CN1930182A - 抗凝剂化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结构式(A)的化合物，寡糖－间隔基－GpIIb/IIIa拮抗剂(A)，其中所述寡糖是带负电荷的寡糖残基，包括4－25个单糖单元，带正电荷的抗衡离子补偿电荷，并且其中寡糖残基衍生自本身具有(AT－III介导的)抗－Xa活性的寡糖；间隔基是一个键或者基本上无药学活性的连接残基；GpIIb/IIIa拮抗剂是模拟纤维蛋白原的RGD和/或K(QA)GD片段的残基，典型地包括非必需酯化的羧酸酯部分和位于与另一个相距10－20埃的残基中的碱性部分；或者其药学可接受盐或其前体药物或溶剂合物。本发明的化合物具有抗凝活性，并且能用于治疗或预防栓塞疾病。

Description

抗凝剂化合物
本发明涉及新的抗凝剂化合物，含有所述化合物作为活性成分的药物组合物，以及所述化合物用于制备药物的用途。
急性心肌梗塞，局部缺血和中风都是由动脉粥样硬化冠状动脉中形成闭塞血栓引起的。动脉血栓由血小板(凝血细胞)与(增加水平的)纤维蛋白原聚集而形成。该过程与其中纤维蛋白原裂解成纤维蛋白凝块的凝结系统的激发态和失调有关。在(动脉)血栓形成治疗中必需介入这些主要的和从属的途径之一。
丝氨酸蛋白酶是在血液凝固级联中起着重要作用的酶。这组蛋白酶成员是例如凝血酶，胰蛋白酶，因子VIIa，IXa，Xa，XIa，XIIa，和蛋白质C。凝血酶是凝固级联中最后的丝氨酸蛋白酶。凝血酶的主要功能是纤维蛋白原裂解产生纤维蛋白单体，其交联形成不溶性凝胶。另外，凝血酶通过级联早期激活因子V和VIII来调节其自身产生。它还有细胞水平的重要作用，它对特异性受体起作用，引起血小板聚集，内皮细胞激活和成纤维细胞增殖。因此凝血酶在淤血和血栓形成中起着中心调节作用。因子Xa催化凝血酶原转化为凝血酶。因子Xa的抑制有效导致血液凝固的抑制。
几种活化剂引发血小板聚集，不只是凝血酶，还有ADP，胶原和肾上腺素。所有情况下，导致血小板聚集的最后共同途径是纤维蛋白原与其受体的结合，所述关键膜糖蛋白是复合体GPIIb/IIIa。因此，认为对纤维蛋白原与这种蛋白质结合的抑制是用于防止(动脉)血栓形成和治疗血栓形成疾病的非常有效的抑制血小板聚集的途径。
GPIIb/IIIa(αIIbβ3)是属于整联蛋白家族的表面受体。整联蛋白由两个链，一个α亚基和一个β亚基构成，它们以钙依赖方式通过一价键连接在一起。GPIIb组成有二价阳离子结合域的亚基(αIIb)，而GPIIIa是protypical亚基(β3)。已经从全身细胞分离到了整联蛋白，并且它是细胞-细胞和细胞-酶作用物粘着和传导信号的中介体。GPIIb/IIIa上有三个结合位点，一个识别氨基酸序列Arg-Gly-Asp(RGD结合位点)，另一个识别Lys-Gln-Ala-Gly-Asp(KQAGD结合位点)并且一个识别Lys-Gly-Asp(KGD结合位点)。
在每一个循环血小板上，有35,000至100,000GPIIb/IIIa复合体；大多分布相似血小板表面上，较小部分在内部保留。GPIIb/IIIa复合体与其血浆配体不反应，直到血小板被外源激动剂例如ADP或凝血酶激活。当这发生时，产生内-外信号，导致复合体胞外部分构象改变，使得分子能结合纤维蛋白原和其他配体。
模拟纤维蛋白原的α-链(RGD)和γ-链(KQAGDV)片段的化合物可以以拮抗剂起作用。以前已经描述过以肽模拟结构为基础的多种有效GPIIb/IIIa拮抗剂。一些(非常)有效的例子是Ro 435054，珍米洛非班，RWJ 50042，替罗非班和拉米非班。但是，没有进一步开发或在达到晚期临床试验之后保留的表现出极好的体外效力和药物动力学曲线的大量GPIIb/IIIa拮抗剂，因为没有坚持控制血小板聚集和部分由于化合物短半存留期引起的不明确的药物学性状。短半存留期导致自由药物的血浆水平大的差异，并且可能是剂量响应个体间差异性的原因(需要监测治疗)。H.Darius在Thromb Res.2001，103，S117-S124中还报道使用GPIIb/IIIa拮抗剂的所有大临床试验中治疗效果较小，此外，还观察到糖蛋白IIb/IIIa受体-拮抗剂治疗的患者组(口服治疗)死亡率升高。认为窄的治疗窗口和有限的药物生物可利用率，以及关于血小板纤维蛋白原受体调节的仍然非常有限的知识是这种治疗失败的原因。
结论是，需要具有可预测抗血栓形成作用，优选有更长半存留期(实现血小板聚集的长久水平)的GPIIb/IIIa拮抗剂。
根据本发明，现在发现了新的化合物，它们是抑制剂，优选通过抑制凝固级联(因子Xa)和血小板聚集途径(GpIIb/IIIa)中的两个关键靶物而具有混合药物动力学作用。
本发明的化合物具有结构式A：
寡糖-间隔基-GpIIb/IIIa拮抗剂(A)，
其中所述寡糖是带负电荷的寡糖残基，包括4-25个单糖单元，带正电荷的抗衡离子补偿电荷，其中寡糖残基衍生自本身具有(AT-III介导的)抗-Xa活性的寡糖；间隔基是一个键或者基本上无药学活性的连接残基；GpIIb/IIIa拮抗剂是模拟纤维蛋白原的RGD和/或K(QA)GD片段的残基，典型地包括非必需酯化的羧酸酯部分和位于与另一个相距10-20埃的残基中的碱性部分；或者其药学可接受盐或其前体药物或溶剂合物。
通过对抗纤维蛋白原与其受体的结合通过对凝固因子Xa和对血小板聚集的ATIII-介导的抑制作用，本发明的化合物是有效的抗血栓形成剂。当与本领域已知的联合疗法相比时，其中GpIIb/IIIa抑制剂与抗凝疗法(例如描述于Expert Opin.Investig.Drugs(2003)12(9)，1567，和US 2003/0199457 A1)联合，本发明的化合物的药动学和药效学曲线导致血小板凝固的更持久的控制，并导致较小的剂量响应的个体间差异。本发明的化合物的另一个优点是通过下面操作可以协调药理学作用：(a)通过改变影响与ATIII结合的寡糖的类型，分别导致Xa抑制活性的提高或降低，半存留期延长或缩短，(b)通过改变GpIIb/IIIa拮抗剂的类型，能增强或减弱血小板凝固的抑制，(c)通过改变间隔基长度，进一步调整各种化合物的各自药理学作用是可能的。
有人报道过包括其他寡糖的其他偶联物，是一个五糖和一个直接的凝血酶抑制剂的合成偶联物(Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9(14)，2013-8；WO99/65934；WO 01/42262)或者两个寡糖的偶联物，其中寡糖中的一个具有间接AT-E介导的抗-凝血酶活性，另外还有其他寡糖的AT-III介导的抗-Xa活性(EP 0,649,854)。虽然也是抗血栓形成化合物，那些化合物只对凝固级联的因子起作用。另一方面，本发明的化合物对循环血小板表面上存在的GPIIb/IIIa受体也起作用。因此，作用机理明显不同于各种其他类型的抗血栓形成偶联物。利用本发明的化合物，在一个单一药物中可获得两种互补的抗血栓形成疗法。
本发明的化合物用于治疗和(可能地)防止栓塞病。这包括其中凝固级联被激活的多种血栓形成和血栓形成前状态，包括但不限于，深静脉血栓形成，肺栓塞，血栓静脉炎，血栓形成或栓塞产生的动脉闭塞，血管成形术期间或之后的动脉再闭合，动脉损伤或侵入性心脏病手术之后的再狭窄，手术后静脉血栓形成或栓塞，中风和心肌梗塞。
在本发明的化合物中不能使用4-25个单糖单元的任何带负电荷寡糖残基。本发明合适的化合物是其中寡糖是硫酸化或磷酸化寡糖残基的寡糖。优选地，寡糖残基衍生自本身具有(AT-III介导的)抗-Xa活性的寡糖，例如EP 0,454,220，EP 0,529,715，WO 97/47659，WO98/03554和WO 99/36443中描述的寡糖。根据本发明优选的化合物是其中寡糖残基有4-16个单糖单元，最优选是硫酸化五糖残基的化合物。优选五糖残基具有结构B
Figure A20058000700200091
其中R1独立地是OSO3 -或(1-8C)烷氧基，并且带正电荷抗衡离子补偿电荷。
特别优选的五糖具有结构C
Figure A20058000700200092
其中R1是OCH3或OSO3 -。
带正电荷抗衡离子补偿电荷。在结构C的最优选五糖中，R1是OCH3。
间隔基是一个键或者基本上没有药学活性的连接残基。在优选实施方案中，间隔基是基本上没有药学活性的连接残基，优选有1-50个原子，不包括寡糖残基的氧。间隔基的化学性质对于本发明的化合物的抗血栓形成活性的重要性较小。但是，本发明的化合物的间隔基优选是柔顺的。
本领域技术人员可以容易地设计合适的间隔基。间隔基更优选的长度是10-35个原子，特别是10-28个原子。考虑到合成原因，认为较长间隔基更不合适，然而在本发明的化合物中仍然可以成功使用较长间隔基。优选间隔基包含至少一个-(CH2CH2O)-单元。更优选的间隔基包含多个，优选6个-(CH2CH2O)-单元。最优选的间隔基是*-(CH2CH2O)3-(CH2)2-NH-C(O)-CH2O-(CH2CH2O)3-(CH2)2-，*指示的末端与寡糖残基的氧连接。
间隔基与GpIIb/IIIa拮抗剂残基的连接点基本上可以任意选择，前提是GpIIb/IIIa拮抗剂活性没有被破坏。因此，典型存在的羧酸酯部分(非必需酯化的)和碱性部分必须保持不受影响。
在根据本发明优选的化合物中，GpIIb/IIIa拮抗剂残基选自衍生自Ro 435054，SC 54701(珍米洛非班)，RWJ 50042，sibrafiban(Ro443888)，拉米非班(Ro 449883)，GPI 562，FK 633，替罗非班(MK 383)，奥布非班(SC 57101)，表非替得(C6822)，roxifiban(XV 459)，elarofiban(RWJ53308)，SR121787，来达非班(BIBU 52)，lotrafiban(SB 214857)，gantofiban (YM028)，T-250，EF 5077，ZD 2486，TAK 029，TP 9201，L 703014，SR 121566(SR 121787的活性形式)的残基。所述残基的衍生物还包括化学修饰的残基，其中保留了(非必需酯化的)羧酸酯部分和碱性部分(或保护的碱性部分)。
优选的GpIIb/IIIa拮抗剂残基具有结构D
Y-N(H)-C(O)-X         (D)，
其中Y是N(H)-C(O)-C(R2)(C(R2)2COOH)或
N(H)-C(O)-C(R2)(CH2芳基)-N(H)-C(O)-C(R2)(C(R2)2COOH)，
O-亚苯基-C(R2)2-C(R2)(COOH)-N(H)-C(O)-C(R2)(C(R2)2COOH)，
O-亚苯基-C(R2)2-C(R2)(C(O)-R3-O-C(R2)2COOH)，
其中R2独立地是H或(1-4C)烷基；并且其中芳基是苯基，羟基苯基，苯硫基或吡啶基，并且R3是哌啶基；
而X是苄脒，(CH2)2-N(H)-C(O)-苄脒，(CH2)2-C(O)-N(H)-苄脒或者
Figure A20058000700200101
其中n是0，1，2或3。
本发明最优选的化合物是实施例中描述的化合物II，V，VIII，X，XI，XII，XIII，XIV，XV和XVI，其中化合物XIII是最优选的。
带正电荷的抗衡离子是H+，Na+，K+，Ca2+，等。优选的式(A)的化合物是它们的钠盐形式。
术语碱性部分意思是任何公知的碱性部分，例如胺，脒，胍，哌啶等。
两个基团空间取向“彼此相距10-20埃的距离”的短语意思不仅是延着键测量。本领域技术人员可利用测定该距离的立体技术(参见，例如J.Med.Chem.1994，37，2537-2551)。
术语(1-8C)烷基意思是具有1-8个碳原子的支化的或没有支化的烷基，例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，叔丁基，己基和辛基。甲基和乙基是优选的烷基。
术语“前体药物”意思是在体内代谢成活性化合物的化合物，例如其中式A的化合物的GpIIb/IIIa拮抗剂残基中的碱性部分(例如氨基或苯甲酰氨基)被例如羟基，(1-6C)烷氧基或(1-6C)烷氧羰基保护。
根据本发明的溶剂合物包括水合物。
利用本领域公知的方法，通过非必须地修饰先前描述的例如衍生自Ro 435054，RWJ 50042或SC 54701(珍米洛非班的药物活性成分)，替罗非班，拉米非班，或者氨基酸的类似物，肽模拟物或者另外的官能团(例如，-COOH，-NH2，-SH，-OH等)的GPIIb/IIIa拮抗剂，能制备本发明的化合物。合成这样的修饰的RGD-类似物的例子描述于Bioorganic Chemistry 29，357-379(2001)，其中化合物是靶向药物送递的有效载体。根据本发明，非必须地修饰的GPIIb/IIIa拮抗剂部分是(a)直接与寡糖偶联或者(b)与寡糖-间隔基残基偶联或者(c)与间隔基偶联，其接着与寡糖-间隔基-残基偶联(例如通过从WO99/65934；WO 01/42262公知的办法)。为此目的可以使用任何合适的寡糖，例如文献中已知的寡糖(例如从EP 0,454,220和EP 0,529,715已知的，但是不限于这些来源)或者商业上可获得的寡糖。通过本领域公知的，例如Buijsman，R.等(Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9，2013-2018)描述的方法，可以及时在合适的点将寡糖磷酸化。
例如通过利用EP 0,649,854中描述的方法能实现间隔基与寡糖的偶联。
用作本发明的化合物的GpIIb/IIIa拮抗剂(基础)的已知GpIIb/IIIa拮抗剂的其他例子(不限于这些例子)：化合物Ro 43 8857(J.Med.Chem.35，4393(1992))，Ro 48 3657，BIBL 12，FK 633，GR 144053，EMD76 334，SR 121566，SB 208651，SC 54684，SC 52012，DMP 754，FR158999，GR 200976，XV 788，MK 383(替罗非班)，RWJ 53308，ZD2486，L709780，RGD 891，T 250，C 6822，BIBU 104，SB 214857，SC 57101，G 7453，TAK 029，XV 454，XV 459，L 734217，DMP 802，SR 121787，TP 9201，DMP 757，SC 52012，RPR 109891，YM 68128，ME 3229，ME 3230，CT 50352，MK 852，S 1197，DMP 728，SC 57345，L 738167，GR 233548，RO438857，TA 993，YM 337，BIBW 194，BIBU 129，BIBW 98，tetrafibricin，L 703014，BIBU 251，GR 91669，RG 13965，G 7446，PS 028，XR 300，NSL 9403，L 756568，S 1762，L 746223，L 767685，NSL 95301，G 4120，SB 207043，GR 83895，P246，L 739758，XR 299，SV 873，RWJ 50228，XQ 870，EF 5154，AR 0510，G 7570，G 7442，G 7464，RWJ 52656，TAK 024，MS 180，MS 28168，XU 063，XU 065，L 734115，SM 20302，TS 943，NSL 96184，UR 12947，XU 057，L 750034，UR 3216，UR 2922，CP 4632，AR 0598，SC 79992，SC 4992，RGD 039，ME 3277，T 250，SC 57099B，SKF106760，SKF 107260，RWJ 52654，PSA 0613，CGH 400，NSL 95317，XT 111，RWJ 27755，L 736622，SC 46749，SM 20302，YM 570029，CY 311176和EP 0,529,858中描述的化合物，WO 96/20172，EP0,496,378，EP 0,530,505，Bioorg.Med.Chem.3，539(1995)，WO93/08174，J.Am.Chem.Soc.115，8861(1993)，J.Med.Chem.43，3453(2000)，Bioorg.Med.Chem.3，337(1995)，US 5,239,113，US5,344,957，US5,973,003，US 5,703,125，WO 96/37464，WO 93/07867，US 5,378,712，EP 445,796，US 5,273,982，US 5,770,575，WO 01/602813，EP 656,348，US 5,726,185，EP 505,868，EP 560,730，US 5,561,112，EP 513,675，US 5,574,016，WO 94/09030，EP 478,363，US 5,292,756，US 5,206,373，WO 93/16994，US 5,312,923，EP 743,302，US 5,658,929，US 5,880,136，US 5,814,643和US 6,040,317。
本发明还包括新设计的模拟纤维蛋白原的RGD和/或K(QA)GD片段的GpIIb/IIIa拮抗剂残基，典型地包括非必需地酯化的羧酸酯和位于彼此相距10-20埃距离的残基中的碱性部分的化合物。
上述制备本发明的化合物的方法中的操作步骤，肽偶联，能例如通过叠氮化物方法，混合酸酐方法，活化酯方法，碳化二亚胺方法这样的肽片段偶联或缩合的本领域公知的方法来实现，或者，优选地，在铵/uronium盐象TBTU的影响下，特别是加入催化和外消旋作用清除化合物象N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基苯并三唑。E.Gross和J.Meienhofer编著的The Peptides，Anal Synthesis.Biology，Vol 3，(Academic Press，New York，1981)给出了综述。
在合成过程中用N-保护基团可以包括化合物中存在的胺官能团，这指α-氨基保护的肽化学中通常使用的基团，象叔丁氧羰基(Boc)基团，苄氧羰基(Z)基团，9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基团或邻苯二甲酰(Phth)基团，或者可以通过屏蔽叠氮化物部分导入。上文提到的ThePeptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol 3中给出了氨基保护基和它们的去除方法的综述。
脒官能团，如果存在，能在偶联步骤中去保护，或者能使用氨基甲酸酯，例如烯丙氧羰基或苄氧羰基来保护。优选在温和条件下使用1，2，4-二唑啉-5-酮部分作为母体导入脒官能团。
用于保护α-羧酸基团的肽化学中通常使用的基团可以保护羧酸基团，例如叔丁酯。修饰的GPIIb/IIIa拮抗剂的羧酸基团优选被保护成苄基酯。保护基团能通过不同途径去除，取决于那些保护基团的性质。通常在酸性条件下，在清除剂存在下或还原条件下进行去保护，例如催化氢化。
GPIIb/IIIa拮抗剂与寡糖偶联的先决条件是在正交反应结合基团的存在下，例如羧酸酯基团，它能直接偶联于寡糖残基或寡糖-间隔基衍生物或者通过间隔基与寡糖-间隔基衍生物偶联。为了在大多数情况下允许这样的偶联，GPIIb/IIIa拮抗剂的另外的修饰是必需的。
利用本领域公知的方法以各种各样的途径能实现式I的化合物的间隔基-衍生的构件的构建，或者通过一步一步导入氨基酸，它们的衍生物或肽模拟物的线性方式，或者以通过中间构建物的构件偶联的集合方式。
可以从反应混合物分离药学可接受盐形式的本发明的化合物。通过用下面的有机酸或无机酸处理式(I)的游离碱也可以获得药学可接受盐：例如盐酸，氢溴酸，氢碘酸，硫酸，磷酸，乙酸，丙酸，羟基乙酸，马来酸，丙二酸，甲磺酸，富马酸，琥珀酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，抗坏血酸等。
本发明的化合物可以具有手性碳原子，因此可以获得纯对映体，或对映体的混合物，或者是含有非对映体的混合物。获得纯旋光对映体的方法是本领域公知的，例如将从旋光活性酸和外消旋混合物获得的盐结晶，或者使用手性柱的色谱法。对于非对映体，可以使用正相或反相柱。
本发明的化合物可以口服或肠胃外给药。这些化合物和其组合物的精确剂量和给药方案必须根据要给之药物的个体的需要，病痛或需要的程度或者医师的判断。一般情况下，肠胃外给药要求比其他给药方法更低的剂量，更取决于吸收。然而，给人的日剂量优选是每千克体重0.0001-10毫克，更优选每千克体重0.001-1毫克。
用本发明的化合物制备的药物也可以作为(急性)抗凝血治疗的辅药来使用。在这样的情况下，药物和用于这样疾病的其他化合物一起给药，例如阿司匹林，氯吡格雷或斯特汀。
与例如标准参考书，Gennaro等，Remington′s PharmaceuticalSciences，(第18版，Mack Publishing Company，1990，具体参见Part8：Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture)中描述的药学上合适的辅助剂混合，化合物可以被压制成固体剂量单位，例如丸剂，片剂，或者被加工成胶囊或栓剂。利用药学上合适的液体，化合物可以以溶液，混悬剂，乳剂的形式应用，例如用作注射制剂，或者用作喷雾剂，例如用作鼻用喷雾剂。
为了制备单位剂量，例如，片剂，考虑到使用常规添加剂，例如填充剂，着色剂，聚合物粘合剂等等。一般情况下，可以使用不干扰活性化合物功能的任何药学可接受添加剂。
施用组合物的合适的载体包括乳糖，淀粉，纤维素衍生物等等，或者它们的混合物，以合适量使用。
通过下面的实施例进一步详细说明本发明。
实施例
使用的缩写
Aq.＝水溶液
Ala＝丙氨酸
Alloc＝烯丙氧羰基
Asp＝(L)-天冬氨酸
ATE＝抗凝血酶III
Bn＝苄基
Boc＝叔丁氧羰基
Bt＝苯并三唑
t-Bu＝叔丁基
DCM＝二氯甲烷
DiPEA＝N，N-二异丙基乙胺
DMAP＝N，N-二甲基氨基吡啶
DMF＝N，N-二甲基甲酰胺
EDC＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐
Et＝乙基
ESI＝电雾化电离
HPLC＝高效液相色谱
HOBt＝N-羟基苯并三唑
NMM＝N-甲基吗啉
Me＝甲基
MS＝质谱
Phe＝(L)-苯丙氨酸
sat.＝饱和
RT＝室温
TBTU＝2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐
TEA＝三乙胺
TFA＝三氟乙酸
THF＝四氢呋喃
Tos＝甲苯-4-磺酰基
TRAP＝凝血酶受体激动剂肽
Tyr＝L-酪氨酸
Z＝苄氧羰基
方案1
N-(4-氰基-苯甲酰基)-β-丙氨酸乙酯(2)
RT下将DCM(30毫升)中β-丙氨酸.HCl(2.81克，18.3毫摩尔)和4-氰基-苯甲酰氯(3.03克，18.0毫摩尔)悬浮液搅拌过夜。混合物用EtOAc稀释，用柠檬酸水溶液(3％)，饱和NaHCO3水溶液和H2O洗涤。干燥(MgSO4)并蒸发溶剂，得到化合物 2(2.52克，56％)。
N-(4-[1，2，4-氧杂二唑-5-啉基]-苯甲酰基)-β-丙氨酸乙酯(3)
将化合物 2(2.50克，10.2毫摩尔)溶解于EtOH(70毫升)。加入羟胺.HCl(0.99克，14.3毫摩尔)和Et3N(2.49毫升，17.3毫摩尔)并且将混合物在RT搅拌过夜。回流1.5小时之后反应完成。冷却沉淀出产物并浓缩(～10毫升)，过滤，用EtOH洗涤并真空干燥。
通过与吡啶(3×15毫升)共同蒸发，从羟基苯甲脒粗产物(2.8g，10毫摩尔)去除微量H2O，然后将其溶解于吡啶(100毫升)。加入氯甲酸乙酯(1.43毫升，15.0毫摩尔)，并且在回流温度下将混合物搅拌18小时。将反应物倒入H2O(200毫升)中止反应，接着用EtOAc(3×75毫升)萃取。将有机层干燥(MgSO4)并浓缩。用甲苯蒸发去除残留吡啶。重结晶(EtOAc/己烷)得到稍微带粉色的固体(2.48克，81％)。
N-(4-[1，2，4-氧杂二唑-5-啉基]-苯甲酰基)-β-丙氨酸(4)
化合物 3(0.60克，2.0毫摩尔)溶解于1，4-二烷/H2O(10毫升，1/1，v/v)的混合物中。加入NaOH水溶液(2.0毫升，2N)并且在RT下将混合物搅拌3小时。用Dowex H+中和反应混合物并过滤。减压浓缩滤液，并且在真空下干燥得到的白色固体。产率0.51克(93％)。
1-叠氮基-1-去氧-四甘醇(5)
将四甘醇(90克，0.46摩尔)冷却至0℃，并且加入10毫升水中氢氧化钠(3.0克，75毫摩尔)溶液，接着加入100毫升THF。将混合物剧烈搅拌30分钟。0℃下剧烈搅拌下缓慢加入50毫升THF中对-甲苯磺酰氯(8.8克，46毫摩尔)溶液以保持混合物均匀。
搅拌5小时之后，将混合物倒入400毫升水中。用DCM(4×20毫升)萃取溶液。合并的有机层用H2O(20毫升)和盐水(20毫升)洗涤并干燥(MgSO4)。过滤后减压去除溶剂，得到一甲苯磺酸酯油状物。
将粗产物溶解于EtOH(120毫升)和H2O(18毫升)的混合物。加入叠氮化钠(3.25克，50毫摩尔)并且将混合物在60℃下搅拌过夜。真空蒸发EtOH(50毫巴，50℃)并且加入150毫升EtOAc。溶液用盐水(20毫升)洗涤并且用MgSO4干燥。过滤之后减压去除溶剂(50毫巴，50℃)，得到叠氮化物 5，为油状物(6.25克，两步产率62％)。
15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(6)
将化合物 5(1.15克，5.25毫摩尔)溶解于甲苯(10毫升)。向溶液中加入50％氢氧化钠水溶液(12.5N，5毫升)，四丁基铵硫酸氢盐(0.34克，1.05毫摩尔)和溴乙酸叔丁酯(4.27毫升，26.3毫摩尔)。RT下剧烈搅拌悬浮液。3小时之后，混合物用EtOAc(10毫升)稀释，盐水(10毫升)，盐酸(2N，5毫升)和H2O(5毫升)洗涤。用EtOAc萃取含水层，然后将合并的有机层干燥(MgSO4)。浓缩之后，通过硅胶(20克)柱色谱法(洗脱剂：庚烷-EtOAc，1/0-0/1)纯化粗产物。将合适的级分浓缩，得到叠氮化物，为浅黄色油状物(1.25克，71％)。Rf 0.8(EtOAc/MeOH，95/5，v/v)。
在含有乙酸(0.2毫升)的EtOH(30毫升)中用10％Pd/C(100毫克)氢化将叠氮化物还原。4小时之后经两层Whatman GF/A滤纸过滤去除催化剂。将滤液浓缩，溶解于DCM(25毫升)，并且用Argonaut MP碳酸酯树脂去除乙酸。过滤去除树脂并蒸发溶剂，得到化合物 6，产率1.17克(100％)。
(N-苄氧羰基-L-苯丙氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(7)
化合物 6(3.60克，11.7毫摩尔)和Z-Phe-OH(3.51克，11.7毫摩尔)溶解于DCM(30毫升)。依次加入HOBt(1.39克，11.7毫摩尔)，EDC(2.83克，14.0毫摩尔)和TEA(3.38毫升，23.4毫摩尔)，并且将溶液搅拌过夜。用EtOAc(30毫升)稀释反应混合物并且用饱和NaHCO3水溶液(2×10毫升)，5％柠檬酸水溶液(10毫升)和H2O(10毫升)洗涤。将有机相干燥(MgSO4)并减压浓缩。用硅胶(75克)柱色谱法(洗脱剂：EtOAc-EtOAc/MeOH，95/5，v/v)纯化，得到化合物 7，为无色油状物(4.95克，72％)。Rf 0.5(EtOAc/MeOH，95/5，v/v)。
(L-苯丙氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(8)
将化合物 7(2.42克，4.11毫摩尔)溶解于含有乙酸(0.4毫升)的EtOH(100毫升)中，并且在10％Pd/C(0.1克)存在下在H2中搅拌。16小时之后，将混合物过滤并浓缩。反复在甲苯中浓缩产物来去除乙酸，并且在DCM(20毫升)中用Argonaut MP碳酸酯树脂(1.3克)处理。将树脂过滤并蒸发溶剂，得到化合物 8，为无色油状物(1.69克，90％)。Rf 0.05(EtOAc/MeOH，95/5，v/v)。
(N-叔丁氧羰基-O-苄基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(9)
根据较早时对化合物 7的合成所述，使用NMM(0.84毫升，7.4毫摩尔，pH 8.3)代替TEA，使化合物 8(1.69克，3.71毫摩尔)与Boc-AspBn-OH(1.20克，3.71毫摩尔)偶联。后处理之后，得到黄色油状物。用硅胶(50克)柱色谱法(洗脱剂：EtOAc/庚烷，2/1→EtOAc/MeOH，95/5，v/v)纯化，得到化合物 9，为无色油状物(2.30克，82％)。Rf 0.6(DCM/MeOH，9/1，v/v)。
(O-苄基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(10)
在EtOAc(10毫升)中用1.5N盐酸溶液处理Boc-保护的化合物9(1.09克，1.43毫摩尔)。RT下搅拌100分钟之后，将反应混合物冷却(0℃)，并且通过倒入饱和NaHCO3水溶液(15毫升)而中和。
用EtOAc(2×10毫升)萃取含水层，用H2O(10毫升)洗涤合并的有机层并干燥(MgSO4)。浓缩，得到粗产物 10，其不用纯化即可在下面的反应中使用。Rf 0.2(EtOAc/MeOH，95/5，v/v)。
({N-(4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯甲酰基)-β-丙氨酰}-O-苄基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(11)
将羧酸 4(0.12克，0.42毫摩尔)和胺 10(粗产物，最多0.40毫摩尔)溶解于DMF(5毫升)。依次加入HOBt(50毫克，0.42毫摩尔)，EDC(94毫克，0.50毫摩尔)和NMM(88微升，0.61毫摩尔)，并且将溶液搅拌过夜。用EtOAc和2-丁醇(10毫升，1/1，v/v)的混合物稀释棕色溶液，并且用3％柠檬酸(5毫升)，饱和NaHCO3(5毫升)和盐水(5毫升)萃取。连续用EtOAc萃取含水相，并且用MgSO4干燥合并的有机层。去除溶剂，得到粗产物化合物 11(0.27克，78％)，其不用纯化即可在下面的反应中使用。Rf 0.2(DCM/MeOH，9/1，v/v)。
({N-(4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯甲酰基)-β-丙氨酰}-O-苄基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸(12)
在DCM(5毫升)和TFA(3毫升)的混合物中搅拌化合物 11(0.2克，粗产物，最多0.22毫摩尔)。2小时之后将溶液浓缩并且反复在甲苯(3×5毫升)中浓缩去除残留的TFA。用制备HPLC-MS纯化产物，得到纯形式的化合物 12(0.11克，自第9步的三个步骤的产率是56％)。
({N-(4-[1，2，4-脒基苯甲酰基]-β-丙氨酰)-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰}-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(I)
将化合物 11(65毫克，粗产物，最多71微摩尔)溶解于EtOH(10毫升)，H2O(2毫升)和乙酸(0.1毫升)的混合物。加入10％Pd/C(50毫克)并且在H2气下将混合物搅拌过夜。通过两层Whatman GF/A滤纸过滤去除催化剂，并浓缩滤液。通过利用制备HPLC-MS获得纯的产物并冻干。产率7.7毫克(14％。ESI-MS：787[M+H]+。
间隔基-衍生的GPIIb/IIIa拮抗剂12，23，31，33，43，50，52，54，62与五糖63偶联的常规方法，参见方案8和9
间隔基-衍生的羧酸(33微摩尔)(即化合物12，23，31，33，43，50，52，54或62)通过与DMF(2×2毫升)共蒸发而干燥，溶解于DMF(1毫升)，并在TBTU(10.5毫克，33微摩尔)和DiPEA(5.7微升，33微摩尔)存在下，在N2气下搅拌。1小时之后，加入包含氨基间隔基的五糖 63(56毫克，31微摩尔)。
RT下将反应混合物搅拌过夜，并且通过离子交换(Mono-Q)和反相(LunaC18)色谱法进行分析。五糖被完全消耗完之后，将反应混合物浓缩(＜50℃，15mmHg)。
用10％Pd/C(就粗产物来说加入等重量)将(粗)产物(10毫克/毫升，H2O)氢化去保护(H2)。16小时之后将溶液脱气，经0.45μM HPLC过滤器过滤并减压浓缩(＜50℃，15mmHg)。通过离子交换色谱将偶联物纯化(Q-琼脂糖凝胶，缓冲剂：H2O→2M NACl)，接着用SephadexG25-柱(H2O)脱氧并冻干。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-{({N-(4-脒基苯甲酰基)-β-丙氨酰}-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸)-(15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰)-(1-氮杂-4，7，10-三氧杂十二烷基)}-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-0-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八钠盐(II)
Figure A20058000700200201
根据常规方法偶联 12(21.4毫克，24.8微摩尔)和五糖 63(42.4毫克，23.6微摩尔)，纯化并去保护，获得产物，为白色固体，产率34毫克(42％，2步骤)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)：δ3.38-3.32(8x s，34H，8x OMe)；ring D：5.36(d，1H，H1)，4.18(m，1H，H6a)，4.04(d，1H，H6b)，3.80(m，1H，H5)，3.47(m，1H，H3)，3.27(dd，1H，H2)；ring E：4.59(d，1H，H1)，3.82(m，1H，H4)，3.62(m，1H，H5)，3.45(m，1H，H3)，3.15(m，1H，H2)；ring F：5.27(d，1H，H1)，4.49(t，1H，H3)，4.33(d，1H，H6a)，4.20(m，1H，H2)，4.08(m，1H，H6b)，3.86(t，1H，H4)；ring G：4.92(bs，1H，H1)，4.54(d，1H，H5)，4.07(m，1H，H4)，3.74(1H，dd，H3)，3.37(m，1H，H2)；ring H：4.99(d，1H，H1)，4.25(m，1H，H2)，4.22(m，1H，H6a)，4.17(dd，1H，H6b)，3.92(ddd，1H，H5)，3.66(t，1H，H4)，3.58(m，1H，H3)；间隔基：3.96(s，2H，C(O)CH2O)，3.62-3.51(m，26H，13x CH2O)，3.33-3.30(m，4H，OCH2CH2NHCH(O)CH2，OCH2CH2NHC(O)-Phe)，3.25(m，1H，OCH2aCH2NHC(O)-Phe)，3.17(m，1H，OCH2bCH2NHC(O)-Phe)；肽：7.84(d，2H，Harom苯甲脒)，7.79(d，2H，Harom苯甲脒)，7.25(t，2H，HaromPhe)，7.20(t，1H，HaromPhe)，7.09(d，2H，HaromPhe)，4.51(dd，1H，CH Asp)，4.38(t，1H，CH Phe)，3.60(m，2H，CH2N β-Ala)，2.83(dAB，2H，CH2Phe)，2.52(t，2H，C(O)CH2β-Ala)，2.44(dAB，2H，CH2Asp)。ESI-MS：计算值：2511.4；实测值：m/z 1267.9[M+H+Na]2+，1256.9[M+2H]2+，1245.9[M+2H-Na]2+，852.9[M+H+2Na]3+，845.5[M+2H+Na]3+，838.3[M+3H]3+，639.9[M+2H+2Na]4+，1232.8[M-2Na]2-，1221.7[M-3Na+H]2-，1210.8[M-4Na+2H]2-，1199.8[M-5Na+3H]2-，814.1[M-3Na]3-。
方案1.I和II的合成
方案2
4-(叔丁氧羰基氨基)-苯甲腈(14)
75℃下，在THF(50毫升)和吡啶(4毫升)的混合物中搅拌4-氨基苯甲腈( 13，2.95克，25毫摩尔)和二碳酸二叔丁酯(8.0毫升，35毫摩尔)。16小时之后，将红色反应混合物冷却，用EtOAc(30毫升)稀释，并且用盐酸(1N，15毫升)，饱和NaHCO3水溶液(15毫升)和盐水(15毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并浓缩。通过硅胶(75克)柱色谱法(洗脱剂：EtOAc/庚烷，1/5→1/2，v/v)纯化深棕色油状物，得到化合物 14，为橙色油状物(3.25克，60％)，含有～30％双-Boc保护产物。后者混合物不用进一步纯化即可在下面的反应中使用。
4-(1，2，4-二唑-5-啉基)-苯胺(16)
根据较早对化合物 3的制备所描述的，将化合物 14(3.25克，14.9毫摩尔)转化为二唑啉 15。在DCM(15毫升)和TFA(8毫升)的混合物中将得到的粗产物浅橘色固体搅拌5小时。减压浓缩并与甲苯(2×10毫升)蒸发，得到棕色固体，其通过硅胶(40克)柱色谱法(洗脱剂：EtOAc)纯化，得到化合物 16(1.81克，经三个步骤69％)。Rf 0.5(EtOAc)。
N-[4-(1，2，4-二唑-5-啉基)-苯基]-琥珀酰胺酸(17)
将苯胺衍生物 16(0.89克，5.0毫摩尔)溶解于吡啶(25毫升)。和4-N，N，-二甲基氨基吡啶(63毫克，0.5毫摩尔)一起加入琥珀酸酐(0.75克，7.5毫摩尔)，并且在100℃下将混合物搅拌过夜。减压浓缩溶液，淡棕色固体从EtOH/MeOH/H2O(60毫升，5/35/1，v/v/v)的混合物中重结晶。过滤之后，将母液浓缩至10毫升，得到羧酸 17固体，其在50℃真空下干燥16小时。产率1.28克(92％)。Rf0.3(DCM/MeOH/AcOH，100/10/1，v/v/v)。
(N-叔丁氧羰基-O-苄基-L-天冬氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(18)
将化合物 6(0.94克，3.1毫摩尔)和Boc-AspBn-OH(0.99克，3.1毫摩尔)溶解于DCM(8毫升)。依次加入HOBt(0.36克，3.1毫摩尔)，EDC(0.74克，3.8毫摩尔)和NMM(0.34毫升，6.2毫摩尔)，并且将溶液搅拌过夜。用EtOAc(10毫升)稀释反应混合物并且用饱和NaHCO3水溶液(2×5毫升)，5％柠檬酸水溶液(5毫升)和H2O(5毫升)洗涤。将有机相干燥(MgSO4)并减压浓缩。用硅胶(20克)柱色谱法(洗脱剂：EtOAc/庚烷，3/1→1/0，v/v)进行纯化，得到化合物 18，为无色油状物(1.15克，61％)。Rf 0.7(EtOAc/MeOH，95/5，v/v)。
(O-苄基-L-天冬氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(19)
根据较早时对化合物 10的合成所描述的相同的反应条件和处理步骤，在45分钟内处理化合物 18(0.51克，0.83毫摩尔)。产物 19不用进一步纯化即可在下面的反应中使用。
N-{[4-(1，2，4-二唑-5-啉基)-苯基]-琥珀酰氨酰-(O-苄基-L-天冬氨酰)}-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(20)
根据较早对 11的合成所描述的，将化合物 17(0.30毫摩尔)和 19(0.30毫摩尔)偶联。粗产物 20(0.17克，75％)不用进一步纯化即可在下面的反应中使用。Rf 0.3(DCM/MeOH，9/1，v/v)。
N-{(4-苯甲脒基)-琥珀酰氨酰}-L-天冬氨酰-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(III)
在EtOH/H2O/AcOH的混合物中将 20(32毫克，41微摩尔)催化氢化。过滤，浓缩并通过制备HPLC-MS纯化，得到间隔基衍生物III，为白色固体。产率20毫克(77％)。ESI-MS：640[M+H]+。
N-[4-(1，2，4-二唑-5-啉基)-苯基]-琥珀酰氨酰-(O-苄基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(22)
根据较早对化合物 11的合成所描述的，将二唑啉 17(24毫克，88微摩尔)和粗产物胺 10最多58毫克，88微摩尔)偶联。粗产物 22不用进一步纯化即可在下面的反应中使用。Rf 0.6(DCM/MeOH，9/1，v/v)。
N-[4-(1，2，4-二唑-5-啉基)-苯基]-琥珀酰氨酰-(O-苄基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(23)
在DCM(1.0毫升)和TFA(1.0毫升)的混合物中搅拌粗产物化合物22(最多88微摩尔)。2小时之后，将溶液浓缩，并且通过制备HPLC将产物纯化。将合适的级分浓缩得到化合物 23，产率31毫克(最后三步的产率41％)。
N-{(4-苯甲脒基)-琥珀酰氨酰}-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(IV)
通过在EtOH(7毫升)和H2O(1毫升)的混合物中经10％Pd/C(50毫克)催化氢化将粗产物化合物 22(最多80毫克，87微摩尔)去保护。24小时之后，将混合物过滤并浓缩，并通过制备HPLC将粗产物纯化。冻干后分离白色泡沫状化合物IV，产率10.5毫克(15％)。ESI-MS：787[M+H]+。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-{[N-(4-苯甲酰氨基)-琥珀酰胺酰]-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸}-(15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰)-(1-氨基-4，7，10-三氧杂十二烷基)}-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八钠盐(V)
将羧酸 23(30.0毫克，34.8微摩尔)与五糖 63(59.4毫克，56.4微摩尔)偶联，接着根据常规方法进行纯化和去保护。获得偶联物V，为白色固体，产率37.5毫克(48％，2步骤)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)：δ3.43-3.32(8x s，34H，8x OMe)；ring D：5.36(d，1H，H1)，4.21(m，1H，H6a)，4.05(d，1H，H6b)，3.79(m，1H，H5)，3.48(m，1H，H3)，3.33(m，1H，H4)，3.20(dd，1H，H2)；ring E：4.58(d，1H，H1)，3.79(m，1H，H4)，3.65(m，1H，H5)，3.48(m，1H，H3)，3.15(m，1H，H2)；ring F：5.26(d，1H，H1)，4.48(t，1H，H3)，4.32(d，1H，H6a)，4.22(m，1H，H6b)，4.15(dd，1H，H2)，4.08(m，1H，H5)，3.84(t，1H，H4)；ring G：4.98(bs，1H，H1)，4.55(d，1H，H5)，4.07(m，1H，H4)，3.73(1H，dd，H3)，3.37(m，1H，H2)；ring H：4.98(d，1H，H1)，4.25(dd，1H，H2)，4.21(m，1H，H6a)，4.17(m，1H，H6b)，3.92(ddd，1H，H5)，3.66(t，1H，H4)，3.58(m，1H，H3)；间隔基：3.96(s，2H，C(O)CH2O)，3.61-3.51(m，26H，13x CH2O)，3.38-3.30(m，4H，OCH2CH2NHCH(O)CH2，OCH2CH2NHC(O)-Phe)，3.19(m，1H，OCH2aCH2NHC(O)-Phe)，3.12(m，1H，OCH2bCH2NHC(O)-Phe)；肽：7.69(d，2H，Harom苯甲脒)，7.63(d，2H，Harom苯甲脒)，7.25(t，2H，HaromPhe)，7.20(t，1H，HaromPhe)，7.09(d，2H，HaromPhe)，4.44(dd，1H，CH Asp)，4.38(t，1H，CH Phe)，2.90(dAB，2H，CH2Phe)，2.75(m，2H，CH2琥珀酰)，2.55(m，2H，CH2琥珀酰)，2.43(dAB，2H，CH2 Asp)。ESI-MS：计算值：2511.4；实测值：m/z 1267.8[M+H+Na]2+，1256.8[M+2H]2+，1245.8[M+2H-Na]2+，852.8[M+H+2Na]3+，845.5[M+2H+Na]3+，838.2[M+3H]3+，639.9[M+2H+2Na]4+，1232.7[M-2Na]2-，1221.7[M-3Na+H]2-，1210.7[M-4Na+2H]2-，1199.7[M-5Na+3H]2-，814.1[M-3Na]3-。
方案2.III和IV的合成
Figure A20058000700200271
方案3
N-3-[4-(N-叔丁氧羰基)-哌啶丙酰]-(R)-(-)-3-哌啶甲酸乙酯(26)
在DCM(20毫升)中将3-(N-Boc-哌啶基)-丙酸( 24，1.00克，3.89毫摩尔)，TBTU(1.38克，4.28毫摩尔)和DiPEA(2.70毫升，15.6毫摩尔)的混合物搅拌5分钟。接着，加入(R)-3-哌啶甲酸乙酯(L)-酒石酸盐(25，0.61克，3.89毫摩尔)，并且将溶液搅拌2小时。反应用5％NaHCO3水溶液中止(20毫升)，用3％柠檬酸水溶液(20毫升)和H2O(20毫升)洗涤。用DCM(3×10毫升)萃取含水相并且干燥合并的有机层(MgSO4)。得到化合物 26(2.34克)，为棕-微黄色油状物，其不用进一步纯化即可在下面的反应中使用。Rf 0.7(EtOAc/MeOH，93/7，v/v)。
N-3-[4-(N-苄氧羰基)-哌啶丙酰基]-(R)-(-)-3-哌啶甲酸乙酯(28)
在DCM(10毫升)和TFA(10毫升)的混合物中搅拌粗产物化合物26(最多3.89毫摩尔)。1小时之后，减压浓缩溶液。在甲苯(3×10毫升)中反复浓缩去除痕量TFA。接着，将粗产物衍生物 27溶解于DCM(10毫升)，接着加入DiPEA(2.02毫升，11.7毫摩尔)和(N)-苄氧羰基-琥珀酰亚胺(1.94克，7.79毫摩尔)。搅拌过夜之后，用EtOAc(20毫升)稀释反应混合物，用饱和NaHCO3水溶液(10毫升)，3％柠檬酸水溶液和H2O(10毫升)洗涤。用MgSO4干燥有机层并浓缩，得到Z-保护的化合物 28，为无色油状物(1.37克，三个步骤的产率是82％)。Rf 0.5(EtOAc)。
N-3-[4-(N-苄氧羰基)-哌啶丙酰基]-(R)-(-)-3-哌啶甲酸(29)
将1，4-二烷(20毫升)和0.5M NaOH(20毫升)中化合物 28(0.35克，3.14毫摩尔)的溶液搅拌1小时。用Dowex 50WX4-H+离子交换中和，过滤并浓缩，得到羧酸衍生物 29，为微黄色油状物(1.27克，100％)。Rf 0.05(EtOAc)。
{N-3-[4-(N-苄氧羰基)-哌啶丙酰]-(R)-(-)-3-哌啶甲酰}-(O-苄基-L-天冬氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(30)
将化合物 29(0.24克，0.60毫摩尔)和粗产物 19(最多0.60毫摩尔)的混合物，与EDC(0.14克，0.72毫摩尔)和NMM(90微升，0.78毫摩尔)一起在DCM(5毫升)中搅拌5小时。用DCM(10毫升)稀释溶液并且用饱和NaHCO3水溶液(10毫升)，3％柠檬酸水溶液和H2O(10毫升)洗涤。将有机相用MgSO4干燥并浓缩。粗产物 30通过硅胶(5克)柱色谱法(洗脱剂：EtOAc/庚烷/MeOH，2/1/0→9/0/1，v/v/v)纯化。产率0.29克(53％)。Rf 0.6(EtOAc/MeOH，7/1，v/v)。
{N-3-[4-(N-苄氧羰基)-哌啶丙酰]-(R)-(-)-3-哌啶甲酰}-(O-苄基-L-天冬氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸(31)
在DCM(5毫升)和TFA(5毫升)的混合物中搅拌化合物 30(0.29克，0.32毫摩尔)。3小时之后，将混合物浓缩并反复用甲苯蒸发(3×10毫升)。通过制备HPLC纯化产物，得到 31，产率0.23克(86％)。
{N-3-[4-(N-苄氧羰基)-哌啶丙酰]-(R)-(-)-3-哌啶甲酰}-(O-苄基-L-天冬氨酰)-L-苯丙氨酰-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(32)
将化合物 29(0.17克，0.42毫摩尔)和粗产物 10(0.25克，最多0.38毫摩尔)溶解于DCM(5毫升)。依次加入HOBt(59毫克，0.46毫摩尔)，EDC(94毫克，0.49毫摩尔)和NMM(88微升，0.63毫摩尔)，并且将溶液搅拌过夜。用EtOAc(10毫升)稀释反应混合物并且用饱和NaHCO3水溶液(2×5毫升)，5％柠檬酸水溶液(5毫升)和H2O(5毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩。通过硅胶(5克)柱色谱法(洗脱剂：DCM/MeOH，1/0→95/5，v/v)进行纯化，得到化合物 32，为无色油状物(0.24克，60％)。Rf 0.3(DCM/MeOH，95/5，v/v)。
{N-3-[4-(N-苄氧羰基)-哌啶丙酰]-(R)-(-)-3-哌啶甲酰}-(O-苄基-L-天冬氨酰)-L-苯丙氨酰-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸(33)
将化合物 32(0.20克，0.19毫摩尔)去保护，并且根据较早对化合物 31的合成所描述的进行纯化。产率50毫克(30％)。
{N-3-[4-(N-苄氧羰基)-哌啶丙酰]-(R)-(-)-3-哌啶甲酰}-O-苄基-L-天冬氨酸叔丁酯(34)
向DCM(5毫升)中化合物 29(0.69克，1.72毫摩尔)和AspBa-O-t-Bu酯(0.54克，1.72毫摩尔)的搅拌的混合物加入TBTU(0.58克，1.80毫摩尔)和DiPEA(0.90毫升，5.4毫摩尔)。2小时之后，用EtOAc(10毫升)稀释反应混合物，并且用饱和NaHCO3水溶液(2×5毫升)，5％柠檬酸水溶液(5毫升)和H2O(5毫升)洗涤。将有机层用MgSO4干燥并减压浓缩。通过硅胶(25克)柱色谱法(洗脱剂：EtOAc/庚烷，1/2→1/0，v/v)进行纯化，得到化合物 34，为浅黄色油状物(0.84克，73％)。Rf 0.6(EtOAc)。
N-{[N-3-(4-哌啶丙酰)-(R)-(-)-3-哌啶甲酰]-L-天冬氨酰}-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(VII)
Figure A20058000700200301
在EtOH(5毫升)和H2O(1毫升)的混合物中用10％Pd/C(30毫克)催化氢化，将化合物 31(35毫克，39微摩尔)去保护。16小时之后，将混合物通过两层Whatman GF/C滤纸过滤并浓缩。分离化合物VII，冻干后为白色泡沫状物质，产率24毫克(92％)。ESI-MS：673[M+H]+。
N-{[N-3-(4-哌啶丙酰)-(R)-(-)-3-哌啶甲酰]-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰}-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(IX)
Figure A20058000700200302
如较早对化合物VII的合成所描述的，将化合物 32(45毫克，43微摩尔)去保护。经制备HPLC和冻干，得到纯IX，产率8.8毫克(26％)。ESI-MS：820[M+H]+。
1-{N-3-(4-哌啶丙酰)-(R)-(-)-3-哌啶甲酰}-L-天冬氨酸(VI)
通过在DCM(5毫升)和TFA(5毫升)的混合物中搅拌，将化合物34(47毫克，71微摩尔)去保护。5小时之后将混合物浓缩并反复用甲苯(3×5毫升)蒸发。粗产物中间体在1，4-二烷(5毫升)和H2O(5毫升)的混合物中经10％Pd/C(30毫克)催化氢化。3小时之后，混合物经两层Whatman GF/C滤纸过滤，接着用MeOH洗涤。浓缩滤液并通过制备HPLC纯化，得到纯化合物VI，冻干后为白色泡沫物，总产率9.8毫克(39％)。ESI-MS：384[M+H]+。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-{[N-3-(4-哌啶丙酰)-(R)-(-)-3-哌啶甲酰-(L)-天冬氨酰]-(15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰)-(1-氮杂-4，7，10-三氧杂十二烷基)}-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八钠盐(VIII)
根据常规程序中描述的，将羧酸衍生物 31(51毫克，59微摩尔)与五糖衍生物 63(105毫克，56微摩尔)偶联，接着将粗产物去保护并纯化。冻干之后获得纯的化合物VIII。产率101毫克(两步骤总的产率76％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY，旋转异构体混合物)：δ5.39(d，1H，H-1ring D)，5.31(bs，1H，H-1ring F)，5.00(d，1H)，4.95(bs，1H)，4.61(bs，1H)，4.59(d，1H)，4.50(m，1H)，4.34(d，1H)，4.27-4.20(m，7H)，4.19-4.15(m，2H)，4.10-4.03(m，3H)，4.02(s，2H CH2Ac间隔基)，3.92(ddd，1H)，3.88(ddd，1H)，3.86-3.75(m，7H)，3.71(dd，1H)，3.69-3.52(m，38H)，3.49-3.43(m，14H)，3.40-3.30(m，12H)，3.26-3.11(m，4H)，2.96-2.89(m，3H)，2.77(m，1H)，2.68(m，1H)。
ESI-MS：计算值：2397.4；实测值：m/z 1221.6[M+2Na]2+，1210.6[M+H+Na]2+，1199.6[M+2H]2+，822.1[M+3Na]3+，814.8[M+2H+Na]3+，807.4[M+H+2Na]3+，1175.7[M-2Na]2-，1164.7[M-3Na+H]2-，1153.8[M-4Na+2H]2-，776.2[M-3Na]3-，768.9[M-4Na+H]3-，761.5[M-3Na+H]3-，570.9[M-5Na+H]4-，576.4[M-4Na]2-，456.5[M-5Na]5-。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-{[N-3-(4-哌啶丙酰)-(R)-(-)-3-哌啶甲酰-(L)-天冬氨酰-(L)-苯丙氨酰]-(15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰)-(1-氮杂-4，7，10-三氧杂十二烷基)}-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八钠盐(X)
Figure A20058000700200331
根据常规程序中描述的，将化合物 33(32.4毫克，32.8微摩尔)与五糖衍生物 63(56.0毫克，31.2微摩尔)偶联，接着去保护并纯化。获得产物X，为白色粉末。产率49毫克(两步骤总的产率62％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY，1∶1旋转异构体混合物)：δ7.32-7.19(m，5H，H-aromPhe)，5.39(d，1H，H-1ring D)，5.29(d，1H，H-1ring F)，4.99(d，1H)，4.93(bs，1H)，4.59(d，1H)，4.53(s，1H)，4.50-4.43(m，3H)，4.33(d，1H)，4.26-4.15(m，8H)，4.13-4.08(m，3H)，4.06-4.02(d，1H)，3.98(d，1H CH2Ac间隔基)，3.94-3.78(m，9H)，3.74(bs，1H)，3.68-3.52(m，38H)，3.50-3.42(m，14H)，3.38-3.30(m，12H)，3.27-2.85(m，6H)，2.80-2.70(m，2H)。ESI-MS：计算值：2546.4；实测值：m/z 1273.2[M+2H]2+，1284.2[M+H+Na]2+，1295.2[M+2Na]2+，856.5[M+2H+Na]3+，863.8[M+H+2Na]3+，871.1[M+3Na]3+，1238.3[M+H-3Na]2-，1227.3[M+2H-4Na]2-，1216.3[M+3H-5Na]2-，825.2[M-3Na]3-，817.9[M-4Na+H]3-，810.5[M-5Na+2H]3+，803.2[M-6Na+3H]3-，613.1[M-4Na]4-，607.7[M-5Na+H]4-，485.9[M-5Na]5-，401.1[M-6Na]6-。
方案3.VI，VII和IX的合成
Figure A20058000700200341
方案4
N-(4-[1，2，4-戊二唑-5-啉基]-苯基-琥珀酰氨酰-O-苄基-L-天冬氨酸(36)
N2气下相搅拌的化合物 17(1.0克)的DMF(35毫升)溶液加入，NMM(351微升)，接着加入氯甲酸异丁酯(440微升)。5分钟之后加入Asp(Bn)(tBu)(1.12克)，接着加入DiPEA(586微升)和DMAP(7.8毫克)。1小时之后加入H2O，并且用EtOAc萃取混合物(两次)。用饱和NaCl溶液洗涤有机层，用MgSO4干燥并减压浓缩。加入甲苯，然后沉淀出产物 35。加入庚烷并将产物过滤，产率55％。Rf＝0.5(DCM/MeOH/AcOH9∶1∶0，1)。
向 35(843毫克)加入DCM和TFA(40毫升，1∶1，v/v)的混合物并且搅拌3小时。然后加入甲苯浓缩混合物，定量得到 36。Rf 0.2(Tol/EtOH 8∶2，v/v)。
N-烯丙氧羰基-L-酪氨酸(38)
经20分钟，向冰浴中冷却的搅拌的4N氢氧化钠水溶液(30毫升)中酪氨酸(10克)的溶液缓慢加入氯甲酸烯丙酯(6.4毫升)。加完10分钟之后移去冰浴，并加入4N氢氧化钠水溶液(30毫升)和H2O(5毫升)。RT下反应2小时后加入MeOH(60毫升)。又反应2小时后用Et2O萃取反应混合物。在冰浴上将含水的混合物冷却，用36-38％盐酸酸化至pH 2-3，并用EtOAc萃取。
将有机萃取液干燥(Na2SO4)并减压浓缩，得到AllocTyr-OH(38)油状物(14.5克，88％)。Rf 0.35(DCM/MeOH/AcOH，89/10/1，v/v/v)。N-烯丙氧羰基-4-O-苄基-L-酪氨酸(39)
将Alloc-Tyr-OH(38，5.5克)溶解于DMF(40毫升)，减压下去除一半体积的DMF。N2气下将残余物冷却至0℃并小批次加入氢化钠(60％分散，1.9克)。0℃下将悬浮液搅拌1小时。然后加入苄基溴(1.88毫升)的DMF(5毫升)溶液。RT下1小时后加入2N盐酸(7毫升)，减压浓缩反应混合物。向残余物加入水H2O(50毫升)，用2N氢氧化钠水溶液将pH调至9，用甲苯和EtOAc的混合物洗涤。加入EtOAc，并用2N盐酸将混合物酸化至pH 3。分离有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩。应用硅胶柱色谱法(DCM/MeOH/AcOH，89/10/1，v/v/v)纯化残余物。将从柱中得到的产物溶解于EtOAc，用H2O洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到化合物 39(4.66克，77％)。Rf 0.5(DCM/MeOH/AcOH，89/10/1，v/v/v)。
(N-烯丙氧羰基-4-O-苄基-L-酪氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂十五烷酸叔丁酯(40)
向搅拌的alloc-Tyr(Bn)-OH( 39，0.61克)和15-氨基-3，6，9，12-四氧杂-十四烷酸叔丁酯(6)(0.54克)的THF(2毫升)溶液加入TBTU(0.7克)和NMM(0.38毫升)。16小时后加入15-氨基-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁酯(6)(0.18克)，TBTU(0.1克)，用NMM将pH调至7湿pH-试纸)。三天之后将反应混合物过滤并减压浓缩滤液。用硅胶柱色谱(EtOAc/庚烷/EtOH，65/33/2to50/0/1，v/v/v)纯化残余物，得到标题化合物 40(0.7克，67％)。Rf 0.25(EtOAc/庚烷/EtOH，66/33/1，v/v/v)。
15-N-(4-O-苄基-L-酪氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂十五烷酸叔丁酯(41)
向搅拌的化合物 40(0.43克)的DCM(15毫升)溶液加入H2O(75微升)，氢化三丁基锡(0.4毫升)和PdCl2(PPh3)2(12毫克)。通过TLC检测反应(EtOAc/乙醇，25/1，v/v)。反应完成后将反应混合物冷却至0℃，加入H2O(10毫升)，用2N盐酸酸化至pH 4。分离有机层，干燥(Na2SO4)并减压浓缩。用硅胶柱色谱法纯化残余物(梯度洗脱：DCM/MeOH，95/5至DCM/MeOH/N-甲基吗啉，450/50/3)，得到标题化合物 41(0.36克，78％)。Rf 0.4(DCM/MeOH，10/1，v/v)。
15-N-{4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯基-琥珀酰胺酰-(O-苄基-L-天冬氨酰)-(4-O-苄基-L-酪氨酰)}-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸(43)
将化合物 41(360毫克，0.49毫摩尔)和 36(241毫克，0.5毫摩尔)溶解于THF(5毫升)。向该混合物加入NMM(108微升，0.98毫摩尔)后加入TBTU。将混合物搅拌过夜。在PVDF(0.45微米)滤纸上过滤溶液。通过硅胶柱色谱法进行纯化(洗脱剂：DCM-4DCM/MeOH，95/5，v/v)，得到化合物 42油状物(560毫克，100％)。Rf 0.5(DCM/MeOH，9/1，v/v)。根据对化合物 12的制备所描述的进行化合物水解。通过硅胶柱色谱法进行纯化(DCM/MeOH/AcOH，90/10/3，v/v/v)，得到化合物 43(185毫克，39％)。
1H-NMR(MeOD，400MHz)：7.70(AB，4H，Harom苯甲脒)，7.32(m，10H，Bn)，7.12(d，2H，Tyr)，6.88(d，2H，Tyr)，5.10(d，2H，CH2 Bn)，5.00(s，2H，CH2苄基)，4.67(m，1H)，4.48(m，1H)，4.06(s，2H)，3.61(m，10H)，3.52(m，2H)，3.41(m，2H)，3.32(m，2H)，3.10-2.40(m，8H)。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-＜12-[15-{N-(4-苯甲酰氨基)-琥珀酰胺酰-(L-天冬氨酰-L-酪氨酰)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰}]-12-氮杂-3，6，9-三氧杂十二烷基＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八钠盐(XI)
根据常规程序中描述的，将化合物 43(62.2毫克)与五糖衍生物 63(110毫克)偶联，接着去保护并纯化。获得产物22毫克(两步骤总的产率14％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)：δ3.54-3.30(8x s，34H，8xOMe)；ring D：5.28(d，1H，H1)，4.14(m，1H，H6a)，3.97(m，1H，H6b)，3.72(m，1H，H5)，3.37(m，1H，H3)，3.24(m，1H，H4)，3.12(m，1H，H2)；ring E：4.50(d，1H，H1)，3.73(m，3H，H3，4，5)，3.16(m，1H，H2)；ring F：5.16(d，1H，H1)，4.39(m，2H，H3，4)，4.24(d，1H，H6a)，4.14(m，1H，H6b)，4.00(m，1H，H2)，3.97(m，1H，H5)；ring G：4.84(bs，1H，H1)，3.97(m，1H，H4)，3.66(m，2H，H2，3)；ring H：4.91(d，1H，H1)，4.14(m，2H，H2，6a)，4.08(m，1H，H6b)，3.84(m，1H，H5)，3.51(m，1H，H3)；间隔基：3.88(s，2H，C(O)CH2O)，3.54-3.24(m，32H)肽：7.59(d，2H，Harom苯甲脒)，7.53(d，2H，Harom苯甲脒)，6.84(d，2H，HaromTyr)，6.63(d，2H，HaromTyr)，4.38(dd，1H，CH Asp)，4.21(t，1H，CH Tyr)，2.70(m，2H，CH2Tyr)，2.47(m，1H，CH2 Asp)，2.30(dd，1H，CH2 Asp)，2.74-2.40(m，4H，琥珀酰)。
方案4.XI的合成
方案5
15-羟基-3，6，9，12-四氧杂-十四烷酸叔丁酯(44)
向搅拌的四甘醇(40毫升)和THF(15毫升)的混合物加入叔丁醇钾(2.8克)。将反应混合物加热至40-50℃，直到获得澄清溶液。将该溶液冷却至0℃，一次加入溴乙酸叔丁酯(4毫升，246毫摩尔)。移去冷却浴并在RT下将反应混合物搅拌2小时。用EtOAc稀释并用盐水洗涤两次。用EtOAc将两次得到的盐水层萃取两次。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并减压浓缩，得到化合物 44(4.66克)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ4.03(s，2H)，3.60-3.76(m，16H)，1.47(s，9H).。
14-(甲苯-4-磺酰基氧)-3，6，9，12-四氧杂-十四烷酸叔丁酯(45)
0℃下，向搅拌的化合物44(4.66克)的DCM(30毫升)溶液加入NMM(2毫升)和对甲苯磺酰氯(3.2克)。移开冷却浴，在RT下将反应混合物搅拌18小时。加入盐水，用DCM萃取混合物三次。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并减压浓缩，得到油状物(7.4克)，该油状物仍然含有起始物。将该油状物再次溶解于DCM(30毫升)和NMM(2毫升)并加入对甲苯磺酰氯(3.2g克)，0℃下搅拌溶液。室温下反应2天之后加入盐水，用DCM萃取混合物三次。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并减压浓缩。用硅胶柱色谱法(EtOAc/庚烷，1/1，v/v)纯化粗产物，得到化合物 45(4.6克，66％)。Rf 0.15(EtOAc/庚烷1/1，v/v)。
14-[4-O-(N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸苯甲酯)]-3，6，9，12-四氧杂-十四烷酸叔丁酯(47)
N2气下在70℃下加热搅拌的Boc-Tyr-OBn(46，0.6克)，化合物 45(1.0克)，碳酸铯(0.82克)和碘化钠(0.12克)在DMF(30毫升)中的混合物。20小时之后将反应混合物冷却至RT并加入盐水。用EtOAc萃取混合物(四次)。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并减压浓缩。用硅胶色谱柱法纯化粗产物(EtOAc/甲苯，梯度1/2至1/1，v/v)，得到化合物 47(0.92克，80％)。Rf 0.15(EtOAc/庚烷，1/1，v/v)。
14-＜4-O-{4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯基-琥珀酰胺酰-(O-苄基-L-天冬氨酰)-L-酪氨酸苄酯}＞-3，6，9，12-四氧杂-十四烷酸叔丁酯(49)
0℃下，向搅拌的乙酸叔丁酯(4毫升)中化合物 47(0.42克)的混合物中加入4N盐酸二烷(2毫升)溶液。2小时之后加入硫酸(0.04毫升)，半小时后加入另一部分硫酸(0.04毫升)。又半小时后，加入饱和碳酸氢钠水溶液，并用EtOAc萃取混合物四次。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并减压浓缩，得到化合物 48(0.14克)。将该化合物溶解于THE(2毫升)，并向该搅拌的溶液加入化合物 36(0.11克)，TBTU(84毫克)和30微升NMM。2小时后将反应混合物减压浓缩。用硅胶色谱法纯化残余物(EtOAc/EtOH，梯度1/0至9/1，v/v)，得到化合物 49(90毫克，36％)。Rf 0.5(EtOAc/EtOH 9/1，v/v)。
14-＜4-O-{4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯基-琥珀酰胺酰-(O-苄基-L-天冬氨酰)-O-苄基-L-酪氨酸苄酯}-3，6，9，12-四氧杂-十四烷酸(50)
将化合物 49(90毫克)溶解于二烷并减压浓缩。将残余物溶解于DCM(1毫升)并加入TFA(1毫升)。2小时之后加入二烷(5毫升)，并减压浓缩混合物。残余物溶解于乙腈并减压浓缩。用HPLC纯化残余物：柱子LUNA 10u C18(2)250×50毫米，流速50毫升/分钟，梯度3％0.1N TFA的H2O水溶液，47％乙腈和50％H2O/乙腈(10/1，v/v)至3％0.1N TFA的H2O溶液，90％乙腈和7％H2O/乙腈(10/1v/v)，30分钟内，得到化合物 50(73毫克，85％)。MS(EI)：m/z 970[M+H]+。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-＜12-[14-{N-(4-苯甲酰氨基)-琥珀酰胺酰-(L-天冬氨酰-4-O-L-酪氨酰)-3，6，9，12-四氧杂-十四烷酰}]-12-氮杂-3，6，9-三氧杂十二烷基＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八钠盐(XII)
根据常规程序，将化合物 50(40.3毫克，41.5微摩尔)与五糖衍生物 63(71.1毫克，39.5微摩尔)偶联，接着纯化并去保护，获得产物，为白色蓬松状固体，产率63.5毫克(两步骤总的产率60％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)：δ3.43-3.32(8x s，34H，8x OMe)；ring D：5.36(d，1H，H1)，4.21(m，1H，H6a)，4.05(d，1H，H6b)，3.77(m，1H，H5)，3.44(m，1H，H3)，3.31(m，1H，H4)，3.19(dd，1H，H2)；ring E；4.58(d，1H，H1)，3.79(m，1H，H4)，3.67(m，1H，H5)，3.44(m，1H，H3)，3.16(m，1H，H2)；ring F：5.28(d，1H，H1)，4.48(m，1H，H3)，4.32(d，1H，H6a)，4.18(m，1H，H2)，4.15(m，1H，H6b)，4.07(m，1H，H5)，3.86(t，1H，H4)；ring G：4.92(bs，1H，H1)，4.07(m，1H，H4)，3.91(dd，1H，H3)，3.31(m，1H，H2)，3.18(m，1H，H5)；ring H：4.98(d，1H，H1)，4.23(dd，1H，H2)，4.22(m，1H，H6a)，4.17(m，1H，H6b)，3.93(ddd，1H，H5)，3.59(m，1H，H4)，3.57(m，1H，H3)；间隔基：3.96(s，2H，C(O)CH2O)，3.61-3.51(m，26H，13x CH2O)，3.38-3.30(m，4H，OCH2CH2NHCH(O)CH2，OCH2CH2NHC(O)-Phe)，3.19(m，1H，OCH2aCH2NHC(O)-Phe)，3.12(m，1H，OCH2bCH2NHC(O)-Phe)；肽：7.70(d，2H，Harom苯甲脒)，7.62(d，2H，Harom苯甲脒)，7.01(d，2H，HaromTyr)，6.77(d，2H，HaromTyr)，4.57(dd，1H，CH Asp)，4.28(dd，1H，CH Tyr)，2.87(dAB，2H，CH2Tyr，2.50(t，2H，CH2琥珀酰)，2.48(t，2H，CH2琥珀酰)，2.48(dAB，2H，CH2 Asp)。
方案5.XII的合成
方案6
N-(3-羧基苯磺酰)-4-O-{4-(N-苄氧羰基-4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酸苄酯(52)
将化合物 51(123毫克，根据Bioorg.Med.Chem.2001，29，357-379所述制备)溶解于乙腈和水的混合物(10毫升，6/4，v/v)。加入碳酸钾(381毫克)并将溶液冷却至0℃。15分钟内分批加入3-羧基苯磺酰氯，并且在0℃将混合物搅拌30分钟，在RT搅拌1小时。再将溶液冷却至0℃，又加入一部分3-羧基苯磺酰氯(102毫克)。30分钟后，将反应混合物温热至RT并搅拌过夜。用1N盐酸将混合物酸化至pH1，减压浓缩，粗产物溶解于EtOAc。用1N盐酸，饱和NaCl溶液洗涤有机层，干燥(MgSO4)并浓缩，得到化合物 52(0.11克，73％)。Rf0.5(DCM/MeOH，9/1，v/v)。MS(ESI)M+＝729。
N-＜3-{[14-N-(14-氮杂-1-羧基-2，5，8，11-四氧杂-十四烷酸)]-酮基}-苯磺酰＞-4-O-{4-(N-苄氧羰基-4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酸苄酯(54)
将粗产物化合物 52(216毫克)和化合物 6(49毫克)溶解于DCM(5毫升)。加入TBTU(145毫克)和NMM(82微升)，并将混合物在RT下搅拌过夜。用EtOAc稀释混合物，用饱和NaHCO3水溶液，柠檬酸和饱和NaCl洗涤。用乙酸乙酯萃取合并的含水相，然后用MgSO4干燥合并的有机相并浓缩，得到0.31克 68，为棕色油状物。接着，在DCM(5毫升)和TFA(2.5毫升)的混合物中搅拌粗产物化合物 53。4小时之后将混合物浓缩。通过制备LC/MS纯化产物(C18，乙腈/H2O，0.01％TFA)，得到84毫克化合物 54。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-＜＜12-N-<3-{[14-N-(4-氮杂-1-羰基-2，5，8，11-四氧杂-十四烷基)]-酮基}-苯磺酰＞-4-O-{4-(4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酸＞-12-氮杂-3，6，9-三氧杂-十二烷基＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八钠盐(XIII)
根据常规程序，将羧酸 54(53毫克)与五糖 63(95毫克)偶联，接着纯化并去保护，获得偶联物XIII，为白色泡沫，产率77毫克(两步骤总的产率58％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)：δ3.43-3.32(8x s，34H，8x OMe)；ring D：5.39(d，1H，H1)，4.22(m，1H，H6a)，4.04(d，1H，H6b)，3.79(m，1H，H5)，3.46(m，1H，H3)，3.34(m，1H，H4)，3.24(dd，1H，H2)；ring E：4.59(d，1H，H1)，3.82(m，1H，H4)，3.66(m，1H，H5)，3.52(m，1H，H3)，3.20(m，1H，H2)；ring F：5.28(d，1H，H1)，4.48(t，1H，H3)，4.34(d，1H，H6a)，4.22(m，1H，H2)，4.09(m，1H，H5)，3.85(m，1H，H4)；ring G：4.92(bs，1H，H1)，4.52(bs，1H，H5)，4.09(m，1H，H4)，3.75(1H，m，H3)，3.35(dd，1H，H2)；ring H：4.99(d，1H，H1)，4.22(m，2H，H2，H6a)，4.16(m，1H，H6b)，3.91(ddd，1H，H5)，3.68(m，1H，H4)，3.60(m，1H，H3)；间隔基：3.91(s，2H，C(O)CH2O)，3.66-3.32(m，32H，16x CH2).肽：7.85(dt，1H，Harom)，7.75(t，1H，Harom)，7.62(dt，1H，Harom)，7.43(t，1H，Harom)，6.83(d，2H，Harom Tyr)，6.48(d，2H，HaromTyr)，3.86(m，2H，CH2O)，3.65(m，1H，H-1Tyr)，3.36(m，2H，CH2N)，2.91(m，2H，CH2N)，1.91(m，2H，CH2哌啶基)，1.72(m，2H，CH2丁基)，1.59(m，1H，CH哌啶基)，1.44(m，2H，CH2丁基)，1.36(m，4H)。
ESI-MS：m/z 1272.3[M+2TEA-2H]2-，814.5[M+TEA-3H]3-，799.1[M-3H]3-，585.0[M-4H]4-。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-＜＜12-N-＜N-(3-酮基-苯磺酰)-4-O-{4-(4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酸＞-12-氮杂-3，6，9-三氧杂-十二烷基＞＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八钠盐(XIV)
根据常规程序，将羧酸 52(22.5毫克)与五糖 63(52.6毫克)偶联，接着纯化并去保护，获得偶联物XIV，为白色泡沫，产率38.4毫克(两步骤总的产率58％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)：δ3.43-3.32(8x s，34H，8x OMe)；ring D：5.39(d，1H，H1)，4.22(m，1H，H6a)，4.04(d，1H，H6b)，3.79(m，1H，H5)，3.46(m，1H，H3)，3.34(m，1H，H4)，3.20(dd，1H，H2)；ring E：4.58(d，1H，H1)，3.82(m，1H，H4)，3.66(m，1H，H5)，3.52(m，1H，H3)，3.18(m，1H，H2)；ring F：5.28(d，1H，H1)，4.49(t，1H，H3)，4.34(d，1H，H6a)，4.20(m，1H，H2)，4.08(m，1H，H5)，3.85(m，1H，H4)；ring G：4.94(bs，1H，H1)，4.54(bs，1H，H5)，4.08(m，1H，H4)，3.75(1H，m，H3)，3.35(dd，1H，H2)；ring H：4.98(d，1H，H1)，4.22(m，2H，H2，H6a)，4.17(m，1H，H6b)，3.92(ddd，1H，H5)，3.68(m，1H，H4)，3.60(m，1H，H3)；间隔基：3.62-3.38(m，16H，8x CH2).肽：7.83(dt，1H，Harom)，7.71(t，1H，Harom)，7.62(dt，1H，Harom)，7.42(t，1H，Harom)，6.81(d，2H，Harom Tyr)，6.46(d，2H，Harom Tyr)，3.84(m，2H，CH2O)，3.66(m，1H，H-1 Tyr)，3.33(m，2H，CH2N)，2.90(m，2H，CH2N)，1.93(m，2H，CH2哌啶基)，1.72(m，2H，CH2丁基)，1.59(m，1H，CH哌啶基)，1.44(m，2H，CH2丁基)，1.34(m，4H)。ESI-MS：m/z 1155.2[M+2TEA-2H]2-，736.3[M+TEA-3H]3-，702.6[M-3H]3-。
方案6.XIII和XIV的合成
方案7
14-[4-O-(N-烯丙氧羰基-L-酪氨酰)]-3，6，9，12-四氧杂-十四烷酸叔丁酯(55)
将化合物 38(1.0克)溶解于DMF(50毫升)并减压去除10毫升DMF。N2气下将残余物冷却至0℃，并小批量加入氢化钠(60％分散度，0.34克)。0℃下将悬浮液搅拌1小时。然后加入化合物 45(1.3克)的DMF(4毫升)溶液。RT下反应24小时后，减压浓缩反应混合物。向残余物加水(50EtOAc洗涤混合物。加入EtOAc固体氯化钠，并用2N盐酸水溶液将混合物酸化至pH 3。分离有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩。用硅胶色谱法纯化残余物(DCM/MeOH/AcOH，949/50/1，v/v/v)。将从柱子得到的产物溶解于EtOAc，用H2O洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到化合物 55(0.6克，37％)。Rf 0.4(EtOAc/吡啶/AcOH/H2O270/16/9/4，v/v/v/v)。
2-[(4-哌啶基)氧]乙酸苄酯(57)
根据先前J.Med.Chem.1992，35，4393-4407中描述的制备2-[(4-哌啶基)氧]乙酸叔丁酯(56)。向化合物 56(4.3克，20毫摩尔)加50毫升的DCM/TFA(1∶1)，并将溶液搅拌大约30分钟。减压浓缩混合物。将粗产物溶解于EtOH(40毫升)和NMM(7毫升)的混合物，向其中加入二碳酸二叔丁酯(4.8克，22毫摩尔)。将混合物搅拌大约55小时。接着，减压浓缩反应混合物。向残余物加4M NaOH(250毫升)和Et2O，萃取后分离有机层。用2N盐酸将水层酸化至pH 3，接着用EtOAc萃取三次。将合并的有机层干燥(硫酸镁)并浓缩，得到2-[4-(N-Boc-哌啶基)氧]乙酸酯(2.1克，40％)。
后者粗产物溶解于丙酮(25毫升)和三乙胺(3.4毫升)。加入苄基溴(965微升，8.1毫摩尔)，将反应混合物搅拌过夜。
加入冰水(200毫升)和EtOAc。用2N盐酸将混合物酸化至pH3。用饱和NaHCO3和盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到760毫克粗产物。用硅胶柱色谱法纯化产物(庚烷/EtOAc，1/1，v/v)，得到418毫克(15％)纯产物。Rf 0.47(庚烷/EtOAc，1/1，v/v)。后者产物溶解于DCM/TFA(10毫升，1/1，v/v)并搅拌1小时。减压浓缩反应混合物并加入甲苯(5毫升)。溶解于EtOAc(50毫升)并用饱和NaHCO3洗涤。用EtOAc萃取含水层两次。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩，得到331毫克(100％)标题化合物 57。1H-NMR(MeOD，400MHz，HH)：δ7.37(m，5H，Ar)，6.00(s，2H)，4.17(s，2H)，3.56(m，1H)，3.16(m，1H)，2.76(m，1H)，1.98(m，1H)1.63(m，1H)。
14-{[4-O-(N-烯丙氧羰基-L-酪氨酰)]-2-[(4-哌啶基)氧]乙酸苄酯}-3，6，9，12-四氧杂-十四烷酸叔丁酯(58)
根据较早对化合物 64描述的，将化合物(55)(400毫克，0.72毫摩尔)和(57)(215毫克，0.86毫摩尔)偶联。通过硅胶色谱法纯化产物(DCM→DCM/MeOH，95/5，v/v)，得到587毫克(91％)标题化合物58。Rf 0.65(DCM/MeOH/AcOH，95/5/0.3，v/v/v)。
14-{4-O-L-酪氨酰-2-[(4-哌啶基)氧]乙酸苄酯}-3，6，9，12-四氧杂-十四烷酸叔丁酯(59)
向化合物 58(587毫克，0.66毫摩尔)的DCM(15毫升)溶液依次加入H2O(75微升)，吗啉(115微升，1.32毫摩尔)和PdCl2(PPh3)2。3小时之后将反应混合物倒入H2O/盐水混合物(1/1，v/v)中，用DCM萃取。将有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物(DCM/MeOH，9/1，v/v)，得到433毫克(89％)的标题化合物 59。Rf0.66(DCM/MeOH，9/1，v/v)。
N-(4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯甲酸(60)
根据对化合物 3的合成所描述的，将对-氰基苯甲酸甲酯(5.0克，31毫摩尔)转化为相应的二唑啉酮。将粗产物(4.6克，20.9毫摩尔)溶解于THF(50毫升)和MeOH(50毫升)的混合物。加入H2O(50毫升)，得到悬浮液，接着加入4N NaOH水溶液(10毫升)。6小时之后减压蒸馏去除有机溶剂。用EtOAc/甲苯萃取含水层(1/2，v/v)，用2N盐酸酸化并过滤沉淀物。40℃下减压干燥粗产物，得到4.2克(97％)化合物 60。ESI-MS：207[M+H]+。
14-{{N-(4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯甲酰基}-{4-O-L-酪氨酰-2-[(4-哌啶基)氧]乙酸苄酯}}-3，6，9，12-四氧杂-十四烷酸叔丁酯(61)
向化合物 59(433毫克，0.59毫摩尔)和60(134毫克，0.65毫摩尔)的DMF(6毫升)溶液加入TBTU(227毫克，0.71毫摩尔)和NMM(130微升，1.18毫摩尔)。RT下搅拌16小时后减压浓缩反应混合物。加入EtOAc并用盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过HPLC(C18，ACN/H2O)纯化产物，得到337毫克(64％)的化合物 61。ESI-MS：891[M+H]+，913[M+Na]+，835[M-tBu+H]+。
14-{{N-(4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯甲酰基}-{4-O-L-酪氨酰-2-[(4-哌啶基)氧]乙酸苄酯}}-3，6，9，12-四氧杂-十四烷酸(62)
根据先前对于化合物 12的合成所描述的进行叔丁酯的水解。通过HPLC(C18，ACN/H2O/3％0.1N TFA(水溶液))纯化产物，得到181毫克(57％)期望的化合物 62。
1H-NMR(MeOD，400MHz)：7.91(AB，4H，Harom苯甲脒)，7.35(m，5H，Bn)，7.19(d，2H，Tyr)，6.88(dd，2H，Tyr)，5.24(m，1H，CH Tyr)，5.18(d，2H，CH2 Bn)，4.17(d，2H)，4.10(s，2H)，4.08(m，2H)，3.80(m，2H)，3.65(m，14H)，3.58(m，1H)，3.32(m，2H)，3.07(m，2H)，1.82-1.01(m，4H).ESI-MS：835[M+H]+。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-＜[1-氨基-4，7，10-三氧杂十二烷基]-14-{{N-(4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯甲酰基}-{4-O-L-酪氨酰-2-[(4-哌啶基)氧]乙酸苄酯}}-3，6，9，12-四氧杂-十四烷酰＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八钠盐(XV)
根据常规程序，将化合物6 2(51.7毫克)与五糖 63(106毫克)偶联，接着去保护并纯化，产率127毫克(两步骤总的产率87％)。
方案7.XV的合成
Figure A20058000700200481
方案8.II，V，VIII，X-XIII，XV，XVI的合成
方案8(续)
能类似地制备，XVI：
Figure A20058000700200502
方案9.XIV的合成
Figure A20058000700200503
方案10.参考化合物
Figure A20058000700200511
药理学数据
I.a.ADP诱导的人血小板聚集抑制作用体外试验：
导入：
向体外人血小板富集血浆(PRP)加入二磷酸腺苷(ADP)，诱导血小板聚集。通过测定PRP的光密度(OD)来评价聚集作用。利用这里描述的体外试验来测定试验化合物对ADP-诱导的人血小板聚集的抑制活性。用微量滴定板读数器同时测定几种化合物的活性。
试验媒体：健康人志愿者的血小板，所述志愿者在前十天没有用任何药物。
参照化合物：在该项试验中，替罗非班(AGGRASTAT(MSD)，购买的用于静脉内灌注的0.25毫克/毫升浓缩液)抑制5μM ADP诱导的人血小板聚集，浓度30-60nM时抑制50％(IC50)。
赋形剂：试验化合物应该优选溶解于MQ H2O，浓度是1mM。另一种可选择的赋形剂是MQ H2O中的0.9％NaCl。化合物溶液(或者在MQH2O中或者是MQ H2O中的0.9％NaCl)进一步在MQ H2O中的0.9％NaCl中稀释。
技术：
试剂
1.血小板富集血浆(PRP)：从健康志愿者获得自由流动的血液(至少100毫升)并收集在0.1体积的3.8％柠檬酸钠.2H2O的蒸馏水溶液中(w/v)。最后的浓度是0.38％柠檬酸钠。
RT下以1,600N/kg将柠檬酸处理的血液离心(160克)。15分钟之后，停止转动停止离心，收集上清液(＝PRP)。
2.ADP(Kordia/Chrono-par#384)。使用之前，制备50μM0.9％NaCl溶液。
装备
1.KX-21型Sysmex血细胞计数器。
2.带有620nm滤器的Labsystems iEMS读数器MF，轨道振动器设置在1,000rpm并保持37℃恒温。用Labsystems iEMS程序测定吸收。
3.带有针头的血液收集系统600毫升，art P4203(NPBI)。
4.96孔平底微量滴定板(Greiner Labortechnik)。
程序
使用Sysmex血细胞计数器对上清液(PRP)中的血小板计数，并用PPP稀释上清液，得到含有400,000±50,000plt/μL的PRP。PRP在RT下应该稳定至少20分钟但是不长过3小时。
ADP-诱导的聚集
用吸移管将150微升PRP移到微量滴定板的孔中。加入一定浓度范围(每种化合物7个浓度)的30微升化合物或者赋形剂，并将微量滴定板放在37℃的Labsystems iEMS读数器MF中。然后测定620nm的光密度(OD620)。在读数器中摇动2分钟之后(1,000rpm)，第二次测定OD。这证实了血小板的稳定性(不存在自发的血小板聚集)。
然后，加入20微升50μM ADP溶液，并且每14分钟即时测定620nm的OD(图1)。两次测定之间，以1,000rpm摇动平板40秒。在至少两个使用不同志愿者的PRP的实验中研究每种试验化合物。通常，试验化合物的最高的最终浓度在1E-6和1E-7M之间，化合物浓度以倍数2降低，直到实现小于25％的血小板聚集抑制。
响应ADP-诱导的聚集作用的评价
在t＝0分钟和t＝10分钟，计算每种化合物浓度(包括赋形剂)的平均OD。利用下面的公式计算各种浓度下的抑制百分率：
100％-(ODt＝0分钟的化合物-ODt＝10分钟的化合物)×100％/(ODt＝0分钟的赋形剂-ODt＝10分钟的赋形剂)
试验化合物的IC50是ADP-诱导的血小板聚集作用被减小50％的试验化合物的浓度。为此，以抑制百分率值对化合物浓度做图。然后，利用Graphpad Prism 3.0(可变斜率)计算试验化合物的IC50，nH(Hill斜率)和效力。
需要的量：2毫克。
参考：Salmon，D.M.(1996)Thrombosis Research 84，213-216.
表1.ADP-诱导的(5μM)人血小板聚集作用的抑制(IC50)
  化合物 MW   IC50μM，平均值 na   对比样品
  I   786   0.61   1b   *
  II   2512   1.56   2b
  III   639   0.38   1b   *
  IV   786   0.35   2b   *
  V   2512   0.69   6b
  VI   383   22.58   2b   *
  VII   672   0.38   4b   *
  VIII   2398   2.30   2b
  IX   819   1.18   2b   *
  X   2545   1.45   2b
  XII   2530   0.47   3
  XIII   2520   0.10   3
  XIV   2287   0.63   2
  XVII   386   0.11   6b   *
  XVIII   350   2.01   2b   *
  XIX   497   0.08   2b   *
  XX   339   0.31   4b   *
  XXI   436   0.05   15   *
na＝试验次数；b根据Caron等，(2002)J.Cardiovasc.
Pharmacol.40，296-306所述使用Chronolog聚集
作用测定仪测定血小板聚集。
I.b.TRAP诱导的人血小板聚集抑制作用体外试验：
导入：体外向洗涤过的人血小板(WPL)加入trombin受体激动剂肽(TRAP)，诱导血小板聚集。通过测定WPL的光密度来评价聚集作用。利用这里描述的体外试验来测定试验化合物抑制TRAP-诱导的人血小板聚集的活性。用微量滴定板读数器同时测定几种化合物的活性。
试验媒体：健康人志愿者的血小板，所述志愿者在前十天没有用任何药物。
参照化合物：在该项试验中，替罗非班(AGGRASTAT(MSD)，购买的用于静脉内灌注的0.25毫克/毫升浓缩液)抑制5μM TRAP诱导的人血小板聚集，最终浓度30-60nM时抑制50％(IC50)。
赋形剂：试验化合物应该优选溶解于MQ H2O，浓度是1mM。另一种可选择的赋形剂是MQ H2O中的0.9％NaCl。化合物溶液(或者在MQH2O中或者是MQ H2O中的0.9％NaCl)进一步在MQ H2O中的0.9％NaCl中稀释。
技术：
试剂
1.血小板富集血浆(PRP)：从健康志愿者获得自由流动的血液(至少100毫升)并收集在0.1体积的3.8％柠檬酸钠.2H2O的MQ H2O溶液中(w/v)。最后的浓度是0.38％柠檬酸钠。RT下在HettichRotanta/AP离心机(750rpm)中以1,600N/kg将柠檬酸处理的血液离心(160克)。15分钟之后，停止转动停止离心，收集上清液(＝PRP)。
2.洗涤过的血小板(WPL)：每毫升PRP加入新制备的1微升PGI2溶液后，在Hettich Rotanta/AP离心机(即，2,800rpm)，RT下，以13,500N/千克(1,350克)将悬浮液离心10分钟。将沉淀重新温和悬浮在相同体积的含有5ng/毫升PGI2的新鲜Watson缓冲液后，再次在RT下将悬浮液以1,350克(2,800rpm)离心10分钟。最后的血小板沉淀重新悬浮于Watson缓冲液，达到大约400,000±50,000血小板/毫升。
3.Watson缓冲液：
MQ H2O中134mM NaCl，2.9mM KCl，12mM NaHCO3，0.34mMNa2HPO4.2H2O，1mM MgCl2.6H2O，5mM葡萄糖和5mM HEPES。用1M NaOH将pH调节至7.4。
4.前列腺素I2(Sigma，P6188粉末)：
以100微升等份在-20℃贮存1M KOH中1毫克/毫升PGI2贮存液。仅在使用之前，制备MQ H2O中冰冷0.9％NaCl中的5微克/毫升溶液。
5.人纤维蛋白原(Kordia/ERL，art nr：FIB 2粉末)：0.5克纤维蛋白原粉末溶解于真空下的50毫升MQ H2O中。这种贮存液以1毫升等份贮存在-20℃。使用之前，制备0.5毫克/毫升盐水溶液。
6.TRAP
使用之前，制备MQ H2O中0.9％NaCl中的50μM TRAP溶液。对于每一次试验，制备新鲜溶液。
装备
1.KX-21型Sysmex细胞计数器。
2.带有405nm滤器的Labsystems iEMS读数器MF，轨道振动器设置在1,000rpm并保持37℃恒温。用Labsystems iEMS程序测定吸收。
3.带有针头的血液收集系统600毫升，art nr P4203(NPBI)。
4.96孔平底微量滴定板(Greiner Labortechnik)。
程序
使用Sysmex血细胞计数器对WPL浓缩物计数，并用Watson缓冲液稀释悬浮液，获得400,000±50,000plt/μL的浓度。使用之前，让WPL在室温下稳定至少20分钟但是不长过3-4小时。
TRAP-诱导的聚集
用吸移管将150微升WPL移到微量滴定板的孔中。加入15微升化合物或者赋形剂和15微升纤维蛋白原溶液，并将微量滴定板放在37℃微量滴定板读数器中。然后测定405nm的光密度(OD)。在读数器中摇动2分钟之后，再次测定OD405。证实血小板的稳定性(不存在自发的血小板聚集)。加入20微升50μM TRAP，并且每14分钟即时测定405nm的OD405。两次测定之间，以1,000rpm摇动平板40秒(图1)。为了测定试验化合物的IC50，在至少两个使用不同志愿者的WPL的实验中研究每种试验化合物。通常，起始化合物在培养基质中的浓度在1E-6M和1E-7M之间，化合物浓度以倍数2降低，直到实现小于25％的血小板聚集抑制。
响应的评价：在t＝0分钟和t＝10分钟，计算每种化合物浓度(包括赋形剂)的平均OD。利用下面的公式计算各种浓度下的抑制百分率：
100％-(ODt＝0分钟的化合物-ODt＝10分钟的化合物)×100％/(ODt＝0分钟的赋形剂-ODt＝10分钟的赋形剂)
以化合物浓度对抑制百分率值做图。利用Graphpad Prism 3.0(可变斜率)计算试验化合物的IC50，nH(Hill斜率)和效力。试验化合物的IC50是TRAP-诱导的血小板聚集作用被减小50％的试验化合物的浓度。
需要的量：2毫克。
参考：Salmon，D.M.(1996)Thrombosis Research 84，213-216.
表2.TRAP(5μM)-诱导的人血小板聚集作用的抑制(IC50)
化合物 MW   IC50μM，平均值 na 对比样品
  I   786   0.22   2b   *
  II   2512   0.31   2b
  III   639   0.25   2b   *
  IV   786   0.12   2b   *
  V   2512   0.20   7b
  VI   383   6.29   2b   *
  VII   672   0.27   5b   *
  VIII   2398   0.66   3b
  IX   819   -   -   *
  X   2545   0.76   3b
  XII   2530   0.11   1
  XIII   2520   0.08   1
  XIV   2287   0.08   1
  XVII   386   0.10   4b   *
  XVIII   350   1.19   2b   *
  XIX   497   0.10   2b   *
  XX   339   0.38   2b   *
  XXI   436   0.05   8   *
na＝试验次数；b根据Caron等，(2002)J.Cardiovasc.
Pharmacol.40，296-306所述使用Chronolog聚集作用测定仪测定血小板聚集。
II.缓冲液中抗-因子Xa活性的测定(微量滴定板方法)
导入：
激活的因子X(Xa)是血凝固级联中的一个因子；抗凝血酶(AT-III)对其活性稍有抑制。抗凝血剂能直接抑制Xa，或者象肝素一样，通过加强AT-III的抑制活性。通过测定产色反应物S-2222在AT-III存在下的水解速率能评价抗-Xa活性。应用这项试验来测定Kabi缓冲液中类肝素制剂的抗-Xa活性。
试验介质：Kabi缓冲液
参考化合物：国际标准肝素(11.4抗-XaU/毫克)。
技术：
试剂
1.Kabi缓冲液
缓冲液成分：NaCl 10.17克(174毫摩尔)；乙二胺四乙酸二钠二水合物3.26克(9.6毫摩尔)；tromethamine(Tris)6.11克(50.4毫摩尔)；用超纯水补充至1升*。用盐酸将溶液的pH调节至7.4(0.10摩尔/L)。
*对于所有的水溶液使用超纯水(Milli-Q质量)。
2.Xa溶液
将牛因子Xa(Kabi Diagnostica，Stockholm，Sweden)溶解于Kabi缓冲液，得到含有1.5U/毫升(0.75nKat/毫升)的溶液。
3.S-2222溶液
将S-2222(Kabi Diagnostica)溶解于超纯水，得到含有0.375毫克/毫升(0.5毫摩尔/升)。
4.AT-III溶液
将人AT-III(Kabi Diagnostica)溶解于Kabi缓冲液，得到含有0.25U/毫升的溶液。必须每天制备新鲜溶液。
5.校准样品的标准溶液
将标准肝素溶解于Kabi缓冲液，得到含有大约0.25抗-XaU/毫升的标准溶液。
步骤：
试验样品的制备
将每种制剂溶解于超纯水并且用Kabi缓冲液稀释至0.02-0.2抗-XaU/毫升范围的必需浓度。
Xa活性的测定
用吸移管将各种试验样品(0.05毫升)移到RT下的微量滴定板的孔中。向各样品加入AT-E溶液(0.05毫升)，并使用Vari-摇动器摇动平板。
用吸移管将Xa溶液(0.05毫升)移到各孔10分钟之后加入AT-III溶液并再次摇动平板，精确2分钟之后加入Xa溶液，将0.1毫升S-2222溶液用吸移管移到各孔并再次摇动平板。所有的加入都使用12-管吸移管。
残留量的Xa催化S-2222的水解，RT下分别培养2和22分钟之后用光度测量法测定水解速度。使用310C型Microelisa读数器(Organon Teknika，Oss，The Netherlands)在405nm测定各样品吸光度，并计算吸光度的增加(ΔOD)。对每种试验样品都测定两次。每10个样品包括一个空白样品(0.05毫升Kabi缓冲液)。
校准曲线
从一等份校准样品标准溶液制备一定范围的稀释物(对于肝素样品稀释倍数是1,3)。得到的标准样品(大约15个样品)应该含有0,01-0,25抗-Xa U/毫升。在各轮中，根据Xa活性的测定一节中所述，对0,05毫升的每一个标准样品测定至少三次。利用最小二乘方，通过将直线拟合下面的式子获得校准曲线：log[平均ΔOD(空白)-平均ΔOD(标准样品)]/平均ΔOD(标准样品)对log抗-Xa U/毫升值。
响应评价：
对于每一个样品，利用校准曲线测定平均抗-Xa活性，单位U/毫升。为了比较，也给出了自由五糖XXII的抗-Xa活性数据，XXII是偶联物寡糖部分的“母体”。
表3.五糖偶联物的抗-Xa活性
  化合物   Mw   U/mg   U/nmol   对比样品
  II   2512   618±32   1.55
  V   2512   565±32   1.42
  VIII   2398   605±43   1.45
  X   2545   545±38   1.39
  XII   2530   619±157   1.57
  XIII   2520   671±119   1.69
  XIV   2287   735±107   1.68
  XXII   1639   775±23   1.27   *
药动学
对豚鼠(DH)给与0.5微摩尔/千克(i.v.)抗凝剂。通过如上所述，在特定时间间隔对血浆抗-Xa活性进行来自体内测定来间接获得五糖XXII，偶联物寡糖部分的“母体”，和偶联物VIII的半存留期。利用LC-MS/MS，通过测定特定时间间隔的血浆浓度来测定参考GpIIb/IIIa拮抗剂XVII，XIX和XX(见方案10)的半存留期。
图1豚鼠0.5摩尔/千克的动力学
结论：
当与参考GPIIb/IIIa拮抗剂比较时，部门的偶联物VIII的半存留期显著延长。

Claims (15)

1.结构式A的化合物：
寡糖-间隔基-GpIIb/IIIa拮抗剂(A)，
其中
所述寡糖是带负电荷的寡糖残基，包括4-25个单糖单元，带正电荷的抗衡离子补偿电荷，并且其中寡糖残基衍生自本身具有(AT-III介导的)抗-Xa活性的寡糖；
间隔基是一个键或者基本上无药学活性的连接残基；
GpIIb/IIIa拮抗剂是模拟纤维蛋白原的RGD和/或K(QA)GD片段的残基，典型地包括非必需酯化的羧酸酯部分和位于与另一个相距10-20埃的残基中的碱性部分；或者其药学可接受盐或其前体药物或溶剂合物。
2.权利要求1的化合物，其中所述间隔基是基本上无药学活性的连接残基。
3.权利要求1或2的化合物，其中所述间隔基有1-50个原子的长度。
4.权利要求1-3任一项的化合物，其中所述间隔基包括至少一个-(CH2CH2O)-单元。
5.权利要求1-4任一项的化合物，其中所述寡糖有4-16个单糖单元。
6.权利要求1-5任一项的化合物，其中所述寡糖是硫酸化五糖残基。
7.权利要求5的化合物，其中所述五糖残基有结构B
Figure A2005800070020002C1
其中R1独立地是OSO3 -或(1-8C)烷氧基，电荷被带正电荷的抗衡离子补偿。
8.权利要求7的化合物，其中所述五糖残基有结构C
Figure A2005800070020003C1
其中R1是OCH3或OSO3 -，电荷被带正电荷的抗衡离子补偿。
9.权利要求1-8任一项的化合物，其中所述GpIIb/IIIa拮抗剂残基选自衍生自Ro 435054，SC 54701(珍米洛非班)，RWJ 50042，sibrafiban(Ro 443888)，拉米非班(Ro 449883)，GPI 562，FK 633，替罗非班(MK 383)，奥布非班(SC 57101)，表非替得(C6822)，roxifiban(XV459)，elarofiban(RWJ53308)，SR121566(SR121787的活性形式)，来达非班(BIBU 52)，lotrafiban(SB 214857)，gantofiban(YM028)，T-250，EF 5077，ZD 2486，TAK 029，TP 9201，或L 703014的残基。
10.权利要求1-8任一项的化合物，其中所述GpIIb/IIIa拮抗剂具有结构D
Y-N(H)-C(O)-X    (D)，
其中Y是N(H)-C(O)-C(R2)(C(R2)2COOH)或
N(H)-C(O)-C(R2)(CH2芳基)-N(H)-C(O)-C(R2)(C(R2)2COOH)，
O-亚苯基-C(R2)2-C(R2)(COOH)-N(H)-C(O)-C(R2)(C(R2)2COOH)，
O-亚苯基-C(R2)2-C(R2)(C(O)-R3-O-C(R2)2COOH)，
其中R2独立地是H或(1-4C)烷基；并且其中芳基是苯基，羟基苯基，苯硫基或吡啶基，并且R3是哌啶基；
而X是苄脒，(CH2)2-N(H)-C(O)-苄脒，(CH2)2-C(O)-N(H)-苄脒或者
Figure A2005800070020003C2
其中n是0，1，2或3。
11.权利要求1的化合物，选自下面的化合物：
和
Figure A2005800070020005C1
12.结构式A的化合物的制备方法，包括一个步骤，其中非必需修饰的GPIIb/IIIa拮抗剂残基(a)与寡糖直接偶联或者(b)与寡糖-间隔基残基偶联或者(c)与间隔基偶联，其接着与寡糖-间隔基-残基偶联。
13.含有权利要求1-11任一项的化合物和药学合适的辅助剂的药物组合物。
14.权利要求1-11任一项的化合物在治疗中的用途。
15.权利要求1-11任一项的化合物在制备用于治疗或预防栓塞疾病的药物中的用途。
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