CN109481692A - 一种青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物和应用，该衍生物是具有下列通式(1)的高分子化合物或所述通式(1)的化合物在药学上可接受的盐：式(1)中，青蒿琥酯与肝素通过酯键相连。所述的青蒿琥酯肝素衍生物中，青蒿琥酯的质量百分含量为5％～50wt％。青蒿琥酯肝素衍生物的药物组合物包括所述的青蒿琥酯肝素衍生物或所述的青蒿琥酯肝素衍生物与增效剂的混合物。该衍生物是青蒿琥酯与肝素通过酯键相连，药物组合物是青蒿琥酯肝素衍生物自组装成粒径为10‑1000纳米的纳米颗粒，或负载抗疟药物的纳米颗粒，用于制备治疗或预防由疟原虫引起的疟疾的药物。

Description

一种青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物和应用
技术领域
本发明涉及一种青蒿琥酯-肝素衍生物及其药物组合物和在药学中的应用，属于医药制造的技术领域。
背景技术
寄生虫病是寄生虫侵入人体而引起的疾病。因虫种和寄生部位不同，引起的病理变化和临床表现各异。本类疾病分布广泛，世界各地均可见到，以贫穷落后、卫生条件差的地区多见，热带和亚热带地区更多，感染的人群主要是接触疫源较多的劳动人民及免疫力较低的儿童。
疟疾是热带地区最重要的寄生虫疾病，也是疟原虫寄生于人体所引起的一种传染病。患者经疟蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染，不同的疟原虫分别引起间日疟、三日疟、恶性疟及卵圆疟。疟疾主要表现为周期性规律发作，全身发冷、发热、多汗、长期多次发作后，可引起贫血和脾肿大。在严重的病例中会引起黄疸、癫痫发作、昏迷或死亡。
疟疾流行于102个国家和地区，据世界卫生组织(WHO)估计，有二十亿人口居住在流行区。热带及亚热带地区，位于赤道周围的宽大带状区域，特别是在非洲、东南亚和中、南美洲的一些国家，恶性疟死亡率极高，以非洲疫情最甚，那里的任何居民从出生到死亡，每年感染这种疾病多次。据WHO统计，2016年全世界的疟疾病例共有2亿例，造成约50万人死亡，90％发生在非洲。
奎宁最早用于治疗疟疾，氯喹也是非常有效的抗疟疾药物。20世纪中期以后出现了一些新的药物，中国科学家研制的青蒿素、双氢青蒿素等有很好的抗疟疾效果，得到广泛的应用，但是青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯的水溶性均非常差，体内半衰期短，生物利用度低。
随着抗疟疾药物的大量使用，疟原虫逐渐对于几种药物发展出抗药性，例如：具有氯喹抗药性的恶性疟已经遍及世界各地。对两种药物磺胺多辛/乙胺嘧啶联合使用的抗药性在南亚和南美用氯喹难治的地带也已经扩散。另外，青蒿素的抗药性问题在部分东南亚地区日益严重。近年来，柬埔寨西部和北部地区、泰国、越南和缅甸东部地区，疟原虫已普遍发展出对最有效的抗疟药物青蒿素的抗药性。世界卫生组织建议疟疾的治疗方案是基于青蒿素类药物的联合用药，选用的抗疟疾药物包括甲氟喹、苯芴醇或磺胺多辛/乙胺嘧啶等。
因此，有必要发明一种更有效的抗疟药物，具有赋予靶向疟原虫感染的红细胞的功能，提高体内半衰期和生物利用度，克服抗药性，提高药效。
发明内容
技术问题：本发明的目的是提供一种青蒿琥酯肝素衍生物，具有自组装和共组装成纳米颗粒的能力，组装的纳米颗粒具有靶向疟原虫感染的红细胞的功能。本发明同时提供一种青蒿琥酯肝素衍生物的药物组合物及其在制备抗疟药物中的应用。
技术方案：本发明的一种青蒿琥酯肝素衍生物，该衍生物是具有下列通式(1)的高分子化合物或所述通式(1)的化合物在药学上可接受的盐：
式(1)中，青蒿琥酯与肝素通过酯键相连。
所述的青蒿琥酯肝素衍生物中，青蒿琥酯的质量百分含量为5％～50wt％。
本发明的青蒿琥酯肝素衍生物的药物组合物包括所述的青蒿琥酯肝素衍生物或所述的青蒿琥酯肝素衍生物与增效剂的混合物。
所述的增效剂是以下物质的任一种：苯芴醇、阿莫地喹、甲氟喹、磺胺多辛、乙胺嘧啶、氨酚喹林、氯喹、三哌喹、乙氢去甲奎宁、伯氨喹、常山碱、奎宁、氨喹酯、氨酚喹、卡马喹、克疟喹、磷酸伯氨喹、咯奈啶、磷酸氯喹、磷酸萘酚喹、羟基哌喹、阿替夫林、磷酸羟基哌奎。
所述的药物组合物为粒径10-1000纳米的颗粒。
所述的药物组合物是固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂，含有药效学上可接受的载体。
所述青蒿琥酯肝素衍生物和药物组合物，其纳米颗粒的制备由青蒿琥酯肝素衍生物化合物与助剂或增效剂的混合物，通过薄膜分散法、逆相蒸发法、超声波分散法、喷雾干燥法或高压均质法制备。
本发明的青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物在制备抗疟药物的应用。
本发明的青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物在制备治疗或预防血吸虫病、弓形虫病、利什曼病、丝虫病或钩虫病药物的应用。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优点：
本发明涉及一种青蒿琥酯肝素衍生物、药物组合物及其在制备预防和治疗疟疾药物中的用途属于首次公开。
本发明的青蒿琥酯肝素衍生物具有自组装功能，自组装成的纳米颗粒粒径10-1000纳米；
本发明的青蒿琥酯肝素衍生物或与助剂、增效剂的药物组合物共组装制备成纳米颗粒，具有治疗或预防疟疾的作用；
本发明的药物组合物具有控制释放青蒿琥酯的作用，延长药物半衰期，具有更好的抗疟疾复燃效果；
本发明的药物组合物具有抵抗疟原虫耐药性的功能；
本发明的药物组合物纳米颗粒具有负载抗疟药物的功能，负载抗疟药物的药物组合物具有高效抗疟作用；
本发明的药物组合物纳米颗粒具有靶向疟原虫感染的红细胞的功能，易于进入细胞内，发挥药效；
本发明的药物组合物毒性低。
附图说明
图1青蒿琥酯肝素衍生物的合成路线。
图2动态光散射法测量青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒尺寸。
图3青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒透射电镜图。
图4青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒和青蒿琥酯的溶血率(标尺100纳米)。
图5青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒和青蒿琥酯血药浓度变化(静脉注射)。
图6青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒在不同条件下(pH 7.4、5.0)青蒿琥酯释放曲线。
图7青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒靶向疟原虫感染红细胞的透射电镜观察，图中黑圈处半透明部分为被红细胞摄入的纳米颗粒。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明的的技术方案做进一步详细说明。
本发明的本发明的一种青蒿琥酯肝素衍生物是具有下列通式(1)的高分子化合物或所述通式(1)的化合物在药学上可接受的盐：
式(1)中，青蒿琥酯与肝素通过酯键相连。青蒿琥酯-肝素衍生物中青蒿琥酯的含量为5％～50％。
本发明的药物组合物是青蒿琥酯-肝素衍生物或所述的青蒿琥酯-肝素衍生物与药效学上可接受的载体，或所述的青蒿琥酯-肝素衍生物与增效剂。所述的增效剂是苯芴醇、阿莫地喹、甲氟喹、磺胺多辛、乙胺嘧啶、氨酚喹林、氯喹、三哌喹、乙氢去甲奎宁、伯氨喹、常山碱、奎宁、氨喹酯、氨酚喹、卡马喹、克疟喹、磷酸伯氨喹、咯奈啶、磷酸氯喹、磷酸萘酚喹、羟基哌喹、阿替夫林、磷酸羟基哌奎。
本发明的药物组合物为粒径10-1000纳米的纳米颗粒。
本发明的药物组合物是固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。为了制成各种剂型，可以广泛使用本领域公知的各种载体。
本发明的药物组合物在制备抗寄生虫病药物中的应用，该应用是所述青蒿琥酯肝素衍生物或其药学可接受的盐或所述的青蒿琥酯肝素衍生物与增效剂，与药学上可以接受的载体制成药物组合物。
本发明的青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物应用于制备治疗或预防疟疾的药物。
本发明的青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物也可以应用于制备治疗或预防血吸虫病、弓形虫病、利什曼病、丝虫病或钩虫病的药物。
本发明药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明青蒿琥酯肝素衍生物或本发明青蒿琥酯肝素衍生物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药使用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。
本发明青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物的给药途径可为注射给药，包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。
本发明青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。为了制成各种剂型，可以广泛使用本领域公知的各种载体。
由本发明青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物制成纳米颗粒，颗粒粒径10-1000纳米。
从活性筛选来看，本发明青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物表现良好的杀灭疟原虫作用。试验表明本发明化合物的无明显体内毒性。因此可作为抗疟疾药物用于动物，优选用于哺乳动物，特别是人。
本发明的青蒿琥酯肝素衍生物的制备方法：青蒿琥酯的羧基活化后与肝素反应，使之通过酯键相连，得到具有两亲性的青蒿琥酯肝素衍生物。键合到肝素分子上的青蒿琥酯的量采用紫外光谱法测量。青蒿琥酯肝素衍生物中青蒿琥酯的质量含量为5％-50％。
青蒿琥酯肝素衍生物和药物组合物纳米颗粒的制备方法：由本发明的青蒿琥酯肝素衍生物化合物与助剂或增效剂的混合物，通过薄膜分散法、逆相蒸发法、超声波分散法、喷雾干燥法或高压均质法等方法制备。
本发明的青蒿琥酯肝素衍生物具有两亲性，本发明青蒿琥酯肝素衍生物或与助剂、增效剂的混合物制备成纳米颗粒，具有可形成液体制剂、固体制剂、半固体制剂、灭菌制剂和无菌制剂的特性；本发明的青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物用于抗疟疾药物，具有靶向疟原虫感染的红细胞的功能，生物利用度高，无明显毒副作用。
下述通过实施例进一步说明本发明，但本发明不限于以下实施例。
实施例1：
青蒿琥酯肝素衍生物的合成(合成路线见图1)
肝素钠(HEP)150mg加入到10毫升二甲基乙酰胺(DMAc)中，加热至50℃，搅拌3小时，溶解完毕备用。青蒿琥酯(ART)0.768g(2mmol)溶于10毫升二甲基乙酰胺中，加入N,N'-羰基二咪唑(CDI)0.324g(2mmol)，室温下活化2小时。然后，活化的青蒿琥酯溶液滴加到肝素溶液中，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.122g(1mmol)，30℃下搅拌反应48小时。反应液体中加入KH2PO4溶液中和，用蒸馏水透析(MWCO:3500)24小时，去除小分子杂质。冷冻干燥得到青蒿琥酯肝素衍生物白色固体产物，用红外光谱和核磁共振谱表征。用紫外光谱法测量(标准曲线法)青蒿琥酯肝素衍生物中青蒿琥酯的质量百分含量为29.2％。FT-IR(KBr):1746cm-1v(-C＝O),1135cm-1v(-C-O-C-),866cm-1v(-OO-).1H-NMR(500MHz,D2O:DMSO-d6 1:2v/v)δ5.79(H-10,ART),5.70(H-12,ART),5.33(H-a,-CH-O-,HEP),5.27(H-b,-CH-O-,HEP),5.00-4.78(H-c,d,-C-CH-O-,-CH2-,HEP),4.50(H-e,-CH-,HEP),4.14-3.13(H-f-j,HEP),1.96(H-k,,-NHCOCH3,HEP),2.68-2.51(H-16,17,ART),2.46-1.76(H-4-7,8,9,12,ART),1.63(H-13,-CH3,ART),1.21(H-15,-CH3,ART),1.12(H-14,-CH3,ART)。
实施例2：
青蒿琥酯肝素衍生物的合成
本实验中试剂的摩尔比设定为ART:CDI:DMAP＝2:2:1。分别取肝素钠(HEP)30、90、180、270mg加入到二甲基乙酰胺(DMAc)中，加热至50℃，搅拌3小时，溶解完毕备用。适量青蒿琥酯(ART)溶于二甲基乙酰胺中，加入对应摩尔量的CDI，室温下活化2小时。然后，活化的青蒿琥酯溶液滴加到肝素溶液中，加入适量DMAP，30℃下搅拌反应48小时。反应液体中加入KH2PO4溶液中和，用蒸馏水透析(MWCO:3500)24小时，去除小分子杂质。冷冻干燥得到四种青蒿琥酯肝素衍生物白色固体产物，其中，青蒿琥酯的质量百分含量分别为5.1％，18.5％，35.3％，49.6％。
实施例3：
青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的制备
实施例1的青蒿琥酯肝素衍生物10毫克溶于1毫升二甲亚砜，逐滴加入到10毫升水中，快速搅拌。然后用蒸馏水透析(MWCO:3500)12小时，得到青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液，冷冻干燥得到青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒粉末。粒径分析结果(马尔文ZetasizerNanoZS90粒度仪)如下图2，平均粒径112纳米，表面电位-11.2mV。透射电镜(JEM-2100system，200kV，JEOL)测量纳米颗粒的形态如图3，呈球形结构。
实施例4：
青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的制备
实施例2的四种青蒿琥酯肝素衍生物各10毫克溶于1毫升二甲亚砜，逐滴加入到10毫升水中，快速搅拌。然后用蒸馏水透析(MWCO:3500)12小时，得到青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液，冷冻干燥得到四种青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒粉末。粒径由马尔文Zetasizer NanoZS90粒度仪测量，平均粒径110-180纳米，表面电位-10～-25mV。
实施例5：
负载甲氟奎的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的制备
实施例1的青蒿琥酯肝素衍生物10毫克和甲氟奎2毫克溶于1毫升二甲亚砜，逐滴加入到10毫升水中，快速搅拌。然后用蒸馏水透析(MWCO:3500)12小时，得到负载甲氟奎的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液，冷冻干燥得到负载甲氟奎的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒粉末。粒径由马尔文Zetasizer NanoZS90粒度仪分析，平均粒径130纳米，表面电位-21.2mV。
实施例6：
负载奎宁的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的制备
实施例1的青蒿琥酯肝素衍生物10毫克和奎宁3毫克溶于1毫升二甲亚砜，逐滴加入到10毫升水中，快速搅拌。然后用蒸馏水透析(MWCO:3500)12小时，得到负载奎宁的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液，冻干得到纳米颗粒粉末。粒径由马尔文ZetasizerNanoZS90粒度仪分析，平均粒径126纳米，表面电位-18.6mV。
实施例7：
负载苯芴醇的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的制备
实施例1的青蒿琥酯肝素衍生物10毫克和苯芴醇2毫克溶于1毫升二甲亚砜，逐滴加入到10毫升水中，快速搅拌。然后用蒸馏水透析(MWCO:3500)12小时，得到负载苯芴醇的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液，冻干得到纳米颗粒粉末。粒径由马尔文ZetasizerNanoZS90粒度仪分析，平均粒径132纳米。
实施例8：
负载咯奈啶的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的制备
实施例1的青蒿琥酯肝素衍生物10毫克和咯奈啶2毫克溶于1毫升二甲亚砜，逐滴加入到10毫升水中，快速搅拌。然后用蒸馏水透析(MWCO:3500)12小时，得到负载咯奈啶的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液，冷冻干燥得到负载咯奈啶的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒粉末。
实施例9：
负载常山碱的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的制备
实施例1的青蒿琥酯肝素衍生物10毫克和常山碱1毫克溶于1毫升二甲亚砜，逐滴加入到10毫升水中，快速搅拌。然后用蒸馏水透析(MWCO:3500)12小时，得到负载常山碱的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液。
实施例10：
负载伯氨喹的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的制备
实施例1的青蒿琥酯肝素衍生物10毫克和伯氨喹3毫克溶于1毫升二甲亚砜，逐滴加入到10毫升水中，快速搅拌。然后用蒸馏水透析(MWCO:3500)12小时，得到负载伯氨喹的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液，冷冻干燥得到负载伯氨喹的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒粉末。
实施例11：
负载氯喹的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的制备
实施例1的青蒿琥酯肝素衍生物10毫克和氯喹4毫克溶于1毫升二甲亚砜，逐滴加入到10毫升水中，快速搅拌。然后用蒸馏水透析(MWCO:3500)12小时，得到负载氯喹的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液，粒径由马尔文Zetasizer NanoZS90粒度仪分析，平均粒径134纳米。
实施例12：
青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的溶血性
实施例3的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒配制成浓度为1000μg/mL,100μg/mL and10μg/mL的溶液。志愿者新鲜血液离心15分钟后，红细胞部分用生理盐水洗涤三次。一只试管中加入0.5毫升红细胞和1毫升生理盐水，为阴性对照。一只试管加入0.5毫升红细胞和1毫升去离子水为阳性对照。三只试管中加入0.5毫升红细胞和1毫升生理盐水，分别加入浓度为1000μg/mL,100μg/mL and 10μg/mL的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液。试管在37℃震荡器中孵育3小时。3000rpm离心10分钟，上清液中的血红蛋白含量用紫外可见光谱测量(波长540nm)，溶血率计算：
(At-An)/(Ap-An)×100％，其中,At实验组的吸光度,Ap和An分别是阳性和阴性对照组的吸光度。结果如图4。
结果：可以看出，与阳性对照溶血率100％相比，青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的溶血率极低，1000μg/mL高浓度下，青蒿琥酯溶血率10.90％，而青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的溶血率低于5％,显示青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒具有良好的安全性，不引起溶血。
实验例13：
青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒药代动力学
BALB/c小鼠(雌性,5周,20-22g)分成2组(每组2只)。第一组青蒿琥酯溶液；第二组实施例3的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液(青蒿琥酯给药剂量10mg/kg，均为等青蒿琥酯摩尔剂量)。尾静脉注射药物PBS溶液。0.5,2,6,12,and 24
分别在预定时间(0.5小时,2小时,6小时,12小时,24小时)取血样，3000rpm离心10分钟获得血浆。100微升血浆中加入0.1M氢氧化钠溶液50微升，37℃水浴中孵育20min，使纳米颗粒降解。加入0.1N盐酸溶液50微升和甲醇100微升，5000rpm离心5分钟。上清液溶于100微升甲醇中，用HPLC(Agilent 1100,CA)分析测量(HPLC洗脱液：乙腈/水＝4/1，含0.1％TFA；流速:1.0mL/min；温度:25℃，测量波长:238nm)。动力学参数用软件DAS software处理(version 2.0.1,计量药理学专业委员会,中国).
结果：血液中药物浓度与时间关系如图5，计算得到药代动力学参数见表1。
可以看出，3小时内血液中青蒿琥酯基本代谢完毕，半衰期仅为1.39小时，青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒血液中滞留时间达到9小时以上，血液清除半衰期长达约5小，且最大药物浓度达到18.12μg/mL，高于青蒿琥酯的14.13μg/mL。此外，青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的生物利用度是青蒿琥酯的2倍以上,而血浆清除速率CL远低于青蒿琥酯的值。显示青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒长循环和突出的长效作用，以及更高的药物生物利用度。所以，青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒有很长的血液循环时间，很低的血浆清除速度。
表1.青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒药代动力学参数(静脉给药)
*参数:AUC,0-t曲线下面积；MRT0-t,滞留时间；Ke,消除速度常数；t1/2,消除半衰期；CL,血浆清除率；Cmax,血浆峰值浓度。
实施例14：
青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的药物释放试验
实施例3的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液10毫升(浓度1mg/mL)于透析袋中(MWCO 3500)。透析袋分别置于200毫升37℃的PBS缓冲液(pH 7.4)、PBS缓冲液(pH 5.0)，PBS缓冲液中含有0.5％吐温80，37℃培养箱中孵育。在预定时间(0.5h,1h,3h,5h,10h,15h,20h,24h)取样透析液10mL并加入等体积新缓冲液。透析液冻干后用2mL二氯甲烷抽提，干燥后用100微升二氯甲烷/甲醇(1:1,v/v)复溶，用高效液相色谱进行分析，产物出峰时间4.23分钟。(Agilent 1100色谱仪,Zorbax反相C18柱，150×4.6mm，5μm，进样量20μL，柱温25℃，检测波长λ＝210nm；淋洗液：乙腈/水＝4/1，含0.1％TFA；流速:1.0mL/min)。
结果：青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒降解后释放出的青蒿琥酯含量如图6所示。显然，在模拟血液的中性条件下(pH 7.4)，70小时释放出的青蒿琥酯为23.45％，显示良好的稳定性。模拟疟原虫食物囊泡的酸性条件下(pH 5.0)，释放出的青蒿琥酯大于80％。这是由于酸性条件下酯键水解。
实验例15：
青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的杀灭疟原虫试验
方法：SYBR Green I荧光法测量样品的杀灭疟原虫效果
药品样品：
a)青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液(实施例3)，PBS溶液，pH 7.4，浓度(均按等摩尔青蒿琥酯剂量)：5000nM,1000nM,200nM,40nM,8.0nM,1.6nM,0.32nM and 0.064nM。青蒿琥酯为对照组。
b)材料：疟原虫株(3D7)感染的人红细胞(0.5％parasitemia)，RPMI 1640完全培养基，二氧化碳培养箱(5％CO2,5％O2,平衡N2,37℃)。
100μL含培养基的药品样品(均按等摩尔青蒿琥酯剂量)加入到96孔板,然后每个孔中加入100μL疟原虫感染的红细胞(0.5％parasitemia)。药物终浓度保持5000nM,1000nM,200nM,40nM,8.0nM,1.6nM,0.32nM and 0.064nM。培养基为空白。二氧化碳培养箱中孵育48小时(37℃)。然后，避光条件下每个孔中加入50μL裂解缓冲液(含SYBR Green I)，继续孵育30分钟。用微板荧光仪测量荧光强度(Fluoroskan Ascent,Thermo，激发波长485，发射波长538nm)。数据用GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)进行非线性拟合，计算IC50值(n＝3)。
疟原虫P.falciparum 3D7感染的学红细胞与青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液(浓度0.5mg/mL)共孵育2小时(37℃)。将培养液滴加于透射电镜用铜网上制样，用透射电镜(TEM)观察记录纳米颗粒被红细胞摄入行为(见图7)。
结果：青蒿琥酯、青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒抑制疟原虫的效率具有剂量依赖性。青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒溶液的半抑制浓度IC50为11.26nM，对照组青蒿琥酯的IC50为6.49nM。
图7是青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒被感染疟原虫的红细胞摄入的结果，可以陷入红细胞膜表面的透明纳米颗粒，显示青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒靶向感染的红细胞的作用。
实验例16：
青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的抗疟活性试验
动物造模：昆明雄性小鼠，体重18-22g，分笼饲养，自由进食饮水，充分光照，每12小时明暗交替。实验前，待献血鼠体内疟原虫红细胞寄生率达到15％-20％时输血感染实验鼠。
动物分组：按体重随机分为青蒿琥酯组(第1组)、实施例3的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒组(第2组)、实施例5的负载甲氟奎的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒(第3组)、实施例6的负载奎宁的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒(第4组)、实施例7的负载苯芴醇的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒(第5组)、实施例8的负载咯奈啶的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒(第6组)。剂量为等当量青蒿琥酯60mg/kg。
给药方案：单次给药，仅给药一次，给药后第1天开始涂片观察，随后隔天涂片。镜检疟原虫，记录动物感染、转阴、复燃及死亡情况，分别计算转阴率、复燃率。
药物配置：其中青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒组和负载增效剂组均已配好。青蒿琥酯现用现配：精密称取适量青蒿琥酯，加适量5％碳酸氢钠溶液，充分混摇使澄清，形成青蒿琥酯钠溶液，再用生理盐水稀释，备用。
统计分析：体重数据以mean±SD表示，组间比较采用SPSS20.0单因素方差分析(ANOVA)。
结果：
单次给药对比：青蒿琥酯和纳米颗粒制剂在同等剂量(60mg/kg)单次给药，给药后1天转阴率均达到100％，抗疟效果未见明显差异。但是，青蒿琥酯组在给药后第3天转阴小鼠均已复燃，可见青蒿琥酯在60mg/kg单次给药时，有抗疟活性，无法维持抗疟效果，3天后全部复燃，5天后全部死亡。实施例3的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒组(第2组)在给药后第3天转阴小鼠复燃率仅为30％，第5天转阴小鼠复燃率达到60％，复燃的小鼠5天后全部死亡。显然，实施例3的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒组的抗疟效果优于青蒿琥酯。
负载增效剂的实施例5的负载甲氟奎的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒(第3组)、实施例6的负载奎宁的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒(第4组)、实施例7的负载苯芴醇的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒(第5组)、实施例8的负载咯奈啶的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒(第6组)在给药后第3天转阴小鼠均没有复燃，第5天转阴小鼠也没有出现复燃。负载增效剂的纳米颗粒组单次给药时，有更好的抗疟活性，抗疟疾复燃效果优异。显然，负载增效剂的青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒组的抗疟效果优于青蒿琥酯，抗复燃效果优于青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒组。
所有实验小鼠体重无明显变化，显示所有制剂无明显毒性。
给药期间观察动物一般状况，包括皮毛、呼吸、眼睛、黏膜、行为和步态、大便与尿液等均未见明显异常，提示静脉给药未见肉眼可观的明显不良症状。
表3单次给药抗疟结果
实验例17
小鼠体内毒性试验
动物：ICR小鼠，雄性，18-22g，购自维通利华实验动物技术有限责任公司。
口服给药。本发明青蒿琥酯肝素衍生物纳米颗粒的体内毒性试验的结果，其口服半致死量大于1000mg/kg，表明毒性远低于青蒿琥酯。
表3药物在小鼠体内毒性试验结果
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权利要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种青蒿琥酯肝素衍生物，其特征在于，该衍生物是具有下列通式(1)的高分子化合物或所述通式(1)的化合物在药学上可接受的盐：
式(1)中，青蒿琥酯与肝素通过酯键相连。
2.根据权利要求1所述的青蒿琥酯肝素衍生物，其特征在于，所述的青蒿琥酯肝素衍生物中，青蒿琥酯的质量百分含量为5％～50wt％。
3.一种如权利要求1所述的青蒿琥酯肝素衍生物的药物组合物，其特征在于，该药物组合物包括所述的青蒿琥酯肝素衍生物或所述的青蒿琥酯肝素衍生物与增效剂的混合物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述的增效剂是以下物质的任一种：苯芴醇、阿莫地喹、甲氟喹、磺胺多辛、乙胺嘧啶、氨酚喹林、氯喹、三哌喹、乙氢去甲奎宁、伯氨喹、常山碱、奎宁、氨喹酯、氨酚喹、卡马喹、克疟喹、磷酸伯氨喹、咯奈啶、磷酸氯喹、磷酸萘酚喹、羟基哌喹、阿替夫林、磷酸羟基哌奎。
5.根据权利要求3或4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为粒径10-1000纳米的颗粒。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物是固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂，含有药效学上可接受的载体。
7.根据权利要求1或3所述的青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物，其特征在于，所述青蒿琥酯肝素衍生物和药物组合物，其纳米颗粒的制备由青蒿琥酯肝素衍生物化合物与助剂或增效剂的混合物，通过薄膜分散法、逆相蒸发法、超声波分散法、喷雾干燥法或高压均质法制备。
8.一种如权利要求1或3所述的青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物在制备抗疟药物的应用。
9.一种如权利要求1或3所述的青蒿琥酯肝素衍生物及其药物组合物在制备治疗或预防血吸虫病、弓形虫病、利什曼病、丝虫病或钩虫病药物的应用。
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