KR20140042795A - 비뇨기 염증을 치료 또는 예방하는 방법 - Google Patents

Abstract

a. 변형된 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르(여기서, 상기 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르는 알킬기 또는 플루오로알킬기를 포함하는 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 위치 1개 이상과 황산염기 1개 이상을 포함함); b. 부분적으로나 전체적으로 황산화된 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르, 또는 이의 조합을 포함하는 화합물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내 비뇨기 염증을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 기술되어 있다.

Description

비뇨기 염증을 치료 또는 예방하는 방법{METHODS FOR TREATING OR PREVENTING UROLOGICAL INFLAMMATION}

관련 출원에 대한 상호 참조 문헌

본 출원은, 2008년 4월 4일자로 출원된 U.S. 가출원 일련 번호 제61/042,310호의 이익을 주장하는, 2009년 4월 3일자로 출원된 국제 출원 PCT/US09/039498호의 우선권을 주장하는 부분 계속 출원인, 2010년 8월 27일자로 출원된 US 정식 출원(nonprovisional application) 일련 번호 제12/870,774호의 우선권을 주장하는 부분 계속 출원인, 2011년 3월 23일자로 출원된 US 정식 출원 일련 번호 제13/069,860호의 우선권을 주장하는 부분 계속 출원이다. 본 출원은 또한 2010년 6월 8일자로 출원된 US 가출원 제61/352,550호의 우선권을 주장하는, 2011년 6월 8일자로 출원된 국제 출원 PCT/US11/39550호의 우선권도 주장한다. 이들 출원은 모두 교시를 위하여 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.

승인

본 발명에 이르게 한 연구는 부분적으로 국립 위생 연구소(승인 번호: T32 HL 079874-04) 및 중소 기업 기술 혁신 사업(승인 번호: R43 DK093413-01)의 자금 지원을 받았다.

비뇨기 염증은 다수의 사람들에 있어서 상당한 건강상의 관심사이다. 예를 들어, 신경인성 방광(NGB) 질환은 추후 방광의 섬유증을 유발시키는 과도한 염증으로부터 기인될 수 있다. 어린이의 경우, 다수의 선천적 질환이 NGB 질환, 예를 들어 후방 요도관, 방광/총배설관 뒤집힘증 및 척추 수막류(MMC)/척추 갈림증을 일으킨다. NGB 질환은 어린이에 있어서 신부전과 신장 이식의 가장 일반적인 원인들 중 하나로 여전히 남아있다. 어린이에서의 이러한 과정은 성인에서 공통되는 부분이 나타나는데, 성인의 경우 만성 염증성 방광 장애, 예를 들어 간질성 방광염(IC)은 상당한 골반통 및 쇠약성 배뇨 증상을 일으킨다. 미국에서 4백만명 이상의 사람이 IC를 가지고 있으며, 이들 중 대다수는 주로 여성이다. 근본적인 생리 작용은 염증을 기반으로 하지만, 정확한 병인은 여전히 파악하기 어려운 상태이다. 최근에, IC와 연관된 질환 부담(disease burden)과 비용이 미국 내 비뇨기 질환 프로젝트(the Urologic Diseases in America Project)에 의해 분석되었는데, 이는 매년 7억 5천만 달러를 초과하는 것으로 파악되었다. 현재, 이러한 병태의 치료법은 이 병태의 원인과 병인이 불명확함으로 인해, 차선책이 되어 왔다. 질환의 진행을 영속시키는 염증 캐스케이드에 대한 근본적인 이해의 부족으로 인해 치료상의 선택권이 부족하게 되었다.

통증성 방광 증후군/간질성 방광염(PBS/IC)은, 진정으로 효과적인 치료 선택권이 거의 존재하지 않으며 쇠약성 질환으로 계속 진행되는, 무통성 방광 장애(indolent bladder disease)이다.^1-4 주로 여성에서 발병되는 PBS/IC는 빈뇨, 방광통, 야뇨증, 급뇨 및 골반통을 특징으로 하는 만성 질환이다. 근본적인 생리 작용은 염증을 기반으로 하지만, 상기 질환의 병인은 다인성이며;⁴ 원인이 되는 기작은 GAG 층의 결함과 비만 세포 매개성 신경 염증을 포함한다.⁵ 1997년에 미국에서 PBS/IC가 약 백만명의 사람에서 발병한 것으로 추산되었으며;⁶ 보다 최근에, 여성 전체의 0.1% 내지 1%의 범위인 것으로 추산된다. 최근에, PBS/IC와 연관된 질환 부담과 비용이 미국 내 비뇨기 질환 프로젝트에 의해 분석되었는데, 이는 매년 7억 5천만 달러를 초과하는 것으로 파악되었다.⁷

2가지 항염증성 황산화 다당체가 현재 이용 가능한 의료용 치료제이지만, 이들 둘 다 특별히 효과적이지 않다. 첫째, 헤파린은 방광내 투여되지만, 표적을 벗어난 효과, 비용 및 약간의 효능이 헤파린의 정기적인 사용을 제한한다.^8-10 둘째, GAG 층을 보충하는 것으로 주장되고 있는 경구용 엘미론(Elmiron)(펜토산 폴리설페이트)은 효능의 개시를 위한 리드 타임이 길며, 여성의 50% 미만에서만 효과적이고, 방광에 대한 생물학적 이용 가능성이 떨어지며(섭취량의 6% 미만), 표적을 벗어난 원치않는 효과를 다수 나타낸다.^{11, 12} 기타 다른 치료법 2가지로서는, 시스티스탯(Cystistat)¹³(비변형 0.04% 히알루론산, HA)의 방광내 점적 주입법과, 시스토프로텍(CystoProtek)^{14, 15} 또는 0.2% 황산 콘드로이친의 방광내 점적 주입법을 포함한다. PBC/IC의 관리를 위한 선택권으로서는, 경구용 히드록시진, 케르세틴, 아미트립틸린, 가바펜틴 및 나르코틱스를 포함하고; 방광내 투여용 DMSO, 레시니페라톡신 및 보톡스도 또한 사용되어 왔으며, 병용 요법도 사용되어 왔다.^2-4 치료상 선택권의 검토는 더 효과적인 치료법이 필요하다는 것에 일치한다.

방광이 소변을 담고 있기 위해서는 유연성(연성)이 있어야 한다. 이는, 방광이 다양한 용적의 소변을 낮은 압력으로 담을 수 있어야 함을 의미한다. 이렇지 않으면 방광 압력을 상승시키게 되고, 소변을 신장으로 보내게 되어, 사구체 손상, 신장 실질 섬유증 및 신부전을 일으키게 된다. 방광 벽 내부에서 세포외 매트릭스(ECM)의 과다한 침착은 방광 벽 연성 상실에 대한 주요 기작이다. 이러한 섬유증은 다수의 기작들로부터 기인될 수 있는데, 이 기작들 중 하나로서는 만성 염증을 포함한다. 이에 대응하여, 방광 섬유증은 ECM 단백질(제I형 및 제III형 콜라겐)의 축적을 수반하는, 상처 치유 과정의 일부이다. 또한, 만성 조직 염증 동안, 섬유 아세포 및 근 섬유 아세포에 대한 손상은 세포 증식, 이동성, 수축성 그리고 ECM 합성을 활성화시킨다. 최종적인 결과는 섬유증, 유연성 상실 및 방광의 기능 장애이다.

기타 다른 통상적으로 허용되는 염증 치료법은 UV 광선 치료법, 코르티코스테로이드 및 글루코코르티코이드, 아시트레틴, 사이클로스포린 및 메토트렉세이트를 수반할 수 있다. 그러나, 이들 치료법은 각각 면역 억제 및 간 질환으로부터 피부가 얇아지는 현상 및 선천적 결손증에 이르는 범위로 심각한 부작용을 야기할 수 있다. 부분적이거나 완전한 비효율성으로 인하여, 이들 치료법은 종종 환자가 치료 결과에 만족하지 못하게 한다.

상기 나타낸 바와 같이, 헤파린 치료법도 또한 실험에 의해 연구되어 왔다. 황산화 다당체인 헤파린은 통상적으로 거의 오직 항응고제로서 사용되어 왔지만, 헤파린의 항 염증 특성도 널리 알려져 있다. 헤파린과 이의 유도체는 이러한 염증성 질환을 치료함에 있어서 몇 가지 가능성을 보였다. 특히 헤파린과 이의 유도체는 염증 캐스케이드에 있어서 3개 이상의 중요한 사건을 방해한다. 첫번째, 헤파린은 백혈구 인테그린 P-셀렉틴 및 L-셀렉틴에 부착되어 이것들을 차단한다. 두번째, 헤파린과 이의 유도체는 양이온 PMN 프로테아제 사람 백혈구 엘라스타제 및 카텝신 G에 결합하여 이것들을 억제함으로써 염증 캐스케이드를 감소시키며, 이는 셀렉틴 억제의 제1 헤파린 장벽을 탈출하는 PMN에 의한 단백 분해 조직 손상을 감소시킨다. 세번째, 헤파린과 이의 유도체는 진행된 당화 반응 최종 생성물(RAGE)에 대한 수용체와 이의 리간드 간 상호 작용을 잠제적으로 억제한다.

비록 헤파린과 이의 유도체가 염증 치료시 가능성을 보인 바 있지만, 헤파린 및 이의 유도체를 사용하는 치료법은 몇 가지 주요 단점을 나타낸다. 첫번째, 헤파린과 이의 유도체는 돼지로부터 유래된 것이므로, 바이러스의 종간 감염의 우려를 가져온다. 두번째, 헤파린의 항응고 특성으로 인하여, 이 화합물로 당뇨병을 치료할 경우 과다 출혈의 위험이 있다. 세번째, 헤파린은, 헤파린과 양이온성 단백질 혈소판 인자-4(PF-4)의 복합체에 대한 항체를 생성하는 임의의 개체들에서 혈소판 감소증을 유도하여, 치명적인 혈소판 응집과 전신의 기이한 동맥혈 및 정맥혈 응고를 일으킬 수 있다. 그러므로, 충족되지 않은 중요한 요구 사항은 기타 다른 치료법에서 확인되는 무수한 부작용을 막으면서 비뇨기 염증을 치료하는데 사용될 수 있는 화합물을 제형화하는 것이다.

본 발명은 비뇨기 염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

a. 변형된 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르(여기서, 상기 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르는 알킬기 또는 플루오로알킬기를 포함하는 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 위치 1개 이상과 황산염기 1개 이상을 포함함);

b. 부분적으로나 전체적으로 황산화된 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르, 또는 이의 조합

을 포함하는 화합물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내 비뇨기 염증을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 기술되어 있다.

본 발명의 이점은 이하 상세한 설명에 부분적으로 제시될 것이며, 부분적으로는 상세한 설명으로부터 명백할 것이거나, 또는 이하에 기술된 양태의 실시에 의해 알게 될 수 있다. 이하에 기술된 이점은 첨부된 특허청구범위에서 특히 지적된 요소 및 조합에 의해 실현 및 성취될 것이다. 전술된 일반적인 설명과 이하 상세한 설명은 둘 다 단지 예시적이고 설명을 위한 것으로서 제한적인 것이 아님이 이해되어야 한다.

본 명세서에 포함되어 그 일부를 이루는 첨부 도면들은 이하에 기술된 몇 가지 양태들을 예시한다.
도 1은 알킬화 및 플루오로알킬화 히알루로난 및 이의 황산화된 유도체를 제조하는 합성 반응식을 나타낸다.
도 2는 (1) 제어된 가수 분해 연쇄 절단에 의한 부분 해중합, (2) 트리부틸암모늄 염으로의 전환, 그리고 (3) 부분적으로 황산화된 히알루로난을 생성하기 위한 황산화에 의해 부분적으로 황산화된 히알루로난을 제조하는 예시적인 합성 절차를 나타낸다.
도 3은 염수가 점적 주입된 대조군 방광과 LL-37이 점적 주입된 방광을 비교하는 방광의 전체 이미지를 나타낸다. 염수가 점적 주입된 대조군 방광은 12시간(A) 및 24시간(B) 경과 후에 수집되었다. 2등분되어 내부 점막 층을 노출시킨 방광의 경우, 염증의 증거가 없었다. LL-37이 점적 주입된 방광(45분 동안 1회 점적 주입)은 12시간(C) 및 24시간(D) 경과 후에 수집되었다. 12시간 경과 후(C), 중간 정도의 염증과, 국부 홍반/출혈, 및 전반적인 부종이 관찰되었다. 24시간 경과 후(D), 심각한 염증과, 전반적인 홍반/출혈, 상당한 부종, 및 혈관 과증식이 분명하게 관찰되었다.
도 4는 염수가 점적 주입된 대조군 방광과 LL-37이 점적 주입된 방광을 비교하는 H&E 조직학적 구조를 나타낸다. 염수가 점적 주입된 대조군 방광은 12시간(A) 및 24시간(B) 경과 후에 수집되었다. 횡단 절개 조직학적 구조는 12시간 또는 24시간 경과시 (U-요로 상피, SBM-점막하층, LP-프로프리아층, SMC-평활근 세포층에서) 염증의 증거를 전혀 나타내지 않았다. LL-37이 점적 주입된 방광(45분 동안 1회 점적 주입)은 12시간(C) 및 24시간(D) 경과 후에 수집되었다. 12시간 경과 후(C), 중간 정도의 염증과, 요로 상피의 국부 궤양, SBM 및 LP 층에 있어서 중간 정도의 조직 부종이 관찰되었다. 혈관으로부터의 PMN 변연화(직사각형)와 함께 모든 층(U, SBM, LP 및 SMC)에 있어서, 중간 정도의 PMN 침윤이 나타났다. 미세 농양(MA) 형성의 증거는 없었다. 24시간 경과 후(D), 심각한 염증이 관찰되었고, SBM에서는 중간 정도의 부종, LP에서는 심각한 부종이 있었다. 모든 층에서 상당한 PMN 침윤이 있었고(원), MA 형성, 및 혈관으로부터의 PMN 변연화(직사각형)가 있었다. 모든 이미지는 10배 확대한 것이다.
도 5는 염수가 점적 주입된 대조군 방광과 LL-37이 점적 주입된 방광을 비교하는 조직 MPO 염증 정량 분석법을 나타낸다. 염수가 점적 주입된 대조군 방광 조직 내 최소 MPO 활성(12시간 경과 후 11ng/㎖, 24시간 경과 후 14ng/㎖; 청색 막대). LL-37이 점적 주입된 방광 내 MPO 활성은 상당히 증가하였으며, 12시간(229ng/㎖)에서 24시간(849ng/㎖)에 이르기까지 계속 증가하였다(적색 막대).
도 6은 LL-37이 점적 주입되기 전 GM-1111(10㎎/㎖)의 예비 코팅/처리시 (2등분되어 내부 점막 표면을 노출시킨 방광) 전체 이미지(A) 대 LL-37이 점적 주입된 후 GM-1111(10㎎/㎖)의 후처리시 (2등분되어 내부 점막 표면을 노출시킨 방광) 전체 이미지(B)를 나타낸다. 모든 조직은 24시간 경과 후에 수집되었다. (A)에서는 최소한의 염증과, 단지 경미한 정도의 부종 및 군데 군데에서 혈관 과증식이 관찰되었다. (B)에서는 중간 정도의 염증과, 중간 정도의 부종이 관찰되었으나, 출혈의 증거는 없었다. 패널 (C) 및 (D)는 조직의 조직학적 구조이다((C)는 (A)에 상응하며, (D)는 (B)에 상응함). SAGE 예비 코팅/처리(C)로 점막하층(SBM)에서는 경미한 부종이 나타났으나, 프로프리아층(LP)에서는 부종의 증거가 없었다. 모든 층에 걸쳐 PMN의 증거가 관찰되지 않았으며, 이와 함께 혈관으로부터의 변연화도 없었다. GM-1111 후처리(D)로 SBM 및 LP에 존재하는 부종이 나타났으나, 요로 상피 및 SBM은 PMN이 완전히 사라졌으며, 이와 함께 LP층에는 PMN이 상당히 적게 있었다. PMN의 존재(원)는 평활근 세포층(SMC)에 인접하여 존재하는 심부 LP 층에 더 집약되었다. 혈관으로부터의 PMN 변연화에 대한 유의적 증거는 관찰되지 않았다(직사각형). 패널(E)는 GM-1111 예비 코팅/처리에 대한 조직 MPO 분석 결과를 나타내는 것으로서, 전처리된 샘플 내 MPO 활성이 22배 감소하는 것을 나타낸다(자주색 막대). 패널(F)는 GM-1111 후처리에 대한 조직 MPO 분석 결과를 나타내는 것으로서, 후처리된 샘플 내 MPO 활성이 2.5배 감소하는 것을 나타낸다(자주색 막대). 모든 조직학적 이미지는 10배 확대한 것이다.
도 7은 LL-37이 점적 주입되기 전 헤파린(10㎎/㎖)의 예비 코팅/처리시 (2등분되어 내부 점막 표면을 노출시킨 방광) 전체 이미지(A) 대 LL-37이 점적 주입된 후 헤파린(10㎎/㎖)의 후처리시 (2등분되어 내부 점막 표면을 노출시킨 방광) 전체 이미지(B)를 나타낸다. 모든 조직은 24시간 경과 후에 수집되었다. (A)에서는 상당한 염증과, 부종, 혈관 과증식, 및 출혈이 분명하게 관찰되었다. (B)에서는 상당한 염증과, 유사한 수준의 부종, 혈관 과증식, 및 출혈이 분명하게 관찰되었다. 패널 (C) 및 (D)는 조직의 조직학적 구조이다((C)는 (A)에 상응하며, (D)는 (B)에 상응함). 헤파린 예비 코팅/처리(C)로 요로 상피 궤양(U), 점막하층(SBM) 및 프로프리아층(LP)에서의 부종이 나타났으며, 모든 층에 걸쳐 PMN가 존재하였고, 혈관으로부터의 PMN 변연화가 나타났다. 헤파린 후처리 샘플(D)에 대하여 유사한 염증성 조직학적 구조가 관찰되었다. 패널(E)는 헤파린 예비 코팅/처리에 대한 조직 MPO 분석 결과를 나타내는 것으로서, 전처리된 샘플 내 MPO 활성이 약간 감소하는 것을 나타낸다(자주색 막대). 패널(F)는 헤파린 후처리에 대한 조직 MPO 분석 결과를 나타내는 것으로서, 후처리된 샘플 내 MPO 활성이 유의하게 감소하지 않음을 나타낸다(자주색 막대). 모든 조직학적 이미지는 10배 확대한 것이다.
도 8은 “방광 방호물(bladder armor)”로서 GM-1111 코팅의 용도를 나타낸다. 페널 (A) 및 (B)는 GM-1111(10㎎/㎖)이 점적 주입된 후 즉시 수집된 조직을 나타낸다. (A) 저 전력(10×), (B) 고 전력(20×). (A) 및 (B)는 요로 상피(U)에 인접하여 존재하는 비뇨기 GAG 층의 균일한 GM-1111 코팅을 나타내며(녹색 형광), 이와 함께 점막하층(SBM), 프로프리아층(LP) 및 평활근 표면(SMC) 층에 더 깊숙히 침투함을 나타낸다. 동맥 내부를 감싸는 내피 세포는 기저면과 관강내면 둘 다의 위가 GM-1111에 의해 상당히 코팅되었음을 나타낸다(직사각형). 패널 (C) 및 (D)는 GM-1111(10㎎/㎖)이 점적 주입된 후 24시간 경과시 수집된 조직을 나타낸다. (C) 및 (D)는 둘 다 20배 확대한 이미지이다. 비뇨기 GAG 층을 따라서 GM-1111의 증거는 없었지만, SBM의 선택된 영역 내부와, 기저면 및 관강내면 둘 다의 위에 존재하는 소 동맥 내부를 감싸는 내피를 따라서는 상기 GM-1111 코팅이 여전히 매우 분명하게 있었다(직사각형). GM-1111은 SMC 층의 무작위 영역에서 삽입하는 것이 여전히 분명하였다.
도 9는 GM-0111의 예비 점적 주입이 LL-37(250μM) 유도성 방광염을 예방하는 것을 나타낸다. 데이터는, LL-37의 방광 내 점적 주입 후 24시간 경과시 체중 변화(a), 체중당 방광의 중량(b), 병리 해부 스코어(c), 그리고 조직학적 스코어(d)를 나타낸다. 각각의 그래프에 있어서 가로선들은 평균(a와 b) 및 중앙값(c와 d) 을 나타낸다. 회색 영역은 정상 범위를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001.
도 10은 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 조직의 현미경 사진을 나타내는 것으로서, LL-37(250μM)의 점적 주입 후 24시간 경과시 방광 내 뚜렷한 염증 변화를 나타낸다. GM-0111의 예비 점적 주입은, 감소된 염증 지표(다형핵 호중구 침윤(PMN으로 채워진 호염기구 영역, 화살표 머리 부분), 광범위한 부종(

); 및 껍질이 벗겨진 상피 세포층(화살표))에 의해 나타낸 바와 같이, 용량 의존적 방식으로 방광 내 염증 변화의 중증도를 감소시킨다. 미처리 정상 방광(a 및 e), PBS/LL-37로 처리된 방광(b 및 f), GM-0111(10㎎/㎖)/LL-37로 처리된 방광(c 및 g), 그리고 GM-0111(100㎎/㎖)/LL-37로 처리된 방광(d 및 h). ML: 근육층, EL: 상피층 및 Lu: 관강. 이미지 전경(a~d) 및 박스 내부 영역의 근접 사진(e~h)(원래의 5배로 확대한 것임).
도 11은 GM-0111의 예비 점적이 LL-37(250μM) 유도성 방광염을 예방하는 것을 나타낸다. 데이터는, LL-37의 방광 내 점적 주입 후 24시간 경과시, SAP의 혈청 농도(a), MPO의 조직 활성(b), IL-6의 조직 농도(c) 및 PTX3(d)를 나타낸다. 각각의 그래프에 있어서 가로선들은 평균값을 나타낸다. 회색 영역은 정상 범위를 나타낸다. **p<0.01 및 ***p<0.001.

본 발명의 화합물, 조성물 및/또는 방법을 개시 및 기술하기에 앞서, 이하 기술된 양태들은 물론 다양할 수 있는 특정 화합물, 합성 방법 또는 용도에 제한되는 것은 아님이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 구체적인 양태들을 설명하기 위한 것이지 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아님이 이해되어야 한다.

본 명세서와 하기 특허청구범위에 있어서, 다음과 같은 의미를 가지는 것으로 정의될 다수의 용어들이 언급될 것이다.

본 명세서와 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형(“a”, “an” 및 “the”)은 내용이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함하는 것임을 주목하여야 한다. 그러므로, 예를 들어 “약학적 담체”에 대한 언급은 2개 이상의 이와 같은 담체의 혼합물 등을 포함한다. “선택적” 또는 “선택적으로”란, 이후에 기술된 사건 또는 상황이 일어날 수 있거나 일어나지 않을 수 있으며, 상기 기술은 사건 또는 상황이 일어나는 경우와 일어나지 않는 경우를 포함함을 의미한다. 예를 들어 “선택적으로 치환된 저급 알킬”이란 어구는 저급 알킬기가 치환될 수 있거나 치환되지 않을 수 있으며, 이러한 기술은 비치환 저급 알킬과 치환이 있는 경우 저급 알킬 둘 다를 포함함을 의미한다.

명세서 및 말미의 청구항에 있어서, 조성물 또는 물품 중 특정 요소 또는 성분의 중량부에 대한 언급은, 조성물 또는 물품 중 요소 또는 성분과 임의의 기타 다른 요소 또는 성분 간 중량부로 표현되는 중량의 관계를 나타낸다. 그러므로, 2중량부의 성분 X와 5중량부의 성분 Y를 함유하는 화합물에 있어서, X 및 Y는 2:5의 중량비로 존재하고, 추가 성분들이 화합물 중에 함유되는지 여부에 상관 없이 상기와 같은 비율로 존재한다.

특별히 반대로 기술되어 있지 않는 한, 성분의 중량%는 이 성분을 포함하는 제형 또는 조성물의 총 중량을 기준으로 한다.

본 명세서 및 말미의 청구항에서 사용된 화학 종의 잔기란, 특정 반응식에서 생성되는 화학 종의 생성물 또는 이후의 제형 또는 화학 생성물인 부(moiety)를 말하는데, 여기서 부가 실제로 상기 화학 종으로부터 유래하는지 여부에는 상관이 없다. 예를 들어, -OH 기를 1개 이상 함유하는 히알루로난은 화학식 Y-OH로서 표시될 수 있는데, 상기 식 중 Y는 히알루로난 분자의 나머지 부분(즉, 잔기)이다.

본원에 사용된 “치료하다”라는 용어는, 이전에 존재한 병태의 증상을 유지 또는 감소시키는 것으로 정의된다. 본원에 사용된 “예방하다”라는 용어는, 질환 또는 장애의 1개 이상의 증상의 발현 가능성을 없애거나 감소시키는 것으로 정의된다. 본원에 사용된 “억제하다”라는 용어는, 본원에 기술된 화합물의 부재시의 동일한 활성과 비교할 때 활성을 완전히 없애거나 활성을 감소시키는 상기 화합물의 능력이다.

본원에 사용된 “비뇨기 염증”이란 용어는, 비뇨 생식계의 임의의 부분 또는 영역과 연관된 염증으로 정의된다. 비뇨기 염증으로서는, 방광, 요도, 요로 상피 내막, 신장, 전립선, 질, 자궁 또는 이의 임의의 조합의 염증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에 사용된 “SAGE”란 용어는, 알킬화 및 플루오로알킬화된 반합성 글리코사미노글리코산 에테르로서 정의된다.

비뇨기 염증을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 하나의 양태에서, 방법은 변형된 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이나 에스테르를 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이나 에스테르는 알킬기 또는 플루오로알킬기를 포함하는 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 위치 1개 이상 및 황산염기 1개 이상을 포함한다.

하나의 양태에서, 변형된 히알루로난의 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 양성자 1개 이상은 비치환 알킬기로 치환된다. 본원에 사용된 “알킬기”란 용어는, 1개 내지 24개의 탄소 원자로 이루어진 분지형 또는 비분지형 포화 탄화수소기이다. 하나의 양태에서, 알킬기는 C₁~C₁₀ 분지형 또는 직쇄형 알킬기이다. 알킬기는 비치환 또는 치환될 수 있다. 알킬기가 치환되는 경우, 알킬기 상에 존재하는 수소 원자 1개 이상은, 이에 한정되는 것은 아니지만 알키닐, 알케닐, 아릴, 할로겐화물, 니트로, 아미노, 에스테르, 케톤, 알데히드, 하이드록시, 카복실산, 아랄킬 또는 알콕시를 포함하는 기로 또는 그 이상으로 대체될 수 있다. 알킬기에 대하여 “비치환된”이란 용어는, 단지 수소와 탄소만으로 구성된 포화 탄화수소이다. 비치환 알킬기의 예로서는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 테트라데실, 헥사데실, 에이코실, 테트라코실 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 양태에서, 히알루로난의 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 양성자 1개 이상은 플루오로알킬기로 치환된다. 본원에 사용된 “플루오로알킬기”란 용어는, 1개 내지 24개의 탄소 원자로 이루어진 분지형 또는 비분지형 포화 탄화수소기이며, 여기서 수소 원자들 중 1개 이상은 플루오르로 치환된다. 임의의 양태에서, 플루오로알킬기는 트리플루오로메틸기 1개 이상을 포함한다. 다른 양태에서, 플루오로알킬기는 화학식 -CH₂(CF₂)_nCF₃(식 중, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 정수임)를 가진다. 하나의 양태에서, 플루오로알킬기는 -CH₂CF₂CF₃ 또는 -CH₂CF₂CF₂CF₃이다.

하나의 양태에서, SAGE는 (a) 히알루로난 또는 이의 유도체를, N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 양성자 1개 이상을 탈양성자화시키기에 충분한 양의 염기와 반응시키는 단계, 그리고 (b) 탈양성자화된 히알루로난 또는 이의 유도체를, 탈양성자화된 1차 C-6 하이드록실기 1개 이상을 알킬화 또는 플루오로알킬화하기에 충분한 시간 동안 이에 충분한 농도의 알킬화제 또는 플루오로알킬화제와 반응시키는 단계에 의해 생성된다. 염기성 조건들은 또한 글리코시드 결합의 절단으로 이어질 수도 있으며, 이로 인하여 변형 과정 중 더 작은 분자량의 히알루로난 유도체를 생성할 수 있다는 것은 당업자들에 의해 이해될 것이다. 또한, 염기성 조건은 산을 카복실레이트 및 2차 하이드록실기로 탈양성자화시키고, 이러한 친핵성 부들은 각각, 이 부들의 (평형 상태에서의) 상대적 존재도와 음이온 종의 친핵성에 비례하여, 뒤따르는 알킬화에 참여할 수 있다는 것도 이해될 것이다. 예를 들어, 글루쿠론산 부의 2-O 및/또는 3-O 하이드록실 양성자 또는 N-아세틸 글루코사민 부의 C-4 하이드록실 위치는 탈양성자화 및 알킬화 또는 플루오로알킬화될 수 있다. 이의 예는 도 1에 도시되어 있으며, 이 도면에서, R은 수소, 알킬기 또는 알킬기일 수 있다. 히알루로난 출발 물질은 유리 산 또는 이의 염으로서 존재할 수 있다.

히알루로난 출발 물질의 유도체도 또한 본원에서 사용될 수 있다. 유도체로서는 알킬화 또는 플루오로알킬화 단계 전 히알루로난의 임의의 변형체를 포함한다. 다양한 분자량의 히알루로난이 본원에서 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 히알루로난은 분자량이 변형(즉, 알킬화, 플루오로알킬화 및 황산화) 전보다 10kDa 작다. 다른 양태에서, 히알루로난은 알킬화 또는 플루오로알킬화 이전의 분자량이 10kDa 내지 2,000kDa, 25kDa 내지 1,000kDa, 또는 50kDa 내지 500kDa이다. 임의의 양태에서, 히알루로난 출발 물질 또는 이의 유도체는 동물 공급원으로부터 유래되지 않는다. 이러한 양태에서, 히알루로난은 기타 다른 공급원, 예를 들어 박테리아로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 재조합 비.서브틸리스(B.subtilis) 발현 시스템 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 균주가 히알루로난 출발 물질을 생산하는데 사용될 수 있다.

히알루로난 출발 물질 또는 이의 유도체는 처음에 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 양성자 1개 이상을 탈양성자화하기에 충분한 양의 염기와 반응하게 된다. 염기의 선택은 다양할 수 있다. 예를 들어, 알칼리 수산화물, 예를 들어 수산화나트륨 또는 수산화칼륨이 본원에서 사용될 수 있다. 염기의 농도 또는 양은 원하는 정도의 알킬화 또는 플루오로알킬화에 따라서 다앙할 수 있다. 하나의 양태에서, 염기의 양은 히알루로난 출발 물질 또는 이의 유도체의 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 양성자 0.001% 이상을 탈양성자화하기에 충분하다. 다른 양태에서, 염기의 양은 히알루로난 출발 물질 또는 이의 유도체의 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 양성자의 0.001% 내지 100%, 0.001% 내지 90%, 0.001% 내지 80%, 0.001% 내지 70%, 0.001% 내지 60%, 0.001% 내지 50%, 1% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 30%, 5% 내지 20%, 10% 내지 50%, 20% 내지 50%, 또는 30% 내지 50% 탈양성자화하는데 충분하다. 용액의 염기성이 강할수록 연쇄 절단 반응의 진행 가능성과 알킬화/플루오로알킬화 정도는 증가할 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들어, 기타 다른 하이드록실기가 히알루로난 상에 존재한다(예를 들어, 2-OH 및/또는 3-OH는 알킬화 또는 플루오로알킬화될 수 있음). 하나의 양태에서, 히알루로난 상에 존재하는 하이드록실기 전부는 알킬화 또는 플루오로알킬화될 수 있다. 다른 양태에서, 히알루로난 상에 존재하는 하이드록실 양성자들의 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 또는 이의 임의의 범위가 탈양성자화되고, 추후 알킬화 또는 플루오로알킬화될 수 있다.

히알루로난 출발 물질 또는 이의 유도체가 염기로 처리된 후, 탈양성자화된 히알루로난은 알킬화제 또는 플루오로알킬화제와 반응하게 되어, SAGE를 생성한다. 알킬화제의 예로서는 할로겐화알킬을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 브롬화알킬 및 요드화알킬이 특히 유용하다. 이와 유사하게, 플루오로알킬화제는 할로겐화 플루오로알킬을 포함할 수 있다. 일반적으로 유기 합성에 사용되는 알킬화제와 플루오로알킬화제가 본원에 사용될 수 있다.

알킬화 및 플루오로알킬화된 SAGE를 제조하는 예시적인 합성 방법이 도 1에 제공되어 있다. 도 1을 참고로 하면, 히알루로난(HA)은 염기(예를 들어, NaOH) 및 알킬화제(예를 들어, CH₃I)로 처리되어, 히알루로난의 N-아세틸 글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 양성자를 메틸화하고, 메틸화된 히알루로난(MHA)을 생성한다. 도 1은 또한 플루오로알킬화제(예를 들어, CF₃(CF₂)₂CH₂Br)를 사용하여 플루오로알킬화된 히알루로난(FHA)을 제조하는 예시적인 합성 절차를 제공한다.

알킬화 또는 플루오로알킬화된 SAGE는, 알킬화 또는 플루오로알킬화된 SAGE를 황산화제와 반응시켜 황산화됨으로써, 황산화된 생성물을 생산한다. 황산화도는 부분적 황산화로부터 완전 황산화에 이르기까지 다양할 수 있다. 일반적으로 알킬화 또는 플루오로알킬화된 히알루로난 또는 이의 유도체 상에 존재하는 유리 하이드록실기는 황산화될 수 있다. 하나의 양태에서, 1개 이상의 C-2 하이드록실 양성자 및/또는 C-3 하이드록실 양성자는 황산염기로 치환된다. 추가의 구체예는 화합물의 N-아세틸 글루코사민 부의 C-4 하이드록실 위치, 또는 글루쿠론산 부의 C-2 및 C-3 위치에서의 황산화에 관한 임의의 조합, 그리고 N-아세틸 글루코사민 부의 C-4 하이드록실 위치에서의 황산염을 포함할 수 있다. 황산화도는 알킬화 또는 플루오로알킬화 SAGE의 이당체 단위 당 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 또는 이의 임의의 범위일 수 있다. 하나의 양태에서, 알킬화 또는 플루오로알킬화된 SAGE가 염기로 처리되어 1개 이상의 하이드록실 양성자들을 탈양성자화할 수 있으며, 이후 황산화제를 첨가할 수 있다. 황산화제는 하이드록실기 또는 탈양성자화된 하이드록실기와 반응하여 황산염기를 생산하는 임의의 화합물이다. SAGE의 분자량은 반응 조건에 따라서 다양할 수 있다. 하나의 양태에서, SAGE의 분자량은 2kDa 내지 500kDa, 2kDa 내지 250kDa, 2kDa 내지 100kDa, 2kDa 내지 50kDa, 2kDa 내지 25kDa, 또는 2kDa 내지 10kDa이다. 도 1은 황산화 알킬화 또는 플루오로알킬화 SAGE(각각 SMHA 및 SFHA)의 예시적인 합성 과정을 도시한다.

하나의 양태에서, 변형된 히알루로난의 알킬기는 메틸이고, 히알루로난의 C-2 하이드록실 양성자 및/또는 C-3 하이드록실 양성자 1개 이상은 황산염기로 치환된다. 다른 양태에서, 변형된 히알루로난의 알킬기는 메틸이며, 히알루로난의 C-2 하이드록실 양성자 및/또는 C-3 하이드록실 양성자 1개 이상은 황산염기로 치환되고, 알킬화 이후 화합물은 분자량이 2kDa 내지 200kDa이다. 이와 같은 화합물의 예로서는 실시예에 기술된 GM-111101이 있다. 추가의 구체예는 화합물의 N-아세틸 글루코사민 부의 C-4 하이드록실 위치, 또는 글루쿠론산 부의 C-2 및 C-3 위치에서의 황산화의 임의의 조합, 및 N-아세틸 글루코사민 부의 C-4 하이드록실 위치에서의 황산염을 포함할 수 있다. 임의의 양태에서, C-6 위치가 알킬화 또는 플루오로알킬화되지 않을 때, 1개 이상의 C-6 위치들은 황산화된다. 하나의 양태에서, C-6 위치들 중 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 90% 이하, 95% 이하 또는 100% 이하가 황산화된다. 다른 양태에서, C-6 위치들 모두는 알킬화 및/또는 플루오로알킬화에 의하거나, 아니면 황산화에 의해 변형된다.

본원에 기술된 변형된 히알루로난은 다분산성과 초기 평균 분자량이 상이한 여러 가지 히알루론산 공급원들로부터 제조될 수 있다. 시험관 내 생화학적 결과들, 생체 내 생물학적 활성들, 그리고 알킬화/황산화 수준은 출발 HA의 크기와 용해도에 근거하여 다양할 수 있다. 예를 들어, 크기 5kDa 내지 60kDa인, 용이하게 용해되는 HA를 출발 물질로서 사용하여, 메틸화 및 황산화 수준, 그리고 높은 생물학적 활성 수준이 재현될 수 있었다.

하나의 양태에서, 부분적 또는 전체적으로 황산화된 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르는 비뇨기 염증을 치료 또는 예방하기 위해 대상체에 투여될 수 있다. 본원에 사용된 “부분적으로 황산화된 히알루로난”이란 용어는, 히알루로난의 황산화도가 이당체 단위당 3.5 미만인 경우를 말한다. 본원에 사용된“전체적으로 황산화된 히알루로난”이란 용어는, 히알루로난의 황산화도가 이당체 단위당 3.5 내지 4.0인 경우를 말한다. 이러한 경우, 히알루로난 C-6 하이드록실기가 전부 황산화되는 것이 아닌 경우가 대부분이다.

히알루로난 출발 물질은 유리 산 또는 이의 염으로서 존재할 수 있다. 히알루로난 출발 물질의 유도체도 또한 본원에서 사용될 수 있다. 유도체는 황산화 이전 히알루로난의 임의의 변형체를 포함한다. 광범위하게 다양한 분자량의 히알루로난이 해중합 단계를 위해 본원에서 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 해중합 이전 히알루로난은 분자량이 1,000kDa 초과이다. 다른 양태에서, 해중합 이전 히알루로난은 분자량이 10kDa 내지 1,000kDa일 수 있다. 다른 양태에서, 해중합 이전 히알루로난은 분자량이 10kDa 미만일 수 있다. 광범위하게 다양한 분자량의 히알루로난도 또한 황산화 단계를 위해 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 히알루로난 출발 물질은 황산화 이전 저분자량 히알루로난 또는 히알루로난 올리고당으로 전환되어, 부분적으로 황산화된 히알루로난을 생산할 수 있다. 이하 더 상세히 논의될 바와 같이, 저분자량 히알루로난은 산이나 염기로 분해된 히알루로난이다. 대안적으로, 히알루로난 올리고당은 효소, 예를 들어 히알루로난 신타제 또는 히알루로니다제를 사용하여 제어된 방식으로 히알루로난을 분해함으로써 생산된다. 추후, 분자량이 상이한 히알루로난 올리고당은 GPC 또는 이온 교환 분리에 의해 분리될 수 있다. 도 1은 히알루로난으로부터 저분자량 히알루로난 또는 히알루로난 올리고당을 생산하는 예시적인 절차를 도시한다.

하나의 양태에서, 황산화되는 히알루로난 또는 히알루로난 올리고당은 분자량이 1kDa 내지 2,000kDa이다. 다른 양태에서, 황산화되는 저분자량 히알루로난 또는 히알루로난 올리고당은 분자량이 5kDa 내지 500kDa, 10kDa 내지 200kDa, 또는 20kDa 내지 100kDa이다. 저분자량 히알루로난을 제조하는 예시적인 절차는 실시예에 제공되어 있다. 상기 논의된 바와 같이, 히알루로난을 산이나 염기로 절단하여 히알루로난의 분자량을 변형함으로써 저분자량 히알루로난을 생산할 수 있다. 임의의 양태에서, 히알루로난 출발 물질 또는 이의 유도체는 동물 공급원으로부터 유래되지 않는다. 이러한 양태에서, 히알루로난은 기타 다른 공급원, 예를 들어 박테리아로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 재조합 비.서브틸리스 발현 시스템은 히알루로난 출발 물질을 생산하는데 사용될 수 있다.

저분자량 히알루로난 또는 히알루로난 올리고당이 염기로 처리된 후, 이는 황산화제와 반응하여, 부분적 또는 전체적으로 황산화된 히알루로난을 생산한다. 일반적으로 유기 합성에 사용되는 황산화제가 본원에 사용될 수 있다. 황산화제의 예로서는 피리딘-황 트리옥사이드 복합체, 트리에틸아민-황 트리옥사이드 복합체, 또는 디메틸 포름아미드-황 트리옥사이드 복합체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 부분적으로 황산화된 히알루로난을 제조하는 예시적인 합성 절차는 도 2에 제공되어 있다. 도 2를 참고로 하였을 때, 저분자량 히알루로난 또는 히알루로난 올리고당은 트리부틸아민 염으로 전환되고, 동결 건조되어 디메틸포름아미드 중에 재현탁되며, 이후 황산화제(예를 들어, 피리딘-황 트리옥사이드 복합체, 트리에틸아민-황 트리옥사이드 복합체, 또는 디메틸 포름아미드-황 트리옥사이드 복합체)로 처리되어 1개 이상의 하이드록실 양성자를 황산화시킨다. 몇몇 경우, 다당체가 피리딘-황 트리옥사이드 복합체로 황산화되면 다당체의 부분적인 가닥 절단이 일어날 수 있어, 황산 글리코실로 전환될 수 있고, 복합체 내 피리딘과 반응할 수 있는 환원 말단부를 형성하며, 다당체 단편의 N-글리코실-피리디늄 복합체를 형성한다는 것이 당업계에 알려져 있다. 몇몇 양태에서, 이러한 복합체들은 효능 또는 유해 효과의 상실을 보인다. 다른 양태에서, 황산화된 HA의 복합체는 놀랍게도 활성을 보유할 뿐만 아니라 심지어 개선된 활성을 보인다는 것이 파악되었다.

하나의 양태에서, 황산화도는 부분적으로 황산화된 히알루로난의 이당체 단위 당 0.1, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 또는 4.0 이하, 또는 이의 임의의 범위이다. 다른 양태에서, 부분적으로 황산화된 히알루로난은 황산화도가 약 2.5 내지 4.0 이하, 2.5 내지 3.5, 또는 3.0 내지 3.5이다. 하나의 양태에서, 부분적 또는 전체적으로 황산화된 히알루로난의 평균 분자량은 100kDa 미만이다. 다른 양태에서, 부분적 또는 전체적으로 황산화된 히알루로난은 평균 분자 크기가 1kDa 내지 50kDa 미만, 2Da 내지 20kDa, 또는 3kDa 내지 10kDa이다. 하나의 양태에서, 부분적 또는 전체적으로 황산화된 히알루로난은 평균 분자 크기가 약 3kDa, 4kDa, 5kDa, 6kDa, 7kDa, 8kDa, 9kDa 또는 10kDa이고, 여기에서 임의의 수치는 범위의 하한점 또는 상한점을 형성할 수 있다. 다른 양태에서, 부분적 또는 전체적으로 황산화된 히알루로난은 평균 분자 크기가 약 3kDa 내지 10kDa 미만, 약 3kDa 내지 약 9kDa, 약 3kDa 내지 약 8kDa, 약 3kDa 내지 약 7kDa, 약 3kDa 내지 약 6kDa, 약 4kDa 내지 약 6kDa, 또는 약 5kDa이다. 반응 조건에 따라서, 저분자량 히알루로난 또는 히알루로난 올리고당에 존재하는 상이한 하이드록실기 1개 이상은 황산화될 수 있다. 하나의 양태에서, 저분자량 히알루로난 또는 히알루로난 올리고당의 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 양성자는 황산화된다. 다른 양태에서, 히알루로난의 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 양성자, 우론산 잔기의 C-2 하이드록실 양성자 또는 C-3 하이드록실 양성자 1개 이상, 또는 N-아세틸-글루코사민 잔기의 C-4 하이드록실 양성자 1개 이상은 황산염기로 치환된다. 다른 양태에서, 저분자량 히알루로난 또는 히알루로난 올리고당의 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 양성자, 우론산 잔기의 C-2 하이드록실 양성자 및 C-3 하이드록실 양성자 1개 이상, 그리고 N-아세틸-글루코사민 잔기의 C-4 하이드록실 양성자 1개 이상은 황산염기로 치환된다. 다른 양태에서, 저분자량 히알루로난 또는 히알루로난 올리고당에 존재하는 하이드록실 양성자의 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 미만, 또는 이의 임의의 범위는 탈양성자화된 후 황산화될 수 있다.

본원에 기술된 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난은 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르일 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 유리 산을 적절한 양의 약학적으로 허용 가능한 염기로 처리함으로써 제조된다. 약학적으로 허용 가능한 염은 유기 염, 금속 염 또는 이의 조합일 수 있다. 대표적인 약학적으로 허용 가능한 염기로서는 수산화암모늄, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화리튬, 수산화칼슘, 수산화마그네슘, 수산화 제1철, 수산화아연, 수산화구리, 수산화알루미늄, 수산화 제2철, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 2-트리메틸에탄올암모늄 양이온(콜린), 리신, 아르기닌, 히스티딘 등이 있다. 하나의 양태에서, 반응은 비활성의 수혼화성 유기 용매와 합하여 또는 단독으로 수중에서, 약 0℃ 내지 약 100℃, 예를 들어 실온의 온도에서 수행된다. 구조식 I의 화합물 대 사용된 염기의 몰비는, 임의의 특정 염에 대하여 요구되는 비율을 제공하도록 선택된다. 예를 들어 유리 산 출발 물질의 암모늄 염을 제조하기 위하여, 출발 물질은 약 1당량의 약학적으로 허용 가능한 염기로 처리되어, 중성의 염을 생성할 수 있다.

에스테르 유도체는 통상적으로 이하 실시예에 설명된 바와 같이 화합물의 산 형태에 대한 전구체로서 제조되며, 따라서 전구 약물의 역할을 할 수 있다. 일반적으로 이러한 유도체는 저급 알킬 에스테르, 예를 들어 메틸, 에틸 등일 것이다. 아미드 유도체 -(CO)NH₂, -(CO)NHR 및 -(CO)NR₂(식 중, R은 상기 정의된 알킬기임)는, 카복실산 함유 화합물과 암모니아 또는 치환된 아민을 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 또한, 에스테르는 지방산 에스테르일 수 있다. 예를 들어, 팔미트산 에스테르는 제조되어 대안적 에스터라제 활성화 전구 약물로서 사용될 수 있다.

본원에 기술된 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난은 임의의 부형제 중에 제형화될 수 있으며, 생물학적 시스템 또는 실체는 약학 조성물을 제조하는데 용인될 수 있다. 이와 같은 부형제의 예로서는 물, 수성 히알루론산, 염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 행크 용액 및 기타 다른 생리적 평형 염 수용액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 비수성 비이클, 예를 들어 불휘발성 오일, 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일 및 참깨 오일, 트리글리세라이드, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 주사 가능한 유기 에스테르, 예를 들어 올레산 에틸도 또한 사용될 수 있다. 기타 다른 유용한 제형은 증점제, 예를 들어 소듐 카복시메틸셀룰로스, 솔비톨 또는 덱스트란을 함유하는 현탁액을 포함한다. 부형제는 또한 소량의 첨가제, 예를 들어 등장성 및 화학적 안정성을 증강시키는 물질을 함유할 수도 있다. 완충제의 예로서는 인산염 완충제, 중탄산염 완충제 및 트리스 완충제를 포함하고, 보존제의 예로서는 티메로솔, 크레솔, 포르말린 및 벤질 알코올을 포함한다. 임의의 양태에서, pH는 투여 방식에 따라서 변형될 수 있다. 예를 들어, 조성물의 pH는 약 5 내지 약 6인데, 이는 국소 적용에 적당하다. 부가적으로 약학 조성물은, 본원에 기술된 화합물 이외에, 담체, 증점제, 희석제, 보존제, 표면 활성제 등을 포함할 수 있다.

약학 조성물은 또한 본원에 기술된 화합물과 함께 사용되는 활성 성분 1개 이상을 포함할 수도 있다. 생성된 약학 조성물은 약물 및 기타 다른 생물학적 활성 제제를, 적용 위치로부터 멀리 떨어진 조직 또는 인접한 조직에 지연 연속 전달하기 위한 시스템을 제공할 수 있다. 생물학적 활성 제제는 이것이 적용되는 생물 시스템에서 국부 또는 전신 생물, 생리 또는 치료 효과를 제공할 수 있다. 예를 들어, 제제는 다른 역할들 중에서도 특히 감염이나 염증을 억제 및/또는 예방하고, 세포 성장 및 조직의 재생을 증강시키며, 종양의 성장을 억제하고, 진통제로서의 역할을 하며, 세포 부착 억제 작용을 촉진시키고, 치조골 및 치아 손실을 감소시키며, 연골 및 체중 지지 관절의 퇴행을 억제하고, 골 성장을 증강시키는 역할을 할 수 있다. 부가적으로, 본원에 기술된 화합물들 중 임의의 것은 약학적으로 허용 가능한 화합물들 2개 이상의 조합을 함유할 수 있다.

이와 같은 화합물의 예로서는, 항미생물 제제, 항염증 제제, 마취제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 조성물을 약물 전달 장치로서 사용하는 방법은 이하에 상세히 기술되어 있다.

약학 조성물은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 하나의 양태에서, 조성물은 본원에 기술된 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난을 약학적으로 허용 가능한 화합물 및/또는 담체와 혼합함으로써 제조된다. “혼합”이라는 용어는, 화학 반응 또는 물리적 상호 작용이 없도록 2개의 성분들을 함께 섞는 것으로서 정의된다. “혼합”이라는 용어는 또한 화합물과 약학적으로 허용 가능한 화합물 간 화학 반응 또는 물리적 상호 작용을 포함하기도 한다. 반응성 치료 약물, 예를 들어 친핵성 기를 가지는 약물과의 공유 결합이 화합물에서 이루어질 수 있다. 둘째, 가교 다당체 내 약리학적으로 활성인 제제의 비공유 포집도 또한 일어날 수 있다. 셋째, 정전기적 또는 소수성 상호 작용은 본원에 개시된 화합물 내에 약학적으로 허용 가능한 화합물이 체류하는 것을 용이하게 할 수 있다.

특정 경우에 있어서, 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난의 바람직한 실제 양은, 사용중인 특정 화합물, 제형화된 특정 조성물, 적용 방식, 구체적인 상황과 치료중인 대상체에 따라서 다양할 것임이 이해될 것이다. 소정의 숙주에 대한 투여량은 통상의 고려 사항들, 예를 들어 대상 화합물들 및 공지된 제제의 차등적 활성의 관례적 비교, 예를 들어 통상의 적절한 약리학적 프로토콜에 의해 결정될 수 있다. 전문의, 제약업자 및 약학 화합물의 용량을 결정하는 업계의 숙련자는, 표준 권고 사항(Physician’s Desk Reference, Barnhart Publishing(1999))에 따라서 용량을 결정하는데 문제가 없을 것이다.

본원에 기술된 약학 조성물은 국부 또는 전신 치료가 요구되는지 여부와, 치료될 부위에 따라서 다수의 방법으로 투여될 수 있다. 제형은, 연고, 로션, 크림, 겔, 점안액, 좌제, 스프레이, 로젠지, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상의 약학 담체, 수성, 분말 또는 유질 베이스, 증점제 등이 필수적이거나 바람직할 수 있다. 투여는 또한 에어로졸이나 건조 미분화 분말을 흡입함으로써 폐에 직접 이루어질 수도 있다. 투여는 또한 염증이 발생하였거나 퇴행중인 관절 공간에 직접 주사함으로써 이루어질 수도 있다. 투여는 또한 정맥 내, 근육 내, 피하, 섭취 또는 경점막 경로로 이루어질 수도 있다. 경점막 경로는 경협측, 설하, 경구, 질내, 비강내, 직장 경로 등을 포함할 수 있다. 투여는 또한 방광내 점적 주입법에 의해, 즉 방광으로의 요도 카테터를 통해 일어날 수도 있다.

투여용 제조물은 멸균 수성 및 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 담체의 예로서는 물, 알코올/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예를 들어 염수 및 완충된 매질을 포함한다. 만일 비경구용 비이클이 개시된 조성물 및 방법의 부차적인 이용에 필요하다면, 이 비이클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화 나트륨, 젖산 처리된 링거 용액, 또는 불휘발성 오일을 포함한다. 만일 정맥 내 비이클이 개시된 조성물 및 방법의 부차적인 이용에 필요하다면, 이 비이클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예를 들어, 링거 덱스트로스를 주성분으로 하는 것) 등을 포함한다. 보존제 및 기타 다른 첨가제, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 비활성 기체 등도 존재할 수 있다.

투약은 치료될 병태의 중증도와 민감성에 따라서 달라지긴 하지만, 보통은 수 일에서 수 개월에 이르기까지의 치료 과정 중 또는 당업자가 전달을 중지해야 할 때를 결정할 때까지, 매일 1회 이상 투여될 것이다. 당업자는 최적 투여량, 투약 방법 및 반복 횟수를 용이하게 결정할 수 있다.

변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난은 비경구로, 즉 정맥 내, 근육 내 또는 피하로 주입되어, 전신 비뇨기 염증성 장애를 치료 또는 예방할 수 있다. 유사하게, 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난은 또한 캡슐, 정제, 츄잉검, 로젠지, 분말 또는 마시는 약으로서 경구로 투여될 수도 있다. 대안적으로, 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난은 방광 내 점적 주입법(즉, 카테터를 통한 방법)에 의해 투여될 수 있다.

본원에 기술된 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난은, 약학적으로 허용 가능한 화합물의 전달을 필요로 하는 환자에게 1개 이상의 상기 화합물을 전달할 수 있으며, 상기 전달은 약학적으로 허용 가능한 화합물을 수용할 수 있는 조직 1개 이상을 본원에 기술된 조성물 1개 이상과 접촉시키는 단계를 포함한다. 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난은, 사람이나 사람 이외의 동물에 대해 치유 또는 치료 가치를 가지는, 광범위하게 다양한 방출성 생물 활성 물질에 대한 담체로서 사용될 수 있다. 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난에 의해 운반될 수 있는 물질들 중 다수는 상기 논의되어 있다. 본 발명의 겔에 혼입되는데 적당한 생물 활성 물질들 중 치료 약물, 예를 들어 항 염증 제제, 해열제, 항염증용 스테로이드 및 비스테로이드 약물, 호르몬, 성장 인자, 피임약, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제, 진통제, 수면제, 진정제, 정신 안정제, 항경련제, 근육 이완제, 국부 마취제, 진경제, 항궤양제, 펩티드 작용제, 교감 신경 흥분제, 심혈관 제제, 항종양제, 올리고뉴클레오티드 및 이의 유사체 등이 포함된다. 생물학적 활성 물질은 약학적으로 활성인 양으로 첨가된다.

본원에 기술된 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난은 기타 다른 관련 치료제들보다 안전하다. 예를 들어, 헤파린 및 기타 다른 황산화된 다당체는 동물 연구 및 임상 연구 둘 다에서 당뇨 합병증을 감소시킬 수 있으며, 당뇨병성 신경병증에 특히 효과적이다. 그러나, 항응고 특성은 과다 출혈의 위험을 나타내므로, 헤파린은 당뇨 합병증을 예방하기 위한 일반적 임상 환경에서 사용될 수 없다. 본원에 기술된 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난은 항응고 활성이 낮은데, 이는 장기 치료에 중요한 고려 사항으로서, 이하 실시예에 설명되어 있다. 부가적으로, SAGE는 독성이 아주 작거나 전혀 없는데, 이 또한 실시예에 설명되어 있다.

하나의 양태에서, 본원에 기술된 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난은 대상체 내에서 LL-37의 활성을 억제할 수 있다. LL-37은 hCAP18 전구체 단백질의 C-말단으로부터 생산된 숙주 방어 펩티드로서, 순환 호중구, 점막 상피 세포, 각질 세포, 골수성 골수 세포, 피부, 위장관, 부고환 선 및 폐의 상피 세포에서 생산된다. LL-37은 사람과 마우스 둘 다에서 비뇨기 상피 세포(요로 상피 세포)에 의해 생산되며, 신장 및/또는 방광 감염(신우신염 또는 방광염)이 발생하였을 때 소변 중 수준이 상당히 상승한다. 미생물을 근절하는데 있어서 LL-37이 가지는 역할 이외에, 상기 LL-37은 면역 조절성으로서, 백혈구의 주화성을 촉진하고, 혈관을 생성하며, 비만 세포의 탈과립을 촉진하고, 호중구 기능을 강화하며, 케모카인, 예를 들어 IL-8을 유도하고, NF-κB를 통하여 염증 반응을 조절하며, 세포외 매트릭스 성분들의 발현을 증가시킴으로써 염증을 촉발한다. LL-37에 대한 작용의 하류 염증성 기작에 관한 상세한 내용은 완전히 이해되지는 않지만, 반응은 다수의 세포 표면 수용체 및 신호 전달 경로의 활성화를 수반한다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 본원에 기술된 화합물에 의한 LL-37의 억제는 비뇨기 염증을 치료하는데 유용할뿐만 아니라, 비뇨기 염증을 예방하는데에도 유용할 수 있다.

LL-37 수준의 상승과 비뇨기 염증 발생 간 연관성을 바탕으로, 대상체 내에서 비뇨기 염증을 치료 또는 예방하는 화합물의 능력을 스크리닝하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 하나의 양태에서, 방법은

실험용 동물에, 대상체 내에서 염증을 유도하는 양의 LL-37을 투여하는 단계;

단계 (a) 이전 및/또는 단계 (a) 이후에 화합물을 동물에 투여하는 단계; 및

동물 내 염증의 양을, 동일한 양의 LL-37이 투여되되 본 화합물은 투여되지 않은 대조군 동물과 비교하는 단계

를 수반한다.

하나의 양태에서, 쥣과 동물 모델은, LL-37을 억제하여, 비뇨기 염증을 치료 또는 예방하는 상이한 화합물들의 능력을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 비뇨기 염증을 치료 및 예방하는데 유용한 화합물을 스크리닝하는 예시적인 절차는 실시예에 제공되어 있다.

임의의 양태에서, 비뇨기 조직으로 침투하여 이 조직에 국부화되는 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난의 능력을 추적하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 변형된 히알루로난 또는 부분적/전체적으로 황산화된 히알루로난은 형광 표지화될 수 있다. 하나의 양태에서, 형광 표지화된 변형된 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르는, (a) 황산염기 1개 이상; (b) 알킬기 또는 플루오로알킬기를 포함하는 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 위치 1개 이상, 그리고 (c) 1개 이상의 이당체 단위에 공유 결합된 형광기를 포함한다. 형광 표지화된 변형된 히알루로난을 제조하는 예시적인 절차는 실시예에 제공되어 있다.

실시예

이하 실시예는, 본원에 기술 및 청구된 화합물, 조성물 그리고 방법이 어떻게 제조되고 평가되는지에 대하여 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된 것으로서, 본 발명자들이 자신들의 발명으로서 간주하는 범위를 순전히 예시하고자 하는 것이지 한정하고자 하는 것은 아니다. 수치(예를 들어, 양, 온도 등)에 관한 정확성을 보장하기 위한 노력들이 행하여졌으나, 약간의 오차와 편차가 파악되어야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부(part)는 중량부이고, 온도는 ℃로 표현되거나 주위 온도이며, 압력은 대기압 또는 대기압에 가까운 압력이다. 기술된 방법으로부터 얻어진 생성물의 순도 및 수율을 최적화하는데 사용될 수 있는 반응 조건, 예를 들어 성분의 농도, 요구되는 용매, 용매 혼합물, 온도, 압력 및 기타 다른 반응 범위와 조건들의 다수의 변형 및 조합이 존재한다. 단지 합리적이고 통상적인 실험만이 이와 같은 공정 조건을 최적화하는데 필요할 것이다.

1. 알킬화 및 황산화된 히알루로난의 평가

GM-1111의 제조

이하 연구에서 평가된 변형된 히알루로난인 GM-1111은, 참조로 포함되어 있는 국제 공개 WO 제2009/124266호에서 이미 합성된 것이다. GM-1111의 구조는 도 1에 제공되어 있으며, “SMHA”라고 나타내어져 있다.

LL-37 유도성 방광염 모델

모든 동물 실험은 완전한 승인 하에서, 동물 실험 윤리 위원회(유타 대학교)에 따라서 수행되었다. 성체 암컷 C57/B16 마우스(매사추세츠주 윌밍톤 소재, 찰스 리버)(8주령 내지 12주령)를 모든 동물 실험에서 사용하였다. 모든 동물을 우리에 가둔 다음, 무균 환경에서 유지시키고, 먹이와 물은 임의로 공급하였으며, 이때 명 주기(light cycle)는 12시간으로 하였다. 합성 LL-37을 유타 핵심 시설 대학교로부터 HPLC-균질형으로 구입하였으며(펩티드 서열: LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES), 이를 나노퓨어 물에 용해하여, 작업 농도를 320μM로 만들었다. 각각의 실험군은 6마리의 마우스로 이루어졌다. 이소플루란(펜실베이니아 베틀레헴 소재, 민래드(Minrad))로 전신 마취를 한 후, 가요성 카테터(실라스틱(SILASTIC) 실험실 튜브, 다우 코닝(Dow Corning), 0.30㎜ I.D.×0.64㎜ O.D., 길이 1.5㎝)를 멸균 조건 하에서 경요도로 삽입하였다. 소변을 전부 빼낸 후, 발열성 물질이 없는 0.9% 염화나트륨 용액 150㎕를 1분 동안 점적 주입한 후, 세정 단계에서 전부 빼냈다. 그 다음, LL-37(320μM)을 최대 용량(150㎕)과 동일한 용적으로 점적 주입하였는데, 이때 방광 내 접촉/체류 시간은 45분으로 하였다. 대조군은 실험군과 동일한 용적 및 접촉/체류 시간으로 하여 발열성 물질이 없는 0.9% 염화나트륨의 점적 주입으로 이루어졌다. 방광이 팽창될 때 방광을 파열시킬 수 있는 가능한 상처를 남기지 않고, 잠재적인 방광요관역류를 방지하기 위해서, 주입 조작은 낮은 속도로 유지하였으며, 점적 주입 시린지는 카테터 상에 계속 장착시켜 두어, 전체 기간 45분 동안 용액의 누수가 일어나지 않는 것을 보장하였다. 45분의 접촉/체류 시간 경과 후, 방광의 속을 완전히 비우고, 동물을 마취에서 깨웠다. 실험군에 따라서, 동물을 희생시키고, 방광내 투여 후 12시간 또는 24시간 경과시의 조직을 수집하였다.

LL-37 유도성 방광염에 변형된 히알루로난 및 헤파린 처리

2개의 실험군을 SAGE 처리 및 헤파린 처리하였을 때에 대해 검사하였다. 앞서 상세히 설명된 바와 같이 마우스를 마취한 다음, 카테터를 삽입하였다. 제1군(SAGE 및 헤파린 처리 각각에 대해 n = 4)에 우선 LL-37(320μM)은 최대 방광 용량(150㎕)으로 45분 동안 점적 주입한 다음, 방광을 완전히 비우는 것으로 이루어졌다. 직후, 10㎎/㎖로 SAGE 또는 헤파린을 최대 방광 용량(150㎕)으로 45분 동안 점적 주입하였다. 이후, SAGE 또는 헤파린을 방광내 투여한 후 24시간 경과시 방광을 수집하였다. 제2군(SAGE 및 헤파린 처리 각각에 대해 n = 4)은 우선 10㎎/㎖로 SAGE 또는 헤파린을 최대 방광 용량으로 45분 동안 점적 주입하는 것으로 이루어졌다. 그 다음, 방광을 비운 후, LL-37(320μM)을 45분 동안 접종하였다. 이후, LL-37을 투여한 후 24시간 경과시 조직을 수집하였다. 모든 방광 조직을 반으로 절단한 후, 가공하여, 고정한 다음, H&E 염색 또는 조직 MPO 분석을 수행하여, 염증 수준을 정량하였다.

형광 GM-1111의 합성

탈이온화(DI) H₂O 10㎖ 중 GM-1111 50㎎(표 1) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 10㎎의 교반된 용액에, 디메틸포름아미드(DMF) 4㎖ 중 알렉사플루오르(AlexaFluor) 633 히드라지드(오리건주 유진 소재, 인비트로겐(Invitrogen)) 1㎎ 용액을 첨가하였다. pH를 4.75로 조정하고 나서, 여기에 분말형 N,N-디에틸아미노프로필 카보디이미드(EDCI) 10㎎을 첨가하였다. 3N NaOH를 적가하여 상기 혼합물의 pH를 4.75로 유지시켰다. Al 호일을 사용하여 반응 혼합물을 빛으로부터 차단시킨 다음, 실온에서 밤새 교반하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 100mM NaCl 용액(MWCO 1000)에 대해 2회 투석한 후, DI H₂O에 대해 1회 투석하였다. 투석된 용액을 동결 건조하여 건조시켜, GM-1111-알렉사플루오르 633 접합체 25㎎을 생성하였다. 캘리포니아 팔로 알토 소재, 배리언 인코포레이션(Varian Inc.)의 캐리 50 UV-Vis 분광 분석계를 사용하여 632㎚에서의 1㎎/㎖ 용액의 흡광도로부터 치환도(SD)를 결정하였다. 평균 MW가 5000Da이고, 이당체 중량이 539(9개 이당체)이며, 알렉사플루오르 633에 대한 평균 분자량이 1200Da인 GM-1111에 있어서, SD는 14%, 또는 7개의 이당체 단위당 알렉사플루오르 633 변형 약 1회였다.

알렉사플루오르 633-GM-1111의 점적 주입에 의한 방광 코팅

마우스를 상기 상세히 기술된 바와 동일한 방식으로 마취한 다음, 카테터를 삽입하였다. 방광에 SAGE 알렉사플루오르 633 생체 접합체(10㎎/㎖)를 최대 방광 용량(150㎕)으로 45분 동안 점적 주입하였다. 이후, 방광내 SAGE를 투여한 즉시(t=0) 또는 투여 후 24시간 경과시(t=24) 방광을 수집하였다. 감광 조건 하에서 모든 조직을 가공한 후, 고정 및 절개하였다. 조직 절편들을 DAPi로 대비 염색하여 모든 세포내 핵들을 확인하였다. 유타 핵심 시설 대학교에서 FV1000 공초점 올림푸스 IX81 현미경 및 가변 발광 필터가 장착된 HeNe 레이저를 사용하여 형광 이미지화를 수행하였다.

조직의 수집 및 조직학적 평가

방광을 분리한 다음, 세로로 분할하였다. 방광의 절편 하나를 4% 파라포름알데히드 중에서 고정시킨 다음, 다른 하나는 조직 미엘로퍼옥시다제(MPO) 분석용으로 가공하였다. 해부 입체 현미경을 사용하여 이등분된 방광의 전체 이미지를, 모티캠(Moticam) 1000 디지털 카메라(캘리포니아주 리치몬드 소재, 모티캠 노스 아메리카(Moticam North America))로 촬영하였다. 방광내 염증의 변화를 평가하기 위하여, 조직을 여러 등급의 알코올로 가공하고 나서, 이를 파라핀에 포매시킨 다음, 5㎛ 절편으로 잘라낸 후, 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하였다. 방광 상피(요로 상피), 점막하층, 프로프리아층 및 평활근 층 내 염증 침윤물(다형핵 백혈구(PMN))의 존재 여부와 침윤 정도, 부종 및 출혈의 발생 여부와 정도, 그리고 표면의 요로 상피 변화, 예를 들어 미란, 궤양 및 미소 농양 형성의 존재 여부에 의해 방광염의 중증도를 평가하였다. 각각의 면들을 검사한 후 올림푸스 BX41 현미경(일본 도쿄 소재, 올림푸스 코포레이션(Olympus Corporation))으로 촬영하고 나서, 다시 이미징 플래닛(Imaging Planet) 1.4MPX 디지털 현미경 카메라(캘리포니아주 골레타 소재, 이미징 플래닛 리서치(Imaging Planet Research))로 촬영하였다.

조직 미엘로퍼옥시다제 분석법

조직 MPO 분석용 2등분한 방광을 액체 질소 중에서 플래쉬 동결시킨 다음, 이를 -80℃에 보관하여 두었다. 용해 완충제(200mM NaCl, 5mM EDTA, 10mM Tris, 10% 글리세린)(미주리주 세인트루이스 소재, 시그마(SIGMA)) 및 프로테아제 억제제 칵테일(일리노이주 록포드 소재, 서모 싸이언티픽(Thermo Scientific), Cat#78140)을 동결 조직 샘플(200㎕ 용해 완충제/10㎎ 동결 조직)에 첨가하였다. 그 다음, 마이크로시저로 조직을 잘게 부순 후, 소 용적 샘플 실험실용 조직-분쇄 균질화기(Tissue-Tearor Homogenizer)(오클라호마 바틀스빌 소재, 바이오스펙 프로덕츠(Biospec Products), 모델 #985-370)로 90초 동안 4℃에서 균질화하였다. 샘플을 각각 15분 동안 2회 원심 분리한 다음(1500g, 4℃), 상청액을 새로 마련한 멸균 튜브에 옮겨 넣었다. MPO 샌드위치 ELISA 키트(MPO Sandwich ELISA Kit)(매사추세츠주 캔톤 소재, 셀 싸이언시스(Cell Sciences), Cat #HK210)를 사용하여 방광 샘플 균질화물 중 MPO의 활성을 정량하였다. 요약하면, 샘플을 ELISA 키트 희석 완충제로 1:5로 희석하고 나서, 제조자의 권고 사항에 따라서 분석을 수행하였다. 표준물, 샘플 및 대조군을 각각 2개씩, 100㎕로 웰에 첨가하였다. 달리 지정되지 않는 한, 모든 항온 처리는 실온에서 1시간 동안 수행하였으며, 이후에는 세정을 수행하였다. 항온 처리 및 세정 절차 후 추적자와 스트렙타비딘-퍼옥시다제를 연속으로 첨가하였다. TMB 기질을 첨가하고 25분 동안 항온 처리하였다. 그 다음, 종결 용액을 첨가한 후, 미세 평판 판독기(캘리포니아주 써니베일 소재, 옵티맥스 튜너블(Optimax Tunable), 몰리큘러 디바이시스(Molecular Devices)) 내 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 샘플 평판을 대상으로 표준 곡선을 생성하고 나서, 선형 회귀 곡선을 생성하였다. 모든 값들은 평균 +/- SD로 표시하였다.

항응고제 특성 및 독성

GM-1111은 항-Xa 활성은 보이지 않았으며, 항-IIa 항응고제 활성은 < 0.2U/㎎이었는데, 이는 미분획화된 헤파린에 있어서 각각 150U/㎎이었다는 점과 비교된다. 헤파린과는 달리, 고도로 하전된 다음이온 중합체는 인자 XII, 즉 2차적으로 활성화되는 키닌의 활성화에 의한 고유 응고 캐스케이드의 강력한 유도제이다. GM-1111은, 심지어 P-셀렉틴 및 RAGE의 약리학적 억제를 달성하는데 요구되는 농도보다 10배 내지 100배 높은 농도에서 조차도 인자 XII의 활성화 테스트에 있어서 의료용 헤파린보다 더 안전한 것으로 보인다. GM-1111은 최적의 안전성과 광범위한 효능을 가지는 것으로 보인다.

표준 드레이즈 테스트(standard Draize test)에서, GM-1111은 배양된 섬유아세포 또는 상피 세포에 대해서는 독성을 보이지 않았으며, 피부 독성도 보이지 않았다. GM-1111을 래트에 1회 정맥 내 투약하고, 매일 정맥 내 주사(n = 성별 당 3마리 래트)하였을 때 GM-1111의 효과에 대한 예비 비-GLP 연구에 있어서, GM-1111은 100㎎/㎏만큼 높은 1회의 정확한 용량 및 7회의 매일 반복된 10㎎/㎏의 정맥 내 용량에 대한 임의의 용량 수준에서 독성의 징후를 나타내지 않았다. GM-1111에 대한 정맥 내 LD50은 > 100㎎/㎏이었다.

결과

LL-37 유도성 방광염

방광을 LL-37에 단 1회 노출시킨 후, 조직을 수집하여 12시간 및 24시간 경과시에 검사하였다. 12시간 경과시 시진을 수행한 결과, 방광에는 중간 정도의 염증이 발생하였는데, 이 염증은 홍반 및 출혈이 집중적으로 일정 부위에 발생하였음과 아울러, 전체적인 부종을 수반하는 것을 특징으로 하였다(도 3의 C). 24시간 경과 후, 방광에는 심각한 염증이 발생하는 것으로 확인되었는데, 이 염증은 전체적인 홍반 및 출혈이 발생하였음과 아울러, 상당한 조직 부종과 혈관 과증식을 수반하는 것을 특징으로 하였다(도 3의 D). 상기 두 시점에서 염수에 노출된 대조군 조직들은 완전히 정상이었는데, 이때 염증이 발생하였다는 증거는 관찰되지 않았다(도 3의 A 및 B).

이후, 12시간 및 24시간 경과시 조직 두개를 가공한 다음, H&E 염색을 사용하여 조직학적으로 평가하였다. 도 3의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 두 시점에서 예상되는 바와 같이 염수에 노출된 대조군에서는 염증이 관찰되지 않았다. 요로 상피, 점막하층, 프로프리아층 및 평활근층은 완전히 원래의 상태를 유지하였는데, 이때 PMN이나 림프구 침윤의 증거를 보이지 않았을 뿐만 아니라, 조직 부종도 나타나지 않았다. LL-37에 노출된지 12시간 경과 후 조직에 있어서(도 3의 C), 요로 상피 세포의 특정 부위에만 궤양이 발생하였으며, 점막하층과 프로프리아층에서는 중간 정도의 조직 부종이 관찰되었다. 뿐만 아니라, 요로 상피, 점막하층 및 프로프리아층(표면층 및 심층) 내에서는 중간 정도의 수만큼의 PMN이 관찰되었음과 아울러, 혈관으로부터 PMN 변연화가 이루어졌다. 12시간 경과 후 미소 농양(PMN 클러스터들)에 대한 증거은 관찰되지 않았다. 전체적인 관찰 결과와 조직학적 관찰 결과 둘 다로부터 얻어진 증거는, 중간 정도의 조직 염증 반응이 12시간 경과 후에 일어났음을 입증하였다. 이러한 관찰 결과들은 12시간 경과시 수집군 내 마우스 6마리 전부에서 지속적으로 관찰되었다.

24시간 경과시 수집군에 있어서, LL-37에 노출된 방광의 조직학적 평가를 수행한 결과 유사한 염증 반응을 보였으나, 염증의 정도는 더 심하였음이 분명하였다(도 4의 D). 점막하층 내에 존재하는 조직 부종의 정성량(qualitative amount)은 24시간 및 12시간 경과시의 조직 간에 유사하였으나, 프로프리아 층에서의 부종은 더 심하였다. 부가적으로, 24시간 경과시의 조직에는 요로 상피, 점막하층 및 프로프리아층(표면층 및 심층) 내에 PMN이 상당히 더 많이 존재하였다. 뿐만 아니라, 24시간 경과시 조직에는 미소 농양(PMN 클러스터) 발생 부위가 여러 개 존재하였으며, 또한 더 심한 염증 반응도 나타았다. 혈관으로부터의 PMN 변연화와 유사한 패턴이 상기 두 수집군에서 확인되었다. 24시간 수집군에 대한 전체 및 조직학적 관찰 결과 둘 다에 관한 증거는, LL-37에 1회 노출된 후 12시간 수집군의 염증 수준보다 높아 염증의 심각한 수준이 분명하였음을 입증하였다. 12시간 수집군과 유사하게, 12시간 수집군에서의 관찰 결과들은 24시간 수집군을 이루는 6마리의 마우스 전부에서 동일하게 관찰되었다.

염증 정도는 조직 MPO 분석법을 통하여 정량되었다. MPO는 골수 계통을 이루는 세포 전부에서 발현되는 당단백질로서, PMN의 아주르 친화성 과립 내에 풍부하게 존재한다. MPO는 감염 또는 염증 발생시 활성화된 PMN에 의해 방출되는 중요한 효소이므로, 염증에 대한 정량적 마커로서 이용된다. 이와 같이 12시간 수집군 조직과 비교한 결과들(도 5)은, 대조군 염수가 점적 주입된 방광(11ng/㎖)과 조작되지 않은/점적 주입되지 않은 대조군 방광(5ng/㎖)에 대한 최소한의 MPO 활성을 설명해주었다. 놀랍게도, LL-37에 노출된지 12시간 경과 후 조직들에서의 MPO 활성(229ng/㎖)은, 대조군 염수에 노출된 샘플에서의 MPO 활성(11ng/㎖)과 비교하였을 때 21배 증가하였다. 24시간 수집 조직을 추가로 평가한 결과(도 5), LL-37에 노출된 방광에서의 최소 MPO 활성(849ng/㎖)은 대조군 염수에 노출된 조직에서의 최소 MPO 활성(14ng/㎖)보다 61배 증가하였음을 알 수 있었다. MPO 데이터는 H&E 조직학적 분석 결과를 뒷받침해주었으며, 이 분석 결과와 일치하였다. 그러므로 12시간의 기간이 경과한 후에는 염증 수준이 중간 정도였고, 24시간 경과 후 염증 수준은 증가하였음이 확인되었다.

변형된 히알루로난에 의한 LL-37 유도성 방광염의 억제

황산화 다당체 용액 10㎎/㎖를 점적 주입함으로써 GM-1111이 LL-37 유도성 방광염을 예방 또는 완화하는 능력을 평가하였다. 2개의 군들을 관찰하였다. 제1군(후처리, n=4)은, 45분 동안 LL-37에 노출시킨 직후, GM-1111로 처리하는 것으로 이루어졌다(체류 시간 = 45분). 제2군(전처리, n=4)은, GM-1111로 처리한 후(체류 시간 = 45분), 45분 동안 LL-37에 노출시키는 것으로 이루어졌다. 제2군은 예비 코팅이 예방 효과를 나타내는지 여부에 대해 평가하는데 사용하였다. 상기 두군에서, 24시간 경과 후 마우스를 희생시킨 다음, 방광을 꺼내어, 이미지를 형성시킨 후, 가공 및 H&E 염색을 수행하였다.

제1군에 있어서, GM-1111로 후처리한 방광을 시진하였을 때, 이 방광은 홍반 및 혈관 과증식은 줄어들었으나, 방광은 여전히 부어있는 것이 확인되었다(도 6B). 조직학적 평가 결과, 놀랍게도 요로 상피와 점막하층에는 PMN이 전혀 없었으나, 점막하층 및 프로프리아층에는 부종이 생겼고, 이와 아울러 프로프리아층 전체에는 PMN이 눈에 띄게 감소하였음을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, 기존의 PMN은 프로프리아층 심부에 제한적으로 출현하였으며, 이와 같은 관찰 결과는 점진적 방식으로 보이는 반응과 일치하였다(도 6의 D). 뿐만 아니라, SAGE 처리된 방광에서는 미소 농양 형성에 관한 증거가 관찰되지 않았으며, 또한 소량의 PMN이 혈관으로부터 빠져나왔다. LL-37로 자극된 방광과 제1군 조직을 비교하는 조직 MPO 분석법을 통하여 염증을 정량화한 결과, GM-1111로 처리된 방광에 있어서 염증 반응은 2.5배 감소하였음이 확인되었다(도 3의 F - 청색 막대)(LL-37 처리 군, MPO 활성 849ng/㎖ vs. SAGE로 후처리된 제1군, MPO 활성 347ng/㎖).

제2군을 시진한 결과, SAGE로 전처리된 방광은 홍반과 혈관 과증식이 거의 사라졌으며, 부종도 미약하게만 남아있었음을 알 수 있었다(도 6의 A). 조직학적 평가 결과, 점막하층에는 약간의 부종이 남아있었지만, 프로프리아층에서는 부종의 증거를 살펴볼 수 없었다. 놀랍게도, 방광의 층들 전부에서는 PMN의 증거가 관찰되지 않았으며, 이와 아울러 혈관으로부터 빠져나오거나 변연화하는 PMN의 증거도 관찰되지 않았다(도 6의 C). 전체적으로, GM-1111로 전처리된 조직들은 비자극성 염수 대조군 조직과 거의 비슷하였다. 조직 MPO 분석법을 이용한 염증의 정량화 즉, LL-37 자극 방광과 제2군 조직을 비교하는 분석법을 수행한 결과, GM-1111로 전처리된 방광에 있어서 염증 반응은 22.3배 감소하였음이 확인되었다(도 6의 E)(LL-37 처리 군, MPO 활성 849ng/㎖ vs. GM-1111로 전처리된 제2군, MPO 활성 38ng/㎖). 조직학적 관찰 결과와 MPO 결과는 둘 다, GM-1111로 방광 조직을 전처리하는 것은 중요한 방어적 치료 수단으로서 사용될 수 있음을 암시하였다.

헤파린 처리된 방광은 차선의 항염증 결과를 보였다. 제1군(후처리군)을 시진한 결과, 부종, 혈관 과증식 및 출혈 모두가 명확하게 관찰되는 상당한 염증이 확인되었다(도 7의 B). 조직학적 관찰 결과들은 일치하였는데, 요로 상피 궤양, 점막하층 및 프로프리아층 부종, 모든 조직층 전체에 걸쳐 다량으로 존재하는 PMN, 그리고 혈관으로부터의 PMN 변연화가 확인되었다(도 7의 D). MPO 분석 결과(도 7의 F), 미처리 LL-37 접종 방광과 헤파린 후처리 조직 간 염증 활성에는 거의 차이를 보이지 않았음을 알 수 있었다(LL-37 처리 군, MPO 활성 849ng/㎖ vs. 헤파린으로 후처리된 제1군, MPO 활성 827ng/㎖). 제2군(전처리)을 시진한 결과, 제1군에서와 유사한 관찰 결과가 확인되었으며, 이 경우, 부종, 혈관 과증식 및 출혈 모두가 명확하게 관찰되는 심각한 염증이 발생하였다(도 7의 A). 조직학적 관찰 결과는 제1군의 관찰 결과도 반영하였는데, 이 경우 요로 상피 궤양, 점막하층 및 프로프리아층 부종, 모든 조직층 전체에 걸쳐 존재하는 PMN, 그리고 혈관으로부터의 PMN 변연화도 함께 관찰되었다(도 7의 C). MPO 분석 결과(도 7의 E), 미처리 LL-37 접종 방광과 헤파린 전처리 조직들 간 염증 활성에는 오로지 경미한 차이만이 확인되었다(LL-37 처리 군, MPO 활성 849ng/㎖ vs. 헤파린으로 전처리된 제2군, MPO 활성 759ng/㎖).

“방광 방호” 제제로서의 GM-1111

변형된 히알루로난의 조직 코팅과 침투 특성을 더 잘 설명하기 위해서, 형광 표지화된 알렉사플루오르 633-GM-1111의 10㎎/㎖ 용액을 점적 주입하였으며, 45분의 체류 시간으로 1회 점적 주입하고 나서 바로(t=0) 조직들을 수집하였으며, 24시간 경과시(t=24)에도 조직들을 수집하였다. 가공된 조직들을 또한 DAPi로 염색하여 세포 내 핵 전부를 동정하였다. 즉시 수집군에 대한 초기 결과들은, 요로 상피에 인접하여 존재하는 표면 비뇨기 GAG 층은 히알루로닌이 균일하게 코팅되었으며, 이와 아울러 점막하층, 프로프리아층 및 표면 평활근층에 히알루로난이 더 깊숙히 침투하였음이 확인되었다(도 8의 A 및 B). 뿐만 아니라, 내피 세포 내막 소동맥은, 이와 같은 혈관 구조의 기저면과 관강면 둘 다에 GM-1111이 유의적으로 코팅되었음을 보여주었다. 내피 내막 소정맥에서는 GM-1111이 코팅되었다는 증거는 관찰되지 않았다. 24시간 수집군에 대한 결과들은, 즉시 수집군 내에서 예전에 관찰되었던, 비뇨기 GAG 층을 따라서 GM-1111이 존재한다는 증거는 찾아볼 수 없었다. 중요한 점은, GM-1111이 소동맥의 기저면과 관강면 둘 다에 존재하는 내피 내막을 따라서, 그리고 점막하층의 특정 영역 내부에서 확실히 관찰되었다는 점이다(도 8의 C 및 D). 마지막으로, GM-1111은 여전히 방광 평활근의 랜덤 영역에 삽입되어 있는 것으로 가시화되었다. 이와 같은 결과들은, GM-1111에 1회 노출되면, 이 GM-1111은 24시간 경과 후 방광 내에 잔류하였음을 암시하는 것이었다.

II. 부분적 및 전체적으로 황산화된 히알루로난의 평가

염기 처리된 히알루로난으로부터 황산화 저분자량 히알루로난(LMW-HA)의 제조

a. 염기 처리된 LMW HA

HA(2g, 67kDa)를 100㎖들이 비이커 중 NaOH(40% w/v) 20㎖에 용해한 다음, 이 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 나서, 가닥 절단을 유도함으로써 HA를 부분적으로 해중합하였다. 생성된 점성의 액체를 이소프로판올 100㎖가 담겨 있는 400㎖들이 비이커에 옮겨 담은 후, 이를 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 중력에 따라서 여과하였으며(여과지), 미정제 생성물을 수집한 다음, 이를 증류수 250㎖ 중에 용해하고 나서, pH를 7.0으로 조정하였다. 상기 용액을 증류수에 대해서 24시간 동안 투석하였으며, 투석이 진행되는 동안 수조를 4회 바꾸어 주었고, 투석물을 동결 건조하여, 염기 처리된 HA 1.2g을 수득하였다. 본 생성물의 크기는 HPLC < GPC 또는 전기 영동에 의해 측정할 수 있었으며, 일반적으로 그 크기는 5kDa 내지 20kDa이었다.

b. 부분적으로 O-황산화된 염기 처리 LMW HA

LMW HA의 트리부틸아민(TBA) 염을 제조하기 위해서, TBA 0.2㎖를 증류수 20㎖ 중 염기 처리된 HA(0.2g)에 첨가하였다. 이 혼합물을 격렬하게 교반하고 동결 건조하였다. 생성된 염(LMW HA-TBA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 20㎖ 중에 용해하였으며, 여기에 필요 과량(6mol/HA 중 총 하이드록실기의 당량, 이당체당 4)의 피리딘-황 트리옥사이드 복합체(0.325g)를 첨가하였다. 40℃에서 3시간 경과 후, 반응물에 물 20㎖를 첨가하여 반응을 급랭시켰으며, 무수 아세트산나트륨으로 포화된 냉각 에탄올 30㎖를 첨가하여 미정제 물질을 침전시켰다. 미정제 황산화 생성물을 여과로 수집하고 나서, 이를 증류수(30㎖) 중에 용해한 다음, 100mM NaCl 용액에 대해 투석하고(용액을 6회 바꾸어줌), 다시 물에 대해 투석한 다음(물을 2회 바꾸어줌)(2일, 이때 용액은 하루에 4회 바꾸어줌), 동결 건조하였다. 생성물의 수율은 61%(0.22g)였다. ¹H NMR을 바탕으로 하였을 때, 치환도는 약 0.5 내지 1이었다. 원소 분석 결과 황의 함량은 4.13%였다. 평균 분자량은 GPC에 의해 6,100인 것으로 결정되었으며, 다분산도는 2.3이었다.

c. 전체적으로 O-황산화된 염기 처리 LMW HA

HA의 트리부틸아민(TBA) 염을 제조하기 위해서, TBA 0.2㎖를 증류수 20㎖ 중 염기 처리된 HA(0.2g)에 첨가하였다. 이 혼합물을 격렬하게 교반하고 동결 건조하였다. 생성된 염(LMW HA-TBA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 20㎖ 중에 용해하였으며, 여기에 필요 과량(16mol/HA 중 가용 하이드록시기의 당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 복합체(11.0g)를 첨가하였다. 40℃에서 3시간 경과 후, 반응물에 물 20㎖를 첨가하여 반응을 급랭시켰으며, 무수 아세트산나트륨으로 포화된 냉각 에탄올 30㎖를 첨가하여 미정제 생성물을 침전시켰다. 황산화 생성물을 여과로 수집하고 나서, 이를 증류수(30㎖) 중에 용해한 다음, 100mM NaCl 용액에 대해 투석하고(용액을 6회 바꾸어줌), 다시 물에 대해 투석한 다음(물을 2회 바꾸어줌)(2일, 이때, 용액은 하루에 4회 바꾸어줌), 동결 건조하여, 생성물 0.26g(수율 60%)을 생성하였다. 생성물은 1H NMR에 의해 특성 규명하였으며, 대략적인 치환도는 약 3.5였다. 원소 분석 결과 황의 함량은 13.22%였다. 평균 분자량은 GPC에 의해 5,900인 것으로 결정되었으며, 다분산도는 2.2였다.

산 처리된 히알루로난으로부터 황산화 저분자량 히알루로난(LMW-HA)의 제조

a. 전체적으로 O-황산화된 저 MW HA(F-OSHA(1)-10,000)

HA의 트리부틸아민(TBA) 염을 제조하기 위해서, TBA 0.2㎖를 증류수 20㎖ 중 HA(0.2g, 약 10,000Da, 1.3MDa HA로부터 분해)에 첨가하였다. 이 혼합물을 격렬하게 혼합하고 동결 건조하였다. 생성된 염(HA-TBA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 20㎖ 중에 용해하였으며, 여기에 필요 과량(6mol/HA 중 가용 하이드록실기의 당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 복합체(0.325g)를 첨가하였다. 40℃에서 3시간 경과 후, 반응물에 물 20㎖를 첨가하여 반응을 급랭시켰으며, 무수 아세트산나트륨으로 포화된 냉각 에탄올 30㎖를 첨가하여 미정제 물질을 침전시켰다. 황산화 생성물을 여과로 수집하고 나서, 이를 증류수(30㎖) 중에 용해한 다음, 100mM NaCl 용액에 대해 투석하고(용액을 6회 바꾸어줌), 다시 물에 대해 투석한 다음(물을 2회 바꾸어줌)(2일, 이때, 용액은 하루에 4회 바꾸어줌), 동결 건조하여, 생성물 0.19g(수율 58%)을 생성하였다. 원소 분석 결과 황의 함량은 12.62%였는데, 이는 황산화도가 3.0 내지 3.5임을 암시하는 것이다. 분자량은 3,000Da 미만이었는데, 이는 황산화 및 정밀 분석 중 산 해중합이 일어났음을 암시하는 것이다.

b. 전체적으로 O-황산화된 저 MW HA(F-OSHA(2)-10,000)

HA의 트리부틸아민(TBA) 염을 제조하기 위해서, TBA 0.2㎖를 증류수 20㎖ 중 산 변형 10,000MW HA(0.2g)에 첨가하였다. 이 혼합물을 격렬하게 혼합하고 동결 건조하였다. 생성된 염(HA-TBA)을 DMF 20㎖ 중에 용해하였으며, 여기에 필요 과량(16mol/HA 중 가용 하이드록실기의 당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 복합체(1.1g)를 첨가하였다. 40℃에서 3시간 경과 후, 반응물에 물 20㎖를 첨가하여 반응을 급랭시켰으며, 무수 아세트산나트륨으로 포화된 냉각 에탄올 30㎖를 첨가하여 미정제 물질을 침전시켰다. 황산화 생성물을 여과로 수집하고 나서, 이를 증류수(30㎖) 중에 용해한 다음, 100mM NaCl 용액에 대해 투석하고(용액을 6회 바꾸어줌), 다시 물에 대해 투석한 후(물을 2회 바꾸어줌)(2일, 이때, 용액은 하루에 4회 바꾸어줌), 동결 건조하여, 생성물 0.23g(수율 62%)을 생성하였다. 생성물은 ¹H NMR에 의해 특성 규명하였으며, 치환도는 3.0 내지 3.5였다. 원소 분석 결과 황의 함량은 12.10%였다. 분자량은 3,000Da 미만이었다.

c. 전체적으로 O-황산화된 저 MW HA(큐피(Kewpie) 히알로-올리고-Pyr.SO ₃ )

큐피 히알로-올리고 HA(200㎎, 0.5mmol, 8.4kDa)를 DMF 10㎖ 중에 용해하였다. TBA(1당량, 0.5mmol, 0.12㎖)를 교반하면서 첨가한 후, 10분 더 교반하였다. 필요 과량(6mol/HA 중 가용 하이드록실기의 당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 복합체(24당량, 12mmol, 1.916g)를 첨가하였다. 40℃에서 3시간 교반한 후, 반응물에 물 15㎖를 첨가하여 반응을 급랭시켰으며, 여기에 무수 아세트산나트륨으로 포화된 냉각 에탄올 25㎖를 첨가하여 미정제 물질을 침전시켰다. 황산화 생성물을 여과로 수집하고 나서, 이를 증류수(25㎖) 중에 용해한 다음, 100mM NaCl 용액에 대해 투석하고(용액을 6회 바꾸어줌), 다시 물에 대해 투석한 다음(물을 2회 바꾸어줌)(2일, 이때, 용액은 하루에 4회 바꾸어줌), 동결 건조하여, 생성물 0.175g(수율 51%)을 생성하였다. 생성물은 ¹H NMR에 의해 특성 규명하였으며, 치환도는 3.5 초과이었다. 평균 분자량은 GPC에 의해 6,800Da인 것으로 결정되었으며, 이의 다분산도는 1.88이었다.

d. 전체적으로 O-황산화된 저 MW HA(노보자임-Pyr.SO ₃ )

11kDa으로 분해된 노보자임 HA(200㎎, 0.5mmol)을 DMF 10㎖ 중에 용해하였다. TBA(1당량, 0.5mmol, 0.12㎖)를 교반하면서 첨가한 다음, 이 혼합물을 10분 더 교반하였다. 그 다음, 필요 과량(6mol/HA 중 가용 하이드록실기의 당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 복합체(24당량, 12mmol, 1.916g)를 첨가하였다. 40℃에서 3시간 교반한 후, 반응물에 물 15㎖를 첨가하여 반응을 급랭시켰으며, 무수 아세트산나트륨으로 포화된 냉각 에탄올 25㎖를 첨가하여 미정제 물질을 침전시켰다. 황산화 생성물을 여과로 수집하고 나서, 이를 증류수(25㎖) 중에 용해한 다음, 100mM NaCl 용액에 대해 투석하고(용액을 6회 바꾸어줌), 다시 물에 대해 투석한 다음(물을 2회 바꾸어줌)(2일, 이때, 용액은 하루에 4회 바꾸어줌), 동결 건조하여, 생성물 0.194g(수율 57%)을 생성하였다. 생성물은 ¹H NMR에 의해 특성 규명하였으며, 치환도는 약 3.0 내지 3.5였다. 평균 분자량은 GPC에 의해 8,100Da인 것으로 결정되었으며, 이의 다분산도는 2.00이었다.

e. 부분적으로 O-황산화된 저 MW HA(노보자임-Pyr.SO ₃ )

11kDa으로 분해된 노보자임 HA(400㎎, 1.0mmol)을 DMF 25㎖ 중에 용해하였다. TBA(1당량, 1.0mmol, 0.24㎖)를 교반하면서 첨가한 다음, 이 혼합물을 10분 더 교반하였다. 그 다음, 필요 과량(3mol/HA 중 가용 하이드록실기의 당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 복합체(12당량, 12mmol, 1.908g)를 첨가하였다. 40℃에서 3시간 교반한 후, 반응물에 물 30㎖를 첨가하여 반응을 급랭시켰으며, 무수 아세트산나트륨으로 포화된 냉각 에탄올 50㎖를 첨가하여 미정제 물질을 침전시킨 후 여과로 수집하였다. 부분적으로 O-황산화된 미정제 HA를 증류수(40㎖) 중에 용해한 다음, 100mM NaCl 용액에 대해 투석하고(용액을 6회 바꾸어줌), 다시 물에 대해 투석한 다음(물을 2회 바꾸어줌)(2일, 이때, 용액은 하루에 4회 바꾸어줌), 동결 건조하여, 생성물 0.386g(수율 56%)을 생성하였다. 생성물을 ¹H NMR에 의해 특성 규명하였으며, 치환도는 2.0이었다. 평균 분자량은 GPC에 의해 9,500Da인 것으로 결정되었으며, 이의 다분산도는 1.77이었다.

f. 전체적으로 O-황산화된 저 MW HA(노보자임-DMF.SO ₃ )

11kDa으로 분해된 노보자임 HA(200㎎, 0.5mmol)를 DMF 10㎖ 중에 용해하였다. TBA(1당량, 0.5mmol, 0.12㎖)를 교반하면서 첨가한 다음, 이 혼합물을 10분 더 교반하였다. 그 다음, 필요 과량(6mol/HA 중 가용 하이드록실기의 당량)의 DMF-황 트리옥사이드 복합체(24당량, 12mmol, 1.836g)를 첨가하였다. 30℃에서 3시간 교반한 후, 반응물에 물 15㎖를 첨가하여 반응을 급랭시켰으며, 무수 아세트산나트륨으로 포화된 냉각 에탄올 25㎖를 첨가하여 미정제 물질을 침전시킨 다음, 여과로 수집하였다. 전체 O-황산화 미정제 HA를 증류수(25㎖) 중에 용해한 다음, 100mM NaCl 용액에 대해 투석하고(용액을 6회 바꾸어줌), 다시 물에 대해 투석한 다음(물을 2회 바꾸어줌)(2일, 이때, 용액은 하루에 4회 바꾸어줌), 동결 건조하여, 생성물 0.057g(수율 17%)을 생성하였다. 생성물은 ¹H NMR에 의해 특성 규명하였으며, 치환도는 약 3.0 내지 3.5였다. 평균 분자량은 GPC에 의해 측정하였으며(1,900Da), 이의 다분산도는 2.48이었다.

도 3a는, (A) FOS HA (2) 10kDa, (B) FOS HA (1) 10kDa, (C) FOS BHA, 및 (D) POS BHA의 비변형 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(PAGE) 분석 결과를 나타낸다. 각각의 샘플 10㎍을 비변형 조건 하에 1.5시간 동안 125V에서 전개하여 노벡스(Novex)^? 트리스-글리신 18% 겔(캘리포니아주 칼스배드 소재, 인비트로겐) 상에서 분리하였다. 도 3b는, (E) 피리딘-황 트리옥사이드 복합체를 사용하는 큐피 히알로 올리고 HA로부터 제조된 FOS HA의 비변형 PAGE 분석 결과, (F) 피리딘-황 트리옥사이드 복합체를 사용하는 노보자임 HA로부터 제조된 FOS HA의 비변형 PAGE 분석 결과, (G) 피리딘-황 트리옥사이드 복합체 사용하는 노보자임 HA로부터 제조된 POS HA의 비변형 PAGE 분석 결과, 그리고 (H) 황 트리옥사이드 N,N-디메틸포름아미드 복합체로 제조된 FOS HA 10kDa의 비변형 PAGE 분석 결과를 나타낸다. 각각의 샘플 15㎍을 비변형 조건 하에서 75분 동안 125V에서 전개하여 20% 아크릴아미드 ID스마트 겔(IDSmart Gel)(플로리다주 보카 레이톤 소재, 보카 싸이언티픽(Boca Scientific)) 상에서 분리하였다. 겔을 0.08% 아주르 A 수용액 중에서 염색하였다.

g. 전체적으로 O-황산화된 저 MW HA(GM-0111)

HA(950kDa HA로부터 분해된 5.4kDa 5.0g, 노보자임)를 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 400㎖ 중에 현탁한 다음, 여기에 트리부틸아민(TBA) 3.0㎖(1당량)를 첨가하였다. 이 용액을 5분 동안 교반하였다. 피리딘-황 트리옥사이드 복합체(24당량, 48.4g)를 6부 첨가한 다음, 이 혼합물을 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물에 물 100㎖를 첨가하여 반응을 급랭하고 나서, 무수 아세트산나트륨으로 포화된 냉각 에탄올 500㎖를 첨가하여 미정제 물질을 침전시켰다. 황산화된 생성물을 여과에 의해 수집하고 나서, 이를 증류수(650㎖) 중에 용해한 다음, 100mM NaCl 용액에 대해 투석하고(용액을 6회 바꾸어줌), 다시 물에 대해 투석한 다음(물을 2회 바꾸어줌)(2일, 이때, 용액은 하루에 4회 바꾸어줌), 동결 건조하여, 생성물 4.6g(수율 51%)을 생성하였다. 원소 분석 결과 황의 함량은 13.5%였는데, 이는 황산화도가 3.0SD 내지 3.5SD임을 암시하는 것이다. 분자량은 겔 투과 크로마토그래피에 의해 5.1kDa인 것으로 결정되었으며, 다분산도는 1.9였다.

항응고 특성 및 독성

GM-0111이 C57BL/6J 마우스에 1회 볼루스로서 투여량 2,000㎎/㎏만큼 경구 투여되었을 때, GM-0111은 관용성이 매우 우수하여 어떠한 독성의 징후들도 보이지 않았다. 뿐만 아니라, 해부학적 관찰 결과는, GM-0111 경구 투여후 24시간 경과시에는 임의의 이상 현상이 나타났음을 암시하지 않았다.

시험관 내 연구

a. 사람 백혈구 엘라스타제(HLE) 억제 분석법

황산화된 HA가 백혈구 엘라스타제에 비치는 억제 효과를 관찰하기 위하여, 7.5㎍/㎖ HLE 100㎕를 0.001㎍/㎖ 내지 100㎍/㎖의 농도 범위로 황산화된 HA 100㎕와 함께 항온 처리하였다. 이 혼합물을 25℃에서 10분 동안 항온 처리하고 나서, 여기에 HLE 기질 suc-Ala-Ala-Val-pNA(1.5mM) 50㎕를 첨가하였다. 활성 HLE는 상기 기질을 절단하여 발색 pNA를 생산하였는데, 추후 이를 대상으로 동력학적 판독 결과 이용하여 405㎚에서의 흡광도 변화를 측정하였다. Vmax(흡수 속도) 대 황산화 HA 농도에 관한 4-매개 변수 로지스틱 비선형 회귀 등식을 이용하여 IC₅₀ 값을 구하였다(표 1).

시험관 내 연구는, GM-0111이 사람의 백혈구 엘라스타제를 억제하였음을 보여 주었다(IC50 = 430ng/㎖). GM-0111-03은 RAGE가 자체의 리간드에 결합하는 것을 억제하였다(CML-BSA에 대한 IC₅₀ = 36ng/㎖, S-100 단백질에 대한 IC₅₀ = 60ng/㎖, 그리고 HMGB1에 대한 IC₅₀ = 91ng/㎖).

b. CML-BSA/RAGE 복합체 억제 분석법

폴리염화비닐 평판을 CML-BSA 5㎍/㎖ 100㎕로 코팅함으로써 CML-BSA 및 RAGE 복합체 억제 분석법을 준비하였다. 별도로, PBST-0.1% BSA 중 RAGE-Fc 키메라 용액 1㎍/㎖를, 연속으로 희석된 동 용적 황산화 저 분자량 히알루로난과 HA 올리고당(농도 = 0.0005㎍/㎖ 내지 100㎍/㎖)과 함께 밤새 4℃에서 항온 처리하였다. 다음 날, RAGE-황산화 HA 믹스 50㎕를 각각의 리간드 코팅된 웰에 옮기고 나서, 이를 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 그 다음, 웰을 PBST로 4회 세정하였다. 결합된 RAGE를 검출하기 위하여, 항 RAGE 항체 0.5㎍/㎖ 50㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 상기 평판을 실온에서 1시간 동안 항온 처리한 후, 웰을 다시 PBST로 4회 세정하였다. HRP 접합된 2차 항체(웰당 50㎕)를 첨가한 후, 이 웰을 실온에서 1시간 동안 항온 처리하고 나서, PBST로 4회 세정하였다. TMB 100㎕를 첨가하여 비색 반응을 개시하였으며, 다시 1N HCl 50㎕를 첨가하여 비색 반응을 종결하였다. 450㎚에서의 흡광도를 사용하여 황산화 HA 농도 및 4-매개 변수 로지스틱 비선형 회귀 등식을 이용하여 얻어진 IC50 값(표 2)에 대한 그래프를 작성하였다.

c. 피리디늄 부가물의 특성 규명

피리딘-황 트리옥사이드 복합체를 사용하여 제조된 황산화 HA 샘플의 피리디늄 함량을 UV 흡광도를 통해 분석하였다. 브롬화 1-부틸피리디늄(미주리주 세인트루이스 소재, 시그마)을 사용하여 표준 곡선을 작성하였으며, 표준 곡선에 속하는 UV 측정치에 대하여 필요에 따라 황산화 HA 샘플을 2㎎/㎖에서 0.025㎎/㎖로 희석하였다. 수정 큐베트 내 255㎚에서의 흡광도 값을 표준 물질 및 샘플에 대해 기록하였다. 표준 곡선으로부터 피리디늄의 중량% 값을 각각의 샘플에 대해 산정하였는데, 그 값은 표 3에 제시하였다. FOSHA-큐피-Pyr.SO₃의 피리디늄 부가물도 ¹³C NMR 분광 분석법에 의해 특성 규명하고, 그 값을 공표된 데이터와 비교하였다(Hintze V, Moeller S, Schnabelrauch M, Beirbaum S, Viola M, Worch H, Scharnweber D. “Modifications of Hyaluronan Influence the Interaction with Human Bone Morphogenetic Protein-4 (hBMP-4)” Biomacromolecules 10:3290-3297, 2009). ¹³C NMR 데이터를 표 4에 제시하였다. 마지막으로, 도 5는 FOSHA-큐피-Pyr.SO3의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 이를 통하여 8.00ppm과 9.10ppm 사이의 피크 3개는 피리디늄 부가물의 피리디늄 양성자를 나타내는 것임이 파악되었다.

생체 내 연구

a. 마우스 방광염 모델

마우스 방광은 다양한 염증 유도 물질, 예를 들어 LL-37(카텔리시딘 펩티드)에 감수성이며, 또한 염증 질환, 예를 들어 방광염에서 잠재적 치료제를 연구하기 위한 동물 모델로서 우수한 것으로 각광받고 있다. 황산화 HA의 항염증 효과를 연구하기 위해, 쥣과 동물 방광염 모델에서 FOSHA 유도체의 보호 효과를 측정하였다. 우선, C57/BL6 성체 암컷 마우스를 마취시켜, 요로를 통해 방광에 카테터를 삽입하였다. 방광에 0.9% 멸균 염수를 주입 및 배수하여 방광을 세정하였다. 이후, 방광에 염수 150㎕, FOSHA(큐피) 10㎎/㎖ 또는 FOSHA(노보자임) 10㎎/㎖로 1시간 동안 예비 점적 주입하였다. 그 다음, 방광을 비운 다음, 여기에 320μM의 LL-37 150㎕를 1시간 더 점적 주입하였다. 모든 동물들은 합병증 없이 완전히 회복되었다. 상기 절차를 마친 후 24시간 경과시 방광을 분리해낸 다음, 사진 촬영을 하고, 다시 MPO 분석용으로 동결시켰다.

b. 미엘로퍼옥시다제(MPO) 분석법

염증 유발 물질에 대한 주요 세포 반응은 다양한 면역 세포를 표적 위치에 보충하는, 손상된 세포 유래 다양한 시토킨을 분비하는 것이다. MPO는 다형핵 세포(염증의 초기 단계에 염증 발생 위치에 보충되는 주요 세포임)에 풍부하게 발현되는 퍼옥시다제 효소이므로, MPO는 염증의 정도를 정량 측정하기 위한 우수한 마커이다. 전체적으로 황산화된 HA의 쥣과 동물 방광염 모델 내 항염증 효과를 분석하기 위하여, 황산화 HA로 전처리된 방광 내 발현된 MPO의 양을 측정하고, 이를 미처리 방광 및 염수 대조군 처리 방광 내 발현된 MPO의 수준과 비교하였다. 방광의 중량을 측정한 다음, 균질화하였다. 균질화된 샘플을 5,000rpm에서 원심 분리하여, 조직 파편으로부터 가용성 분획을 분리하였으며, 마우스 MPO ELISA 키트(HK210, 네덜란드 소재, 하이컬트 바이오테크(Hycult biotech))를 사용하여 조직 균질화물 중 MPO의 농도(ng/㎎)를 측정하였고, 이를 염수가 점적 주입된 대조군(염증이 발생하지 않은 정상 방광)과의 차이%(percent difference)로 표시하였다. 결과를 도 2에 제공하였다.

황산화 HA를 전처리하면 점적 주입된 LL-37에 의해 조직 MPO 농도가 감소하는지 여부를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 일원 분산 분석법(one-way ANOVA)을 이용하고 나서, 다시 터키-크래머 다중 비교(Turkey-Kramer multiple comparison) 테스트(그래프패드 인스탯(GraphPad InStat) 소프트웨어(버전 3.1, 그래프패드 소프트웨어 인코포레이션))를 수행하여 통계학적 분석을 수행하였다. 통계학적 유의도는 p<0.0으로 설정하였다.

c. 결론

시험관 내 연구로부터 얻어진 결과들은, RAGE 길항제 활성에 관한 황산화도의 중요성을 입증하는 것이다(표 2). 부분적 황산화(황 = 6% 미만) 결과, RAGE 길항제의 효능은 훨씬 약했다. 황산화 HA 화합물(MW = 2,000Da 미만)은 또한 시험관 내 분석법에 있어서 효능이 감소하였다. 전체적으로 황산화된 HA 화합물, 예를 들어 피리디늄 부가물을 1%w/w 과량으로 보유하는 화합물은, 방광염 마우스 모델에 있어서 염증을 감소시키는 생체 내 효능이 우수하였다.

GM-0111을 사용하는 예비 점적 주입 실험

LL-37로 유도된 쥣과 동물 방광염 모델 내에서 GM-0111의 치료 효과를 연구하기 위해서 추가 실험을 실시하였다. 각각의 동물을 이소플루란으로 마취시키고, 요도 구멍을 통해 방광으로 가요성 카테터를 삽입하였다(실라스틱 실험실 튜브, 0.30㎜ i.d.×0.64㎜ o.d., 미시건주 소재, 다우 코닝. 실험 동물의 복부를 가만히 눌러서 소변을 빼냈다. 방광에 내독소 불포함 멸균 포스페이트 완충 염수(PBS, 오하이오주 소재, 암레스코(Amresco)) 150㎕를 점적 주입 및 배수함으로써 방광을 세정하였다. 그 다음, 속이 빈 방광을 PBS 150㎕ 또는 다양한 농도의 GM-0111(1㎎/㎖, 5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 30㎎/㎖ 및 100㎎/㎖)(PBS 중에 용해됨)로 채웠다. GM-0111과 방광의 접촉을 늘리기 위해서, 방광을 배수시킨 다음, PBS 또는 GM-0111로 다시 점적 주입하였다. GM-0111을 점적 주입하고 나서 1시간 경과시, 방광을 배수시키고, 동일 용적의 LL-37(250μM)을 점적 주입하여 방광염을 유도하였다. LL-37 점적 주입도 GM-0111 점적 주입에 따라서 반복 수행하였다. 초기 LL-37 점적 주입 후 1시간 경과시, 카테터를 분리하고, 동물을 회복시켰다. 방광에 대한 손상을 최소화하고 방광 요관 역류를 감소시키기 위해서, 용액을 2㎕/초(또는 10㎕/5초)의 유속으로 점적 주입하였다. 또한, 용해된 모든 물질들을 멸균 여과하여 본 방법을 수행하는 중에 일어날 수 있는 미생물에 의한 오염을 최소화하였다.

해부 및 해부 스코어

LL-37을 점적 주입한 후 24시간 경과시, 이소플루란으로 동물을 깊이 마취시키고 해부하였다. 후대정맥을 통해 전혈을 수집하고, 동물의 피를 전부 뽑아낸 후, 방광을 수집하였다. 혈액을 마이크로벳 튜브(독일, 사르슈테트(Sarstedt))로 옮기고 나서 혈청을 수집하였다. 수집된 방광의 중량을 측정한 후, 가로로 2등분하였다. 그 다음, 2등분된 방광을 (혈청 샘플과 마찬가지로) -20℃에 보관하거나(생화학적 분석용), 또는 4% 포르말린 중에 보관하여 두었다(조직학적 평가용).

해부시 충혈 여부(0: 충혈되지 않음, 1: 충혈이 일어남)와 부종 정도(0: 부종이 일어나지 않음, 1: 경미한 정도의 부종이 일어남, 2: 중간 정도의 부종이 일어남, 3: 눈에 띌 정도의 부종이 일어남)에 대해 스코어를 매겨 방광염의 중증도를 분석하였다. 충혈 및 부종의 스코어의 총 합을 통계학적 분석용 해부 스코어로 사용하였다.

생화학적 분석

유도성 방광염에 의해 체내 전신 반응을 분석하고, GM-0111의 보호 효과를 연구하기 위해서, 혈청 아밀로이드 P(SAP)의 농도를 ELISA 키트(오리건주 소재, ICL 레보레토리즈(ICL Laboratories))를 사용하여 측정하였다. 국부 조직 내 염증의 중증도를 분석하기 위해서, 방광을, 프로테아제 억제제(일리노이주 소재, 서모 싸이언티픽, 홀트 프로테아제 인히비터 칵테일(Halt Protease Inhibitor Cocktail))가 보충된 용해 완충액(200mM NaCl, 10mM Tris, 10% 글리세린) 중에서 균질화하였다. 플루오로 MPO™ 키트(Fluoro MPO™ kit)(캘리포니아주 소재, 셀 테크놀로지(Cell Technology))를 사용하여 미엘로퍼옥시다제의 조직 활성을 측정하고, ELISA(캘리포니아주 소재, 바이오레전드(BioLegend) 및 미네소타 소재, R&D 시스템즈)를 사용하여 IL-6 및 PTX-3의 조직내 농도를 측정하였다.

조직학적 평가

포르말린 고정된 조직을 파라핀에 포매시키고, 이를 두께 4㎛로 절단하고 나서, 헤마톡실린 및 에오신(매사추세츠주 소재, 찰스 리버 레보레토리즈, 히스톨로지 서비시즈(Histology Services))으로 염색하였다. 각각의 샘플에 있어서 부종, 다형핵 호중구(PMN) 침윤 및 각각의 슬라이드 내 요로 상피 세포의 미란 발생 여부와 정도를 평가함으로써 염증의 중증도를 이하 기준에 따라서 평가 및 정량하였다(표 5).

통계학적 분석

다양한 측정치로부터 구한 모든 데이터를 각각 확인하였다. GM-0111이 예비 점적 주입되면 PBS 처리시 관찰된 데이터와 비교하였을 때 유의적으로 상이한 변화가 관찰되는지 여부를 비교하기 위해서, 분산 테스트 분석을 수행한 후 더넷(Dunnett)의 t-테스트를 수행하였다. 크러스칼-월리스 랭크 총합 테스트(Kruskal-Wallis rank sum test)로 해부 및 조직학적 스코어를 평가한 다음, kwmc(다중 비교) 테스트(R 2.14.0을 이용하는 피거메스(pgirmess) 라이브러리를 사용함)를 수행하였다. 또한, 미처리 정상 동물로부터 구하여진 데이터들을 비교함으로써, GM-0111이 예비 점적 주입되면 방광에서 염증 변화가 못 일어나도록 보호하는지 여부를 분석한 데이터를 이용하여 테스트를 반복 수행하였다.

결과

GM-0111이 예비 점적 주입되면 방광에서 방광염이 발생되는 것이 억제됨.

LL-37 유도성 방광염 모델에 대한 GM-0111의 보호 효과를 분석하기 위해서, 1시간 동안 방광에 GM-0111을 점적 주입한 후, 다시 1시간 동안 LL-37을 점적 주입함으로써 방광을 다양한 농도의 GM-0111로 코팅하였다. LL-37의 점적 주입 후 24시간 경과시, 동물을 희생시켜 해부를 실시하였으며, 이때, 방광을 생화학적 평가 및 조직학적 평가용으로 수집하였다.

해부하는 동안, 육안 해부학적 변화를 관찰하고 방광의 중량을 측정함으로써 각각의 동물에서 염증의 중증도를 확인하였다. GM-0111을 방광에 예비 점적 주입하면, LL-37에 의해 방광염이 유도되어 발생하였다는 징후가 감소되는 것이 관찰되었다. GM-0111이 예비 점적 주입된 동물의 체중 증가량은 PBS로 처리된 동물의 체중 중가량에 비하여 유의적으로 컸다(도 9a). 자극된 조직 내 체액과 콜로이드성 단백질이 증가함에 따라서 부종이 일어난 방광의 중량은 증가하였다. GM-0111이 예비 점적 주입되면 방광 중량이 상당히 감소되는 것이 관찰되었는데(도 9b), 이는 LL-37로 유도된 염증 변화가 감소하였음을 암시하는 것이다.

LL-37(250μM)이 방광에 점적 주입되면 염증에 변화가 발생되었는데, 그 특징으로서는 다형핵 호중구(PMN)의 점막하층으로의 침윤, 혈관 신생의 증가, 출혈, 방광의 모든 층 전체에 걸쳐 광범위하게 발생한 부종, 그리고 요로 상피가 얇아지는 현상 및 미란을 포함한다(도 10e vs. 도 10f). 체액 및 혈관 신생이 증가하게 되면, 방광은 통상적인 외관을 가졌지만, 충혈이 되었고, 또한 크기도 커졌다(도 10a vs. 도 10b). 시진 결과를 더 자세히 평가하기 위해서, GM-0111이 예비 점적 주입된 방광의 조직학적 변화를 관찰하였다. GM-0111을 예비 점적 주입하면, 염증 징후의 중증도를 상당히 감소시켰는데, 이 경우 상기 염증 징후는 투여량 5㎎/㎖만큼이 투여되었을 때 용이하게 관찰할 수 있는 것으로서, 부종의 정도와 PMN 수가 감소함과 아울러 GM-0111이 예비 점적 주입된 방광의 요로 상피 층은, PBS가 예비 점적 주입된 방광의 비변형 요로 상피 층과 비교하였을 때 원래 상태와 가깝다는 것으로부터 확인되었다(도 10b vs. 도 10c 및 도 10d). GM-0111이 10㎎/㎖에서 그 이상의 농도로 예비 점적 주입된 방광의 조직학적 외관은 미처리 정상 방광의 조직학적 외관과 가깝거나 유사하였다(도 10e vs. 도 10g 및 도 10h).

방광 내 LL-37 매개성 염증 변화를 감소시키고, 동물의 전체적인 건강 상태를 개선함에 있어서 GM-0111의 기작을 연구하기 위해서, 방광 및 혈청 중 다양한 생화학적 마커의 변화를 관찰하였다. 우선, 미엘로퍼옥시다제(MPO)의 조직 활성을 분석하였다. MPO의 주요 공급원은, 주로 염증이 발생하는 중 병원체를 제거하는데 사용되는 호중구 과립형 백혈구이다. PBS가 예비 점적 주입된 방광 내 MPO의 평균 조직 활성은, 미처리 정상 동물 유래 조직 내 MPO의 평균 조직 활성보다 114배 컸다(도 11b). GM-0111을 예비 점적 주입하면, 심지어 1㎎/㎖의 농도로 점적 주입하였을 때 조차도 MPO의 조직 활성은 상당히 감소하였다(도 11b). 그 다음, 본 발명자들은 염증 자극이 있을 때 다양한 세포에 의해 방출되는 주요 전염증성 시토킨들 중 하나인 IL-6의 조직 내 농도를 측정하였다. PBS가 예비 점적 주입된 방광 내 IL-6의 농도는 정상 방광 내 IL-6의 농도보다 약 70배 높았다(도 11c). GM-0111을 예비 점적 주입하면, 조직 내 IL-6의 농도는 GM-0111이 1.0㎎/㎖의 농도로 존재할 때 조차도 정상 방광 내 IL-6의 농도와 비슷하게도 뚜렷이 감소하였다. 본 발명자들은 또한 LL-37로 염증 자극될 때 변하는 독립적 조직 마커를 찾았다. PTX3는 다양한 염증 자극들이 가하여졌을 때 조직 내 또는 혈청 중에 증가하는, 길이가 긴 펜트락신군의 신규 일원이다. MPO 및 IL-6 측정법으로부터 구하여진 데이터와 부합하게도, PTX3의 조직 내 농도는 미검출 수준으로부터 PBS로 예비 점적 주입된 조직 1㎎당 1.1ng까지 눈에 띄게 증가하였다(도 11d). 이러한 증가폭은 GM-0111이 1㎎/㎖로 예비 점적 주입될 때 조차도 상당히 감소하였으며, 다수의 요소들은 GM-0111이 10㎎/㎖ 및 이 이상의 농도로 예비 점적 주입된 조직 내 검출 수준(조직 1㎖당 2pg 미만) 미만으로 유지되었다. 이와 같은 데이터는, LL-37 유도성 방광염에 대한 GM-0111의 보호 효과는 상당하였으며, GM-0111을 1㎎/㎖의 농도로 예비 점적 주입하였을 때에도 얻어질 수 있었음을 암시하는 것이다.

혈중에 존재할 수 있는 생체 마커를 분석하여, 모델 내 방광염의 진행 정도를 모니터하였다. 혈청 아밀로이드 P(SAP)는 길이가 짧은 펜트락신으로서, 포유 동물의 간에 의해 생산 및 분비되는 C-반응성 단백질(CRP)과 유사하다. SAP는 설치류 내 전염증성 시토킨 IL-6의 수준이 상승함에 따라서 뚜렷이 증가하는 것으로 알려져 있다. LL-37에 의해 IL-6의 조직 내 농도가 증가하면, SAP의 혈청 중 농도도 증가하는지 여부를 테스트하였으며, GM-0111이 예비 점적 주입되면 SAP의 농도에 영향을 미치는지 여부도 분석하였다. 측정 결과는, PBS가 예비 점적 주입된 동물에서의 SAP 농도가 미처리 정상 동물에서의 SAP 농도보다 약 5배 높음을 암시하는 것이다(도 11a). 그러나, GM-0111이 (10㎎/㎖ 또는 그 이상의 농도로) 예비 점적 주입된 동물의 SAP 수준은, PBS가 예비 점적 주입된 동물의 SAP 수준보다 상당히 낮았다. 이와 같은 데이터는, 조직학적 평가 결과와 부합하였는데, 이는 SAP가 조직 내 염증 변화를 나타내는 우수한 생체 마커일 수 있음을 암시하는 것이다.

전체적으로, 다양한 생화학적 및 조직학적 분석으로부터 구하여진 데이터는, GM-0111이 LL-37로 유도된 방광내 염증의 중증도를 예방 및 경감함에 있어서 매우 강력한 효능을 나타내는 화합물임을 암시하는 것이다. GM-0111의 보호 효과는, 이 GM-0111이 1㎎/㎖의 농도로 투여될 때에도 관찰될 수 있었으며, 이 GM-0111이 10㎎/㎖의 농도로 투여되었을 때 강력한 보호 효과가 나타났고, 본 발명에 사용된 동물 모델의 경우에는 100㎎/㎖ 이하의 농도로 사용될 때 안전하였다.

본 출원 전체에 걸쳐서 다양한 간행물들이 참조되어 있다. 이러한 간행물들의 개시 내용은 본원에 기술된 화합물, 조성물 및 방법을 더 완전히 설명하기 위하여 본 출원에 전체가 참조로 포함되어 있다. 다양한 변형 및 변화가 본원에 기술된 화합물, 조성물 및 방법에 가하여질 수 있다. 본원에 기술된 화합물, 조성물 및 방법의 기타 다른 양태는, 본원에 개시된 화합물, 조성물 및 방법의 사양 및 실시에 대한 고려 사항으로부터 분명할 것이다. 본 명세서와 실시예는 예시적인 것으로서 간주되어야 할 것이다.

참고 문헌

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Claims (33)

1. a. 부분적으로나 전체적으로 황산화된 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르, 또는 이의 조합; 또는
   b. 변형된 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르(여기서, 상기 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르는 알킬기 또는 플루오로알킬기를 포함하는 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 위치 1개 이상과 황산염기 1개 이상을 포함함);
   를 포함하는 화합물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내 비뇨기 염증을 치료 또는 예방하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 화합물은 변형된 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르인 방법.
3. 제2항에 있어서, 알킬기는 비치환된 알킬기인 방법.
4. 제3항에 있어서, 비치환된 알킬기는 메틸인 방법.
5. 제2항에 있어서, 플루오로알킬기는 1개 이상의 트리플루오로메틸기를 포함하는 방법.
6. 제2항에 있어서, N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 양성자의 1% 내지 100%는 알킬기 또는 플루오로알킬기로 치환되는 방법.
7. 제2항에 있어서, 히알루로난은 변형전 분자량이 10kDa 미만인 방법.
8. 제2항에 있어서, 히알루로난은 변형전 분자량이 10kDa 내지 2,000kDa인 방법.
9. 제2항에 있어서, 1개 이상의 C-2 하이드록실 양성자와 C-3 하이드록실 양성자는 황산염기로 치환되는 방법.
10. 제2항에 있어서, 히알루로난은 N-아세틸 글루코사민 부의 C-4 하이드록실 위치, 글루쿠론산 부의 C-2 위치, 글루쿠론산의 C-3 위치, 또는 이의 임의의 조합에서 황산화되는 방법.
11. 제2항에 있어서, 화합물은 황산화도가 이당체 단위당 0.5 내지 4.0인 방법.
12. 제2항에 있어서, 알킬기는 메틸이고, 1개 이상의 C-2 하이드록실 양성자 및/또는 C-3 하이드록실 양성자는 황산염기로 치환되는 방법.
13. 제2항에 있어서, 알킬기는 메틸이고, 1개 이상의 C-2 하이드록실 양성자 및/또는 C-3 하이드록실 양성자는 황산염기로 치환되며, 화합물은 분자량이 2kDa 내지 10kDa인 방법.
14. 제1항에 있어서, 변형된 히알루로난은 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 비치환된 C₁~C₁₀알킬기를 가지고; 황산염기는 황산화도가 이당체 단위당 0.5 내지 3.5인 글루쿠론산 부의 C-2 또는 C-3 하이드록실 위치에 있으며; 변형된 히알루로난은 분자량이 2kDa 내지 10kDa인 방법.
15. 제2항에 있어서, 화합물은 부분적 또는 전체적으로 황산화된 히알루로난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르인 방법.
16. 제15항에 있어서, N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 양성자 1개 이상은 황산염기로 치환되는 방법.
17. 제15항에 있어서, 히알루로난의 N-아세틸-글루코사민 잔기의 1차 C-6 하이드록실 양성자의 1% 내지 100%는 황산염기로 치환되는 방법.
18. 제15항에 있어서, 우론산 잔기의 C-2 하이드록실 양성자 및 C-3 하이드록실 양성자 1개 이상과, N-아세틸-글루코사민 잔기의 C-4 하이드록실 양성자 1개 이상은 황산염기로 치환되는 방법.
19. 제15항에 있어서, 화합물은 황산화도가 이당체 단위당 0.1 내지 4.0인 방법.
20. 제15항에 있어서, 부분적 또는 전체적으로 황산화된 히알루로난은 평균 분자 크기가 20kDa 미만인 방법.
21. 제15항에 있어서, 부분적으로 황산화된 히알루로난은 평균 분자 크기가 2kDa 내지 10kDa인 방법.
22. 제15항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 에스테르는 전구 약물인 방법.
23. 제1항에 있어서, 황산화된 히알루로난은 평균 분자 크기가 3kDa 내지 6kDa이고, 치환도가 3.0 내지 3.5인 방법.
24. 제1항에 있어서, 화합물은 약학 조성물로서 투여되는 방법.
25. 제24항에 있어서, 조성물은 캡슐, 정제, 츄잉검, 로젠지, 분말 또는 마시는 형태를 포함하는 방법.
26. 제24항에 있어서, 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 섭취 또는 경점막으로 투여되는 방법.
27. 제24항에 있어서, 조성물은 경점막으로 투여되며, 경점막 투여는 경협측, 설하, 경구, 질내, 비강내, 직장 또는 방광내 점적 주입을 포함하는 방법.
28. 제24항에 있어서, 조성물은 항 염증 제제, 해열제, 항염증용 스테로이드 및 비스테로이드 약물, 호르몬, 성장 인자, 피임약, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제, 진통제, 수면제, 진정제, 정신 안정제, 항경련제, 근육 이완제, 국부 마취제, 진경제, 항궤양제, 펩티드 작용제, 교감 신경 흥분제, 심혈관 제제, 항종양제 또는 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 방법.
29. 제1항에 있어서, 화합물 (a) 또는 (b)의 약학적으로 허용 가능한 염은 유기염, 금속염 또는 이의 조합을 포함하는 방법.
30. 제1항에 있어서, 화합물 (a) 또는 (b)의 약학적으로 허용 가능한 염은 NH₄ ⁺, Na⁺, Li⁺, K⁺, Ca⁺², Mg⁺², Fe⁺², Fe⁺³, Cu⁺², Al⁺³, Zn⁺², 2-트리메틸에탄올암모늄 양이온(콜린), 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 리신, 아르기닌 및 히스티딘의 4차 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염을 포함하는 방법.
31. 제1항에 있어서, 비뇨기 염증은 방광, 요도, 요로 상피 내막, 신장, 전립선, 질, 자궁 또는 이의 임의의 조합의 염증을 포함하는 방법.
32. 제1항에 있어서, 화합물의 투여는 대상체 내 LL-37의 활성을 억제하는 방법.
33. a. 실험용 동물의 비뇨생식계에, 대상체 내에서 비뇨기 염증을 유도하는 양의 LL-37을 투여하는 단계;
    b. 단계 (a) 이전 및/또는 단계 (a) 이후에 테스트 화합물을 동물에 투여하는 단계; 및
    c. 동물 내 비뇨기 염증의 양을, 동일한 양의 LL-37이 투여되되 상기 테스트 화합물은 투여되지 않은 대조군 동물과 비교하는 단계
    를 포함하는, 대상체 내에서 비뇨기 염증을 치료 또는 예방할 수 있는 화합물을 스크리닝하는 방법.

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