MX2010010904A - Eteres de glicosaminoglicosano semisinteticos alquilados, y metodos para elaborarlos y usarlos. - Google Patents

Abstract

Se describe en la presente la síntesis de éteres de glicosaminoglicosano semi-sintéticos alquilados y fluoroalquilados, mencionados en la presente como "SAGEs". Se describe también la síntesis de SAGEs alquilados y fluoroalquilados sulfatados. Los compuestos descritos en la presente son útiles en numerosas aplicaciones incluyendo, cicatrización de heridas, liberación de fármacos, y el tratamiento de numerosas enfermedades inflamatorias y trastornos cutáneos.

Description

ETERES DE GLICOSAMINOGLICOSANO SEMISINTETICOS ALQUILADOS, Y METODOS PARA ELABORARLOS Y USARLOS CAMPO DE LA INVENCION Se describe en la presente la síntesis de glicosaminoglicosanos semi-sintéticos alquilados y fluoro-alquilados, mencionados en la presente como "SAGEs". Se describe también la síntesis de SAGEs sulfatados alquilados y fluoroalquilados . Los compuestos descritos en la presente son útiles en numerosas aplicaciones incluyendo, cicatrización de heridas, liberación de fármacos, y el tratamiento de numerosas enfermedades inflamatorias y trastornos cutáneos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Enfermedades inflamatorias como psoriasis, dermatitis, acné, rosácea, envejecimiento fotodérmico, y numerosas enfermedades vinculadas a la señalización mediada por RAGE representan una plaga para la gente a nivel mundial. Para poner estas enfermedades en perspectiva, la National Psoriasis Foundation reporta que la psoriasis sola aflige a 2 - 3 % de la población mundial o aproximadamente 125 millones de personas. Estas condiciones inflamatorias pueden ser desagradables estéticamente y pueden crear serias consecuencias de salud si se dejan sin tratar.

Los tratamientos de estas condiciones aceptados convencionalmente pueden involucrar fototerapia con rayos UV, corticoesteroides y glucocorticoides, acitretina, ciclosporina , y metotrexate . No obstante, cada uno de estos tratamientos puede causar serios efectos secundarios que varían desde inmunosupresión y enfermedades hepáticas a adelgazamiento déla piel y causar defectos congénitos. Debido a la inefectividad completa o parcial, estos tratamientos a menudo dejan pacientes insatisfechos con sus resultados.

Además, de los tratamientos mencionados anteriormente, el tratamiento con heparina ha sido también explorado experimentalmente . La heparina, un polisacárido sulfatado, ha sido usado tradicionalmente casi exclusivamente como un anti-coagulante, pero sus propiedades antiinflamatorias son bien conocidas. La heparina y sus derivados se han mostrado prometedoras en el tratamiento de estas enfermedades inflamatorias. Particularmente la heparina y sus derivados disruptan al menos tres eventos importantes en cascadas inflamatorias. Primero, la heparina se fija a y bloquea las L- y P-selectinas de las integrinas leucocíticas . Segundo, la heparina y sus derivados reducen la cascada inflamatoria por medio del enlace y de la inhibición de la PMN proteasa catiónica humana, elastasa y catepsina G leucocíticas, lo cual reduce el daño por P Ns al tejido proteolítico, que escapa a la primera protección por heparina de inhibición de la selección. Tercero, la heparina y sus derivados inhiben potencialmente la interacción del receptor por productos finales de glicación avanzada (RAGE) con sus ligandos .

Aunque la heparina y sus derivados se han mostrado prometedores en el tratamiento de estas enfermedades inflamatorias, el tratamiento con heparina y sus derivado exhibe varios inconvenientes importantes. Primero, la heparina y sus derivados son derivados porcinos; por consiguiente, conducen a implicaciones de transferencia de virus de especies cruzadas. Segundo, a causa de las propiedades anti-coagulantes de la heparina, diabéticos tratados con este compuesto están en riesgo de sangrado excesivo. Tercero, la heparina puede inducir trombocitopenia en ciertos individuos, que producen un anticuerpo al complejo de heparina con el factor-4 plaquetario de proteínas catiónicas (PF-4), dando como resultado aglutinación plaquetaria catastrófica y coagulación venosa y arterial paradójica generalizada. Por consiguiente, es una importante necesidad insatisfecha, formular compuestos que puedan ser usados para tratar enfermedades inflamatorias mientras que evitan la miríada de efectos secundarios vistos en otros tratamientos .

SUMARIO DE LA INVENCION Se describe en la presente la síntesis de éteres de glicosaminoglicosano semi-sintéticos alquilados y fluoro-alquilados, mencionados en la presente como "SAGEs". Se describe también la síntesis de SAGEs sulfatados alquilados y fluoroalquilados . Los compuestos descritos en la presente son útiles en numerosas aplicaciones terapéuticas y cosméticas y para el tratamiento de numerosas enfermedades inflamatorias y trastornos cutáneos. Las ventajas déla invención se expondrán en parte en la descripción que sigue, y en parte serán obvias de la descripción, o pueden ser aprendidas por la práctica de los aspectos descritos posteriormente. Las ventajas descritas posteriormente serán realizadas y logradas por medio de los elementos y combinaciones particularmente indicadas en las reivindicaciones anexas. Se comprenderá que tanto la descripción general precedente como la siguiente descripción detallada son solamente ejemplares y explicativas y no son restrictivas.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las figuras que se anexan, las cuales son incorporadas en y constituyen una parte de esta especificación, ilustran varios aspectos descritos posteriormente .

Las Figuras 1A - IB ilustran un esquema sintetizado para producir hialuronano alquilado y fluoroalquilado y derivados sulfatados de éste.

La Figura 2 muestra la inhibición de P-selectina por HA parcialmente sulfatado y metilado (P-OSMEHA, o GM-131201) .

La Figura 3 muestra la inhibición de elastasa leucocitica humana por derivados de hialuronano sulfatados, incluyendo hialuronanos alquilados y fluoroalquilados, que son también sulfatados. En donde: · = Cl (P-OSMEHA: nM vs %); ¦ = C2 (P-OSCMHA: nM vs %); A = C3 (Compuesto 3 - P-OSHA: nM vs % de Actividad) ; ? = C4 (Compuesto 4 - F-OSHA: nM vs % de Actividad) .

La Figura 4 muestra la inhibición de anfoterina, también conocida como proteina-1 catalogada en el grupo de alta movilidad (HMGB-1) que enlaza a RAGE inmovilizada por P-OSCMHA. En donde ¦ = P-OSCMHA (Compuesto 2 - P-OSCMHA: Conc vs M.

La Figura 5 muestra la inhibición de calgranulina SlOOb que enlaza a RAGE inmovilizada por P-OSMEHA (GM-131201) .

La Figura 6 muestra la inhibición de carboximetil lisina-BSA (CML-BSA) que enlaza a RAGE inmovilizada por P-OSMEHA (GM-131201) .

La Figura 7 muestra la inhibición de la proliferación queratinocitica por derivados de hialuronano de alto peso molecular, incluyendo hialuronanos alquilados y fluoroalquilados, que están también sulfatados.

La Figura 8, muestra la inhibición de la proliferación queratinocitica por derivados de hialuronano de BPM, incluyendo hialuronanos alquilados y fluoroalquilados , que están también sulfatados.

Las Figuras 9 A - 9 G muestran la co-inyección de SAGE (GM-111101) con el modelo de rosácea con LL_37 : La Figura 9 A, muestra la foto en conjunto de la región de piel inyectada con LL-37 y, La Figura 9 B, muestra el modelo de co-inyección de LL-27 y SAGE , La Figura 9 C -muestra la vista en sección transversal teñida con H & E de una muestra de piel inyectada con LL-37, La Figura 9 D, muestra la vista en sección transversal teñida con H & E de una región de piel inyectada con LL-37 mezclada con SAGE, La Figura 9 E muestra la infiltración de leucocitos polimorfonucleares (PMN) en piel que se midió por la actividad de la enzima PMN mieloperoxidasa (MPO) en biopsias de piel de ratones inyectados con LL-37 solamente, LL-37 mas SAGE o grupos inyectados con SAGE solamente, La Figura 9 F muestra el área de eritema, y La Figura 9 G, muestra la evaluación de eritema en ratones inyectados con _LL-37 solamente o LL-37 mas SAGE.

Las Figuras 10 A - 10 I muestran el tratamiento tópico con SAGE (GM-111101) en el modelo de rosácea con LL-37 : La Figura 10 A muestra la foto en conjunto de la región de piel inyectada con LL_37, La Figura 10 B muestra el tratamiento con SAGE inmediatamente después de inyección con LL-37 y La Figura 10 C muestra el tratamiento con SAGE 12 horas después de inyección con LL-37, La Figura 10 D, muestra la vista en sección transversal teñida con H & E de una muestra de piel inyectada con LL-37, La Figura 10 E muestra la vista en sección transversal teñida con H & E del tratamiento inmediato con SAGE en la región de piel inyectada con LL-37, La Figura 10 F muestra la vista en sección transversal teñida con H & E del tratamiento de 12 horas con SAGE en la región de la piel inyectada con LL_37, La Figura 10 G muestra las mediciones de la actividad MPO del modelo de inyección con LL-37 con diferentes estrategias de tratamiento con SAGE, La Figura 10 H muestra el área de eritema y La Figura 10 I representa la demostración de la evaluación de eritema del modelo de rosácea con LL-37 tratado con aplicación tópica de SAGE.

Las Figuras 11 A - 11 D muestran fotos de la Piel exterior a la luz natural (tratada con 1 mg/ml de SAGE) (Figura A) e imagen fluorescente de Piel exterior (Figura B) ; Piel exterior bajo la luz natural (Figura C) y piel interior bajo condiciones fluorescentes (Figura D) .

Las Figuras 12 A - 12J muestran los efectos derivados de HA sobre la proliferación de células nHDF ( Figura 12 A) y efecto sobre nHEK (Figura 12 B) . Fotos en conjunto de ratones tratados con diferentes concentraciones de GM-111101 y GM-212101. El área intacta (Figura 12 C) y área irritada con ácido fórmico (Figura 12 D) fueron comparadas con 0.1 mg/ml de GM-111101 (Figura 12 E) , 1 mg/ml de GM-111101 (Figura 12 F) , 10 mg/ml de GM-111101 (Figura 12 G) , 0.1 mg/ml de GM-212101 (Figura 12 H) , 1 mg/ml de GM-212101 (Figura 12 I) y 10 mg/ml de GM-212101 (Figura 12 J) .

La Figura 13 A, muestra la evaluación de SAGE en eritema en área raspada, prueba de irritación de piel con SAGE en área raspada La Figura 13 B muestra la evaluación de SAGE en eritema en área raspada, prueba de irritación de piel con SAGE en área raspada La Figura 13 C muestra la evaluación de SAGE en eritema en área intacta, prueba de irritación de piel con SAGE en área intacta La Figura 13 D muestra la evaluación de SAGE en edema en área intacta, prueba de irritación de piel con SAGE en área intacta.

Las Figuras 14 A - 14 E muestran el tratamiento con SAGE usando el modelo inflamatorio con aceite de crotón: cuatro horas después del tratamiento con aceite de crotón en el grupo control (CTL) . Comparación entre las orejas Derecha (sin tratar) (Figura 14 A) e Izquierda (pintada con aceite de crotón) (Figura 14 B) del mismo ratón en el grupo CTL. Se hizo la tinción con H & E para control negativo con pintada con PBS (Figura 14 C) , control positivo con aceite de crotón (Figura 14 D) y aceite de crotón seguido por tratamiento con SAGE (Figura 14 E) . Se identificaron la infiltración leucocitica y edema en el grupo control positivo con aceite de crotón. La actividad mieloperoxidasa (Figura 14 F) es un índice de activación leucocitica polimorfonuclear y fue medida en orejas horadadas después de tratamiento con SAGE. La Figura G representa la diferencia de espesor entre las orejas izquierda y derecha a partir de edema después de tratamiento con SAGE y La Figura F representa la diferencia de enrojecimiento a partir de irritación entre las orejas izquierda y derecha después de tratamiento con SAGE, . (p < 0.05) Las Figuras 15 A - 15 F muestran una vista en sección transversal teñida con H & E de una muestra de piel inyectada con LL_37, (B) vista en sección transversal teñida con H & E del tratamiento con HA en la región de piel inyectada con LL-37, (F) vista en sección transversal teñida con H & E del tratamiento con SAGE (GM-111101) en la región de piel inyectada con LL_37, (G) mediciones déla actividad MPO del modelo de inyección con LL-37 con el tratamiento con HA y SAGE, (H) área de ilustración de eritema y (G) demostración de la evaluación de eritema del modelo de rosácea con LL-37 con tratamiento con HA y SAGE.

Las Figuras 16 A - 16 B muestran que la expresión de RAGE inducida por AGE en células ARPE 19 es incrementada por el crecimiento sobre el producto de AGE carboximetil lisina-albúmina de suero bovino (CML-BSA) y prevenida por heparina modificada.

Las Figuras 17A - 17D muestran que en comparación con el control (A) , el producto de AGE CML-BSA induce una apoptosis en células ARPE-19 (B) que es inhibida por ODSH (C) y casi eliminada por el tratamiento con SAGE (D) .

La Figura 18 muestra que SAGEs de BPM no activan al Factor XII. A diferencia de la heparina que activa al Factor XII a una concentración de 0.4 µg/ml, lo cual está próximo de la concentración terapéutica de heparina plasmática anticoagulante en humanos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Antes de que sean expuestos y descritos los compuestos, composiciones, y/o métodos , se comprenderá que los aspectos descritos posteriormente no se limitan a compuestos específicos, métodos sintéticos, o usos como tales, por supuesto, pueden variar. Se comprenderá también que la terminología usada en la presente es con el propósito de describir aspectos particulares solamente y no está prevista para ser limitante.

En esta especificación y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a un número de términos que serán definidos para tener los significados siguientes.

Se debe hacer notar que, como se usa en la especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un, una" y "el, la" incluyen los referentes al plural a menos que el contexto dicte claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "un portador farmacéutico" incluye mezclas de dos o más portadores, y los similares .

"Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrito subsecuentemente puede tener lugar o no, y que la descripción incluye casos donde el evento o circunstancia tiene lugar y casos donde no ocurre. Por ejemplo, la frase "alquilo inferior opcionalmente sustituido" significa que el grupo alquilo inferior puede ser o no sustituido y que la descripción incluye tanto alquilo inferior no sustituido como alquilo inferior donde hay sustitución.

Las referencias en la especificación y reivindicaciones concluyentes a partes en peso, de un elemento o componente particular en una composición o artículo, denota la relación en peso entre el elemento o componente y cualquiera de los otros elementos o componentes en la composición o artículo para el cual una parte en peso es expresada. Así, en un compuesto que contenga 2 partes en peso del componente X y 5 partes en peso del componente Y, X e Y están presentes en una proporción en peso de 2:5, y están presentes en dicha proporción independientemente de si componentes adicionales están contenidos en el compuesto.

Un por ciento en peso de un componente, a menos que se establezca específicamente lo contrario, está basado en el peso total déla formulación o composición en la cual el componente está incluido.

Un residuo de unas especies químicas, como se usa en la especificación y reivindicaciones concluyentes , se refiere a la porción que es el producto resultante de las especies químicas en un esquema de reacción particular o formulación o producto químico subsecuente, independientemente de si la porción es actualmente obtenida a partir de las especies químicas. Por ejemplo, hialuronano que contiene al menos un grupo -OH puede ser representado por la fórmula Y-OH, donde Y es el remanente (es decir, residuo) de la molécula de hialuronano.

El término "tratar" como se usa en la presente es definido como mantener o reducir los síntomas de una condición pre-existente . El término "prevenir" como se usa en la presente es definido como eliminar o reducir la probabilidad de la ocurrencia de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno. El término "inhibir" como se usa en la presente es la habilidad de los compuestos descritos en la presente de eliminar completamente la actividad o reducir la actividad en comparación con la misma actividad en la ausencia del compuesto.

Se describen en la presente hialuronanos alquilados y fluoroalquilados o derivados de éstos. En un aspecto, al menos un protón del hidroxilo en C-ß primario del residuo N- acetil-glucosamina de hialuronano es sustituido con un grupo alquilo. El término "grupo alquilo", como se usa en la presente es un grupo hidrocarburo saturado ramificado o no ramificado de 1 a 24 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, decilo, tetradecilo, hexadecilo, eicosilo, tetraeicosilo y los similares. En un aspecto, el grupo alquilo es un grupo alquilo de 1 a 10 átomos de carbono de cadena recta o ramificada. En un aspecto adicional, el grupo alquilo es metilo. El grupo alquilo puede ser sustituido o no. En el caso cuando el grupo alquilo es sustituido, uno o más átomos de hidrógeno presentes en el grupo alquilo pueden ser reemplazados con uno o más grupos incluyendo, pero no limitándose a, alquinilo, alquenilo, arilo, haluro, nitro, amino . Ester, cetona, aldehido, hidroxi, ácido carboxilico, aralquilo, o alcoxi.

En otro aspecto, al menos un protón del hidroxilo en C-6 primario del residuo N-acetil glucosamina de hialuronano es sustituido con un grupo fluoroalquilo . El término "grupo fluoroalquilo" como se usa en la presente es un grupo hidrocarburo saturado ramificado o no de 1 a 24 átomos de carbono, en donde al menos uno délos átomos de hidrógeno es sustituido con flúor. En ciertos aspectos, el grupo fluoroalquilo incluye al menos un grupo trifluorometilo . En otros aspectos, el grupo fluoroalquilo tiene la fórmula -CH2 (CF2) nCF3, en donde n es un entero de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En un aspecto, el grupo fluoroalquilo es -CH2CF2CF3 o -CH2CF2CF2CF3.

Se describen en la presente métodos para alquilar o fluoroalquilar SAGEs. En un aspecto los SAGEs son producidos por (a) reacción del hialuronano o un derivado de éste con una cantidad suficiente de base para desprotonar al menos un protón del hidroxilo en C-6 primario del residuo N-acetil glucosamina, y (b) reacción del hialuronano desprotonado o un derivado de éste con un agente alquilante o fluoroalquilante por un tiempo y concentración suficientes para alquilar o fluoroalquilar al menos un grupo hidroxilo en el C-6 primario. Los expertos en el arte comprenderán que las condiciones básicas pueden también conducir a la fragmentación de la ligadura glucocidica, que conduce a derivados de hialuronano de peso molecular más bajo durante el proceso de modificación. También se comprenderá que las condiciones básicas desprotonan el ácido al carboxilato, y los grupos hidroxilo secundarios, y que cada una de éstas porciones puede participar en el seguimiento déla alquilación en proporción a su abundancia relativa al equilibrio y a la nucleofilicidad de la especie aniónica. Por ejemplo, los protones délos hidroxilos en 2-0 y/o 3-0 pueden ser desprotonados y alquilados o fluoroalquilados . Un ejemplo de esto es expuesto en la Figura 1, donde R puede ser hidrógeno, un grupo alquilo, o un grupo fluoroalquilo .

El material inicial de hialuronano puede existir como el ácido libre o la sal de éste. El material inicial de derivados de hialuronano pueden también ser usados en la presente. Los derivados incluyen cualquier modificación del hialuronano antes de la etapa de alquilación o fluoroalquilación . Una amplia variedad de hialuronanos de peso molecular puede ser usada en la presente. En un aspecto, el hialuronano tiene un peso molecular mayor que 10 kDa antes de alquilación o fluoroalquilación . En otro aspecto, el hialuronano tiene un peso molecular desde 25 kDa a 1,000 kDa, 100 kDa a 1,000 kDa, 25 kDa a 500 kDa, 25 kDa a 250 kDa, o 25 kDa a 100 kDa antes de alquilación o fluoroalquilación . En ciertos aspectos, el material inicial de hialuronano o un derivado de éste no es derivado de una fuente animal. En estos aspectos, el hialuronano puede derivarse de otras fuentes tales como bacterias. Por ejemplo, un sistema de expresión de B. subtilis recombinante puede ser usado para producir el material inicial de hialuronano. El material inicial de hialuronano o derivado de éste es hecho reaccionar inicialmente con una cantidad suficiente de base para desprotonar al menos un protón del hidroxilo en C-6 primario del residuo N-acetil glucosamina. La selección de la base puede variar. Por ejemplo, un hidróxido alcalino tal como hidróxido de sodio o hidróxido de potasio puede ser usado en la presente. La concentración o cantidad de base puede variar dependiendo del grado deseado de alquilación o fluoroalquilación . En un aspecto, la cantidad de base es suficiente para desprotonar al menos 0.001 % de los protones del hidroxilo en C-6 primario del residuo N-acetil-glucosamina del material inicial de hialuronano o derivado de éste. En otros aspectos, la cantidad de base es suficiente para desprotonar desde 0.001 % a 50 %, 1 % a 50 %, 5 % a 43 %, 5 % a 40 %, 5 % a 30 %, 5 % a 20 %, 10 % a 50 %, 20 % a 50 %, o 30 % a 50 % délos protones del hidroxilo del C-6 primario del residuo N-acetil glucosamina del material inicial de hialuronano o derivado de éste. Se comprende que cuanto más básica sea la solución, más probables sea las reacciones de fragmentación de cadena y más alto el grado de alquilación /fluoroalquilación que puede lograrse. Por ejemplo, otros grupos hidroxilo presentes sobre el hialuronano (por ejemplo, 2-OH y/o 3-OH pueden ser alquilados o fluoroalquilados ) . En un aspecto, todos los grupos hidroxilo presentes sobre el hialuronano pueden ser alquilados o fluoroalquilados . En otros aspectos, 0.001 %, 0.01 %, 0.1 %, 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, o cualquier intervalo de éstos de protones del hidroxilo presentes en el hialuronano pueden ser desprotonados y subsecuentemente alquilados o fluoroalquilados .

Después de que el material inicial de hialuronano o derivado de éste ha sido tratado con una base, el hialuronano desprotonado es hecho reaccionar con un agente alquilante o agente fluoroalquilante para producir el SAGE . Ejemplos de agentes alquilantes incluyen * pero no se limitan a, un haluro de alquilo. Los bromuros y ioduros de alquilo son particularmente útiles. De manera similar, el agente fluoroalquilante puede incluir un haluro de fluoroalquilo . Pueden usarse en la presente los agentes alquilantes y agentes fluoroalquilantes comúnmente usados en síntesis orgánica.

Un procedimiento sintético ejemplar para elaborar SAGEs alquilados y fluoroalquilados se proporciona en la Figura 1. Con referencia a la Figura 1, el hialuronano (HA) es tratado con una base (por ejemplo, NaOH) y un agente alquilante (por ejemplo CH3I) para metilar un protón del hidroxilo en C-6 primario del residuo N-acetil glucosamina de hialuronano y producir hialuronano metilado (MHA) . La Figura 1 también proporciona un procedimiento sintético ejemplar para elaborar un hialuronano fluoroalquilado (FHA) usando un agente fluoroalquilante (por ejemplo, CF3 (CF2) nCH2Br) .

En ciertos aspectos, es deseable sulfatar el SAGEs alquilado o fluoroalquilado descrito anteriormente. En un aspecto, el SAGE alquilado o fluoroalquilado es sulfatado por reacción del SAGE alquilado o fluoroalquilado con un agente sulfatante para producir un producto sulfatado. El grado de sulfatación puede variar desde sulfatación parcial a sulfatación completa. En general, los grupos hidroxilo libres presentes sobre el hialuronano alquilado o fluoroalquilado o derivado de éste pueden ser sulfatados. En un aspecto, al menos un protón del hidroxilo en C-2 y/o protón del hidroxilo en C-3 es sustituido con un grupo sulfato. En otro aspecto, el grado de sulfatación es desde 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, o cualquier intervalo de éstos por unidades disacáridas del SAGE alquilado o fluoroalquilado . En un aspecto, el SAGE alquilado o fluoroalquilado puede ser tratado con una base para desprotonar uno o más protones de hidroxilo seguido por la adición del agente sulfatante. El agente sulfatante es cualquier compuesto que reaccione con un grupo hidroxilo o grupo hidroxilo desprotonado para producir un grupo sulfato. El peso molecular del SAGE puede variar dependiendo de las condiciones déla reacción. En un aspecto, el peso molecular del SAGE es desde 2 kDa a 500 kDa, 2 kDa a 250 kDa, 2 kDa a 100 kDa, 2 kDa a 50 kDa, 2 kDa a 25 kDa, o desde 2 kDa a 10 kDa . La Figura 1, expone una síntesis ejemplar de SAGEs alquilados o fluoroalquilados sulfatados (SMHA y SFHA, respectivamente) .

La Tabla 3 proporciona las estructuras de varios SAGEs ejemplares. Cada SAGE es identificado por el código es GM-XYSTZZ, donde: X = tipo de grupo alquilo, donde 1 = metilo, 2 = pentafluoropropilo, 3 = heptafluorobutilo, 4 = éter bencil glicidílico Y = tamaño de HA, donde 1 = bajo, 2 = medio, 3 = alto S = grado de sulfatación, donde 1 = parcial, 2 = total T = grado de alquilación, donde 1 = bajo, 2 = alto ZZ = número secuencial de lote 01 o 02, donde el 02 ha sido elaborado y tiene todas las propiedades iguales que el lote 01.

La Tabla 1 proporciona una lista de varios SAGEs como se definieron por el sistema de codificación anterior.

TABLA 1 TABLA 1 (Continuación) A = # de SAGE B = Nombre químico C = Peso molecular (inicial) , K D = Peso Molecular (GPC) , k E = Alquilación F = Alquilación SD G = Sulfatación Codificación GM-XYSTZZ X = Alquilo: 1 = Me, 2 = Pfp, 3 = Hfb, 4 = BG; Y = Peso Molecular: 1 = Bajo, 2 = Medio, 3 = Alto; S = Sulfatación: 1 = Parcial, 2 = Total; T = Alquilación: 1 = SD Baja, 2 = SD alta; ZZ = No. secuencial .

En un aspecto, el grupo alquilo del SAGE es metilo y al menos un protón del hidroxilo en C-2 y/o un protón del hidroxilo en C-3 de hialuronano es sustituido con un grupo sulfato. En otro aspecto, el grupo alquilo del SAGE es metilo, al menos un protón del hidroxilo en C-2 y/o un protón del hidroxilo en C-3 del hialuronano es sustituido con un grupo sulfato, y el compuesto tiene un peso molecular de 2 kDa a 200 kDa después de alquilación. Un ejemplo de un compuesto tal es GM-111101 que se muestra en la Tabla 2.

Cualquiera de los SAGEs alquilados y fluoroalquilados descritos en la presente pueden ser la sal o el éster de éste aceptable farmacéuticamente. La sales aceptables farmacéuticamente son preparadas tratando el ácido libre con una cantidad apropiada de una base aceptable farmacéuticamente. Bases aceptables farmacéuticamente representativas son hidróxido de amonio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de litio, hidróxido de calcio, hidróxido de magnesio, hidróxido ferroso, hidróxido de zinc, hidróxido de cobre, hidróxido de aluminio, hidróxido férrico, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol , lisina, arginina, histidina, y los similares. En un aspecto, la reacción es conducida en agua, sola o en combinación con un solvente orgánico miscible en agua, inerte, a una temperatura desde aproximadamente 0 °C a aproximadamente 100 °C tal como la temperatura ambiente. La proporción molar de compuestos de fórmula estructural I y la base usada es seleccionada para proporcionar la proporción deseada para cualquiera délas sales en particular. Para preparar, por ejemplo, las sales de amonio del material inicial de ácido libre, el material inicial puede ser tratado con aproximadamente 1 equivalente de base aceptable farmacéuticamente para producir una sal neutra .

Los derivados ásteres son preparados típicamente como precursores para la forma ácida de los compuestos - como se ilustra en los ejemplos siguientes - y por consiguiente, pueden servir como profármacos. Generalmente, estos derivados serán ésteres de alquilo inferiores tales como metilo, etilo y los similares. Derivados amida -(CO)NH2, -(CO)NHR y -(CO)NHR y -(CO)NR2, donde R es un grupo alquilo definido anteriormente, pueden ser preparados por reacción de compuestos que contienen ácido carboxilico con amoniaco o con una amina sustituida. También, los ésteres pueden ser ésteres de ácidos grasos. Por ejemplo, el éster palmitico ha sido preparado y puede ser usado como un profármaco activado por estearasa alternativo.

Los SAGEs descritos en la presente pueden ser formulados en cualquier excipiente que el sistema o entidad biológica pueda tolerar para producir composiciones farmacéuticas. Ejemplos de dichos excipientes incluyen, pero no se limitan a, agua, ácido hialurónico en solución acuosa, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, solución de Hank, u otras soluciones de sales equilibradas fisiológicamente acuosas. Pueden también ser usados vehículos no acuosos, tales como aceites fijos, aceites vegetales tales como aceite de oliva y aceite de ajonjolí, triglicéridos , propilen glicol, polietilenglicol, y ásteres orgánicos inyectables como oleato de etilo. Otras formulaciones útiles incluyen suspensiones que contienen agentes mejoradores déla viscosidad, como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Los excipientes pueden también contener cantidades menores de aditivos, tales como sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química. Ejemplos de reguladores incluyen el regulador de fosfato, regulador de bicarbonato, y regulador de Tris, mientras que los ejemplos de conservadores incluyen timerosal, cresoles, formalina y alcohol bencílico. En ciertos aspectos, el pH puede ser modificado dependiendo del modo de administración. Por ejemplo, el pH de la composición es desde aproximadamente 5 a aproximadamente 6, el cual es adecuado para aplicaciones tópicas. Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas pueden incluir, portadores, espesantes, diluyentes, conservadores, agentes tensoactivos y los similares además de los compuestos descritos en la presente.

Las composiciones farmacéuticas pueden también incluir uno o más ingredientes activos usados en combinación con los compuestos descritos en la presente. La composición farmacéutica resultante puede proporcionar un sistema para liberación continua, sostenida, de fármacos y otros agentes activos biológicamente para tejidos adyacentes a o distantes del sitio de aplicación. El agente activo biológicamente es capaz de proporcionar un efecto biológico, fisiológico o terapéutico local o generalizado en el sistema biológico al cual es aplicado. Por ejemplo, el agente puede actuar para controlar y/o prevenir infección o inflamación, mejorar el crecimiento celular y la regeneración de tejido, controlar el crecimiento tumoral, actuar como un analgésico, promover la fijación anti-celular, reducir la pérdida dental y ósea alveolar, inhibir la degeneración de cartílago y de articulaciones que soportan el peso, y mejorar el crecimiento óseo, entre otras funciones. Adicionalmente, cualquiera de los compuestos descritos en la presente pueden contener combinaciones de dos o más compuestos aceptables farmacéuticamente. Ejemplos de dichos compuestos incluyen, pero no se limitan a, agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestésicos, y los similares. Métodos para usar estas composiciones como dispositivos deliberación de fármaco se describen detalladamente posteriormente.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser preparadas usando técnicas conocidas en el arte. En un aspecto, la composición es preparada mezclando un SAGE descrito en la presente con un compuesto y/o portador aceptable farmacéuticamente. El término "mezclando" es definido como mezclar los dos componentes juntos de modo que no haya reacción química o interacción física. El término "mezclando también incluye la reacción química o interacción física entre el compuesto y el compuesto aceptable farmacéuticamente. El enlace covalente a fármacos terapéuticos reactivos, por ejemplo, aquellos que tienen grupos nucleofílicos, puede ser tomado en cuenta en el compuesto. Segundo, el atrapamiento no covalente de un agente activo farmacológicamente es un polisacárido reticulado es también posible. Tercero, las interacciones electrostáticas o hidrofóbicas pueden facilitar la retención de un compuesto aceptable farmacéuticamente en los compuestos descritos en la presente.

Se apreciará que las cantidades de SAGE preferidas actuales es un caso específico variarán de conformidad con el compuesto específico que e sutilizado, la composición particular formulada, el modo de aplicación, y el sitio y sujeto particular que es tratado. Las dosificaciones para un huésped dado pueden ser determinadas usando consideraciones convencionales, por ejemplo, por la comparación acostumbrada de las actividades diferenciales de los sujetos, compuestos y de un agente conocido, por ejemplo, por medio de un protocolo farmacológico convencional apropiado. Médicos y formuladores , expertos en el arte de determinar dosis de compuestos farmacéuticos, no tendrán problemas determinando la dosis de conformidad con las recomendaciones estándares (Physicians Desk Reference, Barnhart Publishing (1999) .

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden ser administradas en numerosas maneras dependiendo de si se desea tratamiento local o generalizado, y del área a ser tratada. La administración puede ser tópicamente (incluyendo oftálmica, vaginal, rectal, intranasal, oral, o directamente a la piel). Las formulaciones para aplicación tópica pueden incluir ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, nebulizadores, líquidos y polvos. Los portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y los similares pueden ser necesarios o deseables. La administración puede también ser directamente en el pulmón por inhalación de un aerosol o polvo seco micronizado. La administración puede también ser por inyección directa en el espacio de la articulación inflamada o en degeneración.

Las preparaciones para administración incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de portadores no acuosos incluyen agua, solución alcohólica/acuosa, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios reguladores. Los vehículos parenterales, si son necesarios para uso colateral de las composiciones y métodos descritos, incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer lactosada, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos, si son necesarios para uso colateral de las composiciones y métodos descritos, incluyen reforzadores nutrientes y fluidos, reforzadores electrolíticos (tal como los basados en dextrosa de Ringer) , y los similares. Los conservadores y otros aditivos pueden también estar presentes tal como, por ejemplo, antimicrobianos, anti-oxidantes , agentes secuestrantes, y gases inertes y los similares.

La dosificación es dependiente de la severidad y de la capacidad de respuesta de la condición a ser tratada, pero normalmente será de una o más dosis al día, con el transcurso déla duración del tratamiento de varios días a varios meses o hasta que un experto en el arte determine el cese déla liberación. Personas de experiencia pueden determinar fácilmente dosificaciones óptimas, metodologías de dosificación y velocidades de repetición.

Los SAGEs y las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden ser usados en una variedad de aplicaciones relacionadas con la liberación del fármaco, liberación de moléculas pequeñas, cicatrización de heridas, tratamiento de trastornos cutáneos inflamatorios, tratamiento de trastornos dentales inflamatorios, tratamiento de trastornos respiratorios inflamatorios, tratamiento de trastornos oculares inflamatorios, cicatrización de daños por quemaduras, en ingeniería/regeneración de tejidos. En un aspecto, los SAGEs y composiciones descritas en la presente pueden mejorar la cicatrización de heridas en un sujeto en necesidad de dicha mejora. Los SAGEs y composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden ser colocadas directamente en o sobre cualquier sistema biológico sin purificación ya que están compuestos de materiales biocompatibles . Ejemplos de sitios donde pueden ser puestos los SAGEs incluyen, pero no se limitan a, tejidos blandos como músculo o grasa; tejidos duros como cartílago o huesos; áreas de regeneración de tejido; un espacio vacío tal como el saco periodontal; incisiones quirúrgicas u otras cavidades o sacos formados; una cavidad natural tal como la oral, vaginal, rectal o las cavidades nasales, el espacio articular, el conducto sin salida del ojo, y los similares; la cavidad peritoneal y los órganos contenidos en ella, y otros sitios adentro o sobre los cuales los compuestos puedan ser colocados incluyendo un defecto déla superficie cutánea tal como un área cortada, raspada o quemada. Se contempló que el tejido puede ser dañado debido a daño o una condición degenerativa o, en la alternativa, los SAGEs y composiciones descritas en la presente pueden ser aplicados a tejidos sin daño para prevenir el daño al tejido. Los SAGEs pueden ser biodegradables y enzimas que se encuentran de manera natural actuarán para degradarlos con el tiempo. Componentes del SAGE pueden ser "bioabsorbibles" porque los componentes del SAGE serán desintegrados y absorbidos en el sistema biológico, por ejemplo, por una célula, tejido y los similares. De manera adicional, SAGEs, especialmente aquellos que han sido re-hidratados, pueden ser aplicados a un sistema biológico para absorber fluido del área de interés.

En el caso de cicatrización de heridas, los SAGEs descritos en la presente pueden ser administrados vía inyección. Para muchos usos clínicos, cuando el SAGE está en la forma de una película de hidrógeno, se prefieren los hidrogeles inyectables por tres razones principales. Primera, un hidrogel inyectable podía ser formado en cualquier conformación deseada en el sitio del daño. A causa de que los hidrogeles iniciales puede ser soles o masillas, los sistemas pueden ser posicionados en formas complejas y luego reticulados subsecuentemente para conformarlos a las dimensiones requeridas. Segunda, el hidrogel se adherirá al tejido durante la formación del gel, y el interbloqueo mecánico resultante que dará origen a microrugosidades superficiales fortalecerá la interfase tej ido-hidrogel . Tercera, la introducción de un hidrogel reticulable podría lograrse usando aguja o por medio de métodos laparoscópicos, minimizando así la invasividad de la técnica quirúrgica.

En el caso de trastornos cutáneos inflamatorios como psoriasis, acné, dermatosis atópica, rosácea o foto-envejecimiento dependiente délos rayos UV, los SAGEs pueden ser aplicados tópicamente como parte de un emoliente para prevenir o tratar la condición prevista. En el caso de trastornos respiratorios como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, daño pulmonar agudo o fibrosis quística, los SAGEs pueden ser disueltos en un vehículo isotónico soluble en- agua, compatible con el fluido de revestimiento délas vías respiratorias y liberados en el pulmón o pasajes nasales como un aerosol inhalado. Alternativamente, los SAGEs pueden ser formulados en un polvo micronizado e inhalados en el pulmón como un polvo seco. En el caso de enfermedades oculares, los SAGEs pueden ser colocados en un vehículo acuoso y aplicados en el ojo tópicamente como gotas, o inyectados directamente en el ojo ya sea por medio de agujas o usando un dispositivo de liberación constante de fármaco implantado. En el caso de trastornos dentales como la enfermedad periodontal, los SAGEs pueden ser añadidos como un componente de un enjuague bucal o formulado en cremas o materiales de empaque para las encías para ser aplicado directamente a las grietas de las encías.

Los SAGEs pueden también ser inyectados parenteralmente ya sea intravenosa, intramuscular o subcutáneamente para tratar o prevenir trastornos inflamatorios generalizados tales como enfermedades vasculares diabéticas o enfermedades renales o enfermedades gastrointestinales inflamatorias. De manera similar, los SAGEs pueden ser inyectados intra-auricularmente para tratar artritis degenerativa e inflamatoria. Los SAGEs pueden también ser administrados oralmente en cápsulas o ser formuladas en un enema para ser liberados intra-rectalmente como tratamiento para enfermedades intestinales inflamatorias .

Los SAGEs y las composiciones descritas en la presente pueden liberar al menos un compuesto aceptable farmacéuticamente en un paciente en necesidad de dicha liberación, que comprende poner en contacto al menos un tejido capaz de recibir el compuesto aceptable farmacéuticamente con una o más composiciones descritas en la presente. Los SAGEs pueden ser usados como un portador para una amplia variedad de sustancias activas biológicamente liberables que tengan valor curativo o terapéutico para animales humanos o no humanos. Muchas de estas sustancias que pueden ser portadas por SAGE se discutieron anteriormente. Se incluyeron entre materiales activos biológicamente los cuales son adecuados para incorporación en los geles de la invención, fármacos terapéuticos, por ejemplo, agentes antiinflamatorios, agentes anti-piréticos , fármacos esferoidales y no-esteroidales para uso anti-inflamatorio, hormonas, factores de crecimiento, agentes anti-conceptivos, antivirales, antibacterianos, anti-fúngicos , analgésicos, hipnóticos, sedantes, tranquilizantes, anti-convulsivos , relajantes musculares, anestésicos locales anti-espasmódicos , fármacos antiúlceras, agonistas peptidicos, agentes simpaticomiméticos , agentes cardiovasculares, agentes anti-tumorales, oligonucleótidos y sus análogos y asi sucesivamente. Una sustancia activa biológicamente es añadida e cantidades activas farmacéuticamente.

En un aspecto, los SAGEs alquilados y fluoroalquilados sulfatados descritos en la presente pueden inhibir la actividad del receptor para Productos Finales de Glicación Avanzada, (RAGE, siglas del inglés, Receptor Advanced Glycation Endproducts ) , P-selectina, o elastasa leucocitica humana. RAGE es altamente expresada en piel humana, donde está presente sobre fibroblastos dérmicos, células dentríticas, queratinocitos , células endoteliales y monocitos. RAGE es sobre-regulado en piel expuesta al sol por Productos Finales de Glicación Avanzada, (AGE, siglas del inglés Advanced Glycation Endproducts) y por el factor a de necrosis de tumor. RAGE desempeña un papel prominente en el envejecimiento foto-inducido por Rayos UV, donde su ligación por productos AGE tal como carboximetil lisina (CML) inducida por rayos UV, promueve el envejecimiento de la piel, a través de la estimulación de la producción de matrices extracelulares por fibroblastos dérmicos. El papel de RAGE es probablemente aún más prominente en psoriasis porque esta enfermedad es criticamente dependiente de linfocitos T activados por iniciación de inflamación. Los linfocitos T pueden también ser importantes mecánicamente en acné y dermatitis atópica. En " el caso de acné, niveles dérmicos elevados de linfocitos T CD3+ y CD4+ y macrofagos estimulan la hiperproliferación de queratinocitos en los ductos délos folículos, produciendo ductos foliculares bloqueados que conducen a la formación del acné comedone. En el caso de dermatitis atópica, antígenos dérmicos activan a linfocitosTH2 , los cuales secretan citoquinas como interleuquina-4 (IL-4) e interleuquina-13 (IL-13), dando como resultado el reclutamiento de eosinófilos en la piel. Los eosinófilos, a su vez, liberan toxinas catiónicas como proteínas básicas importantes, las cuales producen enfermedades cutáneas alérgicas. Por consiguiente, el RAGE potente, que inhibe la actividad de los compuestos decritos en la presente los hace útiles en el tratamiento de una variedad de trastornos cutáneos incluyendo, pero no limitándose a, acné, eczema, dermatitis atópica, psoriasis, o envejecimiento foto-dérmico.

En el estado adulto, RAGE no es siempre tan enteramente favorable al organismo. Los tumores malignos secretan anfoterina (proteína-1 del grupo catalogado de alta movilidad, HMGB-1) como un factor autocrino y el uso de la interacción de anfoterina con RAGE para promover el crecimiento de tumores primarios y la metástasis. Bloquear RAGE con un señuelo recombinante (RAGE soluble o s-RAGE) reduce el crecimiento de ¦ tumores inhibe la metástasis. Durante la sepsis, monocitos y macrófagos secretan anfoterina, la cual interactúa con RAGE sobre los vasos sanguíneos y otras células inflamatorias para mejorar la severidad del choque bacteriano. El bloqueo de esta interacción con anticuerpos contra RAGE previene daños a órganos en sepsis severas. En el estado adulto, RAGE también funciona como un receptor de adhesión vascular que promueve el reclutamiento de PMNs, monocitos y linfocitos en áreas de inflamación. El bloqueo de RAGE entorpece el influjo de células inflamatorias. Esto ha sido previamente demostrado en modelos animales de esclerosis múltiple, donde el bloqueo comparativo de RAGE endotelial vascular con s-RAGE previene el influjo de linfocitos T encefalitogénicos activados en el sistema nervioso central, y retarda el principio y el progreso de inflamación y degeneración neurológica.

RAGE también interactúa con una familia de patrones de enlace de calcio también denominadas calgranulinas S100, las cuales son secretadas por PMNs, monocitos y linfocitos como potentes factores promotores de la inflamación. Niveles elevados de calgranulinas S100 son un marcador prominente déla inflamación por PMN en daño pulmonar agudo y en las secreciones délas vías respiratorias de pacientes con fibrosis quistica. En el ojo, la interacción de calgranulinas S100 con RAGE desempeña un papel prominente que conduce a ceguera en degeneración muscular relacionada con la edad.

RAGE también enlaza al péptido ß-amiloide de Alzheimer y las láminas-ß de proteínas amiloides. A través déla inducción relacionada con RAGE de muerte celular neural e inflamación, interacciones fibrilares de láminas de RAGE-ß median la demencia de Alzheimer y daño a órganos en amiloidosis generalizada .

RAGE es también prominente en diabetes melitus. Cuando la glucosa en sangre es elevada, el grupo aldehido de la glucosa fija aleatoriamente a las aminas de proteínas celulares aductos covalentes. En la presencia de oxidantes tales como ácido hipocloroso (H0C1), el oxidante producido por P Ns, esta porción de glucosa puede entonces oxidarse. Estas proteínas gliosiladas, oxidadas son conocidas como Productos Finales de Glicación Avanzada (AGE) . AGE también enlaza ávidamente al receptor de RAGE, y activa la señalización mediada por RAGE. La señalización por AGE-RAGE es responsable de la disfunción endotelial vascular, pobre cicatrización de heridas y arterioesclerosis arterial acelerada características de diabetes pobremente controlada. En el ojo, la señalización la señalización por AGE-RAGE produce la proliferación de microvasos retínales que conduce a retinopatía diabética y ceguera. En el riñon la señalización por AGE-RAGE es responsable de la hipertrofia renal inicial y luego de fibrosis que causa falla renal diabética (nefropatía diabética) . La señalización por AGE-RAGE probablemente produce apoptosis del endotelio, inhibe el desarrollo de vasos sanguíneos y retarda la cicatrización de úlceras diabéticas cutáneas.

La habilidad de los SAGEs para bloquear RAGE los hace particularmente valiosos como agentes terapéuticos para inflamación. RAGE funciona en útero como un receptor que enlaza a la anfoterina de la proteína nuclear promotora del crecimiento, o proteina-1 catalogada de alta movilidad (HMGB-1). Ahí, la interacción RAGE-anfoterina activa la señalización del crecimiento importante para el desarrollo del sistema nervioso. En el estado adulto, RAGE es expresado en las células de las paredes de los vasos, tejidos neurales, miocitos cardíacos, monocitos y macrófagos, linfocitos-T, células mesangiales renales, y en fibroblastos cutáneos., dendrocitos y queratinocitos . Por consiguiente, en un aspecto, los SAGEs y composiciones descritas en la presente pueden ser usados para reducir la seguridad o prevenir la inflamación en un sujeto, producida por una variedad de diferentes enfermedades atribuidas a enfermedades relacionadas con RAGE, incluyendo, pero no limitándose a, cáncer, esclerosis múltiple, osteoartritis , fibrosis quística, anemia por células falciformes, un trastorno inflamatorio cardiovascular, o complicaciones diabéticas.

En otro aspecto, los SAGEs y composiciones, como entidades cargadas negativamente, pueden también ser administrados para enlazar e inhibir péptidos cutáneos catiónicos derivados de catelicidinas , tratando así o previniendo trastornos cutáneos. Por ejemplo, la condición déla piel conocida como acné rosacea, la cual es conocida porque tiene lugar a partir del exceso de expresión en la piel de péptidos de catelicidinas activas, puede ser tratado o prevenido usando los SAGEs descritos en la presente. Ejemplos de trastornos cutáneos que pueden ser tratados o prevenidos usando los SAGEs incluyen, pero no se limitan a, rosacea, dermatitis atópica (eczema) , dermatitis alérgica por contacto, psoriasis, dermatitis herpetiformis, acné, úlceras cutáneas diabéticas y otras heridas diabéticas, quemaduras (incluyendo el alivio del dolor de quemaduras térmicas), quemaduras solares (incluyendo el alivio del dolor por quemaduras solares) , prevención de cicatrices después de cirugía plástica, queratosis actínica, inflamación de mordeduras de insectos, hiedra venenosa, quemaduras/dermatitis inducidas por radiación, facilitación déla cicatrización de la piel, prevención y tratamiento de cicatrices queloides, o el tratamiento de dermatitis seborréica.

Debido a la habilidad de los SAGEs para inhibir la actividad de RAGE y otros mecanismos biológicos, los SAGEs tienen numerosas aplicaciones terapéuticas además de tratar o prevenir trastornos cutáneos. En un aspecto, los SAGEs pueden ser usados en cirugía dental y oral para tratar gingivitis (enfermedad periodontal) y úlceras aftosas. En otros aspectos, los SAGEs pueden ser usados en aplicaciones oftalmológicas tales como, por ejemplo, en el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, síndrome de sequedad ocular y otras conjuntivitis inflamatorias, iritis uveítis, conjuntivitis alérgica, ayuda anti-inflamatoria en cirugías de cataratas, o en la prevención de inflamación y cicatrización de la córnea.

En aspectos adicionales, los SAGEs pueden ser usados en aplicaciones genitourinarias (por ejemplo, prevención de infecciones del tracto urinario, tratamiento del cáncer celular transicional de la vejiga y del sistema uroepitelial; tratamiento de cistitis intersticial; y uso como un lubricante/protector vaginal para prevenir la transmisión de enfermedades transmitidas sexualmente) .

En otro aspecto, los SAGEs pueden ser usados para tratar numerosos trastornos respiratorios incluyendo fibrosis quística, bronquioectasis , rinitis (tanto alérgica como perenne), sinusitis, enfisema y bronquitis crónica (COPD) , síndrome de fatiga respiratoria del adulto/daño pulmonar agudo, fibrosis pulmonar intersticial, SARS, asma, y virus sincitial respiratorio. En otros aspectos, los SAGEs pueden prevenir y tratar apnea obstructiva durante el sueño y ronquidos, prevenir la infección por patógenos respiratorios comunes (Streptococcus pnemoniae, Hemophilus influenzae, Staphylococcus , Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial pneumonía, infecciones entéricas Gram negativas) en huéspedes inmunosuprimidos tales c como sujetos que son VIH positivos o quienes tienen malignidades hematopoyéticas , o prevenir y tratar otitis media.

Los SAGEs pueden ser usados en aplicaciones cardiovasculares (por ejemplo, tratar o prevenir el síndrome coronario agudo o arterioesclerosis ) ; aplicaciones hematológicas/oncológicas (por ejemplo, prevención y tratamiento de anemia por células falciformes ; prevención y tratamiento de enfermedades metastáticas ; y prevención de estado hipercoagulable de malignidades (síndrome de Trousseau) ) ; tratamiento de enfermedades infecciosas (por ejemplo, síndromes oclusivos vasculares cerebrales y nefritis en malaria Falsiparum, fiebre amarilla, fiebre del Dengue, sepsis generalizada, y tratamiento adjuntivo de VIH para prevenir la fusión viral con e infección de células objetivo; tratamiento de enfermedades gastrointestinales (por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn del intestino, hemorroides, y la prevención de ulceración por estrés del estómago y del esófago) ; tratamiento de enfermedades inmunológicas y reumatológicas (por ejemplo, prevención y tratamiento de osteoartritis , artritis reumatoide, eritematosis por lupus generalizado, prevención y tratamiento de edema angioneurótico, síndrome de Sjogren, esclerosis generalizada, amiloidosis generalizada, y mastocitosis generalizada) ; enfermedades renales (por ejemplo, prevención y tratamiento de nefropatía diabética y glomerulonefritis ) ; y enfermedades neurológicas (por ejemplo, esclerosis múltiple y demencia de Alzheimer) .

Los SAGEs y composiciones descritas en la presente son más seguros que otras terapias relacionadas. Por ejemplo, la heparina y otros polisacáridos pueden reducir complicaciones diabéticas tanto en animales como en estudios clínicos, y son particularmente efectivos contra neuropatías diabéticas. No obstante, las heparinas no pueden ser usadas en grupos clínicos generales para prevenir complicaciones diabéticas porque las propiedades anti-coagulantes presentan un excesivo riesgo de sangrado. Los SAGEs y composiciones descritas en la presente poseen baja actividad anticoagulante, la cual es una importante consideración para tratamiento a largo plazo, lo cual es demostrado posteriormente en los Ejemplos. Adicionalmente , los SAGEs tienen poca o ninguna toxicidad, lo cual es también demostrado en los Ejemplos.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son expuestos para proporcionar a los expertos en el arte una presentación y descripción completa de cómo los compuestos, composiciones y métodos descritos y reclamados en la presente son elaborados y evaluados, y están previstos para ser puramente ejemplares y no están previstos para limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a números (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero podrían haber algunos errores y desviaciones. A menos que se indique de otra manera, partes, son partes en peso, temperatura es en grados centígrados (°C) o es a temperatura ambiente, y presión es o está cerca déla atmosférica. Hay numerosas variaciones y combinaciones de condiciones de reacción, por ejemplo, concentraciones de componentes, solventes deseados, mezclas de solventes, temperaturas, presiones y otros intervalos y condiciones de reacción que pueden ser usados para optimizar la pureza y el rendimiento del producto obtenido a partir del proceso descrito. Solamente se requerirá experimentación de rutina y razonable para optimizar dichas condiciones de proceso. Los compuestos descritos posteriormente son identificados por números de código como se definió anteriormente y se mencionan en la Tabla 2.

I. Síntesis de Derivados de Acido Hialurónico (HA) Alquilados A. Preparación de HA Metilado (DS-2) Se disolvió ácido hialurónico (HA, Novozymes, 950 kDa) (2.0 g) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El liquido viscoso resultante s e transfirió a un vaso de precipitados de 400 mL que contenia 100 mL de isopropanol, y se continúo mezclando. A la mezcla agitada se añadieron 10 mL de iodometano y la mezcla se agitó por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el producto HA metilado crudo. Este MeHA crudo fue disuelto en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de ~ 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externa cuatro veces durante este periodo. El producto de MeHA dializado fue liofilizado para dar 1.25 g de HA metilado como una malla algodonosa.

?? NMR (D20, d) : 1.85 (s, 3H, NCH3) , 3.20-3.80 (m, 10H, OCH+OCH3) .

El grado de sustitución (SD, siglas del inglés Substitution Degree) fue determinado por 1ti NMR, SD = [(integración de HA metilado a d 3.20-3.8 )-( integración de HA a d 3.20-3.8 ) ]/integración de NCH3 a 1.85), y se estimó que SD fue igual a 2, o un promedio de 2 grupos metilo por unidad disacárida. Esto sugiere que tanto el hidroxilo primario como al menos un grupo hidroxilo secundario fueron modificados por este proceso.

B . Preparación de HA Metilado (DS-1) Se disolvió ácido hialurónico (HA, Novozymes, 950 kDa) (2.0 g) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El liquido viscoso resultante s e transfirió a un vaso de precipitados de 400 mL que contenia 100 mL de isopropanol, y se continúo mezclando. A la mezcla agitada se añadieron 4 mL de iodometano y la mezcla se agitó por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el producto HA metilado crudo. Este MeHA crudo fue disuelto en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de ~ 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externa cuatro veces durante este periodo. El producto de MeHA dializado fue liofilizado para dar 1.25 g de HA metilado como una malla algodonosa. 1H NMR (D20, d) : 1.85 (s, 3H, NCH3) , 3.20-3.80 (m, 10H, OCH+OCH3) .

El grado de sustitución (SD, siglas del inglés Substitution Degree) fue determinado por 1H NMR, SD = [(integración de HA metilado a d 3.20-3.8 )-( integración de HA a d 3.20-3.8 ) ]/integración de NCH3 a 1.85), y se estimó que SD fue igual a l, o un promedio de 1 grupo metilo por unidad disacárida. Esto sugiere que el hidroxilo primario y al menos un grupo hidroxilo secundario fueron modificados por este proceso .

C . Preparación de FHA-2 (DS-1) A un matraz de 25 mL que contenia 1.0 g de 2, 2, 3, 3, 4, 4- heptafluoro- 1- butanol (5 mmoles), se añadieron lentamente 1.3 mL de tribromuro de fósforo (7.5 mmoles). La mezcla fue agitada a 60 °C por 30 minutos, y luego se añadió lentamente solución saturada de bicarbonato de sodio (15 mL) para detener la reacción. La solución acuosa fue extraída con tres porciones de 15 mL de diclorometano, la capa orgánica que contenía el bromuro de heptafluorobutilo fue concentrada, y el residuo fue usado sin purificación en la siguiente etapa .

Se disolvió HA (2.0 g) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El líquido viscosos resultante fue transferido a un vaso de precipitados de 400 mL que contenía 100 mL de isopropanol, y se continuó mezclando. A la mezcla agitada se añadió el bromuro de heptafluorobutilo en 10 mL de isopropanol, y la mezcla se agitó por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el producto FHA-2 crudo. Este FHA-2 crudo se disolvió en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externa cuatro veces durante este periodo. El producto de FHA-2 dializado fue liofilizado para dar 1.5 g de FHA-2, designado como FHA-2 como malla algodonosa.

XH NMR (D20, d) : 1.82 (s, 3H, NCH3) , 3.15-3.80 (m, 8H, OCH+OCH2) . 19F NMR (D20, d) : -120.8.

Se determinó el grado de sustitución (SD) por 1ti NMR como 1.0. SD = [(integración de FHA-2 a d 3.15-3.80)-(integración de HA a d 3.20-3.80 )]/[( integración de NCH3 a 1.82) x (2/3)].

D . Preparación de FHA-2 (DS-2) A un matraz de 25 mL que contenia 3.0 g de 2, 2, 3, 3, 4, 4- heptafluoro- 1- butanol (15 mmoles) , se añadieron lentamente 2.5 mL de tribromuro de fósforo (16 mmoles). La mezcla fue agitada a 60 °C por 30 minutos, y luego se añadió lentamente solución saturada de bicarbonato de sodio (15 mL) para detener la reacción. La solución acuosa fue extraída con tres porciones de 15 mL de diclorometano, la capa orgánica que contenía el bromuro de heptafluorobutilo fue concentrada, y el residuo fue usado sin purificación en la siguiente etapa .

Se disolvió HA (2.0 g) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El liquido viscosos resultante fue transferido a un vaso de precipitados de 400 mL que contenia 100 mL de isopropanol, y se continuó mezclando. A la mezcla agitada se añadió el bromuro de heptafluorobutilo en 10 mL de isopropanol, y la mezcla se agitó por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el producto FHA-2 crudo. Este FHA-2 crudo se disolvió en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externa cuatro veces durante este periodo. El producto de FHA-2 dializado fue liofilizado para dar 1.5 g de FHA-2, designado como FHA-2 como malla algodonosa.

XH N R (D20, d) : 1.82 (s, 3H, NCH3) , 3.15-3.80 (m, 8H, OCH+OCH2) . 19F NMR (D20, d) : -115.3, -120.8.

Se determinó el grado de sustitución (SD) por 1H NMR como 2.0. SD = [(integración de FHA-2 a d 3.15-3.80)-(integración de HA a d 3.20-3.8 ) ]/integración de NCH3 a 1.82) x (2/3)].

E . Preparación de FHA-l(DS-l) A un matraz de 25 mL que contenia 1.0 g de 2, 2, 3, 3- pentafluoro- 1- propanol (5 mmoles), se añadieron lentamente 1.3 mL de tribromuro de fósforo (7.5 mmoles). La mezcla fue agitada a 60 °C por 30 minutos, y luego se añadió lentamente solución saturada de bicarbonato de sodio (15 mL) para detener la reacción. La solución acuosa fue extraída con tres porciones de 15 mL de diclorometano, la capa orgánica que contenía el bromuro de heptafluorobutilo fue concentrada, y el residuo fue usado sin purificación en la siguiente etapa .

Se disolvió HA (2.0 g) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El líquido viscosos resultante fue transferido a un vaso de precipitados de 400 mL que contenía 100 mL de isopropanol, y se continuó mezclando. A la mezcla agitada se añadió el bromuro de heptafluorobutilo en 10 mL de isopropanol, y la mezcla se agitó por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el producto FHA-1 crudo. Este FHA-1 crudo se disolvió en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externa cuatro veces durante este período. El producto de FHA-1 dializado fue liofilizado para dar 1.5 g de FHA-1, designado como FHA-1 como malla algodonosa.

X NMR (D20, d) : 1.80 (s, 3H, NCH3) , 3.15-3.80 (m, 8H, OCH+OCH2) . 19F NMR (D20, d) : -113.6, - 118.0.

Se determinó el grado de sustitución (SD) por 1H NMR como 1.0. SD = [(integración de FHA-1 a d 3.15-3.80)-(integración de HA a d 3.20-3.80 )]/[( integración de NCH3 a 1.80) x (2/3)].

F . Preparación de FHA-1 (DS-2) A un matraz de 25 mL que contenia 3.0 g de 2, 2, 3, 3- pentafluoro- 1- propanol (15 mmoles) , se añadieron lentamente 3 mL de tribromuro de fósforo (18 mmoles). La mezcla fue agitada a 60 °C por 30 minutos, y luego se añadió lentamente solución saturada de bicarbonato de sodio (15 mL) para detener la reacción. La solución acuosa fue extraída con tres porciones de 15 mL de diclorometano , la capa orgánica que contenía el bromuro de heptafluorobutilo fue concentrada, y el residuo fue usado sin purificación en la siguiente etapa .

Se disolvió HA (2.0 g) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El líquido viscoso resultante fue transferido a un vaso de precipitados de 400 mL que contenía 100 mL de isopropanol, y se continuó mezclando. A la mezcla agitada se añadió el bromuro de heptafluorobutilo en 10 mL de isopropanol, y la mezcla se agitó por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el producto FHA-1 crudo. Este FHA-1 crudo se disolvió en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externa cuatro veces durante este período. El producto de FHA-1 dializado fue liofilizado para dar 1.5 g de FHA-1, designado como FHA-1 como malla algodonosa.

XH NMR (D20, d) : 1.80 (s, 3H, NCH3) , 3.15-3.80 (m, 8H, OCH+OCH2) . 19F NMR (D20, d) : -113.6, -118.0.

Se determinó el grado de sustitución (SD) por ?? NMR como 2.0. SD = [(integración de FHA-1 a d 3.16-3.80)- (integración de HA a d 3.20-3.8 ) ]/integración de NCH3 a 1.80) x (2/3)].

G . Preparación de B6HA Se disolvió ácido hialurónico (HA, Novozymes Biopolymers, 950 kDa) (2.0 g) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El líquido viscoso resultante se transfirió a un vaso de precipitados de 400 mL que contenía 100 mL de isopropanol, y se continuó mezclando. A la mezcla agitada se añadieron 10 mL de éter bencil glicidílico, y la mezcla fue agitada por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el BGHA producto crudo. Este BGHA crudo fue disuelto en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de ~ 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externo cuatro veces durante este periodo. El producto BGHA dializado fue liofilizado para dar 1.25 g de BGHA como una malla algodonosa .

?? NMR (D20, d) : 1.85 (s, 3H, NCH3) , 3.20-3.80 (m, 10H, OCH+OCH3) . El grado de sustitución /SD) fue determinado por H NMR, SD es menor que 1.

H . Preparación de HA Metilado de BPM (DS-2) Se disolvió ácido hialurónico (HA, Novozymes Biopolymers, 53 kDa) (2.0 g) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El liquido viscoso resultante se transfirió a un vaso de precipitados de 400 mL que contenia 100 mL de isopropanol, y se continuó mezclando. A la mezcla agitada se añadieron 10 mL de éter bencil glicidilico, y la mezcla fue agitada por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el producto HA metilado de BPM crudo. Este MeHA de BPM crudo fue disuelto en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de ~ 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externa cuatro veces durante este periodo. El producto MeHA de BPM dializado fue liofilizado para dar 1.2 g de HA metilado como una malla algodonosa. XH NMR (D20, 6) : 1.85 (s, 3H, NCH3), 3.20-3.80 (m, 10H, OCH+OCH3) . El grado de sustitución (SD) fue determinado por 1H NMR, como 2.

I . Preparación de HA Metilado de BPM (DS-1) Se disolvió ácido hialurónico (HA, Novozymes Biopolymers, 53 kDa) (2.0 g) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El liquido viscoso resultante se transfirió a un vaso de precipitados de 400 mL que contenia 100 mL de isopropanol, y se continuó mezclando. A la mezcla agitada se añadieron 4 mL de iodometano, y la mezcla fue agitada por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el HA metilado de BPM producto crudo. Este MeHA de BPM crudo fue disuelto en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de ~ 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externa cuatro veces durante este periodo. El producto MeHA de BPM dializado fue liofilizado para dar 1.2 g de MeHA de BPM como una malla algodonosa. XH NMR (D20, d) : 1.85 (s, 3H, NCH3), 3.20-3.80 (m, 10H, OCH+OCH3) . El grado de sustitución (SD) fue determinado por 1H NMR, como 1.

J. Preparación de FHA-2 de BPM (DS-1) A un matraz de 25 mL que contenia 1.0 g de 2, 2, 3, 3, 4, 4- heptafluoro- 1- butanol (5 mmoles) , se añadieron lentamente 1.3 mL de tribromuro de fósforo (7.5 mmoles). La mezcla fue agitada a 60 °C por 30 minutos, y luego se añadió lentamente solución saturada de bicarbonato de sodio (15 mL) para detener la reacción. La solución acuosa fue extraída con tres porciones de 15 mL de diclorometano, la capa orgánica que contenia el bromuro de heptafluorobutilo fue concentrada, y el residuo fue usado sin purificación en la siguiente etapa .

Se disolvió HA (2.0 g, 53 kDa) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El líquido viscoso resultante fue transferido a un vaso de precipitados de 400 mL que contenía 100 mL de isopropanol, y se continuó mezclando. A la mezcla agitada se añadió el bromuro de heptafluorobutilo crudo en 10 mL de isopropanol, y la mezcla se agitó por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el producto FHA-2 de BPM crudo. Este FHA-2 de BPM crudo se disolvió en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externa cuatro veces durante este periodo. El producto de FHA-2 de BPM dializado fue liofilizado para dar 1.5 g de FHA-2 de BPM, designado como FHA-2 de BPM como malla algodonosa.

H NMR (D20, d) : 1.82 (s, 3H, NCH3) , 3.15-3.80 (m, 8H, OCH+OCH2) . 19F NMR (D20, d) : -115.3, -120.8.

Se determinó el grado de sustitución (SD) por 1H NMR como 1.0.

K. Preparación de FHA-2 de BPM (DS-2) A un matraz de 25 mL que contenia 3.0 g de 2 , 2, 3, 3, 4, 4- heptafluoro- 1- butanol (15 mmoles) , se añadieron lentamente 2.5 mL de tribromuro de fósforo (16 mmoles). La mezcla fue agitada a 60 °C por 30 minutos, y luego se añadió lentamente solución saturada de bicarbonato de sodio (15 mL) para detener la reacción. La solución acuosa fue extraída con tres porciones de 15 mL de diclorometano, la capa orgánica que contenía el bromuro de heptafluorobutilo fue concentrada, y el residuo fue usado sin purificación en la siguiente etapa.

Se disolvió HA (2.0 g, 53 kDa) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El líquido viscoso resultante fue transferido a un vaso de precipitados de 400 mL que contenia 100 mL de isopropanol, y se continuó mezclando. A la mezcla agitada se añadió el bromuro de heptafluorobutilo crudo en 10 mL de isopropanol, y la mezcla se agitó por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el producto FHA-2 de BPM crudo. Este FHA-2 de BPM crudo se disolvió en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externa cuatro veces durante este periodo. El producto de FHA-2 de BPM dializado fue liofilizado para dar 1.5 g de FHA-2 de BPM, designado como FHA-2 de BPM como malla algodonosa. 1H NMR (D20, d) : 1.82 (s, 3H, NCH3) , 3.15-3.80 (m, 8H, OCH+OCH2) . 19F NMR (D20, d) : -115.3, -120.8.

Se determinó el grado de sustitución (SD) por 1H NMR como 2.0.

L . Preparación de FHA-1 de BPM (DS-1) A un matraz de 25 mL que contenia 1.0 g de 2, 2, 3, 3- pentafluoro- 1- propanol (5 mmoles), se añadieron lentamente 1.3 mL de tribromuro de fósforo (7.5 mmoles). La mezcla fue agitada a 60 °C por 30 minutos, y luego se añadió lentamente solución saturada de bicarbonato de sodio (15 mL) para detener la reacción. La solución acuosa fue extraída con tres porciones de 15 mL de diclorometano, la capa orgánica que contenia el bromuro de heptafluorobutilo fue concentrada, y el residuo fue usado sin purificación en la siguiente etapa .

Se disolvió HA (2.0 g, 53 kDa) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El liquido viscoso resultante fue transferido a un vaso de precipitados de 400 mL que contenia 100 mL de isopropanol, y se continuó mezclando. A la mezcla agitada se añadió el bromuro de heptafluorobutilo en 10 mL de isopropanol, y la mezcla se agitó por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el producto FHA-1 crudo de BPM. Este FHA-1 de peso molecular crudo se disolvió en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de ~ 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externa cuatro veces durante este periodo. El producto de FHA-1 de BPM dializado fue liofilizado para dar 1.5 g de FHA-1 de BPM, designado como FHA-1 de BPM como malla algodonosa.

XH NMR (D20, d) : 1.80 (s, 3H, NCH3) , 3.15-3.80 (m, 8H, OCH+OCH2) . 19F NMR (D20, d) : -113.6, - 118.0. Se determinó el grado de sustitución (SD) por 1H NMR como 1.0.

M. Preparación de FHA-1 de BPM (DS-2) A un matraz de 25 mL que contenia 3.0 g de 2, 2, 3, 3- pentafluoro- 1- propanol (15 mmoles), se añadieron lentamente 3 mL de tribromuro de fósforo (18 mmoles). La mezcla fue agitada a 60 °C por 30 minutos, y luego se añadió lentamente solución saturada de bicarbonato de sodio (15 mL) para detener la reacción. La solución acuosa fue extraída con tres porciones de 15 mL de diclorometano, la capa orgánica que contenía el bromuro de heptafluorobutilo fue concentrada, y el residuo fue usado sin purificación en la siguiente etapa .

Se disolvió HA (2.0 g, 53 kDa) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El líquido viscosos resultante fue transferido a un vaso de precipitados de 400 mL que contenía 100 mL de isopropanol, y se continuó mezclando. A la mezcla agitada se añadió el bromuro de heptafluorobutilo en 10 mL de isopropanol, y la mezcla se agitó por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el producto FHA-1 de BPM crudo. Este FHA-1 de BPM crudo se disolvió en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de ~ 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externa cuatro veces durante este período. El producto de FHA-1 de BPM dializado fue liofilizado para dar 1.5 g de FHA-1 de BPM, designado como FHA-1 de BPM como malla algodonosa. 1H NMR (D20, d) : 1.80 (s, 3H, NCH3) , 3.15-3.80 (m, 8H, OCH+OCH2) . 19F NMR (D20, d) : -113.6, -118.0.

Se determinó el grado de sustitución (SD) por XH NMR como 2.0.

N . Preparación de BGHA de BPM Se disolvió ácido hialurónico (HA, Novozymes Biopolymers, 53 kDa) (2.0 g) en 20 mL de NaOH (40 % en peso/volumen) en un vaso de precipitados de 100 mL y la mezcla se agitó por 2 horas a temperatura ambiente (ta) . El liquido viscoso resultante se transfirió a un vaso de precipitados de 400 mL que contenia 100 mL de isopropanol, y se continuó mezclando. A la mezcla agitada se añadieron 10 mL de éter bencil glicidilico, y la mezcla fue agitada por 24 horas a ta. La suspensión resultante fue filtrada para colectar el producto BGHA de BPM crudo. Este BGHA de BPM crudo fue disuelto en 250 mL de agua destilada, la solución fue ajustada a pH de ~ 7.0, y la solución fue dializada contra agua destilada por 24 horas, cambiando el baño de agua externo cuatro veces durante este periodo. El producto BGHA de BPM dializado fue liofilizado para dar 1.25 g de BGHA de BPM como una malla algodonosa.

XH NMR (D20, d) : 1.85 (s, 3H, NCH3) , 3.20-3.80 (m, 10H, OCH+OCH3) . El grado de sustitución (SD) fue determinado por 1H NMR, SD es menor que 1.

II .Preparación de P-OSPHA-1 de BPM (DS-1) (GM- 211101) Primero, se preparó la sal tributilamonio (TBA) de FHA de BPM (DS-1) por la adición de 1 mL de tributilamina a FHA-1 de BPM (1.0 g) en 100 mi de agua desionizada la cual fue ajustada a pH de 3.0 con HC1 1N. La mezcla fue mezclada vigorosamente, secada por liofilización. La sal resultante ( FHA-1-TBA) fue disuelta en 25 mi de DMF a la cual se añadieron el exceso requerido (6 moles/equivalente del grupo hidroxi disponible en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.4 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mL de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol saturado frió con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El Ha parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua destilada y dializado contra 100 mM de solución de NaCl por dos días, cambiando la solución 4 veces al día y se liofilizó para dar el producto (330 mg) con 75 % de rendimiento y caracterizado por ¾ NMR, SD de sulfatación = 1.0. El grado de sustitución se determinó comparando el desplazamiento de NMR de OCH con los de la literatura (Carbohydrate Research, 1998, 306, 35-43) . 2. Preparación de P-OSPHA-2 de BPM (DS-1) (GM- 311101) Se preparó la sal TBA de FHA-2 de BPM (FHA-2 de HA de PM de 53 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-2 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (TBA de FHA de BPM) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (6 equivalentes/mol del grupo hidroxi disponible en HA ) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.4 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El FHA-2 de BPM parcialmente 0-sulfatado" crudo resultante fue disuelto en agua, dializado, y liofilizado como en 1, para dar el producto (300 mg) con rendimiento de 68 % y caracterizado por 1H NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1. 3. Preparación de P-OSMeHA de BPM (DS-1) (GM-1101) Se preparó la sal TBA de MeHA de BPM (DS-1) (a partir de HA de PM de 53 kDa) a partir de 0.5 mi de tributilamina y MeHA de BPM (0.5 g) en 50 mL de agua destilada como en 1. La sal resultante (TBA de MeHA de BPM) fue disuelta en 50 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (6 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en MeHA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 100 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 150 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El MeHA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado, y liofilizado como en 1, para dar el producto (540 mg) con rendimiento de 62 % y caracterizado por 1H NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.0 - 1.5. 4. Preparación de P-OSFHA-1 de BPM (DS-2) (GM- 211201) Se preparó la sal TBA de FHA-1 de BPM (FHA-1 de HA de PM de 53 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-2 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (TBA de FHA de BPM) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (6 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.4 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El HA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua destilada, y dializado contra 100 mM de solución de NaCl por dos días, cambiando la solución cuatro veces al día, y liofilizado como en 1, para dar el producto (300 mg) con rendimiento de 70 % y caracterizado por 1tt NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.0. 5. Preparación de LMW-P-OSFHA-2 (DS-2) (GM-311201) Se preparó la sal TBA de LMW-FHA-2 (FHA-2 de HA de PM de 53 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-2 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (TBA de LMW-FHA-2) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (6 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.4 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El LMW-FHA-2 parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado y liofilizado como en 1, para dar el producto (310 mg) con rendimiento de 70 % y caracterizado por 1H NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.0. 6. Preparación de LMW-P-OSMeHA (DS-2) (GM-111201) Se preparó la sal TBA de LMW-MeHA (DS-1) (desde HA de PM de 53 kDa) desde 0.5 mi de TBA y LMW-MeHA (0.5 g) en 50 mL de agua destilada como en 1. La sal resultante (TBAMeHA de bajo peso molecular) fue disuelta en 50 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (6 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 100 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 150 mL de etanol frió saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El MeHA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua destilado, dializado y liofilizado como en 1, para dar el producto (560 mg) con rendimiento de 64 % y ' caracterizado por 1H NMR para tener un SD de sulfatación igual a 1.0. 7. Preparación de P-OSFHA-1 (DS-1) (GM-231101) Se preparó la sal TBA de FHA-1 ( FHA-1 de HA de PM de 950 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-1 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (TBA de FHA-1) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (6 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.4 g) .

Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frió saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El HA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua destilada, y dializado contra 100 mM de solución de NaCl por dos días, cambiando la solución cuatro veces en un día, y se liofilizó, para dar el producto (300 mg) con rendimiento de 68 % y caracterizado por 1H NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.0-1.5. 8. Preparación de P-OSFHA-2 (DS-1 (GM-331101) Se preparó la sal TBA de FHA-2 (FHA-2 de HA de P de 950 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-2 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (TBA de FHA-1) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (6 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.4 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El FHA-2 parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado, y se liofilizó como en 1, para dar el producto (320 mg) con rendimiento de 70 % y caracterizado por 1H NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.0-1.5. 9. Preparación de P-OSMeHA (DS-1) (GM-131101) Se preparó la sal TBA de MeHA (DS-1) (desde HA de PM de 950 kDa) desde 0.5 mi de TBA y MeHA (0.5 g) en 50 mL de agua destilada como en 1. La sal resultante (TBA-MeHA) fue disuelta en 50 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (6 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en MeHA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 100 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 150 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El MeHA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua destilado, dializado y liofilizado como en 1, para dar el producto (510 mg) con rendimiento de 60 %, lo cual fue mostrado por 1H NMR para tener un SD de sulfatación igual a 1.0-1.5. 10. Preparación de P-OSFHA-1 (DS-2) (01-231201) Se preparó la sal TBA de FHA-1 (FHA-1 de HA de PM de 950 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-1 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (FHA-1-???) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (6 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.4 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frió saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El HA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado contra 100 mM de solución de NaCl por dos días, cambiando la solución cuatro veces en un día, y se liofilizó, para dar el producto (280 mg) con rendimiento de 68 % y caracterizado por 1H NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.0-1.5. 11.Preparación de P-OSFHA-2 (DS-2) (GM-331201) Se preparó la sal TBA de ' FHA-2 (FHA-2 de HA de PM de 950 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-2 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (FHA-1-???) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (6 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.4 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El FHA-2 parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado, y se liofilizó como en 1, para dar el producto (300 mg) con rendimiento de 69 % y caracterizado por 1H NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.0-1.5. 12. Preparación de P-OSMeHA (DS-2) (GM-131201) Se preparó la sal TBA de MeHA (DS-1) (desde HA de PM de 950 kDa) desde 0.5 mi de TBA y MeHA (0.5 g) en 50 mL de agua destilada como en 1. La sal resultante (TBA-MeHA) fue disuelta en 50 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (6 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en MeHA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 100 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 150 mL de etanol frió saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El MeHA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua destilada, dializado y liofilizado como en 1, para dar el producto (560 mg) con rendimiento de 64 %, lo cual fue mostrado por 1H NMR para tener un SD de sulfatación igual a 1.0-1.5. 13. Preparación de LMW-F-OSFHA-1 (DS-1) (GM-212101) Se preparó la sal TBA de LMW FHA-1 (FHA-1 de HA de PM de 53 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-1 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (FHA-1-???) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El HA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua destilada, dializado contra 100 mM de solución de NaCl por dos días, cambiando la solución cuatro veces en un día, y se liofilizó para dar el producto (300 mg) con rendimiento de 71 % y caracterizado por ' H NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.5-2.0. 14.Preparación de LMW-F-OSFHA-2 (DS-1) (GM-312101) Se preparó la sal TBA de LMW-FHA-2 (FHA-2 de HA de PM de 53 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-2 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (LMW-FHA-2-TBA) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) .

Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El LMW-FHA-2 parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado, y se liofilizó como en 1, para dar el producto (260 mg) con rendimiento de 65 % y caracterizado por """H NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.5-2.0. 15. Preparación de LMW-F-OSMeHA (DS-1) (GM-112101) Se preparó la sal TBA de LMW-MeHA (DS-1) (desde HA de PM de 53 kDa) desde 0.5 mi de TBA y LM MeHA (0.5 g) en 50 mL de agua destilada como en 1. La sal resultante (TBA-LMW MeHA) fue disuelta en 50 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en MeHA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (1.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 100 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 150 mL de etanol frió saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El MeHA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado y liofilizado como en 1, para dar el producto (480 mg) con rendimiento de 60 %, lo cual fue mostrado por 1ti NMR para tener un SD de sulfatación igual a 1.5-2.0. 16. Preparación de LMW-OSFHA-1 (DS-2) (GM-212201) Se preparó la sal TBA de LMW-FHA-1 (FHA-1 de HA de P de 53 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-1 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (LMW-FHA-1-TBA) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frió saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El HA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua y dializado contra 100 mM de solución de NaCl por dos días, cambiando la solución cuatro veces en un día, y se liofilizó para dar el producto (300 mg) con rendimiento de 70 % y caracterizado por 1H NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.5-2.0. 1 . Preparación de LMW-F-OSFHA-2 (DS-2) (GM-312201) Se preparó la sal TBA de LMW-FHA-2 (FHA-2 de HA de PM de 53 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-2 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (LMW-FHA-2-TBA) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupo hidroxi disponible en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frió saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El LMW-FHA-2 parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado, y se liofilizó como en 1, para dar el producto (300 mg) con rendimiento de 68 % y caracterizado por H NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.5-2.0. 18.Preparación de LMW-OSMeHA (DS-2) (GM-112201) Se preparó la sal TBA de LM -MeHA (DS-1) (desde HA de PM de 53 kDa) desde 0.5 mi de TBA y LMW MeHA (0.5 g) en 50 mL de agua destilada como en 1. La sal resultante (TBA-LMW MeHA) fue disuelta en 50 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en MeHA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (1.6 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 100 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 150 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El MeHA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado y liofilizado como en 1, para dar el producto (550 mg) con rendimiento de 63 %, lo cual fue mostrado por XH NMR para tener un SD de sulfatación igual a 1.5. 19. Preparación de F-OSFHA-1 (DS-1) (GM-232101) Se preparó la sal TBA de FHA-1 (FHA-1 de HA de PM de 950 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-1 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (FHA-1-???) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupo hidroxi disponible en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El HA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua destilada y dializado contra 100 mM de solución de NaCl por dos días, cambiando la solución cuatro veces en un día, y se liofilizó para dar el producto (300 mg) con rendimiento de 68 % y caracterizado por XH NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.5. 20. Preparación de F-OSFHA-2 (DS-1) (GM-332101) Se preparó la sal TBA de FHA-2 (FHA-2 de HA de PM de 950 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-2 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (FHA-2-TBA) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupo hidroxi disponible en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El FHA-2 parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado, y se liofilizó como en 1, para dar el producto (310 mg) con rendimiento de 70 % y caracterizado por :H NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.5-2.0. 21.Preparación de F-OSMeHA (DS-1) (GM-132101) Se preparó la sal TBA de MeHA (DS-1) (desde HA de PM de 950 kDa) desde 0.5 mi de TBA y MeHA (0.5 g) en 50 mL de agua destilada como en 1. La sal resultante (TBA- MeHA) fue disuelta en 50 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en MeHA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (1.6 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 100 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 150 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El MeHA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado y liofilizado como en 1, para dar el producto (500 mg) con rendimiento de 60 %, lo cual fue mostrado por 1H NMR para tener un SD de sulfatación igual a 1.5-2.0. 22. Preparación de F-OSFHA-1 (DS-1) (GM-232201) Se preparó la sal TBA de FHA-1 (FHA-1 de HA de PM de 950 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-1 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (FHA-1-???) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupo hidroxi disponible en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frió saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El HA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua destilada y dializado contra 100 mM de solución de NaCl por dos días, cambiando la solución cuatro veces en un día, y se liofilizó para dar el producto (300 mg) con rendimiento de 69 % y caracterizado por 1H NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.5-2.0. 23. Preparación de F-OSFHA-2 (DS-2) (GM-332201) Se preparó la sal TBA de FHA-2 (FHA-2 de HA de P de 950 kDa) por adición de 0.5 mi de tributilamina al FHA-2 (0.25 g) en 50 mi de agua destilada y procesamiento como se hizo anteriormente en 1. La sal resultante (FHA-2-TBA) fue disuelta en 25 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupo hidroxi disponible en HA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 50 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 75 mL de etanol frió saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El HA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado y se liofilizó como en 1, para dar el producto (300 mg) con rendimiento de 69 % y caracterizado por XH NMR, el SD de sulfatación fue igual a 1.5-2.0. 24.Preparación de F-OSMeHA (DS-2) (GM-132201) Se preparó la sal TBA de MeHA (DS-1) (desde HA de PM de 950 kDa) desde 0.5 mi de TBA y MeHA (0.5 g) en 50 mL de agua destilada como en 1. La sal resultante (TBA- MeHA) fue disuelta en 50 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupos hidroxi disponibles en MeHA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (1.6 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 100 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 150 mL de etanol frió saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El MeHA parcialmente O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado y liofilizado como en 1, para dar el producto (550 mg) con rendimiento de 63 %, lo cual fue mostrado por 1H NMR para tener un SD de sulfatación igual a 1.5-2.0. 25. Preparación de P-OSBGHA (01-431101) Se preparó la sal TBA de BGHA (desde HA de PM de 950 kDa) desde 0.5 mi de TBA y BGHA (0.5 g) en 50 mL de agua destilada como en 1. La sal resultante (TBA- BGHA) fue disuelta en 50 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (6 moles/equiv . de grupos hidroxilo disponibles en BGHA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 100 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 150 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El BGHA O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado y liofilizado como en 1, para dar el producto (500 mg) con rendimiento de 60 %, lo cual fue mostrado por XH NMR para tener un SD de sulfatación < 1. 26. Preparación de F-OSBGHA (GM-432101) Se preparó la sal TBA de BGHA (desde HA de PM de 950 kDa) desde 0.5 mi de TBA y BGHA (0.5 g) en 50 mL de agua destilada como en 1. La sal resultante (TBA- BGHA) fue disuelta en 50 mi de D F al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupos hidroxilo disponibles en BGHA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (1.6 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 100 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 150 mL de etanol frió saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El BGHA O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado y liofilizado como en 1, para dar el producto (520 mg) con rendimiento de 61 %, lo cual fue mostrado por XH N R para tener un SD de sulfatación < 1. 27.Preparación de P-OSBGHA (GM-411101) Se preparó la sal TBA de BGHA (desde HA de PM de 53 kDa) desde 0.5 mL de TBA y BGHA (0.5 g) en 50 mL de agua destilada como en 1. La sal resultante (TBA- BGHA) fue disuelta en 50 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (6 moles/equiv. de grupos hidroxilo disponibles en BGHA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (0.8 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 100 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 150 mL de etanol frió saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El BGHA O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado y liofilizado como en 1, para dar el producto (500 mg) con rendimiento de 60 %, lo cual fue mostrado por 1H NMR para tener un SD de sulfatación < 1. 28. Preparación de P-OSBGHA (GM-412101) Se preparó la sal TBA de BGHA (desde HA de PM de 53 kDa) desde 0.5 mi de TBA y BGHA (0.5 g) en 50 mL de agua destilada como en 1. La sal resultante (TBA- BGHA) fue disuelta en 50 mi de DMF al cual se añadió el exceso requerido (12 moles/equiv. de grupos hidroxilo disponibles en BGHA) del complejo de trióxido de azufre-piridina (1.6 g) . Después de agitar por 3 horas a 40 °C, la reacción fue detenida por adición de 100 mi de agua, y el material crudo fue precipitado por adición de 150 mL de etanol frío saturado con acetato de sodio anhidro, y luego se colectó por filtración. El BGHA O-sulfatado crudo resultante fue disuelto en agua, dializado y liofilizado como en 1, para dar el producto (500 mg) con rendimiento de 60 %, lo cual fue mostrado por 1H NMR para tener un SD de sulfatación < 1.

III . Preparación de SAGEs fluorescentes y SAGE palmitoilado a . reparación del conjugado fluorescente de LMW-F-OSFHA-1 (DS-2) Se disolvieron LM -F-OSFHA-1 (50 mg) y NHS (40 mg) en 10 mi de agua, y luego se añadió Alaxa fluo®488 (1 mg) en 4 mi de DMF. Y luego se ajustó el pH a 4.75, después de eso, se añadieron 100 mg de EDC1 en forma sólida. El pH fue conservado en 4.75 por adición de solución de NaOH. La solución fue agitada por toda la noche a temperatura ambiente con cobertura de lámina de aluminio. Luego el producto fue purificado por diálisis contra agua destilada (Peso molecular de corte, 3500) seguido por solución de metanol/agua (50/50, en volumen) se purificó adicionalmente por columna de filtración sobre gel (Sephadex G-25) . Se purificó adicionalmente por columna PD-10 y se liofilizó a sequedad para obtener 40 mg. b . Preparación del conjugado fluorescente de LMW-P-OSMeHA (DS-1) Se disolvieron LMW-F-OSMeHA-1 (50 mg) y NHS (40 mg) en 10 mi de agua, y luego se añadió Alaxa fluo®488 (1 mg) en 4 mi de DMF. Y luego se ajustó el pH a 4.75, después de eso, se añadieron 100 mg de EDC1 en forma sólida. El pH fue conservado en 4.75 por adición de solución de NaOH. La solución fue agitada por toda la noche a temperatura ambiente con cobertura de lámina de aluminio. Luego el producto fue purificado por diálisis contra agua destilada (Peso molecular de corte, 3500) seguido por solución de metanol/agua (50/50, en volumen) , se purificó adicionalmente por columna de filtración sobre gel (Sephadex G-25) . Se purificó adicionalmente por columna PD-10 y se liofilizó a sequedad para obtener 43 mg.

Preparación del SAGE Palmitoilado Se disolvió LMW-P-OSMeHA (50 mg) en 50 mL de DMF, se añadió a la solución de DMF, trietilamina (0.3 mL) mientras se agitaba. Después de 5 min, se añadió cloruro de palmitoilo (0.5 mi). La mezcla resultante fue conservada agitando toda la noche. La solución fue evaporada, y el residuo fue disuelto en agua destilada, se dializó por un día (cambio de agua cuatro veces), y se liofilizó a sequedad , se obtuvieron 35 mg .

IV. Los SAGEs son Potentes Inhibidores de P-selectina, Elastasa Leucocitica Humana y la Interacción de RAGE con todos sus Ligandos .

Materiales . Se adquirieron RAGE anti-humano policlonal de cabra, proteína-1 catalogada de alta movilidad humana recombinante (HMGB-1), Fe quimérica/P-selectina humanas recombinantes, Fe quimérica/RAGE humanas recombinantes, azurocidina humana y azurocidina anti-humana policlonal de cabra de R & D Systems (Minneapolis, MN) . Calgranulina SlOOb humana fue de Calbiochem (San Diego, CA).E1 producto final de glicación avanzada carboximetil lisina-albúmina de suero bovino (CML-BSA) se obtuvo de MBL International (Woburn, MA) . Células monociticas U937 humanas fueron obtenidas de American Type Culture Collection (Manassas, VA) . La proteina A, IgG anti-cabra de conejo conjugada a peroxidasa de rábano, regulador de carbonato-bicarbonato y bloqueador de albúmina de suero bovino (lOx) fueron obtenidos de Piercenet (Rockford, IL) . Calceina AM, Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) , ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) . Suero fetal bovino (FBS), HEPES, aminoácidos no esenciales, solución de penicilina/estreptomicina/L-glutamina, RPMI-1640 sin L-glutamina y bicarbonato de sodio fueron obtenidos de Invitrogen (Carlsbad, CA) . Microplacas de 96 pocilios de alto enlace fueron obtenidas de Corning Life Sciences (Corning, NY) . Todos los otros productos químicos no especificados fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) .

Cultivo Celular. Se desarrollaron monocitos U937 en cultivo en suspensión a 37 °C en aire humidificado con C02 al 5 %, en medio RPMI-1640 suplementado con FBS inactivado térmicamente al 10 %, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruviato de sodio, 0.1 mM de aminoácidos no esenciales de MEM, 100 unidades/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Los experimentos se efectuaron sobre células de los pasajes 1 -5.

Ensayo de Enlace Celular. Se estudió el efecto de SAGEs sobre el enlace de monocitos U937 a P-selectina o RAGE en microplacas de alto enlace recubiertas con 8 µ?/p?? de proteina A (50 µ?/??????) en regulador de carbonato-bicarbonato 0.2 M (pH de 9.4). Las placas fueron lavadas con solución salina regulada con fosfato que contenia BSA al 1 % (PBS-BSA), y se añadió P-selectina-Fc o RAGE-Fc quimérica (50 µ? que contenia 1 µg) a cada pocilio y se incubaron 2 horas a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C, respectivamente. Después de incubación, los pocilios fueron lavados dos veces con PBS-BSA. Cincuenta (50) µ? de SAGEs (0 a 1,000 µ?/???) diluidos seriadamente en 20 mM de regulador HEPES (que contenía 125 mM de NaCl, 2 mM de calcio y 2 mM de magnesio) fueron añadidos a cada pocilio y se incubaron a temperatura ambiente por 15 minutos. Como un control negativo, se añadieron 50 µ? de 10 mM de EDTA a pocilios seleccionados para prevenir el enlace celular a través de la secuestración del calcio. Al final del período de incubación, se añadieron a cada pocilio 50 µ? de células U937 (105 células/pocilio, marcadas con calceína de conformidad con las instrucciones del fabricante) y las placas fueron incubadas 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. Los pocilios fueron entonces lavados dos veces con PBS y las células enlazadas fueron lisadas por adición de 100 µL de regulador que contenía Tris-Triton X-100. Se midió la fluorescencia sobre un lector de microplacas usando excitación de 494 nm y emisión de 517 nm.

Ensayo de enlace en Fase Sólida. Se usaron los ensayos de enlace en fase sólida para estudiar la habilidad de SAGEs para inhibir a sus ligandos. Para estudios del efecto de SAGEs sobre el enlace de RAGE a sus ligandos, se recubrieron placas de polivinilo de 96 pocilios con 5 µg/pocillo de ligandos específicos (C L-BSA, HMGB-1 o calgranulina SlOOb) . Las placas fueron incubadas toda la noche a 4 °C y se lavaron tres veces con PBS-Tween 20 al 0.05 % (PBST) . Separadamente la quimera Fe - RAGE (100 µ?/ml en PBST-BSA al 0.1 %) fueron incubadas con igual volumen de SAGEs diluidos en serie (0.001 a 1,000 µq/ml en PBST-BSA) toda la noche a 4 °C. Al día siguiente, mezcla de 50 µ? de RAGE-SAGE fue transferida a cada pocilio recubierto del ligando respectivo y se incubaron a 37 °C por 2 horas. Los pocilios fueron entonces lavados cuatro veces con PBST. Para detectar RAGE enlazado, se añadieron a cada pocilio 50 µ? de anticuerpo anti-RAGE (0.5 µg/ml) , la mezcla fue incubada por 1 hora a temperatura ambiente, y /o los pocilios fueron lavados otra vez cuatro veces con PBST. Se añadió el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (dilución de anticuerpo de 1:10, 000 en PBST; 50 µ]_, por pocilio) , los pocilios fueron incubados por 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavaron una vez con PBST. Se inició una reacción colorimétrica por adición de 50 µ?? del cromógeno tetrametil bencidina (cromogeno en solución individual de TMB) y se terminó después de 15 min por adición de 50 µ?? de HC1 1N. Se leyó la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas automático.

Ensayo Enzimático . Un ensayo de actividad para caracterizar la inhibición de SAGE de la HLE proteasa PMN catiónica (Fryer A., Huang Y-C, Rao G, Jacoby D, mancilla E, horton R, Piandosi CA, Kennedy T, Hoidal J. Se empleó la 0-desulfatación selectiva produce heparina no anti-coagulante que retiene la actividad farmacológica en el pulmón. J. Pharmacol Exp. Ther 282:208-219, 1997), la cual midió la habilidad de HLE purificada para fragmentar un sustrato cromogénico. Se incubó HLE (100 nM) con SAGE (1-100 nM) en regulador HEPES 0.5 por 15 min. Después de incubación, se añadió a la mezcla de reacción el sustrato elastasa Suc-Ala-Ala-Val-p-nitroanalina (p-NA) a una concentración final de 0.3 mM. La hidrólisis de pNA liberada fue seguida por 15 min midiéndose la absorbancia a 405 nm. A fin de caracterizar la habilidad de SAGEs para activar el Factor CXII o complemento, se emplearon ensayos de actividad que son similares a los usados recientemente para cribado por toxicidad de heparina comercial adulterada (Kishimoto TK, Viswanathan K, Ganguly T, Elankumaran S, Smith S, Pelzer K, Lansing JC, Sriranganathan N. Zhao G, Galcheva . Gargova Z, Al-Hakim A, Bailey GS, Fraser B, Roy S, Rogers-Cotrone T, Buhse L, Whary M, Fox J, Nasr M, Dal Pan GJ, Shriver Z., Langer RS, Venkataranam G, Austen KF, oodcock J, Sasisekharan R. Heparina contaminada asociada con eventos clínicos adversos y activación del sistema de contacto. N. Engl J Med 358:2457-2467, 2008; Guerini M, Beccati D, Shriver Z, Naggi A, Viswanathan K. Bisio A, Capila I, Lansg JC, Guglieri S, Fraser B, Al-Hakim A, Gunay NS, Zhang Z, Robinson L, Buhse L, Nasr M, Woodcock J, Langer R, Vkataranam G, Linhardt RJ, Casu B, Torri G, Sasisekharan R. El sulfato de condroitina sobresulfatado es un contaminante en heparina asociado con eventos clínicos adversos. Nat Biotech 26: 669-675, 2008). Se incubó plasma humano conjuntado (5 µ?) con 100 µ? de SAGE (0.1 a 1000 µg) en HEPES 0.05 M que contenía Tritón X-100 por 5 minutos a 5 °C . La actividad amidolítica específica por el factor de Hageman se determinó por adición de 0.5 m de D-ciclohidrotirosil-GA y después el absorbancia a 405 nm Silverberg M, Dunn JT, Garen L, Kaplan AP. A of human Hagem Factor. Demostration using a sinthetic substrate. J. Bio. Chem 255:7281-7286, 1980). La actividad amidolítica especifica para cada ingrediente activo fue dada por adición de D-A y después el cambio en absorbancia a 405 nm.

Resultados: Los resultados de los ensayos se muestran en la Tabla 2. SAGEs son potentes inhibidores de P-selectina. El desplazamiento mediado por el competidor de monocitos U937 humanos, el cual se adhiere firmemente a P-selectina a través de del ligando-1 de la glicoproteina de P-selectina (PSGL-1), fueron estudiados usando células marcadas fluorescentemente. La Figura 3 muestra que un SAGE inhibe el enlace de U937 a P-selectina con una concentración inhibidora del 50 % (IC50) de 0.5 µg/ l .

TABLA 2.

A B C D E F G H GM-211101 GM-311101 GM-111101 0.017 0.03 0.08 0.12 0.58 0.4 3 2 GM-211201 NR NR NR NR 0.54 NR GM-311201 NR NR NR NR 0.52 NR GM-111201 0.14 0.04 2.27 1.56 0.22 na 2 GM-231101 NR 14.6 GM-331101 NR 4.557 NR GM-131101 GM-231201 8.82 GM-331201 2.28 GM-131201 0.5 0.3 0.04 0.06 1.66 0.42 0.4 4 GM-212101 GM-312101 0.56 GM-112101 0.02 0.042 GM-212201 GM-312201 0.036 0.00 0.05 0.075 0.47 0.4 9 9 GM-112201 GM-232101 0.04 0.02 0.408 1 GM-332101 0.01 0.21 0.371 5 GM-132101 GM-232201 GM-332201 0.22 GM-132201 0.22 0.00 0.1 0.04 0.24 0.4 4 GM-431101 89.5 GM-432101 0.85 GM-411101 GM-412101 A = SAGE B = p-Selectina/PSGL C = RAGE/Mac-1 D = RAGE/CML-BSA E = RAGE/S100B F = RAGE/HMGB1 G = Elastasa Leucocítica H = Factor de Hageman Segundo, un polianión altamente sulfatado, alquilado y SAGEs sulfatados son potentes inhibidores de proteasas leucociticas polimorfonucleares . La Figura 4 muestra que SAGEs sulfatadas y fluoroalquiladas y/o alquiladas inhiben la elastasa leucocítica humana (HLE) con valores de IC50 impresionantemente potentes. Específicamente, · la HA(F-OSHA) totalmente O-sulfatada, no alquilada muestra un IC50 de 0.66 nM para HLE. Para los derivados de HA sulfatada y modificada, los valores de IC50 fueron de 1.89 nM , para HA (P-OSCHMHA carboximetilado parcialmente O-sulfatada; 1.97 nM para HA (P-OSHA) parcialmente O-sulfatada; y 3.46 nM para HA ( P-OSMEHA; G -131101) parcialmente O-sulfatada.

Tercero, SAGEs son inhibidores extremadamente potentes de RAGE. SAGEs inhibieron la interacción de RAGE y anfoterina (HMGB-1) con un IC50 de 1.1 µq/ml (Figura 5). La interacción de RAGE y calgranulinas S100 con una IC50 de 60 ng/ml (Figura 6), y el enlace de RAGE al producto de AGE carboximetil-lisina BSA con un IC50 de 44 ng/ml (Figura 7) . Estos valores son 5 a 10 veces más potentes que los niveles correspondientes de la inhibición del ligando-RAGE, que se han medido con heparina y heparina 2-0, 3-0 desulfatada.

Cuatro, SAGEs son potentes inhibidores de la proliferación de queratinocitos humanos. En estos ensayos se cultivaron queratinocitos epidérmicos neonatales humanos en la presencia y ausencia de SAGEs u otros inhibidores, y se midió la proliferación por adición de un colorante que es reducido en proporción directa al número de células viables presentes. En las figuras presentadas, los valores de absorbancia fueron normalizados a controles, a los cuales fueron asignados una absorbancia relativa de 1.0. La Figura 8 muestra que el HA (P-OSHA) parcialmente 0-sulfatada de alto peso molecular y HA (F-OSHA) totalmente O-sulfatado fueron más efectivos que el derivado de heparina heparina (0DSH)2-0, 3-0 desulfatada en la prevención de la proliferación de queratinocitos cuando se añadieron en concentración de 100 µg/ml. Sulfatación más alta parece ventajosa, ya que HA(P-0SMEHA) carboximetilada parcialmente sulfatada y HA ( P-OSMEHA metilada; GM-131101) fueron menos activos al inhibir la proliferación queratinocitica . La Figura 9 muestra que derivados de peso molecular globalmente más bajo (LMW) fueron mas efectivos que derivados de peso molecular mas alto en reducir la proliferación queratinocitica en este ensayo. En particular, el MeHA parcialmente O-sulfatado de LMW (LM -O-OMEHA; GM-111201), OMHA parcialmente O-sulfatado (LMW-P-OSCMHA) y HA de 53 kDa parcialmente O-sulfatado mismo (LMW-P-OSHA) todos redujeron la proliferación en relación a los controles a concentraciones tan bajas como 1 µg/ml .

V. Estudios In vivo para el tratamiento de Rosacea e Inflamación Materiales y Métodos Productos químicos. Se evaluaron GM-111101, GM-131101, GM-312101 y GM-212101. El medio fue comprado de American Type Culture Collection (ATCC) . El medio EpiLife fue adquirido de Invitrogen (Madison, WI) .

Células. Los Fibroblastos Dérmicos Humanos (nHDF) fueron adquiridos de ATCC. Los queratinocitos epidérmicos neonatales humanos (HEKn) fueron obtenidos de Invitrogen (Madison, WI ) .

Citotoxicidad. 4,000 células nHDF fueron sembradas en 100 µ? de medio en cada pocilio de las microplacas de fondo plano de 96 pocilios, y se incubaron a 37 °C en C02 al 5 % por 12 horas. Todo el medio fue cambiado con medio completo que contenia una variedad de derivados de hialuronano (HA) sulfatados a concentraciones finales de 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 ng/ml en cada columna. A 48 horas, se pipeteó en cada pocilio 20 µ? de TS (Promega, Madison, WI), y las células fueron adicionalmente incubadas por 2 horas. La absorbencia de las muestras fue medida a 490 nm usando un lector de placas de 96 pocilios.

Prueba de irritación de la piel en ratones. Se probaron GM-111101 y GM-212101 in vivo para determinar el potencial de irritación dérmica en la piel de ratones. Los dos agentes probados fueron preparados con dos diferentes concentraciones individualmente, 0.1 mg/ml y 1 mg/ml, se usaron ácido fórmico al 10 % y PBS como control positivo y negativo respectivamente (n = 6) . Ratones Balb/c, los cuales no habían sido usados en experimentos previos se observaron libres de cualquier irritación de la piel, trauma, o signos clínicos adversos antes de irritación de los estudios, fueron aleatorizados y agrupados para condiciones de prueba diseñadas. La espalda de los animales fueron esquilados, libres de pelo, con una esquiladora eléctrica al menos 4 horas antes de la aplicación de la muestra. Justamente antes de la aplicación de la sustancia de prueba, cada ratón recibió cuatro abrasiones epidérmicas paralelas con una aguja estéril en el área inferior del sitio de prueba mientras que el área superior del sitio de prueba permaneció intacto. Bajo anestesia, dos muestras de 0.5 mi de las soluciones de prueba fueron aplicadas en el sitio de prueba entero por introducción bajo una doble capa de gasa en un área de piel de aproximadamente cuadrada de 2.5 cm. Los parches fueron respaldados con plástico, cubiertos con una cinta no reactiva y el sitio de prueba entero fue envuelto con una venda. Los animales fueron regresados a sus jaulas. Después de 24 horas de exposición al agente, el vendaje y la gasa de prueba impregnada fueron retiradas. Los sitios de prueba fueron frotados con agua corriente para remover cualquier compuesto de prueba remanente. A 24 y 72 horas después de aplicación del compuesto, los sitios de prueba fueron examinados para reacciones dérmicas de conformidad con el criterio de evaluación de Draize recomendado para FHSA. El Indice de Irritación Primaria (P.I.I.) del articulo de prueba será calculado después de completar la prueba. Un material que produjo una evaluación de P.I.I. de más o igual a 5.00 se consideraría positivo; el material se consideraría un irritante primario para la piel.

Animales. Ratones Balb/c fueron adquiridos comercialmente de un vendedor aprobado por el departamento de medicina veterinaria y vivero de la Universidad de Utah. Después de que se encuarentenaron por el período prescrito siguiendo la receta, estuvieron listos para uso.

Modelos en rosácea de inyección de SAGE y péptido LL37. La enfermedad crónica de la piel deja una marca indeleble en la vida del paciente, especialmente , como en el caso de rosácea, cuando se presenta en la cara. Como una especie, reaccionamos positiva o adversamente a una apariencia de otro, instintivamente retrocedemos de aquellos cuyo aspecto parece anormal y desagradable para nosotros mismos. Aunque las enfermedades de la piel a menudo no son amenazantes para la vida, son alteradoras de la vida en maneras que no estilan los individuos normales. Rosacea es una de las enfermedades que alteran la vida. Rosacea es una enfermedad cutánea facial desfiguradora común que afecta al 3 % de la población de los Estados Unidos, o aproximadamente 14 millones de Americanos, con principio usualmente entre las edades de 30 a 50 años. Golpea primeramente en caucásicos descendientes célticos, y parece ser más problemática y común en mujeres que en hombres. Sobre un tercio de los pacientes tienen una historia familiar, fuertemente sugerente de una enfermedad hereditaria. La condición es particularmente estigmatizante a causa del mal concepto común de que el enrojecimiento facial y la nariz prominente de rosácea son la consecuencia de consumo excesivo de alcohol. Rosacea se presenta como varios fenotipos clínicos. La presentación más común está caracterizada por rubor central persistente o transitorio y eritema de la cara, con capilaridades dilatadas sobre las mejillas y nariz. Este fenotipo varia desde una "complexión colorada" a vasos capilares dilatados fácilmente visibles, persistentes. Este subtipo es sin un tratamiento tópico efectivo. En una segunda presentación común tienen lugar las pápulas y pústulas sobre las convexidades dentales de la cara, frecuentemente sobrepuestas sobre un fondo de eritema. En la biopsia, la piel está ricamente infiltrada con PMNs. La rosácea pápulopustular es tratada empíricamente con antibióticos generalizados o tópicos, pero no está claramente relacionada con infección cutánea documentada. Macrólidos, ya sea tópica o generali zadamente han sido usados más a menudo como terapia, y pueden producir mejoría no a causa de su actividad antibacteriana sino por su habilidad para retardar la quimotaxis de PMN en áreas de inflamación. En un tercer y afortunadamente más raro - fenotipo, rosácea produce rinofima desde hiperplasia tanto de glándulas sebáceas como de tejido conectivo de la nariz, creando la clásica nariz "Campo de W.C", o "nariz de wiskey". El tratamiento de esta condición requiere excisión quirúrgica del tejido, o terapia láser, para remover el tejido hipertrofiado. En un cuarto fenotipo, rosácea puede producir ojos con escozor, secos con irritación de los párpados (blefaritis), fotosensibilidad, visión borrosa y conjuntivitis. La enfermedad prolongada puede dar como resultado queratitis y aún cicatrización de la córnea.

Este fenotipo, el cual da origen a inflamación de los párpados y de las glándulas meibomianas sobre la superficie del párpado inferior, es común y se traslapa clínicamente con el síndrome del "ojo-seco" visto frecuentemente por los oftalmólogos. La ocurrencia de rosacea exclusivamente sobre áreas faciales expuestas al sol en aquellos con piel delicada y ojos claros apuntan a un papel patógeno para la radiación solar al causar la condición.

La patogénesis de rosácea ha sido recientemente elucidada (Yamasaki K, Di Mardo A, Bardan A, Murakami M, Ontake T, Coda A, Dorscher RA, Bonart C, Descargues P, Hovnanian A, orhenn VB, Gallop RL, La catelicina y la actividad proteasa serina creciente promueven la inflamación de la piel en rosácea, Nat Med 13: 975-980, 2007; Bevins CL, Liu F-T, Rosacea: skin innate - immunity gone awry? Nat Med 13: 904-906, 2007). En elegante trabajo Yamasaki y colaboradores demostraron que la piel involucrada con rosácea contiene altos niveles de catelicidinas y su SCTE proteasa de procesamiento. Catelicidinas, una familia importante de péptidos antimicrobianos en mamíferos, son expresadas en leucocitos y células epiteliales de muchos órganos, donde median respuestas inmunes innatas a bacterias (Nizet V, Ontake T, Lauth X, Trowbridge Jk, Rudisill J, Dorschner RA, Prestonj amasp V, Piraino J, Huttner K, Gallop RL, Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature 414:454-457, 2001). Las catelicidinas también señalan crecimiento vascular, migración de PMN y cicatrización de heridas (Bevins, ibid) . La catelicidina humana es secretada por queritinocitos como un pro-péptido hCAPl8 de 18 kDa y es fragmentada por SCTE en el péptido LL-37 anti-microbiano activo C-terminal, designada después su longitud de 37 aminoácidos y dos leucinas N-terminales. Piel involucrada con rosácea demuestra inapropiadamente altos niveles tanto de calecitinas como de SCTE sin incitar claramente invasión microbiana como un estimulo. Cuando se colocan en medio de cultivo cubriendo queratinocitos humanos primarios LL-37 aumenta grandemente la producción de citoquinas quimiotácticas tales como IL-8. Cuando es inyectado intradérmicamente En ratones en niveles similares a aquellos encontrados en piel involucrada con rosácea, LL-37 produce eritema y estimula infiltración dérmica prominente por PMNs. La inyección intradérmica de SCTE también produce eritema cutáneo e infiltración de PMN de la dermis en tipo salvaje, pero no en ratones con catelicidina. Por consiguiente, hay un crecimiento corporal de evidencia que apoya el concepto de que rosácea es mediada por sobre-expresión local de péptidos de piel catiónicos, pro-inflamatorios, los cuales producen la inflamación, excesiva angiogénesis e hiperplasia sebácea características de la enfermedad. Porque casi cada paciente con rosácea puede decir cual de sus padres tiene un patrón de sonrojo y rubicundez facial reactivos, es obvio para los médicos que rosácea es generalmente activada.

Para producir un modelo de rosacea, se inyectó LL-37 intradérmicamente cada 12 horas por 48 horas. Este modelo produjo eritema de la piel e infiltración intradérmica prominente de leucocitos polimorfonucleados (P Ns) , como reportó Yamasaki y colaboradores. Ratones Balb/c fueron rasurados antes del estudio para exponer un área de piel sobre la espalda. Veinticuatro horas después, se les inyectó 40 µ? de vehículo (solución salina regulada con fosfato, PBS) , péptido catiónico (a la concentración de 320 µ? en PBS), SAGE (320 a 1, 280 µ? en PBS), o mezcla de péptido catiónico + SAGE (péptido + lx a 4x concentraciones molares de SAGE) intradérmicamente en la piel rasurada usando una aguja calibre 31 en una manera para ocasionar una vejiga epidérmica intacta , identificando así que la administración fue al nivel de la dermis o epidermis inferior. El SAGE seleccionado para inyección fue escogido a partir de sobre 20 SAGEs sintetizados recientemente, los cuales fueron probados extremadamente activos en ensayos bioquímicos como inhibidores de elastasa leucocítica humana ( como otra proteína catiónica) y como antagonistas para activación del receptor para producto final de glicación avanzada para cuatro ligandos comunes.

Se mezclaron SAGEs y péptidos juntos en PBS antes de inyección y se dejaron incubar 15 min a temperatura ambiente antes de ser inyectados. Las inyecciones fueron repetidas cada 12 horas después de esto. Cuarenta y ocho horas después de la inyección inicial (cuatro inyecciones en total) , los animales fueron ligeramente anestesiados con 25 mg/kg de pentobarbital intraperitonealmente . Cuando el ratón estuvo dormido, el área de piel inyectada fue fotografiada para registrar visualmente la severidad de eritema y edema. Se evaluó la intensidad del eritema como una evaluación de enrojecimiento (desde 1 a 5) , y el área de eritema fue medido con vernier. El área de piel inyectada fue -entonces biopsiada excisionalmente usando un punzón de agujero de 6 MI para tinción con hematoxilina-eosina para examinar los cambios histológicos y para evaluar la infiltración de PMN mediante mediciones de actividad mieloperoxidasa (MPO) . Una imagen representativa de superficie e histología de piel de cada piel fue vista bajo visor de alto poder bajo un microscopio.

Modelo de rosácea, tratamiento tópico con SAGE. Ratones Balb/c fueron rasurados en el momento de exposición a LL-37 sobre el área de piel sobre la espalda. Se comenzó la aplicación tópica de un emoliente envasado con hialuronano que contenia SAGEs al 5 % (emoliente activo) o emoliente basado en ácido hialurónico solo para esta área de piel cada 12 horas. Veinticuatro horas después, se inyectaron 40 L de vehículo (PBS) o péptido catiónico (a concentración de 320 µ?) subcutáneamente en la piel rasurada en la manera descrita previamente. Las inyecciones y aplicaciones tópicas de emoliente fueron repetidas cada 12 horas después de ésto. Cuarenta y Ocho horas después de la inyección inicial (cuatro inyecciones en total), los animales fueron ligeramente anestesiados como se describió previamente. El área de piel inyectada fue fotografiada para registrar visualmente de la severidad de eritema y de edema. La intensidad de eritema fue evaluada como una evaluación de enrojecimiento (de 1 a 5), y el área de eritema fue medida con un vernier. El área de piel inyectada fue entonces biopsiada excisionalmente usando un punzón de agujero de 6 mm para tinción de H & E para examinar los cambios histopatológicos y para evaluar la infiltración de PMN mediante mediciones de la actividad mieloperoxidasa (MPO) .

Penetración de SAGE en la dermis. Ratones Balb/c fueron rasurados antes del estudio para exponer un área de piel sobre la espalda. Se llevó a cabo la aplicación tópica de SAGE en la piel cada 12 horas. Cuarenta y ocho horas después los animales fueron eutanizados y la piel fue biopsiada. Se estudiaron secciones de piel por microscopía por fluorescencia para determinar la profundidad a la cual SAGEs penetra en la piel.

Modelo de inflamación con aceite de crotón.

Se empleó aceite de crotón, como otro modelo de inflamación de piel mediada por PMN. El aceite de crotón contiene ásteres de forbol, los cuales activan la proteína quinasa C en células cutáneas. Como un resultado, la célula cutánea produce abundantes quimioquinas y quimiotaxinas las cuales señalan el influjo de PMNs desde la circulación. PMN s activadas producen eritema y edema de tejidos de piel. La inflamación inducida por aceite de crotón es un modelo empleado comúnmente de inflamación de piel mediada por PMN en la selección de compuestos anti-inflamatorio -para uso dermatológico .

Para producir este modelo, se mezcló aceite de crotón ( Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) como una solución al 0.8 % en acetona. Usando una pipeta se pintaron 10 µ? sobre cada lado de una oreja del ratón, permaneciendo la otra oreja como control. A 4, 8 y 24 horas después, se midió el espesor de la oreja cerca de la parte superior de la oreja dístal a las crestas cartilaginosas. El cambio en el espesor de la oreja del control fue tomado como un índice de edema. La intensidad de eritema fue evaluada como una evaluación de enrojecimiento (de 1 a 5) , y el área de eritema fue medida con vernier. Después de 24 horas de mediciones, los ratones fueron eutanizados y se tomaron inmediatamente biopsias con perforador de orejas (perforado de agujero de 6 mm) , se pesaron, congelaron y almacenaron a - 80 °C para tinción de H 6 E para examinar los cambios histopatológicos y evaluar la infiltración de P N por medio de las mediciones de actividad mieloperoxidasa (MPO) . Un solo investigador efectuó todas las mediciones y biopsias de orejas a fin de estandarizar el procedimiento y reducir el error. El remanente de las orejas fue removido, impregnado y congelado para inmunohistoquimica .

Ensayo de Mieloperoxidasa (MPO) . Por cada ratón, se tomaron inmediatamente biopsias de tejido (perforador de agujero de 6 mm de diámetro), se pesaron, congelaron y almacenaron a -80 °C. Se midió la actividad MPO en tejido usando un método por Suzuki y colaboradores, Ota H. Sasagawa S, Sakatani T, Fujikura T. Assay method for myeloperoxidase in human polymorphonuclear leukocytes. Anal Biochem 132:345-352, 1983) que modificó Young y colaboradores (Young JM, Spires DA, Bedord CJ, agner B, Bailaron SJ, De Oung LM. The mouse ear inflammatory response to topical arachidonic acid. J.Invest. dermatol 82:367-371, 1984). Cada biopsia de tejido de ratón fue colocada en 0.75 mL de 80 mM de solución salina regulada con fosfato (PBS) pH de 5.4 que contenia 0.5 % de bromuro de hexadecil trimetil amonio (HTAB) . Cada muestra fue homogeneizada por 45 s a 4 °C con un pequeño Tissue Tearor Homogenizer Modelo 985-370 de laboratorio (Biospec Products, Bartlesville, OK) . El homogeneizado fue transferido cuantitativamente a un tubo de microcentrifuga con 0.75 mL adicionales de HTAB en PBS. La muestra de 1.5 mL fue centrifugada a 12,000 x g por 15 minutos, fue mantenida a 4 °C . 30 µL de muestras por triplicado del sobrenadante fueron añadidas a los pocilios de la placa de microtitulo de 86 pocilios. Para el ensayo de MPO se añadieron a cada pocilio 200 µL de una mezcla que contenia 100 de 80 mM de PBS (pH de 4.4), 85 µ?, de PBS 0.22 M (pH de 5.4), y 15 ' µ?, de peróxido de hidrógeno al 0.017 %. Se añadieron 20 µL de 18.4 mM de clorhidrato de tetrametilbencidina solución acuosa de dimetilformamida al 8 % para iniciar la reacción. Las placas de microtitulo fueron incubadas a 37 °C por 3 minutos, y luego se colocaron sobre hielo. La reacción fue detenida con la adición de 30 µ!> de acetato de sodio 1.46 M. La actividad enzimática MPO fue evaluada a una absorbancia a longitud de onda de 630 nm. La actividad MPO fue expresada como densidad óptica (OD) /biopsia .

Análisis Estadístico. Todos los experimentos fueron efectuados por triplicado para pruebas in vitro. Las diferencias significativas entre muestras fueron calculadas por comparación de medias usando la prueba de Aspin- elch. El significado fue declarado en p < 0.05.

Resultados Modelos de rosácea por inyección de SA6E y del péptido LL37. Para determinar si la neutralización directa de catelicidinas catiónicas previno su actividad inflamatoria en la piel se inyectaron subcutáneamente en el área de la espalda rasurada de ratones cada 12 horas después de ahí, solamente LL37, SAGE (GM-111101) solamente, solamente vehículo (PBS), o mezcla de LL37 y SAGE. Después de 48 horas, los ratones fueron sacrificados y se tomaron fotografías macroscópicas en diferentes grupos de tratamiento (Figura 10a y 10b) . Los estudios histológicos usando hematoxilina y tinción con eosina mostraron número creciente de infiltración leucocítica y edema dérmico marcado, mientras que la administración de SAGE inmediatamente después de estimulación dio como resultado la inhibición de la respuesta de hinchazón en la piel (Figura 10c y lOd) .

Los resultados individuales de evaluaciones dérmicas fueron expresados por el área de eritema (Figura lOf) y la evaluación de enrojecimiento de eritema (Figura lOg) . Después de 48 horas, el grupo tratado con SAGE demostró un área dramáticamente decreciente de eritema y una reducción significativa de la evaluación del enrojecimiento. La actividad mieloperoxidasa fue medida en biopsias de perforación de tejido tomadas 48 horas después de inyección como un índice de infiltración de PMN. La co-administración de SAGE con el péptido LL-37 redujo significativamente la actividad MPO en 50 % (Figura lOe) . Por consiguiente, la coinyección de SAGE con el péptido LL-37 indujo sustancialmente la actividad inflamatoria del péptido catelicidina LL-37. Esto indica que SAGEs inhibe la inflamación mediada por LL-37 y sería tratamiento útil para rosácea.

Modelo de Tratamiento de Rosacea Tópica con SAE . El tratamiento tópico de SAGE (GM-111101) es usado para probar si el tratamiento en tiempo remoto a partir de la exposición a LL-37 puede también prevenir la inflamación cutánea inducida por péptido. Por consiguiente, después de la inyección de LL-37 en el área de la piel de la espalda de ratón, se aplicó después correctamente SAGE. Las fotografías macroscópicas mostraron fuerte edema y eritema a 48 horas después de la aplicación de LL-37 (Figura lia, 11b, y lli), aunque el tratamiento tópico con SAGE disminuye significativamente el enrojecimiento y su área afectada tanto para tratamiento inmediato (Figura 11b) como con tratamiento desplazado 12 horas (Figura 11c) . La tinción con H & E indicó muchas más infiltración leucocitica y edema dérmico que los dos grupos de tratamiento con SAGE, lo cual estuvo de acuerdo con los resultados de SAGE como inhibidor de la respuesta de hinchazón de la piel y actividades MPO (Figura llg) . Estos resultados indican que SAGEs puede ser aplicado tópicamente en un emoliente convencional y aceptable farmacéuticamente para tratar la inflamación de rosácea mediada por catelicidina .

Penetración de SAGE en la dermis. Para determinar el nivel de penetración de SAGE en la dermis, compuestos de SAGE, GM-111101 fluorescentes fueron usados como artículo de prueba, y 0.1 mg/ml, 1 mg/ml, y 10 mg/ml de compuesto fluorescente fueron aplicados sobre el área de la piel sin tocar y raspada de ratones Balb/c. Después de 24 horas los ratones fueron sacrificados y el área entera de la piel probada fue excisada y fotografiada bajo condiciones de la luz natural y de rayos UV de longitud de onda extensa. (Figura 12). Se observaron capas de fluorescencia bajo condiciones de la luz natural y de rayos UV para ambas áreas de la piel en tratamiento interior y exterior. Penetración significativa de SAGEs fue distribuida uniformemente en una escala de longitud micrométrica .

Pruebas in Vivo de Citotoxicidad e Irritación de la Piel. Se evaluó la citotoxicidad de derivados de SAGE (SAGEs) GM-131101, GM-312101, y G -212101 en células nHDF y los resultados se demuestran en la Figura 13a . Todos los compuestos fueron también encontrados no tóxicos para las células nHEK hasta la concentración de 10 mg/ml (Figura 13b) . Para las pruebas de irritación de piel in vivo, fotos macroscópicas de ratones en diferentes grupos de tratamiento se representaron en la Figura 13c-13j . El Indice de Irritación Primaria de las sustancias de prueba se calculó y fue 0.00 para ambos GM-111101 y GM-212101; no se observó ninguna irritación en la piel de los ratones (Figura 14). No se encontraron citotóxicos ninguno de GM-111101 y GM-212110. La concentración umbral de todos los SAGEs pudo ser determinada a partir de esta prueba. Bajo las condiciones de esta prueba, los agentes de prueba no se consideraron irritantes primarios de la piel; Como se definió en la Guía de las Reglamentaciones de FHSA, 16 CFR 1500, una sustancia con una evaluación empírica de menos de 5.00 no es irritante primario para la piel. Estos resultados indican que SAGEs no son irritantes por ellos mismos para la piel y pueden ser empleados como tratamientos seguros para trastornos cutáneos inflamatorios .

Modelo de Inflamación con Aceite de Crotón. La aplicación de aceite de crotón a piel de ratón se usó como un modelo altamente reproducible y conveniente de inflamación de la piel mediada por P N. Este modelo se usó para probar la actividad anti-inflamatoria de SAGEs. Las fotografías macroscópicas de ratones en diferentes grupos de tratamientos fueron representadas en la Figura 15a y 15b, así como también los espesores de la oreja medidos para ambas, orejas sin tratar y tratadas, y se compararon en los cinco grupos .

Los resultados individuales de evaluaciones dérmicas fueron expresados por eritema para área raspada y área intacta. Los resultados mostraron reducción significativa de enrojecimiento y espesor en el grupo de tratamiento con SAGE (G -111101 ) en comparación con los grupos sin tratamiento (Figura 15g y 15h) . El examen histopatológico reveló que en orejas pintadas con aceite de crotón hubo un número creciente de infiltración leucocítica, y edema dérmico marcado mientras que la administración de SAGE inmediatamente después de estimulación dio como resultado la inhibición de la respuesta de esponjamiento de la oreja, lo cual fue comparable al de ratones tratados con vehículo. Estos hallazgos histológicos confirmaron adicionalmente los de los datos de mediciones. La actividad MPO fue también medida en biopsias con perforador de orejas tomadas después de la aplicación con aceite de crotón el tratamiento con SAGEs cada 4 horas inició inmediatamente después de la aplicación de aceite de crotón redujo significativamente la actividad MPO (Figura 15f ) . Estos resultados indican que SAGEs puede ser empleado como tratamientos tópicos para trastornos cutáneos inflamatorios, diferentes "rosácea".

Tratamiento Tópico con Acido Hialurónico (HA) en modelo de rosácea. El tratamiento tópico previo del modelo de Rosácea con LL-37 se usó para comparar SAGE (GM-111101) vs . HA. Los resultados mostraron claramente que HA en la administración tópica no alivia la inflamación (Figura 16b, 16e, y 7f ) y actividades de MPO (Figura 16 d) .

Contrariamente SAGE posee propiedades anti-inflamatorias y altamente mejoradas (Figura 16c-f) y pudiera considerarse como un inhibidor de inflamaciones y de rosácea. Estos datos indican que la actividad farmacológica de SAGEs no es inherente en el ácido hialurónico, sino que requiere las nuevas modificaciones químicas de hialuronanos .

Estudio de Toxicidad Intravenosa Aguda In Vivo en Ratas. El objetivo del estudio fue evaluar la toxicidad intravenosa aguda de SAGEs (GM-111101 y GM-212101 cuando se administró como una dosis individual a ratas y también evaluar la toxicidad de GM-111101 cuando se administró una vez diaria por un período de siete días a un nivel de dosis individual .

Un grupo de dosis que consistió de tres ratas machos y tres hembras Sprague-Dawley fue expuesto a una dosis individual de 3 mg/kg de GM-111101, luego una dosis individual de 10 mg/kg de GM-111101 una semana después y finalmente una dosis diaria de 10 mg/kg de GM-111101 por un total de siete días que iniciaron una semana después de la última dosis individual. Dos grupos de tres ratas machos y tres hembras Sprague-Dawley fueron expuestos a GM-111101 a dosis de 30 o 100 mg/kg. Además, dos grupos de tres ratas machos y tres hembras Sprague Dawley fueron expuestos a GM-212101 a dosis de 30 o 100 mg/kg. Dos grupos de tres ratas machos y tres hembras Sprague-Dawley fueron expuestos a 0.9 % de cloruro de sodio por inyección y fueron usadas como grupos control negativo. Todas las dosis fueron administradas a un volumen de dosis de 1 mL/kg por inyección intravenosa vía la vena caudal de la cola. Los cálculos de dosis fueron determinados con base en los pesos corporales documentados más recientemente.

Todos los animales expuestos agudamente (dosis individual) fueron observados inmediatamente después de inyección, y otra vez a 2 horas y 4 horas después de administración de la dosis en el Día 0 para signos aparentes de toxicidad clínica. Además, todos los animales sobrevivientes fueron observados una vez diariamente en los días 1-14 para signos aparentes de toxicidad clínica. Todos los animales expuestos una vez al día por siete días fueron observados una vez al día desde los días 1-14 para signos aparentes de toxicidad clínica. Se registró el peso corporal en el día 0 (dosis aguda) o el día 1 (dosis repetida) antes de administrar la dosis, en el día 6 o 7, y en el día 14, antes de terminación. Se efectuaron evaluaciones macroscópicas de necropsia en cada uno de los animales sobrevivientes en el día 14 del estudio. Los animales que murieron en el estudio en el estudio sufrieron un examen de necropsia macroscópica inmediatamente después de observación de mortalidad.

Los signos clínicos de marcha anormal moderada, ataxia moderada, y orina decolorada naran a-rojiza fueron observados en un animal hembra a partir del grupo de dosis de 30 mg/kg de GM-212101 en las primeras dos horas después de administración de la dosis. Estas observaciones, con la excepción de ligera ataxia, no estuvieron presentes más tiempo que del período de observación de 4 horas y permaneció en el transcurso del resto del estudio. La observación de ataxia no estuvo presente más tiempo que al día siguiente de administración de la dosis. Además, una rata macho del grupo de dosis de 100 mg/kg de GM-212101 se encontró muerta en los primeros cuatro minutos después de administración de la dosis. Todos los animales ganaron peso corporal en el transcurso del periodo de estudio. No fueron visibles lesiones observadas en la necropsia con la excepción de mediciones de foci rojo-oscuro de ~ 1 - 2 mm de diámetro a lo largo del timo en el animal del grupo de dosis de 100 mg/kg de GM-212101 que murió en el estudio.

Con base en los resultados de este estudio, GM-111101 no produjo signos de toxicidad a cualquiera de los niveles de dosis evaluados, incluyendo dosis individuales agudas de 3, 10, 30, y 100 mg/kg y una dosis repetida el día 7 de 10 mg/kg. Por consiguiente, el nivel de efecto no observable (NOEL) para exposición intravenosa a GM-11101 en ratas se consideró que fue al menos 100 mg/kg de GM-212101 produjo signos de toxicidad o de mortalidad a dosis de 30 y 100 mg/kg. Por consiguiente, el NOEL para exposición intravenosa a GM-212101 en ratas se consideró que fue de 10 mg/kg. debido a la ausencia de mortalidad observada a todas las dosis de GM-111101 y la mortalidad observada en solamente 17 % de los animales a una dosis de 100 mg/kg de GM-212101, la LD50 intravenosa en ratas para GM-111101 y GM-212101 se consideró mayor que 100 mg/kg. Estos resultados indican que SAGEs son seguros de emplear como tratamientos inyectados o generalizados para enfermedades.

VI . Investigación de SAGEs para Tratar Degeneración Macular Relacionada con la Edad El complemento activado y RAGE inducen señalización pro-inflamatoria y angiogenica en células RPE cultivadas .

Se condujeron experimentos que estudian la biología de RAGE en células RPE cultivadas que usan la línea celular RPE humana ARPE-19. Como se mostró en la inmunotinción (Figura 17), células ARPE-19 expresan al menos 4 isoformas de RAGE que varían desde 45 - 50 kDa en Usados celulares, y secretan estas isoformas en medio acondicionado. Cuando las células fueron desarrolladas en placas recubiertas con producto AGE CML-BSA, la expresión de las cuatro isoformas de RAGE fue marcadamente sobre-regulada (compárese la inmunotinción derecha con la de la izquierda en la Figura 17) . Porque la ligación de RAGE activa el factor de transcripción NF-??, la expresión mejorada de RAGE promueve grandemente la señalización pro-inflamatoria. La adición de la heparina no anticoagulante, heparina 2-0, 3-0 desulfatada (ODSH) a este sistema previno la sobre-regulación de la expresión de RAGE bloqueando la interacción de CML-BSA con RAGE o células ARPE-19. Esto prevendría que el avance pro-inflamatorio iniciado aumente en la expresión misma de RAGE por ligación con RAGE.

La habilidad de productos de AGE para inducir apoptosis celular de RPE se investigó. Se desarrollaron células ARPE-19 hasta confluencia en cubre-objetos redondos, luego se transfirieron a nuevas placas para exposición a 25 µ? de AGE-BSA por 40 horas. S ensayó entonces la apoptosis con el Equipo de Tinción de Sondas Moleculares Fijables Vivas/Células Muertas (L111101, Eugene, OR) . Cada panel mostró el cubreobjetos completo y en vista agrandada de la interfase vivas/muertas. Los núcleos se tiñeron de rojo con DAPI; las células muertas se tiñeron de verde. A. control con BSA. Se observaron algunas células muertas en los bordes del cubreobjetos, pero células vivas y muertas están entremezcladas en la interfase. B. AGE-BSA (25 µ?) . Se vió muerte celular significativa alrededor de los bordes, y los limites entre células vivas y muertas es definido. C. AGE-BSA (25 µ?) + ODSH (200 µ?) . ODSH parece proporcionar alguna protección pero significa que aún tiene lugar la apoptosis. D. AGE-BSA (25 µ?) + P-OSMeHA (200 µ?) (GM-111101) .

Como se muestra en la Figura 18, el tratamiento con AGE de células ARPE-19 cultivadas indujo apoptosis prominente (Figura 18B) , medida por tinción verde con el equipo de Tinción para Células Vivas/Muertas (sondas Moleculares) . La apoptosis se redujo por incubación concomitante de células con ODSH (Figura 18C) pero es casi completamente evitada por una concentración equivalente de la SAGA P-OSMeHA (GM-111101) (Figura 18 D) . La apoptosis pareció avanzar hacia adentro de los bordes de células cultivadas sobre cubre objetos redondos. RAGE es prominentemente expresada en células RPE donde puede ser expresada selectivamente sobre la membrana basal como en otras células epiteliales humanas. Por consiguiente, en cultivo, AGE debe inicialmente, ser capaz de accesar y ligar a RAGE localizada basalmente solamente en los bordes de las monocapas, produciendo una onda de células muertas que avanza predeciblemente hacia adentro. En contraste, AGE en costras, la cual se acumula entre el epitelio del pigmento retinal y la membrana de Bruch, tendría fácil acceso a RAGE localizado basalmente, posicionar óptimamente la señalización de AGE/RAGE para mediar la apoptosis de RPE localizada que constituye la denominada "atrofia geográfica" degeneración macular relacionada con la edad. Por consiguiente, el SAGE GM-111101 casi previno completamente la apoptosis de RPE inducida por AGE. Estos resultados indican que SAGEs debe de ser efectivo en el tratamiento de enfermedades oculares importantes que causan ceguera, como la degeneración macular relacionada con la edad.

SAGEs son no-tóxicos y no-anticoagulantes. Cuando HA metilado y 0-sulfatado P-OS eHA) , HA pentafluoropropilado y totalmente O-sulfatado (F-OSFHA-1) y HA metilado y totalmente O-sulfatado (F-OSMeHA) fueron aplicados a células epiteliales cutáneas humanas cultivadas o fibroblastos estudiados con un ensayo de toxicidad celular (CellTiter96® Aqueous One Assay, Promega) , los SAGEs no exhibieron proliferación o produjeron toxicidad celular, aún a concentraciones de 1 mg/ml. Lo SAGEs también son no-anticoagulantes. Has fluoroalquilados y sulfatados de bajo peso molecular demostraron ninguna actividad anti-Xa y < 0.2 U/mg de anti-IIa anticoagulante, en comparación con 150 U/mg de cada uno para heparina no fraccionada.

A diferencia de la heparina, polímeros polianiónicos altamente cargados son inductores potentes de la cascada de coagulación por contacto o intrínseca mediante la activación del factor de Hageman (factor Xlla) , que activa secundariamente quininas. SAGEs fueron cribados por su habilidad para estimular coagulación intrínseca (activación del factor de Hageman) . Se incubó con heparina plasma humano conjuntado o Has fluoroalquilado y sulfatado de bajo peso molecular (L W) (LMW-OSFHA-1 , LMW-OSFHA-2) y se determinó la actividad amidolítica usando el sustrato D-ciclohidrotirosil-Gly-Arg-p-NA. Como se mostró en la Figura 19, SAGEs de bajo peso molecular (50 kDa) parecen aún más seguros que heparinas médicas comerciales cuando se probaron por su habilidad para activar el Factor XII, aún a concentraciones de SAGE de 10 a 100 veces más altas que las que logran la inhibición farmacológica de la inflamación.

En el transcurso de esta solicitud, se mencionaron varias publicaciones. Las descripciones integras de estas publicaciones se incorporan a la presente como referencia a fin de describir más completamente los compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente.

Pueden hacerse a los compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente, varias modificaciones y variaciones. Otros aspectos de los compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente serán obvios a partir de las consideraciones de las especificaciones y la práctica de los compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente. Esta previsto que la especificación y ejemplos son considerados como ejemplares.

TABLA 3 : Muestra las estructuras de varios SAGEs ejemplares.

(Continuación) TABLA 3 (Continuación) (Continuación) R = H, alquilo o S03Na dependiendo del grado lquilación y de sulfatación.

Claims (46)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. - Un hialuronano modificado o la sal o éster de éste aceptable farmacéuticamente caracterizado porque comprende al menos un protón del hidroxilo en C-6 primario del residuo N-acetil-glucosamina sustituido con un grupo alquilo o grupo fluoroalquilo, y porque al menos un protón del hidroxilo de hialuronano es sustituido con un grupo sulfato.

2. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo alquilo comprende un grupo alquilo de cadena recta o ramificada de 1 a 10 átomos de carbono.

3.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo alquilo comprende metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, pentilo, o hexilo.

4.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo alquilo es metilo .

5. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo fluoroalquilo comprende al menos un grupo trifluorometilo .

6. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo fluoroalquilo comprende la fórmula -CH2 (CF2) nCF3, en donde n es un entero de 0 a 10.

7. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque n es 1, 2, 3, 4 o 5.

8. - El compuesto de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque el éster aceptable farmacéuticamente es un profármaco.

9. - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque al menos 1 % de los protones del hidroxilo en C-6 primario del residuo N-acetil-glucosamina son sustituidos con un grupo alquilo o un grupo fluoroalquilo .

10. - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque 1 % a 50 % de los protones del hidroxilo en C-6 primario del residuo N-acetil-glucosamina son sustituidos con un grupo alquilo o un grupo fluoroalquilo .

11. - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque al menos un protón del hidroxilo en C-2 y/o en el protón del hidroxilo en C-3 es sustituido con un grupo alquilo o un grupo fluoroalquilo.

12. -El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el hialuronano tiene un peso molecular mayor que 10 kDa antes de alquilación o de fluoroalquilacion .

13. -El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el hialuronano tiene un peso molecular de 40 kDa a 2,000 kDa antes de alquilación o de fluoroalquilacion .

14. -El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque al menos un protón del hidroxilo en C-2 o un protón del hidroxilo en C-3 es sustituido con un grupo sulfato.

15. - El compuesto de conformidad con las reivindicaciones 1 a 13, en donde al menos un protón del hidroxilo en C-2 y un protón en el hidroxilo en C-3 es sustituido con un grupo sulfato.

16. - El compuesto de conformidad con las reivindicaciones 14 o 15, caracterizado porque el protón en el hidroxilo en C-2 y/o el protón en el hidroxilo en C-3 presentes sobre el anillo glucuronico del hialuronano es sustituido con un grupo sulfato.

17. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto tiene un grado de sulfatación desde 0.5 a 3.5 por unidad disacárida.

18. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo alquilo es metilo y al menos un protón del hidroxilo en C-2 y/o un protón del hidroxilo en C-3, presentes sobre el anillo glucuronico del hialuronano es sustituido con un grupo sulfato .

19. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo alquilo es metilo, al menos un protón del hidroxilo en C-2 y/o un protón del hidroxilo en C-3 presentes sobre el anillo glucuronico del hialuronano es sustituido con un grupo sulfato, - y el compuesto tiene un peso molecular de 2 kDa a 10 kDa.

20. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo fluoroalquilo es -CH2CF2CF3 o -CH2C F2C F2C F3 y al menos un protón del hidroxilo en C-2 y/o un protón del hidroxilo en C-3 presentes sobre el anillo glucuronico del hialuronano es sustituido con un grupo sulfato.

21. - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el hialuronano o un derivado de éste no es derivado de una fuente animal.

22. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto aceptable farmacéuticamente y un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21.

23. - La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la composición puede ser administrada intravenosa, intramuscular, subcutánea, intra-articular , oftálmica, vaginal, rectal, intranasal, o tópicamente .

24. - La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la composición comprende adicionalmente un agente anti-inflamatorio, un agente anti-pirético, fármacos esferoidales y no esferoidales para uso anti-inflamatorio, una hormona, unos factores de crecimiento, unos agentes anticonceptivos, un antiviral, un antibacteriano, un antifúngico, un analgésico, un hipnótico, un sedante, un tranquilizante, un anti-convulsivo, un relajante muscular, un anestésico local, un anti-espasmódico, un fármaco anti-úlceras, un agonista peptidico, un agente simpaticomimético, un agente cardiovascular, un agente anti-tumoral, o un oligonucleótido .

25. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizada porque la composición comprende un pH de 5 a 6.

26. - Un método para mejorar la cicatrización de heridas en un sujeto en necesidad de dicha mejora, caracterizado porque comprende poner en contacto la herida del sujeto con un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

27. - Un método para liberación de al menos un compuesto aceptable farmacéuticamente en un paciente en necesidad de dicha liberación, caracterizado porque comprende poner en contacto al menos un tejido capaz de recibir el compuesto aceptable farmacéuticamente con el compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en donde el compuesto comprende el compuesto aceptable farmacéuticamente .

28. - El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para tratar o prevenir una condición oftalmológica, una condición genitourinaria, una condición respiratoria, una condición cardiovascular, una enfermedad gastrointestinal, una enfermedad reumatológica e inmunológica, una enfermedad renal, una enfermedad articular degenerativa, una enfermedad oral o dental, o una enfermedad neurológica.

29. - El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21 en cirugía oral y dental .

30. - Un método para tratar o prevenir un trastorno cutáneo caracterizado porque comprende aplicar un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21 sobre la superficie de la piel.

31. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el trastorno cutáneo comprende rosácea, dermatitis atópica (eczema) , dermatitis alérgica por contacto, psoriasis, dermatitis herpetiformis , acné, úlceras cutáneas diabéticas y otras heridas diabéticas, quemaduras, quemaduras solares, prevención de cicatrices, queratosis actínicas, inflamación a partir de mordeduras de insectos, hiedra venenosa, quemaduras/dermatitis inducidas por radiación, o dermatitis seborreica.

32. - Un método para reducir o prevenir inflamación en un sujeto caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva del compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

33. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la inflamación es producida por cáncer, esclerosis múltiple, osteoartritis , artritis reumatoide, beta amiloide de Alzheimer, enfermedad periodontal, enfermedad intestinal inflamatoria, asma, rinosinusitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, daño pulmonar agudo, fibrosis quistica, anemia por células falciformes, un trastorno inflamatorio cardiovascular, un trastorno inflamatorio pulmonar, un trastorno inflamatorio ocular, cistitis intersticial, un trastorno inflamatorio cerebral, o un trastorno inflamatorio intestinal.

34. - Un método para tratar o prevenir un trastorno ocular caracterizado porque comprende administrar al ojo un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

35. - El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el trastorno del ojo comprende degeneración macular relacionada con la edad, retinopatia diabética, síndrome del ojo seco, conjuntivitis, iritis, uveitis, conjuntivitis alérgica, o inflamación y cicatrización de la córnea.

36. - El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el compuesto es administrado intraocularmente .

37. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para reducir o inhibir la actividad de P-selectina.

38. - El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para reducir o inhibir la activación de RAGE.

39.- El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para reducir o inhibir la actividad de una proteina catiónica.

40.- El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para reducir o inhibir la actividad de la elastasa leucocitica humana.

41. - Un método para producir un hialuronano modificado caracterizado porque comprende (a) hacer reaccionar el hialuronano o un derivado de éste con una cantidad suficiente de base para desprotonar al menos un protón del hidroxilo en C-6 primario del residuo N-acetil glucosamina, y (b) hacer reaccionar el hialuronano desprotonado o un derivado de éste con un agente alquilante o fluoroalquilante por un tiempo y concentración suficientes para alquilar o fluoroalquilar al menos un grupo hidroxilo en C-6 primario desprotonado, y (c) hacer reaccionar el hialuronano alquilado o fluoroalquilado o un derivado de éste con un agente sulfatante para producir el hialuronano modificado .

42. - El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la base comprende un hidróxido de alquilo .

43. - El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el agente alquilante comprende un haluro de alquilo.

44. - El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el agente fluoroalquilado comprende un haluro de fluoroalquilo .

45. - El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el hialuronano modificado está parcialmente sulfatado.

46.- El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el hialuronano modificado está totalmente sulfatado.