MX2014006956A - Heparinas con baja actividad anticoagulante. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una heparina modificada químicamente con una actividad de antifactor II inferior a 10 UI/mg, una actividad de antifactor Xa inferior a 10 UI/mg y un peso molecular promedio (Mw) entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 9,5 kDa. También se divulga un procedimiento de preparación de heparina y su uso médico, incluyendo el tratamiento del paludismo.

Description

HEPARINAS CON BAJA ACTIVIDAD ANTICOAGULANTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a heparinas modificadas químicamente con baja actividad anticoagulante y a procedimientos para su producción. Las heparinas modificadas químicamente son útiles para tratar trastornos en los que la heparina se ha considerado eficaz pero que se ha considerado demasiado propensa a producir efectos secundarios, tales como el paludismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La heparina es un GAG de origen natural que se sintetiza y almacena intracelularmente en los denominados mastocitos en seres humanos y animales. Preparadas industrialmente a partir de la mucosa intestinal porcina, la heparina es un potente anticoagulante y se ha usado clínicamente durante más de 60 años como fármaco de preferencia para la profilaxis y el tratamiento de trastornos tromboembólicos. Los principales efectos adversos del tratamiento con heparina son las complicaciones hemorrágicas causadas por sus propiedades anticoagulantes. La heparina es altamente polidispersa y está compuesta por una población heterogénea de polisacáridos con pesos moleculares que varían de 5 a 40 kDa, con una media de aproximadamente 15 a 18 kDa.

Las heparinas de bajo peso/masa molecular (HBPM) de acuerdo con la Farmacopea Europea 6.0 se definen como "sales de GAG sulfatadas que tienen una masa molecular promedio en masa inferior a 8 y para las que al menos un 60 por ciento de la masa total tiene una masa molecular inferior a 8 kDa." Las heparinas de bajo peso molecular muestran diferentes estructuras químicas en el extremo reductor o no reductor de las cadenas de polisacáridos." "La potencia no es inferior a 70 Ul de la actividad de anti-factor Xa por miligramo calculado con referencia a la sustancia seca. La proporción entre la actividad de anti-factor Xa y la actividad de anti-factor lia es no menor de 1 ,5." Las HBPM usadas clínicamente tienen pesos moleculares que varían de 3 a 15 kDa con una media de aproximadamente 4 a 7 kDa. Producidas mediante despolimerización/fraccionamiento controlado de la heparina, las HBPM exhiben propiedades farmacológicas y farmacocinéticas favorables, incluyendo una tendencia menor a inducción de hemorragia, incremento de la biodisponibilidad y una semivida prolongada tras la inyección subcutánea.

La heparina ejerce su actividad anticoagulante principalmente a través de la unión de alta afinidad y la activación del inhibidor de la serina proteinasa, antitrombina (AT). La unión está mediada por una secuencia de pentasacárido específica. La AT, un importante inhibidor fisiológico de la coagulación sanguínea, neutraliza los factores de coagulación activados formando un complejo estable con estos factores. La unión de la heparina produce un cambio conformacional en la AT que potencia de forma espectacular la tasa de inhibición de los factores de coagulación, de modo que se atenúa la coagulación sanguínea y la formación de coágulos de sangre.

La infección causada por Plasmodium falciparum con frecuencia da lugar a paludismo grave en seres humanos. Los eritrocitos con el parásito (pE) tienen la capacidad de unirse (in vivo: secuestran) en la microvasculatura profunda, así como a los eritrocitos sin infectar, formando las denominadas rosetas. El secuestro y roseteado de los pE aumenta la generación de una enfermedad grave cuando la unión es excesiva, de modo que se bloquea el flujo de sangre, se reduce el aporte de oxígeno y se produce daño tisular.

Se ha sugerido que la heparina es un agente útil en el tratamiento de la enfermedad que se produce durante el paludismo grave. La heparina se ha usado anteriormente en el tratamiento del paludismo grave por la presencia sugerida de coagulación intravascular diseminada (CID) en pacientes con paludismo, pero se interrumpió debido a la aparición de efectos secundarios graves, tales como hemorragias intracraneales. Además, se descubrió que la agregación de los pE no se debe principalmente a la coagulación de la sangre sino a interacciones no covalentes entre una proteína inducida por el parásito sobre las superficies de los pE y el heparán sulfato (un GAG relacionado con la heparina) sobre los eritrocitos y las células endoteliales vasculares. El efecto de la heparina se atribuye a su capacidad para competir con esta interacción (Vogt et al., PloS Pathog. 2006; 2, elOO). Por tanto, existe la necesidad médica de un derivado de heparina con una actividad anticoagulante marcadamente reducida y potencial de inducción de hemorragia diseñado con respecto a su distribución de cadenas con carga y del tamaño adecuado. La patente de EE.UU. N° 5,472,953 (Ekre et al) divulga el uso de heparinas con actividad anticoagulante reducida para el tratamiento del paludismo.

AM Leitgeib et al. in Am. J. Trop. Med. Hyg. 2011 , vol. 84(3), pp. 380-396 informan sobre estudios prometedores con heparinas con baja actividad anticoagulante que se observa que rompen las rosetas de aislados clínicos frescos de pacientes con paludismo.

En resumen, un derivado de la heparina portador de las características polianiónicas de la heparina en aspectos esenciales pero que carece de efecto anticoagulante sería un excelente candidato para tratar enfermedades en las que el efecto anticoagulante de la heparina se consideraría un efecto secundario grave.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a heparinas modificadas químicamente que se preparan de forma selectiva para que conserven los efectos terapéuticos de las cadenas de polisacáridos al tiempo que tengan un efecto anticoagulante bajo.

En el contexto de la presente invención, la actividad anticoagulante de la heparina se refiere a la función clínica de potenciar la inhibición de los factores de coagulación Xa y lia (trombina) por la AT. Otros términos se definirán en contextos aplicables en la descripción siguiente.

En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de preparación de heparina modificada químicamente con una actividad de antifactor II inferior a 10 Ul/mg, una actividad de antifactor Xa inferior a 10 Ul/mg y un peso molecular promedio (promedio en peso, Mw) de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9,5 kDa. El procedimiento comprende generalmente una etapa de oxidación selectiva de la heparina presente en una solución acuosa sometiéndola a un agente oxidante capaz de oxidar residuos de sacárido no sulfatado y seguido de reducción de los residuos de sacáridos oxidados resultantes. El procedimiento también comprende, generalmente, despolimerizar las cadenas de heparina oxidadas y reducidas mediante hidrólisis a un pH ácido de aproximadamente 3 a aproximadamente 4. El procedimiento se puede realizar en la secuencia general, consecutivamente mediante oxidación, reducción y despolimerización con hidrólisis de los modos que se acaban de describir, aunque se pueden añadir otras etapas del proceso complementarias en cualquier orden adecuado.

La despolimerización se realiza a una temperatura de al menos aproximadamente 20°C con el fin de obtener cadenas fraccionadas adecuadamente con pesos moleculares deseables. Con el fin de soportar la selección de cadenas deseables, el procedimiento generalmente también puede incluir una etapa de enriquecer las cadenas de polisacáridos que tengan un peso molecular de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 10,5 kDa. La etapa de enriquecimiento generalmente incluye procedimientos cromatográficos, de filtración o de tamización convencionales bien conocidos por los expertos en fabricación de biopolímeros.

Los procedimientos de acuerdo con la invención pueden comprender además al menos una etapa de eliminación del agente oxidante restante.

Además, los procedimientos de acuerdo con la invención pueden comprender al menos una etapa de eliminación que incluye eliminar las formas reducidas del agente de oxidación. En este contexto, formas reducidas significa agente de oxidación transformado en las formas reducidas al contribuir a la oxidación de los residuos de sacáridos objetivo en la heparina. Asimismo en este contexto, la etapa de reducción puede comprender la adición de un agente reductor que aparte de reducir la heparina oxidada contribuya al consumo (reducción) del agente oxidante restante.

En un aspecto, el procedimiento de acuerdo con la invención comprende una etapa de eliminar cualquier agente oxidante restante y retirar las formas reducidas del agente oxidante entre la etapa reductora descrita y la etapa de despolimerización descrita. La despolimerización se puede realizar con hidrólisis a pH de 3,0 a 3,5.

De acuerdo con esto, en un aspecto, la invención está dirigida a un procedimiento que comprende las etapas consecutivas de oxidar de forma selectiva una heparina no fraccionada sometiéndola a un agente oxidante capaz de oxidar sacáridos no sulfatados; reducir los sacáridos oxidados resultantes; eliminar el agente oxidante restante y las formas reducidas del agente oxidante, y despolimerizar las cadenas de heparina mediante hidrólisis a pH ácido de aproximadamente 3 a aproximadamente 3,5.

La etapa de eliminación puede comprender añadir un alcohol en una cantidad suficiente para que la heparina modificada químicamente precipite. El alcohol puede ser metanol, etanol o alcoholes similares y admite que la heparina modificada químicamente precipite, mineras que el agente oxidante y sus formas reducidas se eliminan con el alcohol.

La etapa de eliminación también puede incluir la adición de un agente de inactivación capaz de inactivar químicamente el agente oxidante para ejercer adicionalmente efectos oxidantes sobre la heparina. Generalmente, los inventores consideran que la etapa de de eliminación o etapas de eliminación descritas de este modo contribuirían a contrarrestar o minimizar la despolimerización inespecífica de la heparina, es decir, efectos de la despolimerización no atribuibles a los resultados predecibles de la hidrólisis ácida. La despolimerización inespecífica puede dar como resultado una pérdida impredecible del peso molecular, productos decolorados (con valores de absorbancia inestables), otros problemas con estabilidad y la aparición de residuos sin identificar no predichos para llegar a heparina o heparinas de bajo peso molecular.

La introducción de una etapa de eliminación tras la etapa de oxidación permite un control mejorado sobre cualquier despolimerización inespecífica. Otro modo de controlar la despolimerización inespecífica, aplicable a cualquier procedimiento descrito anteriormente, es reducir la temperatura significativamente por debajo de la temperatura ambiente durante la etapa o etapas de precipitación previas al añadir un alcohol. Por ejemplo, la temperatura se puede reducir hasta aproximadamente 5 °C con el fin de impedir reacciones indeseadas, lo que tiene como resultado una despolimerización inespecífica.

De acuerdo con la presente invención, la heparina se oxida de forma selectiva, de modo que se inhibe el efecto anticoagulante mediado por la interacción entre la AT y el pentasacárido específico. La oxidación divide selectivamente los glicoles con 2 hidroxilos libres adyacentes y el producto resultante se denomina producto "dividido de glicol". Para este fin, la composición de la heparina no fraccionada se trata con un compuesto de peryodato, tal como metaperyodato sódico en un medio de reacción adecuado, por ejemplo siguiendo las divulgaciones de la patente de EE.UU. 4,990,502. Otros agentes de oxidación serían útiles si tienen el mismo impacto químico sobre los residuos no sulfatados sin dañar los niveles críticos de sulfatos, como se requiere en el producto final. Cuando se usa un compuesto de peryodato como agente oxidante, se reduce a yodato y, después, en la etapa de reducción, a otras formas inertes del yodo, en conjunto denominados "compuestos de yodo". La etapa de eliminación de los procedimientos de la invención sirve para eliminar o minimizar el efecto oxidante de cualquier compuesto de yodo y para eliminar los compuestos de yodo del procedimiento de un modo que contrarreste o minimice la despolimerización inespecífica. Por esta razón, la etapa de eliminación puede comprender una o dos etapas de precipitación con alcohol. También puede incluir la adición de un agente de inactivación con dos grupos hidroxilo adyacentes, tales como etilenglicol, glicerol y agentes similares, con el fin de eliminar química y selectivamente los agentes oxidantes.

La heparina oxidada, por ejemplo después del aislamiento mediante precipitación con alcohol, se trata después con un agente reductor, adecuadamente con borohidruro sódico, por ejemplo de acuerdo con los protocolos de la patente de EE.UU. 4,990,502. Otros agentes reductores se pueden usar si son capaces de realizar una reducción similar de los residuos de ácido glucurónico/idurónico oxidados como borohidruro sódico sin modificar innecesariamente o destruir los grupos sulfato de otros residuos de sacáridos. Las cadenas reducidas de este modo se pueden aislar, por ejemplo, mediante precipitación en alcohol, y se pueden transferir a la etapa de despolimerización.

El uso de heparina no fraccionada en los procedimientos descritos de este modo se considera generalmente ventajoso para la invención, ya que contribuirá a la reducción de los residuos de material y al incremento de la rentabilidad y soporte de provisión de un producto de composición con una cadena de polisacárido de longitud deseable y con grupos sulfatos retenidos.

La etapa de despolimerización se puede realizar en una solución acuosa a una concentración de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 % en peso/volumen de la heparina modificada. Después, con la solución se mezcla un acidificante fuerte hasta obtener un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 4. Un intervalo de pH adecuado es de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 3,5. Un valor de pH de 3,0 es adecuado de acuerdo con el procedimiento de la invención, aunque también se ha encontrado que el pH de 3,5 es adecuado y admite la producción de una heparina modificada químicamente dentro del intervalo de peso molecular indicado. Se ha descubierto que el procedimiento de la invención admite flexibilidad en este intervalo de pH que se puede controlar mediante el tiempo de proceso de la etapa de la hidrólisis cuando se funciona dentro de un marco de tiempo de 4 a 10 horas. El ácido clorhídrico es un ácido adecuado con el proceso de la invención, aunque se puede encontrar que otros ácidos fuertes son útiles si no destruyen sustancialmente los grupos sulfato. Aplicando las condiciones especificadas anteriormente, se recupera un producto con las longitudes de cadena y la estabilidad durante el almacenamiento adecuadas para el posterior procesamiento hasta una composición farmacéuticamente útil.

Los procedimientos dan un enriquecimiento global en los grupos sulfato dentro de la longitud de la cadena de polisacárido, ya que el ácido ¡durónico/glucurónico no sulfatado se modifica químicamente y aparece principalmente como terminales residuales del extremo reductor, De acuerdo con esto, los procedimientos implican condiciones que conservan grupos sulfato y, por tanto, que conservan los dominios sulfatados de la heparina nativa. Los procedimientos también proporcionan cadenas con una distribución del tamaño ventajosa que soporta una eficacia terapéutica deseable y se considera que mejora el índice terapéutico en comparación con otras heparinas de baja actividad anticoagulante descritas. La invención, en términos generales, se extiende a las heparinas modificadas químicamente preparadas con los procedimientos citados.

La invención está dirigida a heparinas modificadas químicamente con una actividad de antifactor II inferior a 10 Ul/mg, una actividad de antifactor Xa inferior a 10 Ul/mg y un peso molecular promedio (Mw) entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 9,5 kDa, que se puedan fabricar con los procedimientos descritos. La heparina modificada químicamente de acuerdo con la invención tiene cadenas de polisacáridos que retienen al menos un 90% de los grupos sulfato. La heparina modificada químicamente de acuerdo con la invención tiene una pérdida de grupos sulfatos de aproximadamente un grupo sulfato por unidad de disacárido de 100 unidades de disacárido, correspondiente a una pérdida de grupos sulfato inferior al 1% del contenido total de sulfatos, cuando se supone que la heparina contiene de media 2,4 grupos sulfato por unidad de disacárido y que existe un grupo sulfato por ácido idurónico, I2S y 2 grupos sulfato para la variante de glucosamina predominante, GIcNS.

Un aspecto de la invención es una heparina modificada químicamente con una actividad de antifactor II inferior a 10 Ul/mg, una actividad de antifactor Xa de hasta 10 Ul/mg y un peso molecular promedio de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9,5 kDa, en la que las cadenas de polisacáridos: (i) conservan al menos un 90% de los grupos sulfato de la correspondiente heparina nativa; (ii) comprenden de 2 a 25 unidades de disacárido correspondientes a pesos moleculares de 1 ,2 a 15 kDa; (iii) tienen una reducción de las secuencias de sacáridos químicamente intactas que proporcionan un efecto anticoagulante mediado por la antitrombina, en comparación con las cadenas de polisacáridos de la heparina nativa; y (iv) tienen una reducción de las unidades de ácido idurónico y/o glucurónico sin sulfatar en comparación con la heparina nativa.

Una heparina modificada químicamente tiene de 2 a 25 unidades de disacárido correspondientes a pesos moleculares de aproximadamente 1 ,2 a aproximadamente 15 kDa. Una heparina modificada químicamente tiene cadenas de polisacáridos con una reducción de las secuencias de pentasacáridos químicamente intactas responsables del efecto anticoagulante mediado por la antitrombina (AT), en comparación con las cadenas de la heparina nativa y tiene cadenas de polisacáridos con una reducción de los residuos de ácido idurónico y glucurónico sin sulfatar en comparación con la heparina nativa.

Un aspecto de la invención es que la heparina modificada químicamente tiene cadenas de polisacáridos predominantes con entre 6 y 17 unidades de disacárido con pesos moleculares entre 3,6 y 9,6 kDa. El término "predominante" en este contexto tiene el significado de las cadenas de polisacáridos "más frecuentes".

Un aspecto de la invención es una heparina modificada químicamente que tiene al menos un 30% de las cadenas de polisacáridos con un peso molecular de al menos 8 kDa.

Un aspecto de la invención es una heparina modificada químicamente que comprende cadenas terminadas con un residuo de treonato o con un derivado de treonato, tales como ésteres o amidas de los mismos. El residuo de treonato se representa más adelante como grupo terminal.

En un aspecto de la invención, del 3 al 15% de las cadenas de polisacáridos de la heparina modificada químicamente tiene una masa molecular de al menos 15 kDa.

En un aspecto de la invención, del 25 al 47 % de las cadenas de polisacáridos de la heparina modificada químicamente tiene una masa molecular de al menos 9 kDa.

En un aspecto de la invención, del 40 al 60 % de las cadenas de polisacáridos de la heparina modificada químicamente tiene una masa molecular de al menos 7 kDa.

En un aspecto de la invención, del 60 al 80 % de las cadenas de polisacáridos de la heparina modificada químicamente tiene una masa molecular de al menos 5 kDa.

En un aspecto de la invención, el 85 % de las cadenas de polisacáridos de la heparina modificada químicamente tiene una masa molecular de al menos 3 kDa.

En un aspecto de la invención, el 95 % de las cadenas de polisacáridos de la heparina modificada químicamente tiene una masa molecular de al menos 2 kDa.

En un aspecto adicional, la heparina modificada químicamente de la invención tiene una distribución de los polisacáridos y su correspondiente masa molecular expresada como un % acumulado del peso de acuerdo con la tabla: En un aspecto adicional, la heparina modificada químicamente de la invención tiene una distribución de los polisacáridos y su correspondiente masa molecular expresada como un % acumulado del peso de acuerdo con la tabla: La hepanna modificada químicamente de acuerdo con la invención tiene cadenas de polisacáridos con el disacárido representado más adelante como la estructura predominante con un residuo de treonato terminal. El disacárido predominante tiene un peso molecular de aproximadamente 600 Da. (n es un número entero de 2 - 25).

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, la heparina modificada químicamente de acuerdo con la invención comprende residuos divididos de glicol con la estructura química: En las cadenas de polisacáridos de heparinas modificadas químicamente aparecen residuos divididos de glicol como resultado de los procesos de oxidación y reducción, como se ha tratado anteriormente en el contexto del procedimiento y la etapa de hidrólisis específica. También se pueden considerar indicativas de la eficacia de la etapa de despolimerización descrita anteriormente (hidrólisis). Se hace también referencia a la patente de EE.UU. 4,990,502 para una referencia química de la aparición de residuos de glicol divididos. El residuo de glicol dividido representado procede de la oxidación y reducción del ácido idurónico y ácido glucurónico sin sulfatar.

La heparina modificada químicamente de acuerdo con la invención tiene un espectro de RMN de H en el intervalo de 5,0 a 6,5 ppm conforme con un espectro de RMN de 1H de la heparina nativa por la ausencia de cualquier señal de protón con una magnitud superior a 0,1 (mol) %.

En un aspecto de la invención, la heparina modificada químicamente como se ha descrito en el presente documento cumple las normas para heparina aceptadas actualmente por tener un espectro de RMN de 1H que cumple el criterio de aceptación de la heparina establecido por el EDQM, Consejo Europeo, 2012, por ejemplo, al no tener ninguna señal sin identificar mayor del 4 por ciento en comparación con la altura de la señal de heparina a 5,42 ppm en los intervalos de 0,10-2,00 ppm, 2,10-3,10 ppm y 5,70-8,00 ppm.

En un aspecto, la heparina modificada químicamente de acuerdo con la invención tiene un intervalo de la masa molecular promedio relativo de aproximadamente 7.500 dalton, variando aproximadamente el 90% entre 2.000 y 15.000 dalton; el grado de sulfatación es de 2 a 2,5 por unidad de disacárido.

En un aspecto de la invención, una heparina modificada químicamente como se describe en el presente documento puede ser útil para terapias divulgadas anteriormente como asociadas con otras regiones de la heparina que el sitio de unión a la AT. Ejemplos incluyen, entre otros, áreas como las de tratamiento de inflamación, tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, reparación tisular, ictus, prevención y tratamiento de shock, especialmente shock séptico, y prevención del desarrollo de metástasis.

Un aspecto de la invención es una heparina modificada químicamente para usar en el tratamiento del paludismo. Las heparinas modificadas químicamente como se han divulgado en el presente documento pueden ser útiles en la prevención o tratamiento de los efectos oclusivos del paludismo, causados por efectos adherentes anormales en la sangre.

Un aspecto de la invención es una combinación de heparina modificada químicamente como se ha divulgado en el presente documento con otro medicamento para el paludismo. En un aspecto de la invención, dichas combinaciones comprenden heparina modificada químicamente y atovacuona/proguanil o artesunato (parenteral). Ejemplos de medicamentos para el paludismo en aspectos de combinación de los medicamentos de la invención son, para su uso por separado o combinaciones de unos con otros, artemeter, lumefantrina, amodiaquina, mefloquina, sulfadoxina, pirimetamina, tetraciclina, doxiciclina, dapsona, clindamicina, quinina, tetraciclina, atovacuona, proguanil, cloroquina, primaquina, sulfadoxina, amodiaquina, dihidroartemisini, piperaquina, dihodroartemisinina y piperaquina.

En otro aspecto más de la invención, una heparina modificada químicamente como se divulga e el presente documento se puede administrar de forma simultánea o secuencial con un medicamento para el paludismo, es decir en una terapia adyuvante con un medicamento para el paludismo.

La expresión "medicamento para el paludismo" incluye agentes usados de forma convencional para tratar el paludismo, tales como agentes ya establecidos para el tratamiento de la infección por parásitos. Un aspecto más de la invención es un procedimiento para el tratamiento del paludismo que comprende la administración al paciente que necesite dicho tratamiento de una cantidad terapéuticamente eficaz de una heparina modificada químicamente como se ha descrito en el presente documento.

Un aspecto más de la invención es una composición farmacéutica que comprende una heparina modificada químicamente como se ha descrito en el presente documento junto con un vehículo farmacéutica y farmacológicamente aceptable. En otro aspecto más de la invención, una composición farmacéutica como se describe en el presente documento se puede administrar sistémicamente mediante administración parenteral, tal como mediante inyección subcutánea o intravenosa. En un aspecto más, una composición farmacéutica como se describe en el presente documento puede administrarse por vía oral. Para la administración parenteral, los compuestos activos se pueden incorporar en una solución o suspensión, que también contenga uno o más adyuvantes tales como diluyentes estériles, tales como agua para inyectables, solución salina, aceites fijos, polietilenglicol, glicerol, propilenglicol u otros disolventes orgánicos, agentes antibacterianos, antioxidantes, agentes quelantes, tampones y agentes para ajustar la osmolalidad. La preparación parenteral se puede administrar en ampollas, viales, jeringas precargadas o desechables también para autoadministración, o como dispositivos para infusión, tal como infusión intravenosa o subcutánea. Las heparinas modificadas químicamente de acuerdo con la invención se pueden administrar por vía subcutánea y con herramientas de autoadministración adecuadas, tales como inyectores.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden una heparina modificada químicamente como se describe en el presente documento pueden comprender combinaciones de uno o varios vehículos convencionales farmacéuticamente aceptables. Los vehículos o excipientes pueden ser un material sólido, semisólido o líquido que puede servir como vehículo para la sustancia activa. Las composiciones se pueden administrar en una dosis única cada 24 hora durante un periodo de 1-30, preferentemente 1-10 días. La dosis puede estar entre 0,5-6 mg/kg de peso corporal administrados por vía intravenosa cada 6 u 8 horas o 1-4 veces al día administradas por vía subcutánea. Una estimación de una única dosis es de 25-100 mg/d de una heparina modificada químicamente, pero puede ser de hasta 1 g o más. La dosis está relacionada con la forma de administración. Las composiciones farmacéuticas descritas pueden comprender además agentes adicionales adecuados para tratar el paludismo con terapias suplementarias o complementarias como se ha indicado en la sección anterior. Una heparina modificada químicamente de la invención necesitará conservar una cantidad suficiente de los grupos sulfatos incluidos en la forma nativa para ejercer una actividad terapéutica no relacionada con los efectos anticoagulantes, por ejemplo dirigiendo la proteína 1 de la membrana de los eritrocitos con P. falciparum (PfEMPI) y, al mismo tiempo, tener la actividad anticoagulante inherente en el pentasacárido anulado o reducido considerablemente. Asimismo, los inventores entienden que la inhibición de selectina, así como otros efectos biológicos dependientes de la heparina, se correlaciona con la longitud de la cadena de polisacárido, de modo que la modificación química no puede dar lugar a una extensa fragmentación de las moléculas nativas. La biodisponibilidad de las heparinas de cadena larga después de la dosificación subcutánea es baja y la posibilidad de trombocitopenia inducida por heparina (TIH) se correlaciona de forma positiva con la longitud de la cadena, los derivados de heparina modificada químicamente de acuerdo con la invención no deben ser de longitud completa. La presente heparina modificada químicamente es el resultado de una serie de consideraciones importantes 1. Inicialmente con el fin de satisfacer los criterios económicos de proceso, la heparina diana tenía que poder producirse a partir de heparina no fraccionada. 2. El proceso no puede dar cadenas cortas demasiado abundantes, ya que el efecto terapéutico se correlaciona de forma positiva con longitudes de cadenas de sacáridos suficientemente largas. 3. El proceso no debe dar cadenas largas demasiado abundantes, ya que la pauta de dosificación por vía subcutánea no es posible con cadenas más largas. 4. De un modo similar, la longitud de cadena larga se correlaciona con efectos secundarios indeseables, tales como TIH. 5. El proceso deberá eliminar el efecto anticoagulante inherente en el pentasacárido de unión a AT. 6. El proceso deberá evitar la desulfatación del polímero, en su lugar deberá aumentar la proporción de los residuos sulfatados, ya que los efectos terapéuticos se correlacionan de forma positiva con el grado de sulfatación, que proporciona una densidad de carga negativa. La invención como se ha descrito anteriormente y que se va a describir en la sección experimental detallada siguiente demuestra que es posible superar los obstáculos indicados con anterioridad y, por tanto, producir un candidato de fármaco que tenga éxito en el tratamiento del paludismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Fig. 1 muestra un ejemplo representativo de la secuencia de la heparina La Fig. 2 muestra la estructura de la unidad de pentasacárido en la heparina requerida para su unión a la AT.

La Fig. 3 muestra un esquema de la síntesis de la heparina modificada químicamente DF02.

La Fig. 4 muestra la estructura predominante de DF02.

La Fig. 5 muestra cómo DF02 y la heparina rompen las rosetas del parásito FCR3S1 .2 de un modo dependiente de la dosis.

La Fig. 6 muestra cómo las rosetas de los aislados frescos de niños con paludismo grave, complicado o leve son sensibles al tratamiento con DF02 (100 (barras oscuras) y 1.000 (barras grises) µglm\).

La Fig. 7 muestra la alteración de la citoadherencia: la unión de pE de parásito FCR3S1.2 a la célula endotelial se puede inhibir o invertir mediante DF02 o heparina de un modo dependiente de la dosis.

La Fig. 8 demuestra que la invasión con merozoítos del parásito FCR3S1.2 de los eritrocitos frescos se puede inhibir por acción de DF02 o heparina de un modo dependiente de la dosis.

La Fig. 9 demuestra que el secuestro de eritrocitos infectados por P. falciparum en los pulmones de ratas se puede inhibir con el tratamiento con heparina modificada químicamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención son las heparinas modificadas químicamente que tienen la denominación común internacional (DCI) sepuvarina sódica, a la que también se le da el código DF02. Estos términos se usan de forma intercambiable y tendrán el mismo significado.

Ejemplo 1 Tanto la heparina como la HBPM están compuestas por unidades repetitivas de disacáridos que contienen un residuo de ácido urónico (ácido D-glucurónico o L-idurónico, UA) y un resto de D-glucosamina (GlcN) que está N-sulfatado o N-acetilado. Estos residuos de carbohidratos pueden además estar sulfatados en O en las posiciones C-6 y C-3 en el caso de la glucosamina y en la posición C-2 en el UA. La estructura de la heparina es variable con respecto a la distribución del UA y residuos sulfato; una secuencia parcial representativa se muestra en la Fig. 1 (que también ilustra el modo de numeración de los átomos de carbono en un residuo de monosacárido). La Fig. 2 muestra la secuencia única del pentasacárido distribuida dentro de los polímeros de heparina que es esencial para la unión a la AT. Se ha demostrado que varias características estructurales de esta secuencia son cruciales para la interacción de la heparina con la AT. En particular, uno de los dos residuos de UA presentes en la secuencia del pentasacárido está sulfatado de forma consistente en la posición C-2; mientras que los grupos hidroxilo en C-2 y C-3 del otro resto urónico están sin sustituir.

Descripción detallada del proceso de fabricación de heparinas modificadas químicamente de acuerdo con la invención La Fig. 3 muestra esquemáticamente la fabricación de una heparina modificada químicamente de acuerdo con la presente invención, en lo sucesivo en el presente documento denominada DF02, mientras que la secciones siguientes esbozan las etapas de fabricación.

La sustancia se prepara a partir de heparina sódica. La preparación implica la oxidación selectiva de residuos de ácido urónico no sulfatado en la heparina por peryodato, incluyendo el resto de ácido glucurónico en la secuencia de pentasacárido que se une a la AT. La rotura de la estructura de este residuo aniquila la interacción de alta afinidad con la AT y, en consecuencia, el efecto anticoagulante (medido como FXa o a-Flla, véanse las Tablas 4 y 5). La posterior reducción y tratamiento con ácido tiene como resultado la escisión del polímero en los sitios en los que se ha oxidado con el peryodato. En conjunto, estas manipulaciones conducen a una pérdida de actividad anticoagulante junto con la adecuada despolimerización de la cadena de heparina.

Posteriormente, los aditivos, impurezas y productos secundarios se eliminan mediante repetidas precipitaciones con etanol, filtración y centrifugaciones. A continuación, la sustancia se obtiene en forma de polvo mediante desecación con vacío y calor. La sustancia farmacológica DF02 se disuelve en tampón acuoso estéril, dando el producto farmacológico que se pretende administrar por vía intravenosa o subcutánea.

Oxidación de ácido glucurónico e idurónico (residuos), eliminación de la actividad anticoagulante Una cantidad de aproximadamente 3.000 gramos de heparina se disuelve en agua purificada para obtener una solución al 10-20% en peso/volumen. El pH de esta solución se ajusta a 4,5-5,5. Posteriormente, a las solución del proceso se añade metaperyodato sódico (Nal04); cantidad de peryodato 15-25% del peso de la heparina. El pH se ajusta de nuevo a 4,5 - 5,5. El reactor se cubre con el fin de proteger la reacción de la luz. La solución del proceso se hace reaccionar durante 22 - 26 horas con agitación constante y mantenimiento de la temperatura a 13 - 17 °C. El pH al final del periodo de reacción se mide y se registra.

Terminación de la reacción de oxidación y la eliminación de los compuestos que contienen yodo A la mezcla de reacción se añade etanol (95 - 99,5%) durante un periodo de 0,5 - 1 hora, con agitación cuidadosa y a una temperatura de 20-25 °C. El volumen de etanol a añadir está en el intervalo de 1-2 volúmenes de etanol por volumen de la solución del proceso. La heparina oxidada se deja después precipitar y sedimentar durante 15- 20 horas, tras lo cual las aguas madre se decantan y se desechan.

Después, el sedimento se disuelve en agua purificada para obtener una solución al 15-30% en peso/volumen. A continuación se añade NaCI para obtener una concentración de 0,15-0,30 mol/litro en la solución del proceso. La agitación continúa durante otra 0,5-1 hora manteniendo la temperatura de 20-25°C. Posteriormente, a esta solución con agitación cuidadosa se añaden 1 ,0-2,0 volúmenes de etanol (95-99,5%) por volumen de solución del proceso durante un periodo de 0,5-1 hora. Esto precipita el producto de la solución. Esta precipitación continúa durante > 1 hora.

Reducción de los ácidos qlucurónico/idurónico oxidados Después de decantar y desechar las aguas madre, el sedimento se disuelve mediante la adición de agua purificada hasta obtener una concentración de la solución del proceso de 15-30% en peso/volumen. Manteniendo la temperatura a 13 - 17 °C, el pH de la solución se ajusta a 5,5-6,5. Una cantidad de 130-150 gramos de borohidruro sódico se añade después a la solución y se disuelve, el pH aumentará inmediatamente a un pH de 10-11 y la reacción se continúa durante 14-20 horas. Se registra el pH de la solución, tanto antes como después de este periodo de reacción. Después de este tiempo de reacción, lentamente se añade ácido diluido con el fin de ajustar el pH a un valor de 4, lo que degrada el borohidruro sódico restante. Después de mantener un pH de 4 durante 45-60 minutos, el pH de la solución se ajusta a 7 con una solución de NaOH diluido.

Hidrólisis ácida para conseguir la despolimerización de las cadenas de polisacárido A la solución se añade un ácido diluido hasta obtener un pH de 3,5 (intervalo aceptable 3,2-3,8). La temperatura se mantiene a 50 - 55 °C, agitando la solución durante 3 horas +/- 10 minutos. Después se añade una solución de NaOH diluido hasta obtener un pH de 7,0 y la solución de reacción se enfría hasta una temperatura de 13-17 °C. A continuación se añade cloruro sódico (NaCI) hasta obtener una concentración de 0,2-0,3 mol/litro.

Purificación del producto Eliminación de aditivos e impurezas del proceso, adición de contrapones y filtración Un volumen de la solución del proceso se añade a 1 ,5-2,5 volúmenes de etanol (95 - 99,5%), seguido de centrifugación a > 2.000 G y a < 20 °C durante 20-30 minutos, tras lo cual se decanta y se desecha el sobrenadante.

La pasta de producto obtenida mediante centrifugación se disuelve después en agua purificada para obtener una concentración del producto del10-20% en peso/volumen. Después se añade NaCI para obtener una concentración de 0,20-0,35 mol/litro. Además, se añaden 1 ,5-2,5 volúmenes de etanol (95-99,5%) por volumen de la solución de proceso que precipita el producto en la solución. Le sigue centrifugación a > 2.000 G y a < 20°C durante 20-30 minutos, tras lo cual el sobrenadante se decanta y se desecha. Después, la pasta restante se añade al agua purificada para disolverla. La concentración del producto estaría ahora en el intervalo de 10-20% en peso volumen. El pH de la solución del producto se ajusta ahora a 6,5-7,5. La solución se filtra y después para eliminar todas las partículas. A continuación, a un volumen de la solución del proceso se añaden 1 ,5-2,5 volúmenes de etanol (95 -99,5%). Le sigue centrifugación a > 2.000 G y a < 20 °C durante 20-30 minutos, tras lo cual el sobrenadante se decanta y se desecha.

Reducción del tamaño y contenido de agua de la pasta precipitada Después, se carga un reactor de vidrio con etanol, volumen de 2 litros. Agitando el etanol se añade la pasta precipitada. La agitación mecánica solidifica la pasta y sustituye el agua presente por el etanol, dando una suspensión de partículas homogéneas. La agitación se interrumpe tras 1-2 horas, tras o cual se dejan sedimentar las partículas, después las aguas madre se decantan. Este procedimiento se repite dos veces. El precipitado se aisla en un filtro de polipropileno (PP). Este procedimiento se repitió dos veces más. Después de la eliminación del exceso de líquido, las partículas se pasan por un tamiz para obtener partículas de tamaño menor y uniformes.

Secado al vacío El producto se distribuye de forma uniforme en dos bandejas previamente pesadas y se introduce en una campana de vacío. La presión se reduce con una bomba de vacío, se anota la presión real obtenida y las bandejas se calientan a 35-40 °C con registro constante de la temperatura. Una corriente de nitrógeno se pasa a través del secador en este momento, manteniendo la presión baja en el secador. Cuando se obtiene un peso constante, es decir no se nota más evaporación, el secado se considera completo. El producto seco se distrobuye, se envasa y se protege de la humedad. El almacenamiento se realiza en un área seca a una temperatura de 20-25 °C.

El producto fabricado de este modo se puede preparar como producto farmacológico mediante un proceso aséptico convencional, tal como una solución que comprende 150 mg/ml de agente activo heparina modificada químicamente y fosfato de Na hasta 15 mM, pH 6-8. El producto farmacológico obtenido de este modo es para administración intravenosa o subcutánea. La heparina químicamente modificada resultante, DF02, es una forma despolimerizada de la heparina con un peso molecular promedio proyectado de 6,5-9,5 kDa y sin, esencialmente, actividad anticoagulante.

El DF02 tiene una distribución del tamaño de polímeros de polisacáridos con un intervalo para n de 2-25 correspondiente a pesos moleculares de 1 ,2-15 kDa. El tamaño predominante son 6-16 unidades de disacárido correspondientes a pesos moleculares de 3,6-9,6 kDa.

Mediante ensayos prácticos se puede encontrar que la reacción de la preparación de heparina oxidada en solución alcalina da lugar a cadenas que son demasiado cortas o a la ausencia del grado adecuado de sulfatación, para la función farmacéutica óptica de la heparina resultante. Adicionalmente, mediante pruebas prácticas, se puede demostrar que el tratamiento de la preparación de heparina en una solución de un pH inferior a 1 conduce a la desulfatación del producto y, por tanto, da lugar a una heparina modificada químicamente con un efecto farmacéutico menos que óptimo.

Tabla 1. Distribución de polisacáridos y su correspondiente masa molecular en DF02 (varios lotes) como % acumulado del peso El valor correspondiente para el peso molecular promedio en peso, Mw, entra dentro del intervalo de 6,5-9,5 kDa.

Tabla 2. Distribución de polisacáridos y su correspondiente masa molecular en DF02 como % acumulado del peso para un lote individual El valor correspondiente para el peso molecular promedio en peso, Mw, es 7,4 kDa.

Ejemplo 2 El ejemplo 2 representa una versión modificada del proceso de fabricación de acuerdo con el ejemplo 1. Determinados parámetros de proceso se han modificado, tales como temperaturas de proceso, con el fin de prevenir cualquier despolimerización inespecífica en la parte inicial del proceso.

Oxidación de ácido glucurónico e idurónico (residuos), eliminación de la actividad anticoagulante Una cantidad de aproximadamente 3.000 gramos de heparina se disuelve en agua purificada para obtener una solución al 10-20% en peso/volumen. El pH de esta solución se ajusta a 4,5-5,5. Posteriormente, a las solución del proceso se añade metaperyodato sódico (Nal04); cantidad de peryodato 15-25% del peso de la heparina. El pH se ajusta a de nuevo a 4,5 - 5,5. El reactor se cubre con el fin de proteger la reacción de la luz. La solución del proceso se hace reaccionar durante 22 - 26 horas con agitación constante y mantenimiento de la temperatura a 13 - 17 °C, mientras que durante las últimas dos horas la temperatura se disminuye a aproximadamente 5 °C. El pH al final del periodo de reacción se mide y se registra.

Terminación de la reacción de oxidación v eliminación de los compuestos que contienen yodo A la mezcla de reacción se añade etanol (95 - 99,5%) durante un periodo de 0,5 - 1 hora, con agitación cuidadosa y a una temperatura de aproximadamente 5 °C. El volumen de etanol a añadir está en el intervalo de 1-2 volúmenes de etanol por volumen de la solución del proceso. La heparina oxidada se deja después precipitar y sedimentar durante 15- 20 horas, tras lo cual las aguas madre se decantan y se desechan.

Después, el sedimento se disuelve en agua purificada para obtener una solución al 15-30% en peso/volumen. A continuación se añade NaCI para obtener una concentración de 0.15-0.30 mol/litro en la solución del proceso. La agitación continúa durante otra 0,5-1 hora manteniendo una temperatura de aproximadamente 5 °C. Posteriormente, a esta solución con agitación cuidadosa se añaden 1 ,0-2,0 volúmenes de etanol (95-99,5%) por volumen de solución del proceso durante un periodo de 0,5-1 hora. Esto precipita el producto de la solución. Esta precipitación continúa durante > 1 hora.

Reducción de los ácidos glucurónico/idurónico oxidados Esta etapa se realiza de conformidad con el Ejemplo 1.

Hidrólisis ácida para conseguir la despolimerización de las cadenas de polisacárido Esta etapa se realiza de conformidad con el Ejemplo 1 con la diferencia de que el tiempo de procesamiento se puede prolongar aproximadamente dos horas antes de elevar el pH a 7,0 con NaOH.

Las etapas adicionales del proceso para obtener un producto farmacológico que comprende, por ejemplo, 150 mg/ml de agente activo heparina modificada químicamente son idénticas a las etapas indicadas en el ejemplo 1.

Realizando las etapas del proceso de acuerdo con el ejemplo 2, se obtiene una heparina modificada químicamente con una distribución de peso molecular del polisacárido mostrada en la Tabla 1 del Ejemplo 1.

Ejemplo 3 El ejemplo 3 representa otro procedimiento de fabricación de heparinas modificadas químicamente de acuerdo con la invención, modificadas sometiendo directamente la solución del proceso procedente de la etapa de oxidación a un agente reductor fuerte antes de introducir cualquier etapa de precipitación.

Oxidación de ácido qlucurónico e idurónico (residuos), eliminación de la actividad anticoagulante Una cantidad de aproximadamente 3.000 gramos de heparina se disuelve en agua purificada para obtener una solución al 10-20% en peso/volumen. El pH de esta solución se ajusta a 4,5-5,5. Posteriormente, a la solución del proceso se añade metaperyodato sódico (NalO- ; cantidad de peryodato 15-25% del peso de la heparina. El pH se ajusta de nuevo a 4,5 - 5,5. El reactor se cubre con el fin de proteger la reacción de la luz. La solución del proceso se hace reaccionar durante 22 - 26 horas con agitación constante y mantenimiento de la temperatura a 13 - 17 °C. El pH al final del periodo de reacción se mide y se registra.

Reducción de los ácidos glucurónico/idurónico oxidados y eliminación de los compuestos que contienen yodo oxidado Manteniendo la temperatura a 13 - 17 °C, el pH de la solución se ajusta a 5,5-6,5. Se añade después a la solución nna cantidad de 130-200 gramos de borohidruro sódico y se disuelve, el pH aumentará inmediatamente a un pH de 10-11 y la reacción se continúa durante 14-20 horas. Se registra el pH de la solución, tanto antes como después de este periodo de reacción. Después de este tiempo de reacción, lentamente se añade ácido diluido con el fin de ajustar el pH a un valor de 4, lo que degrada el borohidruro sódico restante. Después de mantener un pH de 4 durante 45-60 minutos, el pH de la solución se ajusta a 7 con una solución de NaOH diluido.

Eliminación de compuestos que contienen yodo A la mezcla de reacción se añade etanol (95 - 99,5%) durante un periodo de 0,5 - 1 hora, con agitación cuidadosa y a una temperatura de 20-25 °C. El volumen de etanol a añadir está en el intervalo de 1-2 volúmenes de etanol por volumen de la solución del proceso. La heparina oxidada y posteriormente reducida se deja después precipitar y sedimentar durante 15- 20 horas, tras lo cual el licor madre se decanta y se desecha.

Después, el sedimento se disuelve en agua purificada para obtener una solución al 15-30% en peso/volumen. A continuación se añade NaCI para obtener una concentración de 0.15-0.30 mol/litro en la solución del proceso. La agitación continúa durante otra 0,5-1 hora manteniendo la temperatura de 15-25°C. Posteriormente, a esta solución con agitación cuidadosa se añaden 1 ,0-2,0 volúmenes de etanol (95-99,5%) por volumen de solución del proceso durante un periodo de 0,5-1 hora. Esto precipita el producto de la solución. Esta precipitación continúa durante > 1 hora.

Hidrólisis ácida para conseguir la despolimerización de las cadenas de polisacárido Después de decantar y desechar las aguas madre, el sedimento se disuelve mediante la adición de agua purificada hasta obtener una concentración de la solución del proceso de 15-30% en peso/volumen.

A la solución se añade un ácido diluido hasta obtener un pH de 3,0. La temperatura se mantiene a 50 - 55 °C, agitando la solución durante 5 horas de 5 a 10 horas. El progreso de la despolimerización se puede seguir mediante análisis durante el proceso del peso molecular, mediante GPC-HPLC, para determinar el tiempo real de reacción necesario. Después se añade una solución de NaOH diluido hasta obtener un pH de 7,0 y la solución de reacción se enfría hasta una temperatura de 13-17 °C. A continuación se añade cloruro sódico NaCI hasta obtener una concentración de 0,2-0,3 mol/litro.

Como alternativa, con el fin de controlar de forma similar el peso molecular promedio, el ácido diluido se puede añadir para obtener un pH de 3,5, pero para conseguir un nivel comparable de hidrólisis el tiempo del proceso se prolonga de 5 a 6 horas a de 8 a 9 horas. De acuerdo con ambas alternativas, el peso molecular promedio se mantiene dentro del intervalo de especificación de 6,5 a 9,5 kDa.

Las etapas restantes del proceso para obtener un producto farmacológico que comprenda, por ejemplo, 150 mg/ml de agente activo heparina modificada químicamente son idénticas a las etapas indicadas en el ejemplo 1.

Realizando las etapas del proceso de acuerdo con el ejemplo 3, se obtiene una heparina modificada químicamente con una distribución de peso molecular del polisacárido demostrado en la Tabla 1 del Ejemplo 1.

Tabla 3. Intensidad de las señales presentes en los espectros de RMN de H comparadas con la heparina en el intervalo de 5 a 6,5 ppm.

La Tabla 3 es un resultado de estudios de comparación de espectros de RMN de 1H en el intervalo de 5,0 a 6,5 ppm de heparinas modificadas químicamente producidas de acuerdo con los ejemplos 1 a 3.

La tabla 3 confirma que una heparina modificada químicamente fabricada con el proceso de acuerdo con el ejemplo 3 tiene como resultado un espectro de RMN de 1H con ausencia de señales inesperadas en el intervalo de 5,90 ppm a 6,14 ppm equivalente al de la heparina. Estas señales muestran una correlación con las estructuras de doble enlace parcialmente insaturadas que contienen aminas de glucosa, que pueden experimentar otras modificaciones químicas y contribuir a la decoloración del producto. En otros términos, el proceso de acuerdo con el ejemplo 3 no tiene como resultado residuos o estructuras sin identificar que son inesperados en los espectros de protones a partir de heparinas convencionales o heparina de bajo peso molecular.

Con el fin de confirmar que los procedimientos de acuerdo con la invención contribuyen a retener un nivel deseado de las cadenas de polisacáridos sulfatadas, se realizaron pruebas con un electrodo de medición de sulfato en muestras del líquido del proceso de la etapa de hidrólisis ácida, es decir muestras del líquido del proceso no sometidas a las etapas directamente posteriores del procesamiento y purificación en un producto de heparina modificada químicamente. Los resultados demuestran niveles de sulfato liberado (perdido) de los polisacáridos generalmente inferiores a 1.500 ppm. En otros términos, las pruebas confirman que los procedimientos de la invención inducen una pérdida de grupos sulfato no superior a un grupo sulfato por unidad de disacárido de 100 unidades de disacárido, las heparinas modificadas químicamente de acuerdo con la invención contienen un grupo sulfato por ácido idurónico, I2S y 2 grupos sulfato para la variante de glucosamina predominante, GIcNs. De acuerdo con lo anterior, las heparinas modificadas químicamente de acuerdo co la invención conservan al menos el 90% de los grupos sulfato correspondientes a la heparina.

La heparina modificada químicamente producida de acuerdo con los procesos del ejemplo 3 y procesadas hasta un producto exhibe un absorbencia muy baja a 400 nm (solución al 10%). Los valores de absorbancia varían entre 0,02 UA y 0,04 UA para un producto cuando se somete al proceso que incluye la hidrólisis a pH 3,5 o 3,0, respectivamente. Los valores de absorbancia bajos confirman que los efectos de cualquier despolimerización inespecífica asociada con la decoloración de reacciones secundarias de tipo Maillard (medidos como absorbancia a 400 nm) se minimizan y que cabe esperar una estabilidad adecuada de los productos de heparina modificada químicamente de acuerdo con la invención.

Ejemplo 4 Efectos antihemostáticos y anticoaqulación Se realizaron estudios sobre los efectos sobre los parámetros de coagulación y sobre la hemorragia de DF02 en ratas Sprague-Dawley macho adultas y jóvenes. También se estudió la heparina y una preparación de HBPM (Fragmina) para comparar. Los procedimientos de ensayo básicos fueron los siguientes: Quince minutos después de la administración i.v. del articulo de prueba, se realizó una incisión longitudinal en las ratas en la sección media dorsal de la cola. La incisión tenía una longitud de 9 mm y una profundidad de 1 mm y se estandarizó usando un dispositivo de plantilla. La sangre se transfirió desde la incisión hasta que paró el sangrado. El tiempo durante el cual se pudo observar sangrado visible se midió durante hasta 25 minutos. Cuanto más largo es el tiempo de hemorragia, más pronunciados son los efectos anticoagulantes del agente administrado.

Rata adulta Cuarenta minutos después de administrar la dosis se sacrificó a las ratas mediante exanguinación. Se preparó plasma de la sangre estabilizado con citrato. El plasma se almacenó en alícuotas de 1 o 0,5 mi a 70 °C hasta el análisis del APTT y el TP.

Los siguientes compuestos y dosis se analizaron (cada uno en grupos de 8 ratas) en ratas adultas: - Solución salina: (Control negativo) - Heparina: 0,7, 1 ,5, 3,5 y 7,0 mg/kg - Fragmina: 1 ,5, 3,5, 7,0 y 35 mg/kg . DF02: 3,5, 7,0, 35, 70, 105, 210. 350 y 700 mg/kg Rata joven Los siguientes compuestos y dosis se analizaron (cada uno en grupos de 8 ratas) en ratas jóvenes de 14 +-1 día de edad: 2. Solución salina: (Control negativo) 3. DF02: 7,0, 35. 70 y 105 mg/kg El tiempo de hemorragia y los parámetros de coagulación tal como se miden en los animales adultos revelaron que DF02 tiene un efecto anticoagulante bajo en ratas.

La potencia de DF02 fue menor que la de los anticoagulantes heparina y fragmina, ambos con un efecto profundo sobre todos los parámetros, estando el efecto correlacionado directamente con la dosis en cuestión. El efecto sobre el PT fue demasiado débil como para permitir estimaciones comparativas.

El tiempo de hemorragia y los parámetros de coagulación establecidos en los animales jóvenes indican que DF02 tiene un efecto anticoagulante bajo también en ratas jóvenes. El cambio en el tiempo de hemorragia y los parámetros de coagulación en las ratas jóvenes están en el mismo intervalo que en las ratas adultas. Como en las ratas adultas, también en las ratas jóvenes el efecto sobre el PT fue débil.

Para entender mejor la diferencia en la potencia anticoagulante de los compuestos de heparina modificada químicamente se calculó una estimación de las dosis relativas equipotenciales (Tabla 4). La relación entre las dosis relativas equipotenciales estimadas se calculó con respecto a los efectos sobre el tiempo de hemorragia y el APTT medido en el modelo de hemorragia en ratas. La normalización o el comparador se establecieron con respecto a la heparina no fraccionada, véase la Tabla 4, de debajo.

Tabla 4 La tabla 5 siguiente muestra las actividades anticoagulantes específicas de DF02 mediante ensayos con anti-factor Xa y anti-factor lia.

Tabla 5 Para comparar, el correspondiente valor para la heparina no fraccionada (UHF) es al menos 180 Ul/mg.

Ejemplo 5 Investigación de la formación de rosetas y citoadherencia en sangre infectada por paludismo Se han investigado los efectos de DF02 en modelos de paludismo in vitro, por ejemplo rotura de las rosetas en eritrocitos infectados y no infectados, y prevención o alteración de la citoadherencia de eritrocitos infectados al endotelio. En ambos modelos, se ha demostrado que DF02 es eficaz de un modo dependiente de la dosis. Se demostró una potencia significativa de DF02 en estudios de campo, en los que se analizó in vitro el roseteo en eritrocitos frescos infectados por el parásito (pE) de pacientes con paludismo leve o complicado. También se han analizado los efectos de bloqueo de DF02 sobre la invasión por merozoítos de los eritrocitos in vitro. En este modelo se demostró la misma potencia de DF02 por mg de heparina.

Resultados Se ha analizado la sensibilidad a DF02 en ensayos de reseteo y citoadherencia de un clon del parásito con alta formación de rosetas y multiadhesivo (FCR3S1.2) así como de aislados de parásitos de pacientes graves. DF02 rompe las rosetas de muchos cultivos de parásitos analizados de un modo dependiente de la dosis y una rotura total o casi total de las rosetas se alcanzó a 1.000 µg/ml con algunos parásitos (Fig. 5). Las rosetas de aislados clínicos también fueron sensibles a DF02. DF02 también se ha investigado en campo. Cuarenta y siete parásitos de niños con paludismo que muestran el fenotipo de reseteo se trataron con DF02. El 91 % de las muestras de sangre con roseteo recogidas de niños con paludismo grave/complicado mostró un 50% de rotura de las rosetas a la concentración más alta analizada (1.000 µg/ml) (Fig. 6). El efecto de DF02 sobre la unión de los pE a las células endoteliales (citoadherencia) se ha evaluado de forma similar mediante incubación dinámica con el fin de imitar las condiciones del flujo sanguíneo in vivo. El efecto directo sobre la unión primaria a las células endoteliales se analizó añadiendo pE junto con DF02 de forma simultánea al endotelio (bloqueo de la citoadherencia). Hasta el 80% de la unión de los pE se pudo bloquear mediante DF02 en comparación con las muestras sin tratar. Con el fin de analizar la eficiencia de DF02 para desplazar los pE ya unidos del endotelio, los pE se dejaron adherir al endotelio antes de incubar con DF02 a concentraciones finales diferentes (rotura de la citoadherencia). La alteración de citoadherencia con DF02 dio como resultado una reducción de hasta un 80% de la unión (Fig.7). Algunos cultivos de parásitos fueron más sensibles que otros.

Ejemplo 6 Efectos de DF02 sobre la invasión por merozoítos de eritrocitos in Vitro El ciclo de vida dentro del eritrocito de P. falciparum es corto y los pE se rompen cada 48 horas y liberan parásitos que vuelven a invadir los eritrocitos sin infectar. Anteriormente se ha demostrado que la heparina inhibe el cultivo continuo de P. falciparum in vitro al bloquear la invasión por merozoítos de los eritrocitos. Por tanto, se analizaron los efectos de bloqueo de DF02 sobre la invasión por merozoítos de los eritrocitos usando un ensayo in vitro (Fig. 8). DF02 bloqueó la invasión por merozoítos de un modo dependiente de la dosis y la inhibición fue más del 80%. Se descubrió que los efectos inhibidores de DF02 eran iguales a los de la heparina estándar.

Método El ensayo de inhibición de la invasión por merozoítos se realizó con heparina modificada químicamente y heparina no fraccionada. Cultivos de P. falciparum sincronizados con pE maduros (trofozoítos) con una parasitemia del 0,4% y un hematocrito del 2% se cultivaron en microcultivos (100 µ?) en presencia de concentraciones crecientes de heparina modificada químicamente o heparina no fraccionada a 37 ° C durante 24-30 horas. Con el fin de cuantificar la parasitemia, las muestras se tiñeron durante 10 segundos con naranja de acridina y después se analizaron usando un instrumento FACS de Becton Dickinson, Se recogió un mínimo de 50.000 células por muestra.

Resultados Se analizaron los efectos de bloqueo de DF02 y de la heparina estándar sobre la invasión por merozoítos de los eritrocitos usando un ensayo in vitro. DF02 bloqueó la invasión por merozoítos de un modo dependiente de la dosis y alcanzó una inhibición de hasta el 80%. Se descubrió que los efectos inhibidores de DF02 eran iguales a los de la heparina estándar.

Ejemplo 7 Liberación in vivo de eritrocitos infectados secuestrados La eficacia de DF02 para liberar eritrocitos infectados unidos de microvesículas pulmonares a la circulación sanguínea se ha estudiado in vivo en ratas. Se demostró liberación de DF02 en la circulación de pE. En el modelo de ratas, una inyección del sustrato junto con los pE bloqueo hasta el 80% de la unión de pE en los pulmones de rata. De un modo similar, cuando se inyectó primero pE y se dejó que se unieran a la microvasculatura de los animales durante 60 minutos, seguido de una inyección intravenosa de DF02 se observó que hasta el 60& de los pE previamente secuestrados se liberaba por acción del tratamiento (Fig. 9).

Método Se cultivaron pE humanos in vitro y se enriquecieron hasta una parasitemia por encima del 70%. Antes de la inyección en los animales, los eritrocitos infectados humanos se marcaron radiactivamente con 99mTc. Se anestesió a las ratas y los eritrocitos pE marcados se inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola. En las ratas tratadas se inyectaron junto con los pE marcados concentraciones diferentes de la heparina modificada químicamente o se inyectaron primero pE y, tras 3 minutos, se inyectaron concentraciones diferentes de heparina modificada químicamente, heparina no fraccionada, o sulfato de dextrano, mientras que en los animales control se inyectó pE marcados sin DF02, heparina o sulfato de dextrano.

La distribución de las células marcadas se monitorizó usando una cámara gamma durante 30 minutos. La cantidad relativa de células marcadas secuestradas en los pulmones se calculó comparando la actividad de los pulmones extirpados con la del animal entero.

Efecto de la heparina modificada químicamente s sobre el secuestro de pE en ratas in vivo Se realizaron estudios en ratas sobre el secuestro de pE, incluyendo roseteo y citoadherencia,. En este sistema in vivo, los pE de diferentes cepas y clones se adhieren fuertemente a los pulmones de rata de un modo dependiente de PfEMPI . El sistema muestra un efecto de bloqueo del secuestro de la heparina modificada químicamente DF02 sobre los pE con una reducción promedio máxima del 80% (aproximadamente) del secuestro. La inyección conjunta de eritrocitos humanos marcados no infectados con heparina modificada químicamente se comparó con la inyección de eritrocitos no infectados marcados sin heparina modificada químicamente. No se observaron diferencias y la cantidad global retenida fue muy baja. También se trató a las ratas con heparina modificada químicamente s después de que los pE marcados se habían secuestrado con el fin de estudiar la capacidad de la heparina modificada químicamente para liberar pE en la circulación. EL secuestro se redujo en aproximadamente un 50%.

Ejemplo 8 Investigación clínica de sevuparina sódica en pacientes de paludismo Estudio de fase l/ll, aleatorizado, abierto, con control activo y de grupos paralelos para evaluar la seguridad/eficacia de sevuparina/DF02 como tratamiento adyuvante en sujetos afectados con paludismo por falcifarum no complicado.

Los eritrocitos infectados por P. falciparum (pE) tienen la capacidad de secuestrarse en la microvasculatura profunda en muchos de los órganos vitales. La propiedad de secuestro está implicada en la generación de la gravedad y patología de la enfermedad, a través del flujo sanguíneo dificultado, reducción de la liberación de oxígeno y el consiguiente daño tisular, y se basa en la capacidad de los pE con trofozoítos para adherirse al endotelio vascular y a los eritrocitos sin infectar. El efecto combinado de la adhesión al endotelio y a los eritrocitos de los pE es el mecanismo fundamental que conduce a la obstrucción de la microvasculatura y, de este modo, a los síntomas clínicos del paludismo grave.

La sevuparina sódica se administra como una infusión i.v. en combinación con atovacuona/proguanil (Malanil®) como tratamiento antipalúdico de sujetos varones y mujeres (de 18 a 65 años de edad) afectados por paludismo no complicado. A la parte de aumento de dosis (parte 1) le sigue una comparación abierta y aleatorizada del tratamiento con sevuparina sódica y Malanil® frente a Malanil® solo (parte 2). La sevuparina sódica se administra a cada paciente 4 veces al día y la atovacuona/proguanil (Malanil®) se administra a cada paciente de acuerdo con su indicación de prospecto. Las ramas del estudio son sevuparina sódica en combinación con atovacuona/proguanil (Malanil®) y atovacuona/proguanil (Malanil®) solo como control.

Método Las curvas de aclaramiento del parásito y estad ificación secuencial del parásito en sangre de pacientes tratados con DF02 se comparan con el grupo de control. La citoadherencia y, por tanto, el secuestro de pE que contienen las formas más maduras del parásito se ven afectados por DF02, una elevación temporal de la parasitemia y aparición de estadios más maduros del parásito en sangre periférica. Las curvas de aclaramiento en relación con la estadificación en sangre periférica se modelan usando la distribución del estadio, la proporción del secuestro específico del estadio y el aclaramiento de los parásitos específicos del estadio a través de quinina como parámetros. Un enfoque similar se ha analizado en la evaluación de levamisol como terapia adyuvante antiadhesiva en el paludismo por falcifarum (Dondorp et al. J Infecí Dis 2007; 196:460-6). Las diferencias en el secuestro entre pacientes tratados con DF02 y el grupo de control se evaluaron comparando los números integrados (en parásitos por microlitro) y parasitemia (en porcentajes) de parásitos en estadio de trofozoíto y esquizonte observados en la sangre periférica durante hasta 72 horas, determinados como el área bajo la curva tiempo-parasitemia. Los estadios morfológicos bien definidos del parásito consisten en los siguientes: anillos muy pequeños, anillos pequeños, anillos grandes, trofozoítos tempranos, trofozoítos medios, trofozoítos tardíos y esquizontes [Silamut K, et al. Am J Pathol 1999; 155:395-410]. Las edades de estadios asexuales (de la invasión por merozoítos) del parásito que bordean los estadios morfológicos, evaluado mediante cultivo in vitro, son, respectivamente, 12, 17, 22, 28, 37 y 42 h. Una cohorte de formas de anillos grandes en el ingreso evoluciona al estadio de trofozoíto temprano 6 horas después. Otras cohortes correspondientes incluyen anillos muy pequeños en el ingreso y anillos pequeños y grandes combinados tras 12 horas, anillos pequeños en el ingreso y anillos grandes tras 6 horas, trofozoítos tempranos tras 12 horas y trofozoítos medios tras 18 horas, y anillos grande en el ingreso y trofozoítos medios tras 12 horas o trofozoítos tardíos tras 18 horas. La evaluación de los portaobjetos de sangre periférica la realizan dos técnicos en microscopía independientes que desconocen la asignación del fármaco del estudio. medios, trofozoítos tardíos y esquizontes [Silamut K, et al. Am J Pathol 1999; 155:395-410]. Las edades de estadios asexuales (de la invasión por merozoítos) del parásito que bordean los estadios morfológicos, evaluado mediante cultivo in vitro, son, respectivamente, 12, 17, 22, 28, 37 y 42 h. Una cohorte de formas de anillos grandes en el ingreso evoluciona al estadio de trofozoíto temprano 6 horas después. Otras cohortes correspondientes incluyen anillos muy pequeños en el ingreso y anillos pequeños y grandes combinados tras 12 horas, anillos pequeños en el ingreso y anillos grandes tras 6 horas, trofozoítos tempranos tras 12 horas y trofozoítos medios tras 18 horas, y anillos grande en el ingreso y trofozoítos medios tras 12 horas o trofozoítos tardíos tras 18 horas. La evaluación de los portaobjetos de sangre periférica la realizan dos técnicos en microscopía independientes que desconocen la asignación del fármaco del estudio.

Claims (32)

REIVINDICACIONES

1. Heparina modificada químicamente con una actividad de antifactor II inferior a 10 Ul/mg, una actividad de antifactor Xa de hasta 10 Ul/mg y un peso molecular promedio de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9,5 kDa, caracterizada porque las cadenas de polisacáridos: (i) conservan al menos un 90% de los grupos sulfato de la correspondiente heparina nativa; (ii) comprenden de 2 a 25 unidades de disacárido correspondientes a pesos moleculares de 1 ,2 a 15 kDa; (iii) tienen una reducción de las secuencias de sacáridos químicamente intactas que proporcionan un efecto anticoagulante mediado por la antitrombina, en comparación con las cadenas de polisacáridos de la heparina nativa; y (iv) tienen una reducción de las unidades de ácido idurónico y/o glucurónico sin sulfatar en comparación con la heparina nativa.

2. Heparina modificada químicamente de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque las cadenas de polisacáridos predominantes tienen de 6 a 16 unidades de disacárido con pesos moleculares de aproximadamente 3,6 a aproximadamente 9,6 kDa.

3. Heparina modificada químicamente de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque al menos el 30% de las cadenas de polisacáridos tiene un peso molecular de al menos 8 kDa.

4. Heparina modificada químicamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque comprende cadenas de polisacáridos terminadas con un residuo de treonato o con un derivado de treonato.

5. Heparina modificada químicamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el disacárido predominante del polisacárido es un disacárido que tiene la estructura química: en la que R' es un residuo de treonato o un residuo de derivado de treonato; y n es un número entero de 2 a 25.

6. Heparina modificada químicamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque comprende residuos de glicol divididos de la estructura química:

7. Heparina modificada químicamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el 3 - 15 % de las cadenas de polisacáridos tienen una masa molecular de al menos 15 kDa.

8. Heparina modificada químicamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el 25 - 47 % de las cadenas de polisacáridos tienen una masa molecular de al menos 9 kDa.

9. Heparina modificada químicamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el 40 - 60 % de las cadenas de polisacáridos tienen una masa molecular de al menos 7 kDa.

10. Heparina modificada químicamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el 60 - 80 % de las cadenas de polisacáridos tienen una masa molecular de al menos 5 kDa.

11. Heparina modificada químicamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque al menos el 85 % de las cadenas de polisacáridos tiene una masa molecular de al menos 3 kDa.

12. Heparina modificada químicamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizada porque al menos el 95 % de las cadenas de polisacáridos tiene una masa molecular de al menos 2 kDa.

13. Heparina modificada químicamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque tiene un espectro de RMN de H en el intervalo de 5,0 a 6,5 ppm conforme con un espectro de RMN de 1H de heparina nativa por la ausencia de cualquier señal de protón con una magnitud superior a 0,1 (mol) %.

14. Heparina modificada químicamente tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para uso en terapia.

15. Heparina modificada químicamente tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para uso en el tratamiento del paludismo.

16. Uso de una heparina modificada químicamente tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento del paludismo.

17. Un procedimiento para el tratamiento del paludismo que comprende la administración a un paciente que necesite dicho tratamiento de una cantidad terapéuticamente eficaz de una heparina modificada químicamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

18. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una heparina modificada químicamente tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, junto con un vehículo farmacéutica y farmacológicamente aceptable.

19. Un procedimiento de preparación de heparina modificada químicamente con una actividad de antifactor II de hasta 10 Ul/mg, una actividad de antifactor Xa de hasta 10 Ul/mg y un peso molecular promedio (promedio en peso, Mw) de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9,5 kDa, el procedimiento estando caracterizado porque comprende las etapas consecutivas de: (a) oxidar de forma selectiva heparina no fraccionada sometiéndola a un agente oxidante capaz de oxidar residuos de sacáridos no sulfatados; (b) reducir el residuo de sacárido oxidado resultante; y (c) despolimerizar las cadenas de la heparina mediante hidrólisis a un pH ácido de aproximadamente 3 a aproximadamente 4.

20. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque además comprende al menos una etapa de eliminación del agente oxidante restante.

21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado porque al menos una etapa de eliminación comprende eliminar las formas reducidas del agente oxidante.

22. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 , caracterizado porque comprende una etapa de eliminar cualquier agente oxidante restante y retirar las formas reducidas del agente oxidante entre la etapa de reducción (b) y la etapa de despolimerización (c).

23. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende despolimerizar las cadenas de la heparina mediante hidrólisis a un pH ácido de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 3,5.

24. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque la etapa de eliminación comprende añadir un alcohol en una cantidad suficiente para que la heparina modificada químicamente precipite.

25. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, caracterizado porque la despolimerización se realiza a una temperatura de al menos 20 °C.

26. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 25, caracterizado porque la heparina modificada químicamente está enriquecida con cadenas de polisacáridos que tienen un peso molecular de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 10,5 kDa.

27. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, caracterizado porque los ácidos idurónico no sulfatado y/o glucurónico no sulfatado se oxidan de forma selectiva mediante un compuesto peryodato.

28. Una heparina modificada químicamente fabricada por un procedimiento de tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27.

29. Una combinación caracterizada porque comprende una heparina modificada químicamente tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y otro medicamento para el tratamiento del paludismo.

30. Una combinación de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizada porque el otro medicamento es atovacuona/proguanil.

31. Una combinación de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizada porque el otro medicamento es artesunato.

32. Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 , caracterizada porque la heparina modificada químicamente es sevuparina sódica.