CN104053675A - 低抗凝血肝素 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化学修饰的肝素，其具有10IU/mg以下的抗因子II活性，10IU/mg以下的抗因子Xa活性，和约6.5至9.5kDa之间的平均分子量(Mw)。本发明还公开了制备所述肝素的方法及其医药用途，包括治疗疟疾。

Description

低抗凝血肝素

技术领域

本发明涉及具有低抗凝血活性的化学修饰的肝素及其制备方法。所述化学修饰的肝素有用于治疗其中肝素被视为是有效的，但是易产生副作用的疾病，如疟疾。

背景技术

肝素是天然产生的GAG(葡糖胺聚糖)，其在人和动物的所谓的肥大细胞中细胞内合成并储存。从猪肠粘膜工业制得的肝素是一种有效的抗凝血剂并且已经作为预防和治疗血栓栓塞性疾病的优选药物被用于临床超过60年。肝素治疗的主要潜在不良反应是由其抗凝血特性引起的出血性并发症。肝素是高度多分散的并且由分子量范围在5至40kDa，平均分子量约15至18kDa的异质多糖群体构成。

根据欧洲药典6.0的低分子重量/质量肝素(LMWH)被定义为“具有质均分子质量8以下的硫酸化GAG的盐，其中总质量的至少百分之六十具有8kDa以下的分子质量”。低分子质量肝素在多糖链的还原性或非还原性末端展现不同的化学结构。“根据干燥物质计算的效力为每毫克不在70IU以下的抗因子Xa活性”。抗因子Xa活性与抗因子IIa活性的比例为不在1.5以下”。临床上使用的LMWH具有3至15kDa范围的分子量，其平均值约为4至7kDa。由肝素的受控解聚/分级制得的LMWH展现更加有利的药理学和药代动力学特性，包括皮下注射后更低的诱导出血的倾向、增加的生物利用度和延长的半衰期。

肝素主要通过高亲和性地结合于并活化丝氨酸蛋白酶抑制剂，抗凝血酶(AT)，来发挥其抗凝血活性。通过特异性戊多糖序列调节该结合。AT，一种重要的生理学血液凝固抑制剂，通过与活化的凝血因子形成稳定的复合物来中和这些因子。肝素的结合引起AT的构象变化，其急剧地增加抑制凝血因子的比率，由此衰减血液凝固和血栓的形成。

由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)引起的感染经常导致人类中严重的疟疾。被寄生的红细胞(pE)具有结合(体内：隐蔽(sequestrate))于深微脉管系统以及未感染红细胞的能力，所谓的玫瑰结(rosetting)。当结合过度时pE的隐蔽和玫瑰结增加严重疾病的产生，阻断血液流动，降低氧运输，并引起组织损伤。

肝素已经被建议作为严重疟疾期间发生的病理学治疗的有用的试剂。由于疟疾患者中所暗示的弥散性血管内凝血(DIC)的存在，肝素以前被用于治疗严重疟疾，但是由于严重副作用的发生例如颅内出血，其被停止了。另外，已经发现pE聚集不是主要归因于血液凝固，而是由于pE表面上寄生虫诱导的蛋白质与红细胞和血管内皮细胞上硫酸乙酰肝素(一种肝素相关的GAG)之间的非共价相互作用。肝素的作用被归因于其对该相互作用的竞争能力(Vogt等人，PloS Pathog.2006；2,e100)。因此，对于肝素衍生物具有医药上的需要，根据其适当大小和带电荷的链的分布设计的所述肝素衍生物具有显著降低抗凝血活性和诱导出血潜能。美国专利US5,472,953(Ekre等人)公开了具有降低的抗凝血活性的肝素在治疗疟疾中的用途。

AM Leitgeib等人，在Am.J.Trop.Med.Hyg.2011,vol.84(3),pp.380-396中报道了低抗凝血肝素的具有前景的研究，其被发现破坏从疟疾患者新鲜临床分离株的玫瑰结。

总之，基本地具有肝素的多阴离子特征，但是没有抗凝血作用的肝素衍生物将成为治疗其中肝素的抗凝血作用被视为是严重副作用的疾病的绝佳候选物。

发明内容

本发明涉及化学修饰的肝素，其被选择性地制备以保持多糖链的治疗作用，同时具有低的抗凝血作用。

在本发明的上下文中，肝素的坑凝血活性涉及AT增强抑制凝血因子Xa和IIa(凝血酶)的临床功能。其它术语将在以下说明书的相关文本中限定。

在一个方面，本发明涉及化学修饰的肝素的制备方法，所述化学修饰的肝素具有10IU/mg以下的抗因子II活性，10IU/mg以下的抗因子Xa活性，和约6.5至约9.5kDa的平均分子量(重均，Mw)。所述方法通常包含通过使肝素经受能够氧化非硫酸化的糖类残基的氧化剂而选择性氧化存在于水性溶液中的肝素和然后还原所得到的氧化糖类残基的步骤。所述方法通常还包含通过酸性约3至约4pH的水解作用解聚氧化的和还原的肝素链。可以一般顺序进行该方法，以刚表述的方式连续地氧化、还原和水解作用解聚，然而，还可以任何合适的顺序增加其它补充步骤。

在至少约20℃的温度进行解聚以获得具有合意的分子量的合适的分级的链。为了支持合意的链的选择，所述方法通常还可以包括富集具有约5.5至约10.5kDa的分子量的多糖链。所述富集步骤通常包括生物聚合物生产领域技术人员熟知的常规的色谱法、过滤或过筛程序。

根据本发明的方法可以进一步包含至少一个消除剩余氧化剂的步骤。

此外，根据本发明的方法可以包含至少一个消除步骤，所述消除步骤包括去除氧化剂的还原形式。在这种情况下，还原形式意味着将氧化剂(有助于肝素中靶向的糖残基的氧化)转化为还原形式。还在这种情况下，还原步骤可以包含添加还原剂，所述还原剂除了还原氧化的肝素，还有助于消耗(还原)剩余的氧化剂。

在一个方面，根据本发明的方法包含在所描述的还原步骤和所描述的解聚步骤之间，消除任何剩余的氧化剂和去除氧化剂的还原形式的步骤。可以通过水解作用在3.0至3.5的pH进行解聚。

因此，在一个方面，本发明涉及包含以下连续步骤的方法：通过使未分级的肝素经受能够氧化非硫酸化的糖的氧化剂选择性氧化未分级肝素；还原所得到的氧化的糖；消除剩余的氧化剂和氧化剂的还原形式；和通过水解作用于约3至约3.5的酸性pH解聚肝素链。

所述消除步骤可以包含以足够使化学修饰的肝素沉淀的量添加醇。所述醇可以是甲醇、乙醇或类似的醇并且允许化学修饰的肝素沉淀，而氧化剂和其还原形式随着醇被去除。

所述消除步骤还可以包括添加能够化学灭活氧化剂进一步发挥对于肝素的氧化作用的淬灭剂。发明人通常认为所描述的一个或多个消除步骤有助于抵消或最小化肝素的非特异性解聚，即，解聚作用不归因于酸性水解作用的可预期的结果。非特异性解聚可能导致不可预期的分子量的损失，变色的产品(具有不稳定的吸光值)，其它稳定性问题和不被预期存在于肝素或低分子量肝素的不明残基的出现。

在氧化步骤之后引入消除步骤确保对于任何非特异性解聚的改进的控制。在任何先前描述的方法中可以应用的另一种控制非特异性解聚的方式是加入醇时在前述一个或多个沉淀步骤期间将温度显著降低至环境(室)温度以下。例如，可以将温度降低至约5℃以防止不需要的反应导致非特异性解聚。

根据本发明，肝素被选择性氧化，由此抑制AT与特异性五糖之间相互作用所调节的抗凝血作用。氧化选择性分裂具有2个毗邻的游离羟基的二醇，并且所得到的产物被称为“二醇分裂”产物。为此，用高碘酸盐化合物例如偏高碘酸钠，在合适的反应介质中，例如按照美国专利US4,990,502的公开内容，处理未分级肝素的组合物。其它的氧化剂也是可以使用的，只要它们对于非硫酸化残基具有相同的化学影响，且不损坏最终产品中所要求的硫酸根的临界水平。当使用高碘酸盐化合物作为氧化剂时，其被还原成碘酸盐，然后，在还原步骤中，被还原为碘的其它惰性形式，共同称为“碘化合物”。本发明过程的消除步骤用于消除或最小化任何碘化合物的氧化作用，以及从过程中以抵消最小化非特异性解聚的方式去除碘化合物。出于该原因，消除步骤可以包含一个或两个用醇的沉淀步骤。其还可以包括添加具有两个临近的羟基的淬灭剂，例如乙二醇、丙三醇和类似试剂，从而化学地和选择性地消除氧化试剂。

氧化肝素，例如在通过醇沉淀分离后，然后用还原试剂处理，合适地为硼氢化钠，例如根据美国专利US4,990,502的方案。也可以使用其它还原剂，只要它们能够进行如硼氢化钠那样的类似的氧化葡萄糖醛酸/艾杜糖醛酸残基的还原，且没有其它糖残基的不必要的修饰或破坏。例如可以通过醇沉淀分离所还原的链并将其转移至解聚步骤。

在所描述的方法中的非分级的肝素的应用被视为是本发明的一般优势，因为其有助于降低原料的浪费并增加成本功效，并且有助于支持提供具有合意的多糖链长度的和具有保持的硫酸根基团(sulfate group)的组合物产品。

可以在水性溶液中，以约15至约25％w/v的修饰的肝素的浓度，进行解聚步骤。然后将强酸化剂混合于溶液中至pH约3至约4。合适的pH范围为约3.0至约3.5。根据本发明的方法约3.0的pH是合适的，而pH3.5也被发现是合适的并允许所概述的分子量范围的化学修饰的肝素的生成。已经发现本发明过程允许在该pH范围内的灵活性，所述pH范围可以由在4至10小时的时间框架内操作的水解步骤的处理时间来控制。本发明过程中盐酸是一种合适的酸，然而其它强酸被发现是有用的，只要它们基本上不破坏硫酸根基团。通过应用以上所规定的条件，重新获得具有合适的链长和储存稳定性的产物以用于接下来的后处理，以得到药学上有用的组合物。

所述方法得到在多糖链长度内整体富集硫酸根基团，因为非硫酸化的艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸被化学修饰并且主要呈现还原性末端，剩余端子。因此，所述方法涉及保持硫酸根基团且因此保持天然肝素的硫酸化区域的条件。所述方法还得到具有有利的粒径分布的链，其有助于获得合意的治疗功效并且被视为与其它所描述的低抗凝血肝素相比改进的治疗指数。本发明通常延伸至用所引用的方法制备的化学修饰的肝素。

本发明涉及化学修饰的肝素，其具有10IU/mg以下的抗因子II活性，10IU/mg以下的抗因子Xa活性，和约6.5至约9.5kDa之间的平均分子量(Mw)，其可以通过所描述的方法生产。根据本发明的化学修饰的肝素具有保持至少90％的硫酸根基团的多糖链。当假设肝素包含平均2.4个硫酸根基团/二糖单元，并且存在一个硫酸根基团/艾杜糖醛酸，I2S和对于主要的葡萄糖胺变体2个硫酸根基团，GlcNS时，根据本发明的化学修饰的肝素具有硫酸根基团的损失为约一个硫酸根基团/100个二糖单元，其对应于硫酸根基团的损失为总硫酸根含量的1％以下。

本发明的一个方面是一种化学修饰的肝素，其具有10IU/mg以下的抗因子II活性，高达10IU/mg的抗因子Xa活性，和约6.5至约9.5kDa的平均分子量，其中多糖链：

(i)保持至少90％的对应天然肝素的硫酸根基团；

(ii)对应于1.2至15kDa的分子量，包含2至25个二糖单元；

(iii)当与天然肝素的多糖链相比时，具有降低的提供抗凝血酶介导的抗凝血作用的化学完整的糖序列；和

(iv)当与天然肝素相比时，具有降低的未硫酸化艾杜糖醛酸和/或葡萄糖醛酸单元。

化学修饰的肝素具有对应于约1.2至约15kDa的分子量的2至25个二糖单元。化学修饰的肝素当与天然肝素的多糖链相比时具有降低的提供抗凝血酶(AT)介导的抗凝血作用的化学完整的戊多糖序列，并且当与天然肝素相比时具有降低的未硫酸化艾杜糖醛酸和/或葡萄糖醛酸残基。

本发明的一个方面是具有主要出现的具有6至16个二糖单元和3.6至9.6kDa之间的分子量的多糖链的化学修饰的肝素。术语“主要”在这种情况下具有“最常出现”的多糖链的含义。

本发明的一个方面是具有多糖链的化学修饰的肝素，至少30％的多糖链具有至少8kDa的分子量。

本发明的一个方面是化学修饰的肝素，其含有苏糖酸(threonate)残基或苏糖酸衍生物(例如其酯或酰胺)封端的链。所述苏糖酸残基下面被描述为末端基团。

在本发明的一个方面中，化学修饰的肝素的3至15％的多糖链具有至少15kDa的分子质量。

在本发明的一个方面中，化学修饰的肝素的25至47％的多糖链具有至少9kDa的分子质量。

在本发明的一个方面中，化学修饰的肝素的40至60％的多糖链具有至少7kDa的分子质量。

在本发明的一个方面中，化学修饰的肝素的60至80％的多糖链具有至少5kDa的分子质量。

在本发明的一个方面中，化学修饰的肝素的85％的多糖链的具有至少3kDa的分子质量。

在本发明的一个方面中，化学修饰的肝素的95％的多糖链具有至少2kDa的分子质量。

在另一个方面，本发明的化学修饰的肝素具有根据下表的多糖分布和以重量的累积％表示的其对应的分子质量：

在另一个方面，本发明的化学修饰的肝素具有根据下表的多糖分布和以重量的累积％表示的其对应的分子质量：

根据本发明的化学修饰的肝素具有如下描述的二糖作为主要结构的多糖链，所述主要结构具有末端苏糖酸残基。所述主要的二糖具有约600Da的分子量。

(n为2-25的整数)

根据本发明的另一个方面，根据本发明的化学修饰的肝素包含具有以下化学结构的二醇-分裂残基：

二醇-分裂残基出现在化学修饰的肝素的多糖链中，其是如上在方法和特定的水解步骤的文本中所讨论的氧化和还原过程的结果。其还可以被视为是先前描述的解聚(水解)步骤的功效的指示。进一步引用美国专利US4,990,502作为二醇-分裂残基出现的化学参考文献。从未硫酸化的艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸的氧化和还原得到所描述的二醇-分裂残基。

根据本发明的化学修饰的肝素具有5.0至6.5ppm范围内的¹H-NMR波谱，其符合来自于天然肝素的缺少任何0.1(mol)％以上量级的质子信号的¹H-NMR波谱。

在本发明的一个方面，本文所描述的化学修饰的肝素遵照目前所接受的肝素标准，其具有符合由EDQM，欧洲理事会，2012制定的肝素验收标准的¹H-NMR波谱，例如不具有相比于0.10-2.00ppm、2.10-3.10ppm和5.70-8.00ppm范围内的5.42ppm处的肝素信号的高度任何大于4％的不明信号。

在一个方面，根据本发明的化学修饰的肝素具有约7500道尔顿的相对平均分子质量范围，其中约90％在2000至15000道尔顿的范围内；硫酸化的程度是2至2.5/二糖单元。

在本发明的一个方面，本文描述的化学修饰的肝素，可以与肝素的其它区域而非AT结合位点联合用于如前所述的治疗方法。实例包括但不限于，这样的区域用于治疗炎症、治疗神经退行性疾病、组织修复、中风、预防和治疗休克、尤其是脓毒性休克和预防转移瘤的发展。

本发明的一个方面是一种化学修饰的肝素，其用于治疗疟疾。本文描述的化学修饰的肝素可以有用于预防或治疗源自疟疾的闭性效果(由血液中的异常粘附作用引起)。

本发明的一个方面是本文描述的化学修饰的肝素与其它疟疾药物的组合。在本发明的一个方面，这样的组合包含化学修饰的肝素和阿托伐醌/氯胍或青蒿琥酯(肠胃外)。在本发明的组合方面的疟疾药物(药物单独使用，或彼此联合使用)的实例是蒿甲醚、苯芴醇、阿莫地喹、甲氟喹、磺胺多辛、息疟定、四环素、强力霉素、氨苯砜、克林霉素、奎宁、四环素、阿托伐醌、氯胍、氯喹、伯氨喹、磺胺多辛、阿莫地喹、二氢青蒿素(dihydroartemisini)、哌喹、二氢青蒿素、和哌喹。

在本发明的另一方面，本文描述的化学修饰的肝素可以与疟疾药物同时施用或相继施用，即与疟疾药物的联合治疗。

术语“疟疾药物”包括常规用于治疗疟疾的试剂，例如已经确认用于治疗寄生虫感染的试剂。本发明的另一方面为一种治疗疟疾的方法，其包括向需要该治疗的患者施用治疗有效量的本文描述的化学修饰的肝素。

本发明的另一方面为一种药物组合物，其包含本文描述的化学修饰的肝素以及药学上和药理学上可接受的载体。在本发明的另一方面，本文描述的药物组合物可以通过肠胃外施用而全身施用，例如通过皮下或静脉内注射。在另一个方面，本文描述的药物组合物可以口服施用。对于肠胃外施用，可以将活性化合物混合入溶液或混悬液中，其还含有一种或多种佐剂例如无菌稀释剂如注射用水、生理盐水、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成性溶剂、抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、缓冲剂和调节渗透度的试剂。肠胃外制剂可以在安瓶、小瓶、预填充或可丢弃的注射器中递送，也可以自身给药，或作为输液装置递送，例如作为静脉内或皮下输液。根据本发明的化学修饰的肝素可以皮下施用和与合适的自身给药工具如注射器结合施用。

包含本文所述的化学修饰的肝素的药物组合物可以含有一种或数种常规药学上可接受的载体的组合。所述载体或赋形剂可以为充当活性物质载体的固体、半固体或液体材料。可以单剂量每24小时施用组合物持续1-30天，优选1-10天。剂量可以在0.5-6mg/kg给定体重之间，或者每6或8小时静脉注射，或者每天给定1-4次皮下注射。估计的单剂量是25-100mg/天的化学修饰的肝素，但可以达到1g或更多。剂量与施用形式相关。如前章节所述，所描述的药物组合物可以进一步包含其它的适合于治疗疟疾的试剂以用作补充或辅助疗法。本发明的化学修饰的肝素将需要保持足够量的天然形式中的硫酸根基团，以发挥与抗凝血作用不相关的治疗活性，例如靶向于恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(PfEMP1)，并且同时具有彻底废除的或大幅度降低的戊多糖所固有的抗凝血活性。此外，发明人理解选择性抑制，以及其它肝素依赖性生物作用与多糖链长度相互关联，因此化学修饰不能够导致天然分子的广泛破碎。皮下给药后的长链肝素的生物利用度是低的，并且肝素诱导血小板减少(HIT)的能力与链长度正相关，根据本发明的化学修饰的肝素衍生物不应是全长的。本发明的化学修饰的肝素是多种需要考虑的重要事项的结果，1、起初，为了满足生产过程经济标准，靶肝素必须能够从未分级的肝素制得；2、所述生产过程不能够获得过多的短链，因为治疗效果与充分长的糖链长度正相关；3、生产过程不能够获得过多的长链，因为所需的皮下给药策略使用更长链是不能够实现的；4、相似地，长链长度与不需要的副作用例如HIT相关；5、生产方法应消除AT-结合戊多糖所固有的抗凝血作用；6、生产过程需要避免聚合物的去硫酸化，但是应该增加硫酸化残基的比例，因为治疗效果与硫酸化的程度正相关，其提供负电荷密度。如上所描述的以及如下实验章节部分将要详细描述的本发明阐明了能够克服如上所概括的障碍，因此能够制备用于治疗疟疾的成功的药物候选物。

发明的详细和示例性描述

本发明的一个方面是具有国际专利商品名(INN)sevuparin sodium(也编号为DF02)的化学修饰的肝素。这些术语是可以交换使用的并且其具有相同的含义。

附图说明

图1显示肝素序列的代表性实例。

图2显示需要结合于AT的肝素中戊多糖单元的结构。

图3显示化学修饰的肝素DF02的合成方案。

图4显示DF02的主要结构。

图5显示寄生虫FCR3S1.2的玫瑰结是怎样被DF02和肝素以剂量依赖方式破坏的。

图6显示患有严重、复杂或中等疟疾的儿童的新鲜分离株的玫瑰结如何对DF02(100(黑柱状))和1000(灰柱状)μg/ml)的治疗敏感。

图7显示细胞粘附破坏：寄生虫FCR3S1.2的pE与内皮细胞的结合能够被DF02或肝素以剂量依赖的方式抑制或逆转。

图8阐明寄生虫FCR3S1.2对于新鲜红色血液细胞的裂殖子入侵能够被DF02或肝素以剂量依赖的方式抑制。

图9阐明大鼠肺中恶性疟原虫感染的红细胞的隐蔽能够通过化学修饰的肝素的治疗被抑制。

具体实施方式

实施例1

肝素和LMWH由重复的含有或者一个糖醛酸残基(D-葡萄糖醛酸或L-艾杜糖醛酸，UA)和被N-硫酸化或者被N-乙酰化的一个D-葡萄糖胺部分(GlcN)的二糖单元组成。这些碳水化合物残基可以在葡萄糖胺情况下的C-6和C-3位置以及UA的C-2位置进一步被O-硫酸化。肝素的结构根据UA和硫酸根残基的分布而变化；一个代表性的部分序列示于图1(其还阐明了单糖残基中碳原子编号的模式)。图2显示独特的，分布于肝素聚合物中的戊多糖序列，其对于结合AT是必要的。该序列的数个结构特征已经显示对于肝素与AT之间的相互作用是关键的。尤其是该戊多糖序列中存在的两个UA残基之一始终地在C-2位置硫酸化；然而其它糖醛酸部分的C-2和C-3位置的羟基是非取代的。

根据本发明的化学修饰的肝素的生产过程的详细描述

图3概括地显示根据本发明的化学修饰的肝素(后文称为DF02)的生产，而以下章节概述了生产步骤。

从肝素钠制得物质。制备涉及用高碘酸盐选择性氧化肝素中的非硫酸化糖醛酸残基，其包括结合AT的戊多糖序列中的葡萄糖醛酸部分。该残基结构的破坏毁灭了与AT的高亲和性相互作用，因此毁灭了抗凝血作用(用a-FXa或a-FIIa测定，参见表4和5)。接下来的还原和酸处理导致已经被高碘酸盐氧化的位点处的聚合物的裂解。同时，这些操作导致抗凝血活性的丧失伴随肝素链的充分解聚。

因此，通过重复的乙醇沉淀、过滤和离心去除添加物、杂质和副产物。然后通过真空干燥和加热获得粉末形式的物质。将药物物质DF02溶解于无菌水性缓冲液中以得到药物产品，其旨在用于静脉内或皮下施用。

葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，抗凝血活性的删除

将约3000克的肝素溶解于净化水中以获得10-20％w/v的溶液。将该溶液的pH调节至4.5-5.5。然后向生产溶液中加入偏高碘酸钠(NaIO₄)，高碘酸盐的量为肝素重量的15-25％。再次将pH调节至4.5-5.5。遮盖反应器以使反应避光。在持续搅拌下并保持温度在13-17℃使生产溶液反应22-26小时。测定并记录反应时期最后的pH。

氧化反应的终止和含碘化合物的去除

在仔细搅拌下，于20-25℃的温度，经过0.5-1小时将乙醇(95-99.5％)加入反应混合物中。待添加的乙醇的体积为每生产溶液体积1-2体积乙醇的范围。然后允许氧化的肝素沉淀并沉积15-20小时，然后倾倒并弃除母液。

然后，将沉积物溶解于净化水中以获得15-30％w/v的生产溶液。加入NaCl以获得生产溶液中0.15-0.30mol/升的浓度。继续搅拌另外的0.5-1小时，同时保持温度在20-25℃。然后，在仔细搅拌下，经过0.5-1小时，向该溶液加入每体积生产溶液1.0-2.0体积的乙醇(95-99.5％)。从该溶液中沉淀出产物。该沉淀持续＞1小时。

氧化的葡萄糖醛酸/艾杜糖醛酸的还原

倾倒和弃除母液后，通过添加净化水溶解沉积物直至获得15-30％w/v的生产溶液浓度。保持13-17℃的温度，将溶液的pH调节至5.5-6.5。然后向溶液中加入130-150克硼氢化钠并使其溶解，其pH立即上升至pH10-11，并且继续反应14-20小时。记录该反应时期之前和之后的溶液的pH。该反应时间后，缓慢加入稀酸以调节pH值至4，这降解剩余的硼氢化钠。维持pH445-60分钟后，用稀NaOH溶液调节溶液的pH至7。

酸水解以获得多糖链的解聚

将稀酸加入到溶液中直至获得pH3.5(可接受的范围是3.2-3.8)。保持温度在50-55℃，同时搅拌溶液3小时+/-10分钟。然后加入稀NaOH溶液直至获得pH7.0，并且将反应溶液冷却至13-17℃的温度。然后加入氯化钠(NaCl)直至获得0.2-0.3mol/升的浓度。

产品的纯化

去除生产添加物和杂质，添加反离子并过滤

然后将一体积生产溶液加入1.5-2.5体积的乙醇(95-99.5％)中，然后于＞2000G，且＜20℃离心20-30分钟，然后倾倒并弃除上清液。

然后，将通过离心获得的产品糊状物溶解于净化水中以获得10-20％w/v的产品浓度。然后，加入NaCl以获得0.20-0.35mol/升的浓度。进一步，每体积生产溶液加入1.5-2.5体积的乙醇(95-99.5％)，其从溶液中沉淀产品。然后，于＞2000G，且＜20℃离心20-30分钟，然后倾倒并弃除上清液。

接下来，向剩余糊状物中加入净化水以溶解。目前的产品浓度在10-20％w/v的范围。现在将产品溶液的pH调节至6.5-7.5。然后过滤溶液以去除任何微粒。然后，向一体积生产溶液中加入1.5-2.5体积的乙醇(95-99.5％)。随后，于＞2000G，且＜20℃离心20-30分钟，然后倾倒并弃除上清液。

降低沉淀糊状物的尺寸和水含量

然后，用2升体积的乙醇填充玻璃反应器。在搅拌乙醇时添加沉淀糊状物。机械搅拌固化糊状物并且用乙醇替换存在的水以提供均质颗粒混悬液。1-2小时后停止搅拌，然后允许颗粒沉积，然后倾倒出母液。重复该程序两次。在聚丙烯(PP)过滤器上分离沉淀物。重复该过程两次以上。去除过量的液体后，使颗粒过筛以获得更小和均匀尺寸的颗粒。

真空干燥

均匀地将产品分布于两个预先称重的托盘上，并将其置于真空箱中。用真空泵降压，注意获得的实际压力，并将托盘加热至35-40℃，同时持续记录温度。此时，氮蒸汽通过干燥器，同时维持干燥器中的低压。当获得恒定重量时，即没有发现进一步的蒸发，可视为干燥完成。将产品分配、包装并防湿干燥。在20-25℃温度的干燥区域进行储存。

可以通过常规无菌生产过程将如此生产的产品制成药物产品，例如含有150mg/mL的化学修饰的肝素活性剂和15mM磷酸钠的溶液，pH6-8。如此获得的药物产品旨在用于静脉内或皮下施用。所获得的化学修饰的肝素，DF02是具有所设计的6.5-9.5kDa的平均分子量和基本上无抗凝血活性的肝素的解聚形式。

DF02具有多糖聚合物的粒径分布，其中对应于1.2-15kDa的分子量n在2-25的范围内。主要尺寸是对应于3.6-9.6kDa的分子量6-16个二糖单元。

通过实际检测可以发现，在碱性溶液中氧化的肝素制剂的反应产生了相对于得到的肝素的最佳药学功能的过短的链，或者缺少适当的硫酸化程度的链。进一步通过实际检测显示，在pH为1以下的溶液中处理肝素制剂导致产品的去硫酸化，因此产生相比于最佳的药物作用更差的化学修饰的肝素。

表1 DF02(几个批次)中多糖分布及其对应的以重量的累积％计的分子质量

重均分子量的对应值Mw落入6.5-9.5kDa的范围。

表2 单一批次DF02中多糖分布及其对应的以重量的累积％计的分子质量

重均分子量的对应值Mw为7.4kDa。

实施例2

实施例2代表根据实施例1的生产方法的一个修改版本。修改了某些生产参数，例如过程温度，其目的是防止在生产的初始部分中任何的非特异性解聚。

葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，抗凝血活性的删除

将约3000克的肝素溶解于净化水中以获得10-20％w/v的溶液。将该溶液的pH调节至4.5-5.5。然后向生产溶液中加入偏高碘酸钠(NaIO₄)，高碘酸盐的量为肝素重量的15-25％。再次将pH调节至4.5-5.5。遮盖反应器以使反应避光。在持续搅拌并保持温度在13-17℃使生产溶液反应22-26小时，其中在最后两个小时内使温度降至约5℃。测定并记录反应时期最后的pH。

氧化反应的终止和含碘化合物的去除

在仔细搅拌下，于约5℃的温度，经过0.5-1小时将乙醇(95-99.5％)加入反应混合物中。待添加的乙醇的体积为每体积生产溶液1-2体积乙醇的范围。然后允许氧化的肝素沉淀并沉积15-20小时，然后倾倒并弃除母液。

然后，将沉积物溶解于净化水中以获得15-30％w/v的生产溶液。加入NaCl以获得生产溶液中0.15-0.30mol/升的浓度。继续搅拌另外的0.5-1小时，同时保持温度在约5℃。然后，在仔细搅拌下，经过0.5-1小时，向该溶液加入每体积生产溶液1.0-2.0体积的乙醇(95-99.5％)。从该溶液中沉淀出产物。该沉淀持续＞1小时。

氧化的葡萄糖醛酸/艾杜糖醛酸的还原

根据实施例1进行该步骤。

酸水解以获得多糖链的解聚

根据实施例1进行该步骤，其不同之处在于在用NaOH使pH升至7.0之前使过程时间延长约两小时。

获得含有例如150mg/ml化学修饰的肝素活性剂的药物产品的接下来的流程步骤与实施例1中所述的步骤相同。

通过进行根据实施例2的流程步骤，获得了具有实施例1表1中所阐明的多糖分子量分布的化学修饰的肝素。

实施例3

实施例3代表根据本发明的化学修饰的肝素的另一个生产方法，将其修改为在引入任何沉淀步骤之前，直接使得从氧化步骤获得的生产溶液经受强还原剂。

葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，抗凝血活性的删除

将约3000克的肝素溶解于净化水中以获得10-20％w/v的溶液。将该溶液的pH调节至4.5-5.5。然后向生产溶液中加入偏高碘酸钠(NaIO₄)，高碘酸盐的量为肝素重量的15-25％。再次将pH调节至4.5-5.5。遮盖反应器以使反应避光。在持续搅拌下并保持温度在13-17℃使生产溶液反应22-26小时。测定并记录反应时期最后的pH。

氧化的葡萄糖醛酸/艾杜糖醛酸的还原和氧化含碘化合物的消除

在保持13-17℃的温度同时，将溶液的pH调节至5.5-6.5。然后向溶液中加入130-200克硼氢化钠并使其溶解，其pH立即上升至pH10-11，并且继续反应14-20小时。记录该反应时期之前和之后的溶液的pH。该反应时间后，缓慢加入稀酸以调节pH值至4，这降解剩余的硼氢化钠。维持pH445-60分钟后，用稀NaOH溶液调节溶液的pH至7。

含碘化合物的去除

在仔细搅拌下，于20-25℃的温度，经过0.5-1小时，将乙醇(95-99.5％)加入反应混合物中。待添加的乙醇的体积为每体积生产溶液1-2体积乙醇的范围。然后允许氧化的和随后还原的肝素沉淀并沉积15-20小时，然后倾倒并弃除母液。

接下来，将沉积物溶解于净化水以获得15-30％w/v的生产溶液。添加NaCl以获得生产溶液中0.15-0.30mol/升的浓度。持续搅拌另外的0.5-1小时，同时维持15-25℃的温度。然后在仔细搅拌下，经过0.5-1小时，向该溶液中添加每体积生产溶液1.0-2.0体积的乙醇(95-99.5％)。从该溶液中沉淀出产品。该沉淀持续＞1小时。

酸水解以获得多糖链的解聚

倾倒并弃除母液后，通过添加净化水溶解沉积物直至获得15-30％w/v的生产溶液。

将稀酸加入到溶液中直至获得pH3.0。保持温度在50-55℃，同时搅拌溶液5至10小时。解聚过程可以随后是通过GPC-HPLC的分子量同进程分析以确定反应所需要的实际时间。然后加入稀NaOH溶液直至获得pH7.0，并且将反应溶液冷却至13-17℃的温度。然后加入氯化钠NaCl直至获得0.2-0.3mol/升的浓度。

可选地，为了类似地控制平均分子量，可以添加稀酸以获得3.5的pH，但是为了完成可比较水平的水解，过程时间被从5至6小时延长至8至9小时。根据两种可选方案，很好地将平均分子量保持在6.5和9.5kDa的规格范围内。

获得含有例如150mg/ml化学修饰的肝素活性剂的药物产品的剩余流程步骤与实施例1中所述的步骤相同。

通过进行根据实施例3的流程步骤，获得了具有实施例1表1中所阐明的多糖分子量分布的化学修饰的肝素。

表3 在5至6.5ppm的范围内与肝素相比存在于¹H-NMR波谱的信号强度

表3是根据实施例1至3生产的化学修饰的肝素的5.0至6.5ppm范围内的¹H-NMR波谱比较研究结果。

表3确认了根据实施例3的过程生产的化学修饰的肝素导致¹H-NMR波谱中缺少5.90ppm至6.14ppm范围内的意外信号，该范围相当于肝素的范围。这些信号显示与含有部分不饱和的、双键结构的葡萄糖胺相关，其可能进一步经历化学修饰并导致产品的变色。换言之，根据实施例3的过程没有产生常规肝素或低分子量肝素的质子波谱中意想不到的不明残基或结构。

为了确认根据本发明的方法有助于保持合意水平的硫酸化的多糖链，使用硫酸根测量电极对从酸性水解步骤得到的生产液体的样品，即来自于未经受化学修饰的肝素产品的后处理和纯化的直接连续步骤的生产液体的样品进行测试。结果证明从多糖释放的(失去的)硫酸根通常在1500ppm以下。换言之，该测试确认本发明的方法诱导硫酸根基团的失去为每100个二糖单元的二糖单元不超过一个硫酸根基团，根据本发明的化学修饰的肝素包含一个硫酸根基团/艾杜糖醛酸，I2S和对于主要的葡萄糖胺变体，GlcNS为2个硫酸根基团。因此，根据本发明的化学修饰的肝素对应于肝素保持了至少90％的硫酸根基团。

根据实施例3的过程制备的化学修饰的肝素和后处理的产品展现了400nm处非常低的吸光度(10％溶液)。当分别经受包括pH3.5或3.0的水解的过程时，产品的吸光度值在0.02AU至0.04AU之间变化。该低的吸光度值确认最小化了源于美拉德(Maillard)型副反应的任何与变色相关的非特异性解聚的作用(于400nm测定吸光度)，并且预期了根据本发明的化学修饰的肝素产品的合适的稳定性。

实施例4

抗止血和抗凝血作用

在雄性、成年和幼年斯普拉-道来氏(Sprague Dawley)大鼠中进行DF02对于凝血参数和出血的作用的研究。还研究了肝素和LMWH制剂(达肝素(Fragmin))以用于比较。基本试验程序如下：

静脉给药测试样品后15分钟，在尾巴的背侧中部纵切开大鼠。切口为9mm长和1mm深，并且使用模板设备定型。使得切口处出血模糊直至出血停止。测定可以观察到的可视出血期间的时间长达25分钟。出血时间越长，施用试剂的抗凝血作用越显著。

成年大鼠

给药后四十分钟，通过全出血处死大鼠。从血液制备柠檬酸盐稳定的血浆。将血浆以1或0.5mL的整份储存于70℃直至APTT和PT分析。

在成年大鼠中检测了以下化合物和剂量(每组8只大鼠)：

·生理盐水：(阴性对照)

·肝素：0.7、1.5、3.5和7.0mg/kg

·达肝素：1.5、3.5、7.0和35mg/kg

·DF02：3.5、7.0、35、70、105、210、350和700mg/kg

幼年大鼠

在14±1天龄的幼年大鼠中检测了以下化合物和剂量(每组8只大鼠)：

2.生理盐水：(阴性对照)

3.DF02：7.0、35、70和105mg/kg

在成年大鼠中所测定的出血时间和凝血参数揭示DF02在大鼠中具有低的抗凝血作用。DF02的效力较抗凝血肝素和达肝素低，尽管它们对于所有参数均具有深刻的影响，这种作用与讨论的剂量直接相关。对于PT的作用太弱以至于不允许比较评估。

在幼年动物中确定的出血时间和凝血参数提示DF02在幼年大鼠中也具有低的抗凝血作用。幼年大鼠中出血时间和凝血参数的变化在成年大鼠的相同的范围内。如在成年大鼠中那样，在幼年大鼠中对于PT的作用也弱。

为了进一步理解化学修饰的肝素化合物的抗凝血效力的不同，计算了估计的等价相对剂量(表4)。根据如大鼠出血模型中测定的对于出血时间和APTT的作用，计算估计的等价相对剂量之间的关系。相对于未分级的肝素进行归一化或比较，参见下表4。

表4

相对剂量

DF02

肝素

达肝素

出血时间(分钟)	30-50	1	5
				APTT	30-40	1	5

下表5显示通过抗因子Xa和抗因子IIa分析的DF02的特异性抗凝血活性。

表5

为了比较，未分级肝素(UFH)的对应值为至少180IU/mg。

实施例5

疟疾感染的血液中的玫瑰结和细胞粘附的考察

已经考察了DF02在体外疟疾模型中的作用，例如破坏感染和未感染红细胞的玫瑰结，并预防或破坏感染红细胞对内皮的细胞粘附。在这两种模型中，DF02均以剂量依赖方式显示功效。在实地研究中DF02表明显著的功效，其中体外测试了从中等或复杂疟疾患者得到的新鲜被寄生的红细胞(pE)的玫瑰结。还测试了DF02对于裂殖子入侵红细胞的体外阻断作用。在该模型中DF02表明每毫克等同于肝素的效力。

结果

在玫瑰结和细胞粘附试验中，已经测试了高度玫瑰结和多粘附寄生虫克隆(FCR3S1.2)以及从重症患者获得的寄生虫分离株对于DF02的敏感性。DF02以剂量依赖的方式破坏许多测试的寄生虫培养物的玫瑰结，并且在一些寄生虫中总的或近乎总的玫瑰结的破坏达到1000μg/ml(图5)。临床分离株的玫瑰结也对DF02敏感。DF02已经进一步在本领域中考察。用DF02处理四十七种寄生虫，所述寄生虫来自患有显示玫瑰结表型的疟疾的儿童。91％的从严重/复杂疟疾儿童收集的玫瑰结血液样本在最高测试浓度(1000μg/ml)显示出50％的玫瑰结破坏(图6)。通过为了模拟体内血液流动条件的动态培养类似地评价DF02对于pE结合到内皮细胞(细胞粘附)的作用。通过同时加入pE和DF02至内皮检测了对初级结合至内皮细胞的直接作用(细胞粘附阻断)。与未处理的样品相比较，DF02能够阻断高达80％的pE结合。为了测试DF02从内皮逐出已经结合pE的效率，允许pE粘附至内皮，然后与DF02在不同终浓度孵育(细胞粘附破坏)。DF02的细胞粘附破坏导致高达80％的结合的减少(图7)。一些寄生虫培养物较其它更敏感。

实施例6

DF02对于红细胞裂殖子入侵的体外作用

恶性疟原虫的红细胞内生命周期短，并且pE每48小时破裂，而且释放的寄生虫必须再次入侵新鲜的红细胞。以往已经证明肝素通过阻断红细胞的裂殖子入侵体外抑制恶性疟原虫的持续培植。因此，使用体外试验测定DF02对于红细胞裂殖子入侵的阻断作用(图8)。DF02以剂量依赖的方式阻断裂殖子入侵并且抑制达到80％以上。已发现DF02的抑制作用等价于标准肝素的抑制作用。

方法

使用化学修饰的肝素和未分级肝素进行裂殖子入侵抑制试验。在增加浓度的化学修饰的肝素或未分级肝素的存在下，于37℃，在微培养物(100ul)中生长具有0.4％的寄生虫血症和2％的血细胞比容的成熟的pE(滋养体)同步化的恶性疟原虫培养物24-30小时。为了定量寄生虫血症，用吖啶橙将样品染色10秒钟，然后使用Becton Dickinson的FACS设备分析样品。每个样品最少收集50000个细胞。

结果

使用体外分析测定了DF02和标准肝素对于红细胞裂殖子入侵的阻断作用。DF02以剂量依赖的方式阻断裂殖子入侵并且达到80％的抑制。已发现DF02的抑制作用等价于标准肝素的抑制作用。

实施例7

隐蔽感染的红细胞的体内释放

在大鼠中，体内已经研究了DF02对于将结合的感染的红细胞从肺部微血管释放入血液循环的功效。DF02表明了释放入pE循环。在大鼠模型中，物质和pE的注射阻断高达80％的pE结合于大鼠的肺。相似地，当第一次注射pE时，并且允许结合于动物的微血管60分钟，然后静脉注射DF02，已发现通过该处理释放了高达60％的之前隐蔽的pE(图9)。

方法

将人类pE体外培养并富集至70％以上的寄生虫血症。在注射入动物之前，用^99m锝放射性标记人类感染的红细胞。将大鼠麻醉，并将标记的pE红细胞静脉注射至尾静脉中。经处理的大鼠或者是用标记的pE与不同浓度的化学修饰的肝素共同注射，或者先注射pE，3分钟后注射不同浓度的化学修饰的肝素、未分级肝素、或硫酸葡聚糖，而对照动物注射了标记的pE而不注射DF02、肝素或硫酸葡聚糖。使用γ照相机监测标记细胞的分布30分钟。通过将切除肺的活性与整个动物的活性的比较，计算肺部中隐蔽的标记细胞的相对量。

大鼠体内化学修饰的肝素对pE隐蔽的作用

在大鼠中进行pE的隐蔽，包括玫瑰结和细胞粘附的研究。在该体内系统中，不同菌株和克隆的pE以PfEMP1-依赖方式强力粘附在大鼠肺中。该系统显示化学修饰的肝素DF02对于pE的隐蔽-阻断作用，具有最大80％(大约)的隐蔽的平均降低。将未感染标记的人类红细胞与化学修饰的肝素的共同注射与标记的未感染红细胞而无化学修饰的肝素的注射进行比较。其无明显差异，并且保持的整体量非常低。在标记的pE已经隐蔽之后，还用化学修饰的肝素处理大鼠，以研究化学修饰的肝素释放pE入循环的能力。隐蔽被降低了约50％。

实施例8

在疟疾患者中Sevuparin sodium(无对应中译文)的临床研究

Sevuparin/DF02作为辅助治疗在感染非复杂的恶性疟疾的受试者中的I/II期， 随机，开放标记，活性对照，平行分配，安全性/疗效的研究。

恶性疟原虫感染的红细胞(pE)在许多重要器官中具有在深微血管中隐蔽的能力。隐蔽性质通过阻碍血液流动、降低的氧输送和连续的组织损伤而参与到疾病的严重程度和病理过程的产生，并且是基于滋养体pE的粘附在血管内皮和未感染的红细胞的能力。粘附pE的内皮细胞和红细胞共同作用，是导致微血管阻塞的重要机制，并且因此导致严重的疟疾临床症状。

Sevuparin sodium作为静脉注射输液与阿托伐醌/氯胍()联合施用，用作感染非复杂疟疾的女性和男性受试者(18至65岁)的抗疟疾治疗。剂量递增部分(第1部分)之后是用Sevuparin sodium和治疗相对于单独治疗的开放标记的，随机的比较(第2部分)。每天4次将Sevuparin sodium施用给每个患者，并且根据标记指示将阿托伐醌/氯胍()施用给每个患者。该研究组(study arm)是Sevuparin sodium与阿托伐醌/氯胍()的联合和阿托伐醌/氯胍()单独作为对照。

方法

将DF02处理的患者的寄生虫清除曲线和顺序外周血寄生虫阶段与对照组相比较。DF02影响到细胞粘附和因此的含有更成熟形式寄生虫的pE的隐蔽，寄生虫血症的暂时上升和外周血液中寄生虫的更成熟阶段的出现。

使用阶段分布、阶段具体隐蔽的比例和以奎宁作为参数的阶段特异性寄生虫清除，将清除曲线相对于外周血阶段建模。类似的方法已经在恶性疟疾中将左旋咪唑作为抗粘附辅助治疗的评价中得到训练(Dondorp等人J Infect Dis2007；196:460–6)。通过比较整体数量(以每微升寄生虫计)和在外周血中经过长达72小时的时间观察到的滋养体-和裂殖体-阶段寄生虫的寄生虫血症(以百分比计)，将其确定为时间-寄生虫血症曲线下的面积，来评价DF02处理的患者和对照组之间的隐蔽的不同。寄生虫的良好定义的形态学阶段由以下组成：微小环、小环、大环、早期滋养体、中期滋养体、晚期滋养体和裂殖体[Silamut K等人，Am J Pathol1999；155:395–410]。寄生虫的无性阶段的时期(从裂殖子入侵起)衔接的形态阶段(如通过体外培养所评估)分别是12、17、22、28、37、和42小时。入院时一群大环形式6h后发展到早期滋养体阶段。其它匹配的群组包括入院时(onadmission)的微小环和12h后合并的小环和大环，入院时的小环和6h后的大环、12h后的早期滋养体和18h后的中期滋养体，以及入院时的大环和或者12h后的中期滋养体或者18h后的晚期滋养体。通过2个独立的显微镜工作者(其对药物分配的研究不知情)进行外周血切片的评估。

Claims (32)

1.化学修饰的肝素，其具有10IU/mg以下的抗因子II活性，高达10IU/mg的抗因子Xa活性，和约6.5至约9.5kDa的平均分子量，其中多糖链：

(i)保持至少90％的对应天然肝素的硫酸根基团；

(ii)对应于1.2至15kDa的分子量，包含2至25个二糖单元；

(iii)当与天然肝素的多糖链相比时，具有降低的提供抗凝血酶介导的抗凝血作用的化学完整的糖序列；和

(iv)当与天然肝素相比时，具有降低的未硫酸化艾杜糖醛酸和/或葡萄糖醛酸单元。

2.根据权利要求1所述的化学修饰的肝素，其中所述主要出现的多糖链具有6至16个二糖单元并具有约3.6至约9.6kDa的分子量。

3.根据权利要求1或2所述的化学修饰的肝素，其中至少30％的所述多糖链具有至少8kDa的分子量。

4.根据权利要求1至3任一项所述的化学修饰的肝素，其含有苏糖酸残基或苏糖酸衍生物封端的多糖链。

5.根据权利要求1至4任一项所述的化学修饰的肝素，其中所述多糖的所述主要二糖为具有以下化学结构的二糖：

其中R’为苏糖酸残基或苏糖酸衍生物残基；并且n是2至25的整数。

6.根据权利要求1至5任一项所述的化学修饰的肝素，其包含以下化学结构的二醇-分裂残基：

7.根据权利要求1至6任一项所述的化学修饰的肝素，其中3-15％的所述多糖链具有至少15kDa的分子质量。

8.根据权利要求1至7任一项所述的化学修饰的肝素，其中25-47％的所述多糖链具有至少9kDa的分子质量。

9.根据权利要求1至8任一项所述的化学修饰的肝素，其中40-60％的所述多糖链具有至少7kDa的分子质量。

10.根据权利要求1至9任一项所述的化学修饰的肝素，其中60-80％的所述多糖链具有至少5kDa的分子质量。

11.根据权利要求1至10任一项所述的化学修饰的肝素，其中至少85％的所述多糖链具有至少3kDa的分子质量。

12.根据权利要求1至11任一项所述的化学修饰的肝素，其中至少95％的所述多糖链具有至少2kDa的分子质量。

13.根据权利要求1至12任一项所述的化学修饰的肝素，其具有5.0至6.5ppm范围内的¹H-NMR波谱，其符合来自于天然肝素的缺少任何0.1(mol)％以上量级的质子信号的¹H-NMR波谱。

14.根据权利要求1至13任一项所述的化学修饰的肝素，其用于治疗。

15.根据权利要求1至13任一项所述的化学修饰的肝素，其用于治疗疟疾。

16.根据权利要求1至13任一项所述的化学修饰的肝素在制备用于治疗疟疾的药物中的用途。

17.一种治疗疟疾的方法，其包含向需要该治疗的患者施用治疗有效量的根据权利要求1至13任一项所述的化学修饰的肝素。

18.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至13任一项所述的化学修饰的肝素，以及药学上和药理学上可接受的载体。

19.一种制备化学修饰的肝素的方法，所述化学修饰的肝素具有高达10IU/mg的抗因子II活性，高达10IU/mg的抗因子Xa活性，和约6.5至约9.5kDa的平均分子量(重均，Mw)，所述方法包含以下连续步骤：

(a)通过使未分级肝素经受能够氧化非硫酸化的糖残基的氧化剂而选择性氧化未分级肝素；

(b)还原所得到的氧化的糖残基；和

(c)通过约3至约4的酸性pH的水解作用解聚所述肝素链。

20.根据权利要求19所述的方法，其进一步包含至少一个消除剩余的氧化剂的步骤。

21.根据权利要求20所述的方法，其中至少一个消除步骤包含去除所述氧化剂的还原形式。

22.根据权利要求19至21任一项所述的方法，其在所述还原步骤(b)和所述解聚步骤(c)之间包含消除任何剩余的氧化剂和去除氧化剂的还原形式的步骤。

23.根据权利要求22所述的方法，其包含通过约3.0至约3.5的酸性pH的水解作用解聚所述肝素链。

24.根据权利要求20至23任一项所述的方法，其中所述消除步骤包含以足够使化学修饰的肝素沉淀的量添加醇。

25.根据权利要求19至24任一项所述的方法，由该方法在至少20℃的温度进行解聚。

26.根据权利要求19至25任一项所述的方法，由该方法使化学修饰的肝素富集具有约5.5至约10.5kDa的分子量的多糖链。

27.根据权利要求19至26任一项所述的方法，由该方法用高碘酸盐化合物选择性氧化非硫酸化艾杜糖醛酸和/或非硫酸化葡萄糖醛酸。

28.一种通过根据权利要求19至27任一项所述的方法制备的化学修饰的肝素。

29.一种组合，其包含根据权利要求1至15任一项所述的化学修饰的肝素和其它治疗疟疾的药物。

30.根据权利要求29所述的组合，其中所述其它药物是阿托伐醌/氯胍。

31.根据权利要求29所述的组合，其中所述其它药物是青蒿琥酯。

32.根据权利要求29至31任一项所述的组合，其中所述化学修饰的肝素是Sevuparin sodium。