쇄반응을 통해 표 2에 기재된 프라이머를 사용하여 단일사슬단편항체 유전자 AE, BE, CF, DF를 얻고 아가로즈 젤 전기영동으로 정제하였다. 이를 SfiI 제한효소로 절단한 후 pComb3X 벡터에 라이게이션하고 ER2537 대장균에 트랜스폼하여 카르베니실린을 함유하는 배지에서 배양하였다.

자연 항체의 CDR-H3 부위는 면역시스템의 항체생성 기전에 의해 매우 높은 다양성을 가지게 되며, 이를 모방하기 위해 상기한 방법에 의해 본 라이브러리에서도 이 부위에 무제한적 무작위화를 도입하였다. 구체적으로 CDR-H3 부분의 일부 위치에 NNK 코돈을 삽입하였으며 이로부터 나오는 32개의 개별 코돈은 20개의 모든 아미노산과 1개의 정지 코돈(stop codon)을 나타낼 수 있다. 실제로 CDR-H3 부분을 나타내는 올리고뉴클레오티드는 일부 제한적 무작위화 코돈과 그에 인접한 무제한적 무작위화 코돈으로 이루어진다. 항체의 항원선택성을 결정하는 요소 중 하나로 CDR-H3 부위의 길이가 있으며 (Collis et al. Journal of Molecular Biology 2003, 325, 337-354) 이를 반영하기 위해 네 가지의 서로 다른 길이를 가지는 CDR-H3 부위가 설계되었다. 면역글로불린의 서열에 대한 Kabat 정의에 의하면 이들은 각각 9개, 14개, 20개의 CDR-H3 잔기를 가지며, 20개의 잔기를 가지는 CDR-H3는 다시 두 개의 시스테인 잔기가 형성하는 디설피드 결합 (disulfide bond)를 가지지 않는 것과 가지는 것으로 나뉜다. 디설파이드 결합은 길이가 간 CDR-H3 부위에 구조적 안정성을 부여하는 역할을 한다. 이들을 위의 실험방법에 기술된 대로 각각 AE, BE, CF, DF 서브라이브러리로 명하였다. 구축된 라이브러리의 염기서열 및 아미노산 서열은 도 2에 정리되어 있다.

위와 같은 방법으로 조합된 scFv 유전자 라이브러리는 상보성결정부위에 해당하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 과정에서의 오류의 누적으로 인해 대부분의 클론이 서열상의 문제를 가지게 되어 결과적으로 scFv 단편을 발현하지 못하게 되고 기능적 다양성이 매우 낮아지게 된다. 파지 ELISA 기법으로 분석한 결과 30% 이하의 클론들만이 scFv를 발현, 제시하고 있는 것으로 나타났으며 이는 라이브러리의 품질을 크게 낮추는 효과를 가져온다. 이를 극복하기 위해 일차적으로 만들어진 라이브러리를 유전선택을 통해 검열하였다. 구체적으로 pET17b 플라스미드 벡터를 조작하여 벡터 내의 베타락타메이즈 유전자와 베타락타메이즈의 분비신호인 리더서열(leader sequence) 사이에 두 개의 SfiI 제한효소 절단서열을 도입하고 이로부터 나온 벡터를 pFDV로 명명하였다(도 3 및 4). 이를 이용해 위와 같이 만들어진 scFv 유전자 라이브러리를 pFDV 벡터에 삽입한 후 TOP10F' 대장균 균주에 트랜스폼하고 카르베니실린 항생제를 포함하는 한천배지에 도포하였다. 이 때 scFv 유전자에 이상이 있어 발현되지 않는 클론은 scFv 유전자에 융합된 베타락타메이즈 유전자 역시 발현하지 않으므로 카르베니실린이 포함된 배지에서 자랄 수 없다. 이러한 방법으로 scFv를 발현하는 클론들만 선별할 수 있으며, 약 10⁷ 개의 트랜스폼된 대장균 콜로니를 얻었다. 구체적인 방법은 아래 실시예 3과 같다.

실시예 3(라이브러리 검열)

표 1의 올리고뉴클레오티드 45, 46을 프라이머로 하고 pET17b 벡터를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응 (94^oC, 2분; (94^oC, 30초 - 54^oC, 30초 - 72^oC, 3분) 20회 반복; 72^oC, 10분)으로 증폭한 후 아가로즈 젤 전기영동으로 결과물을 정제하였다. 위의 결과물과 앞서 정제한 BE 단편을 각각 SfiI제한효소로 절단한 후 라이게이션한 후 TOP10F' 대장균에 트랜스폼하여 카르베니실린을 함유한 아가로즈 배지에 도포하여 배양하였다. 단일 콜로니를 취하여 카르베니실린을 함유한 배지에서 교반배양한 후 자란 대장균 세포로부터 플라스미드를 분리정제하고 이를 pFDV로 칭하였다. pFDV 벡터와 AE, BE, CF, DF 단편을 각각 SfiI 제한효소로 절단한 후 각각의 절단된 단편을 절단된 pFDV벡터와 라이게이션하고 TOP10F' 대장균에 트랜스폼하여 카르베니실린을 함유한 아가로즈 배지에 도포 배양하여 10⁷개의 트랜스폼된 대장균 콜로니를 얻었다.

이러한 방법으로 얻어진 10⁷의 다양성은 효율적인 항체 발견을 위해 필요한 라이브러리의 크기에 비해 낮기 때문에 여기에 다시 CDR-H3 부위를 이식하여 다양성을 높였다 (도 5). CDR-H3 부위에 해당하는 올리고뉴클레오티드의 합성과정의 오류 때문에 기능적 다양성이 떨어질 것으로 예측되지만, 전체 다양성이 향상되는 효과가 더 크므로 결과적으로 라이브러리의 품질이 향상될 것으로 기대되었다. 이런 방법으로 만들어진 다양한 scFv 유전자 라이브러리를 SfiI 제한효소로 절단한 후 pComb3X 벡터에 삽입하였다 (Scott and Barbas III, 2000, Phage display vectors, In: Phage Display Laboratory Manual, 1st ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA, pp. 2.1-2.19). ER2537 대장균 균주에 트랜스폼한 후 총 7.6 x 10⁹의 크기를 가지는 라이브러리를 얻을 수 있었다. 구체적인 방법은 하기 실시예 4와 같으며, 도 5에 정리되어 있다.

실시예 4(라이브러리 다양성 부여)

실시예 3에서 얻어진 AE, BE 라이브러리 유전자가 들어있는 pFDV 플라스미드를 주형으로 표 1의 올리고뉴클레오티드 41, 14번과 15, 42번을 각각 프라이머쌍으로 중합효소연쇄반응을 통해 각각 2개의 DNA 단편 결과물을 얻었다. 유사하게 CF, DF 라이브러리 유전자가 들어있는 pFDV 플라스미드를 주형으로 41, 14번과 16, 42번 프라이머쌍으로 각각 2개의 DNA 단편 결과물을 얻었다. 41, 14번 쌍으로부터 얻은 DNA단편 4개 (각각 AE, BE, CF, DF를 주형으로 한 것)를 주형으로 41번과 31번(AE), 41번과 32번 (BE), 41번과 33번 (CF), 41번과 34번 (DF)를 프라이머쌍으로 중합효소 연쇄반응을 거쳐 DNA 단편 결과물을 얻어 아가로즈 젤 전기영동으로 정제하였다. 위의 DNA 단편과 15/42번 프라이머쌍으로부터 얻은 DNA 단편 (AE, BE) 혹은 16/42번 쌍으로부터 얻은 DNA 단편 (CF, DF)을 주형으로 중복확장 중합효소연쇄반응을 통해 표 1의 41번과 42번을 프라이머로 사용하여 단일사슬단편항체 라이브러리 유전자를 얻고 아가로즈 젤 전기영동으로 정제하였다. 위의 유전자와 pComb3X 벡터를 각각 SfiI 제한효소로 절단하여 라이게이션하고 ER2537 대장균에 트랜스폼하여 카르베니실린과 2% 포도당을 포함하는 배지에서 배양하였다.

최종 라이브러리는 서로 다른 CDR-H3 길이를 가지는 4종의 서브라이브러리를 혼합한 것으로, 각각의 서브라이브러리는 2.1 x 10⁹ (AE), 2.7 x 10⁹ (BE), 1.1 x 10⁹ (CF), 1.7 x 10⁹ (DF)가지의 클론들을 가진다. 이들 라이브러리는 염기서열분석과 파지 ELISA를 통해 분석되었다. 도 6 및 도 7은 각각 본 발명의 표면제시 항체 라이브러리의 파지 ELISA 분석결과(도 6) 및 염기서열분석결과(도 7)이다. 파지 ELISA는 발현된 파지항체 클론을 anti-HA 항체를 통해 표면에 포획한 후 HRP(horseradish peroxidase)-anti-HA 항체와 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 통해 검출하는 방법을 사용하였다. 이로부터 70 - 80퍼센트의 클론이 scFv를 발현하여 파지 표면에 제시하고 있음을 검증하였다.

트랜스폼된 대장균 라이브러리를 VCSM13 보조 파지(helper phage)로 감염시켜 scFv 클론이 표면제시된 항체파지 라이브러리를 얻었으며(Rader, Steinberger and Barbas III, 2000, Phage display vectors, In: Phage Display Laboratory Manual, 1st ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA, pp. 10.7-10.9 참조), 부다페스트조약에 의거 이를 한국미생물보존센터에 기탁하였다(기탁번호:KCCM10938P). 이 라이브러리는 1밀리리터 당 10¹² 이상의 콜로니형성단위 (colony forming unit, CFU)를 포함하며 필요한 경우 대장균 숙주에 재감염, 증폭(reamplification)함으로써 더 많은 파지 라이브러리를 얻거나 대장균 혹은 파지미드 형태의 라이브러리로 전환할 수 있다(참조: Rader, Steinberger and Barbas III, 2000, Phage display vectors, In: Phage Display Laboratory Manual, 1st ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA, pp. 10.10-10.11). 이를 사용하여 여러 종류의 항원에 대하여 항원특이적 항체를 선별하는 실험을 통해 아래와 같이 항체파지 라이브러리의 기능성을 검증하였다. 퍼옥시레독신 2 (peroxiredoxin 2, PrxII)는 세포내에서 항산화작용을 하는 단백질 중 하나이다. 이를 항원으로 사용하여 PrxII에 선택적으로 결합하는 항체를 선별하는 패닝(panning) 실험을 하였다.

사용예 1

면역시험관(immunotube)에 10 μg/ml 농도의 PrxII 용액을 첨가하여 1시간동안 시험관 표면에 단백질을 흡착시킨 후 분말우유 3% 용액을 시험관에 첨가하여 PrxII가 흡착되지 않은 표면을 보호하였다. 시험관을 비운 후 여기에 분말우유 3% 용액에 분산된 10¹² CFU의 항체파지 라이브러리를 넣어 항원과 결합시켰다. 비특이적으로 결합한 파지를 TBST (tris buffered saline - tween20) 용액으로 3회 씻어낸 후, 남아있는 항원특이적 파지 항체를 100 mM 트리에틸아민 용액을 이용하여 용리하였다. 용리된 파지를 1.0M 농도의 Tris-HCl 버퍼 (pH 7.8)로 중화시킨 후 ER2537 대장균에 37도에서 1시간 감염시키고, 감염된 대장균을 카르베니실린을 함유하는 LB (Luria-Bertani) 한천배지에 도포하여 37도에서 배양하였다. 다음날 배양된 대장균을 3 mL의 SB (super broth) - 카르베니실린 배양액에 현탁하고 15% 글리세롤을 첨가하여 일부는 -80^oC에 보관하고, 나머지 중 50마이크로리터를 20 mL의 SB-카르베니실린-2% 포도당 용액에 접종하여 37도에서 배양하였다. 배양액의 600 나노미터 광선의 흡광도가 0.5가 되면 원심분리하여 박테리아만을 분리하고, 이를 다시 20 mL의 SB-카르베니실린 배양액에 현탁한 후 10¹² PFU (플라크 형성단위)의 VCSM13 보조파지를 넣고 서서히 교반하며 37도에서 배양하였다. 1시간 후 카나마이신 70 μg/ml을 첨가하고 30도에서 빠르게 교반하며 (250 rpm) 밤새 배양하였다. 다음날 배양액을 원심분리한 후, 파지 입자를 포함하는 상층액 1 mL을 라이브러리로 사용하여 위의 패닝 과정을 반복함으로써 항원특이적 클론을 농축시켰다.

3-4회 정도의 반복적인 패닝 후 항체유전자를 포함하는 대장균을 카르베니실린을 함유하는 LB 한천배지에 도포, 배양하여 단일 콜로니들을 얻고, 이를 200 μL SB-카르베니실린 용액에 접종, 배양한 후 IPTG로 유도하여 scFv 단백질을 대장균의 페리플라즘(periplasm)에서 발현하였다. 대장균을 100 μL의 BBS (borate-buffered saline) 용액에 현탁한 후 4도에서 밤새 교반하여 페리플라즘을 추출하고, 이를 ELISA 기법을 사용하여 PrxII 항원과 scFv와의 결합을 확인하는 데 사용하였다 (Steinberger, Rader and Barbas III, 2000, Phage display vectors, In: Phage Display Laboratory Manual, 1st ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA, pp. 11.9-11.12). 결합한 scFv는 HRP(horseradish peroxidase)-anti-HA 항체와 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 이용하여 검출하였다. 이로부터 확인된 항원특이적 항체 클론은 염기서열 분석법을 통해 분석하였다. 이로부터 얻어진 항원특이적 항체의 개수와 염기서열분석 결과가 표 3에 기재되어 있다.

사용예 2-5

유사한 방법으로 설피레독신 (sulfiredoxin) 단백질과 인슐린, 글루타티온(glutathione), LIME 펩타이드 (Hur et al. Journal of Experimental Medicine, 2003, 198, 1463-1473) 등 4종의 추가적인 항원에 대한 항체 발견 실험을 수행하였다. 설피레독신과 인슐린은 퍼옥시레독신 2와 동일한 방법으로 진행되었으며, 9개의 아미노산으로 이루어진 LIME 펩타이드는 에틸시클로헥실카보디이미드(EDC)를 사용하여 우혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)에 결합시킨 후 동일한 방법으로 진행하였다. 3개의 아미노산으로 이루어진 글루타티온의 경우, 바이오틴(biotin)과 시스테인을 포함하는 Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-biotin 서열을 가지는 짧은 펩타이드(Xaa = 시스테인을 제외한 19개의 아미노산이 무작위적으로 포함된 위치)를 스트렙타비딘이 결합된 자기입자(magnetic bead)와 결합시킨 후 디설파이드 결합을 통해 펩타이드와 글루타티온을 연결하여 사용하였다. 이 경우 항원은 면역시험관 표면이 아닌 자기입자 표면에 고정된 형태이다. 이상의 실험을 통해 다양한 목표항원에 대하여 획득한 항체의 수와 염기서열분석 결과가 표 3에 정리되어 있다. 다양한 크기를 가지는 여러 가지의 항원에 대하여 고루 복수의 항원특이적 항체클론을 선별하는 것이 가능했다.

이 중 퍼옥시레독신 2에 대한 항체클론 2개를 이용하여 단일사슬단편항체(single-chain Fv, scFv)를 발현, 정제함으로써 선별된 항체클론의 발현성과 기능성을 분석하는 실험을 수행하였다. 항체유전자가 포함된 pComb3X 플라스미드를 대장균 클론으로부터 획득한 후 이를 TOP10F' 대장균주에 트랜스폼하고 LB-카르베니실린 한천배지(agar plate)에 도포하였다. 이로부터 단일콜로니를 얻어 4mL의 SB-카르베니실린 용액에 접종하여 37도에서 밤새 교반배양하였다. 이를 다시 400mL의 SB-카르베니실린-2% 포도당 배양액에 첨가한 후 OD600 = 0.5가 될 때까지 배양한 후 원심분리하고, 침전된 대장균을 400mL의 SB-카르베니실린에 현탁하였다. 여기에 IPTG를 1mM 농도로 첨가하여 항체발현을 유도하고 30도에서 4시간동안 교반배양하였다. 배양액을 원심분리하여 대장균을 20 mL의 BBS 완충액 (borate buffered saline; 200 mM sodium borate, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8.0)에 현탁하고 4도에서 서서히 밤새 교반하였다. 다음날 원심분리 후 상층액을 취하여 5 mM MgCl₂를 첨가하였다. 여기에 0.5 mL의 Ni-NTA 아가로즈 현탁액을 첨가한 후 1시간동안 4도에서 서서히 회전시켰다. 이를 컬럼 (Bio-rad 사의 Polyprep 혹은 유사품)에 가하여 항체가 결합된 아가로즈 입자를 분리하고 5mM 의 이미다졸이 포함된 20mL의 PBS 완충액을 컬럼에 가하여 세척하였다. 다시 200mM의 이미다졸이 포함된 PBS 완충액 (pH 7.4)를 1mL 가하여 항체를 아가로즈 입자로부터 용리하였다. 이렇게 정제된 단일사슬단편항체는 SDS-PAGE 전기영동법을 사용하여 순도 및 정제량을 측정, 분석하였다(도 8 참조). 약 80%의 순도로 배양액 1 리터당 최대 1밀리그램까지의 수율로 단일사슬단편항체를 정제할 수 있었다.

앞에서 설명된 본 발명의 일실시예는 본 발명의 기술적 사상을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 기재된 사항에 의하여만 제한되고, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상을 다양한 형태로 개량 변경하는 것이 가능하다. 따라서 이러한 개량 및 변경은 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것인 한 본 발명의 보호범위에 속하게 될 것이다.

도 1은 올리고뉴클레오티드로부터 단일사슬단편항체 라이브러리의 구축과정을 도식적으로 나타낸 이해도(번호는 표 1의 올리고뉴클레오티드 번호)

도 2는 본 발명의 라이브러리의 염기서열 및 아미노산 서열

도 3은 기능적 다양성을 높이기 위한 pET17b 벡터의 조작 및 단일사슬단편항체 라이브러리의 클로닝 과정을 나타낸 이해도

도 4는 도 3에 제시된 방법을 통해 제작된 본 발명의 pFDV 벡터의 염기서열

도 5는 본 발명의 단일사슬단편항체 서열에의 CDR-H3의 이식 및 최종 라이브러리의 제작과정을 나타낸 이해도

도 6은 본 발명의 표면제시 항체 라이브러리의 파지 ELISA 분석결과

도 7은 본 발명의 표면제시 항체 라이브러리의 염기서열분석결과

도 8은 정제된 단일사슬단편항체의 폴리아크릴아미드젤 전기영동 (쿠마시 염색). 1: 마커, 2, 4, 6, 8: 정제전 대장균추출물, 3, 5, 7, 9: 정제된 단일사슬단편항체

Claims

V_H3-23/V_L1g 유전자를 골격으로 하여 상보성 결정부위(complementarity determining regions, CDR)에 인공적 다양성을 부여하는 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조 방법에 있어서,

ⅰ)베타락타메이즈 유전자를 선택마커(selection marker)로 가지는 플라스미드 벡터에서 베타락타메이즈 유전자의 리더서열 직후에 제한효소 절단서열들을 도입하여 pFDV 플라스미드 벡터를 제조하는 단계;

ⅱ) 상기 제한효소를 사용하여 pFDV 플라스미드 벡터를 절단하는 단계;

ⅲ)상기 절단된 pFDV 벡터 사이에 표 2와 같이 연쇄적인 중합을 거쳐 얻어지고 각각 도 2의 염기서열 또는 아미노산 서열을 갖는 AE, BE, CF 및 DF 서브라이브러리로 구성된 scFv 유전자 라이브러리를 삽입하는 단계;

ⅳ)상기 scFv 유전자 라이브러리를 포함한 pFDV 벡터를 숙주 균주에 트랜스폼한 후 항생제를 포함한 배지에서 배양하는 단계;

ⅴ)배양 후 상기 scFv 유전자 라이브러리를 포함한 pFDV 플라스미드 벡터를 분리정제하는 단계;

ⅵ)분리정제된 상기 scFv 유전자 라이브러리를 포함한 pFDV 플라스미드 벡터를 주형으로 하여 표 1의 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로 중합효소연쇄반응을 통해 CDR-H3를 이식하는 단계 및;

ⅶ)상기 CDR-H3이 이식된 scFv 라이브러리 유전자 및 pComb3X 벡터를 각각 제한효소로 절단하여 라이게이션하고 숙주 균주에 트랜스폼하여 배양하는 단계를 포함하는 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 제한효소는 SfiI 인 것을 특징으로 하는 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 베타락타메이즈 유전자를 선택마커(selection marker)로 가지는 플라스미드 벡터는 pET17b 플라스미드 벡터인 것을 특징으로 하는 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조방법으로 제조된 항체 파지 표면제시 라이브러리.
pComb3X 벡터에 각각 도 2의 염기서열 또는 아미노산 서열을 갖는 AE, BE, CF 및 DF 서브라이브러리로 구성된 scFv 유전자 라이브러리가 삽입된 파지미드 벡터 조합.
pComb3X 벡터에 각각 도 2의 염기서열 또는 아미노산 서열을 갖는 AE, BE, CF 및 DF 서브라이브러리로 구성된 scFv 유전자 라이브러리가 삽입된 파지미드 벡터를 포함한 박테리오파지(기탁번호:KCCM10938P).