JPH08509746A - 血漿タンパクの浄化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は水溶性血漿タンパクを含む水性組成物中のウイルス不活性化化学薬品乃至洗浄剤の還元法に関するものである。ホフマイスターの順列による高塩析効果を有する塩の温度と０．５Ｍ以上の濃度との適当な組合わせを選ぶことにより前記ウイルス不活性化化学薬品乃至洗浄剤を含む小泡を形成する。これらの小泡を前記水性相からたとえば相分離もしくは濾過により除去し、また前記タンパクをその後、前記水性相から分離する。前記水溶性血漿タンパクはたとえば抗トロンビンIII、トランスフェリンもしくはアルブミンにすることができる。前記水性相がたとえば室温で１Ｍ以上の濃度のクエン酸塩もしくは硫酸塩から成る時に、ウイルス不活性化化学薬品もしくは洗浄剤の還元が２０００倍以上と高く、最終濃度が５ｐｐｍ以下を示す。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 血漿タンパクの浄化 発明の技術分野 本発明は水溶性血漿タンパクを含む水性組成物のウイルス不活性化化学薬品乃 至洗浄剤の還元法に関するものである。ホフマイスター順列による高塩析効果を 有する塩の温度と０．５Ｍ以上の濃度の適当な組合わせの選択とにより、ウイル ス不活性化化学薬品乃至洗浄剤を含む小泡を形成させる。これらの小泡を水性相 からたとえば相分離もしくは濾過により除去し、その後、タンパクを水性相から 分離させる。水性相がクエン酸塩もしくは硫酸塩の室温で１Ｍ以上の濃度の塩か ら成る時、ウイルス不活性化化学薬品乃至洗浄剤の還元が２０００倍以上にもな って、最終濃度は５ｐｐｍ以下になり得る。 発明の背景 血液製剤たとえば抗血友病因子、アルブミン、クリスマス因子ならびに抗トロ ンビンのようなウイルス不活性化は製造業者にとって周知の問題である。これは 標準的には加熱により解決される問題である。血液製剤がこのような方法で不活 性化されない場合は、ウイルス不活性化化学薬品を添加して用いることができる 。しかし、この場合は、添加化学薬品を除去してから医療製品を用いる必要があ る。 ヨーロッパ特許出願番号第０２１８０９０号（マイル ズ・ラボラトリーズ）は塩分配技術を用いて２液相を発生させる能力を有する成 分を含む水性系統からのタンパクもしくは核酸の分離ならびに回収法に関するも のである。この方法では、重合体と水溶性塩たとえば燐酸カリウムまたは燐酸ナ トリウム、もしくは硫酸アンモニウムをタンパクあるいは核酸に添加、そこで生 成溶液を残して分離する。ウイルス不活性化化学薬品もしくは洗浄剤に関する情 報並びに配合物の濃度を低下させる技法に関する情報が欠けている。 ヨーロッパ特許出願番号第０２３９８５９号（ニューヨーク血液センター）は 脂質可溶性プロセス薬品、たとえばウイルス不活性化溶剤乃至洗浄剤を前記生体 学的材料から油抽出物との接触、生成混合物の撹拌、上相と下相の沈降もしくは 遠心分離による分離、そして油と抽出ずみプロセス薬品を含む上相の移注により 除去する方法に関するものである。有機もしくは無機であって高塩析効果を有す る塩の添加、あるいはそれらの共存により得られる利点についての情報は何もな い。水性相でこれらの塩がないと、抽出工程を反復することによって十分に低い 不活性化溶剤乃至洗浄剤のレベルに達するには複雑な工程を必要とする。 ヨーロッパ特許出願第０１３１７４０号（ニューヨーク血液センター）にタン パク含有組成物をジアルキルリン酸塩もしくはトリアルキルリン酸塩と、なるべ くなら非イオン性洗浄剤との共存で接触させることでウイルス の不活性化を行う。この開示によれば、ジアルキルリン酸塩もしくはトリアルキ ルリン酸塩はタンパクをグリシンおよび塩化ナトリウムで沈殿させて除去する。 洗浄剤はダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、クロマト グラフィック吸着と沈澱の中で選ばれたいくつかの工程により除去できる。 これらの方法は骨の折れる時間浪費で、しばしば洗浄剤とウイルス不活性化化 学薬品の還元を十分に示さないものである。 １９９１年発行の「バイオセパレーション」、第２巻、第３１５頁乃至第３２ ４頁のアール、エー、ラメルメイアーによる論文で、疎水性酵素が発酵ブイヨン からたとえば温度と塩の濃度を変動させて洗浄剤を基剤とする２相系統に浄化で きることが知られている。０．２Ｍ以上の塩の濃度は用いられなかった。酵素は 洗浄剤相で回収され、かつ８０乃至９０％まで回収できる。 発明の概要 ここで、特定の塩の濃度を血漿タンパク（血漿から分別されたものか、あるい は生成された組換え体のいずれか）、ウイルス不活性化化学薬品、好ましくは燐 酸トリ−ｎ−ブチル（ＴＮＢＰ）及び／又は洗浄剤好ましくはトリトン（登録商 標）を含む組成物中で０．５Ｍ以上に増加させると、ＴＮＢＰの濃度は１ｐｐｍ 以下に減少、またトリトンの濃度も水性相で５ｐｐｍ以下に減少させ得ることが 意外にもわかった。 ウイルス不活性化化学薬品もしくは洗浄剤あるいはその混合物を添加したタン パク組成物の浄化法をこのようにして見出した。この１行程法は先に周知の多行 程法に比べ実施が容易である。そのうえ、本方法は小泡の形成がほぼ瞬間的であ るので、迅速に実施できる。さらに、本方法は最終製品に与えるウイルス不活性 化化学薬品ならびに洗浄剤の量が先の諸法に比べ同じかそれ以下である。 従って、本発明は水溶性血漿タンパクを含む水性組成物中のウイルス不活性化 化学薬品乃至洗浄剤の濃度を減少させる方法で、前記ウイルス不活性化化学薬品 乃至洗浄剤を含む小泡を、ホフマイスター順列による高塩析効果と、濃度と０． ５Ｍ以上の塩の濃度の適当な組合わせの選択により形成し、その後、事実上小泡 すべてを水性相から除去し、タンパクを水性相から引続き分離させることを特徴 とする方法に関するものである。 本発明は０℃乃至７０℃の範囲の組成物の温度で実施できる。０℃の温度以下 では組成物は凍結しているか、あるいは粘度が少なくとも高い。７０℃以上の温 度では、タンパクが程度の違いはあるが変性していて、その活性を失っている。 前記組成物の温度は１０℃乃至５０℃の範囲、なるべくなら２０℃乃至３０℃が 適当で好ましい。 一般に言って、多量の電解液を親液性ゾルすなわち極めて小さい親水性粒子を 含む組成物に添加する結果として分散物質を沈降させることになる。その結果を “塩析 出”と称する。塩析出効果はイオン、主として陰イオンの性質によるが、陽イオ ンも関連する。前記イオンは親液性物質をコロイド溶液から除去する能力の順に 配列できる。これを時にはホフマイスターの順列、さらに一般的には離液順列と 呼ぶ。ここで１９４６年４月トロントのヴァンノストランド社発行、エス・グラ ストーン著「テキストブック オブ フィジカル ケミストリ」、第２版、第１ ２５４頁乃至第１２５９頁を参照する。ホフマイスター順列による高塩析効果を 有する塩は塩化物イオンよりも高い塩析効果を有する陰イオンをもつものである 。この範囲の陰イオンは１価、２価及び３価陰イオンを含む。２価もしくは３価 陰イオン、なるべくなら３価陰イオンを適切に用いることが好ましい。この範囲 の陰イオンの主なる実施例はクエン酸塩、酒石酸塩、硫酸塩、酢酸塩、燐酸塩お よび浄化物であって、なるべくならクエン酸塩、酒石酸塩ならびに硫酸塩が好ま しい。本発明で有利に用いることができる陽イオンは１価の陽イオンたとえばリ チウム、ナトリウム、アンモニウムならびにカリウムである。単純性と薬剤とし て許容される添加物であるが故に、ナトリウム、アンモニウムもしくはカリウム が好ましく、そのうちナトリウムが最も好ましい。従って、本発明で特に好まし い塩はクエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウムならびに硫酸ナトリウムである。 上述のように異なる陰イオン乃至陽イオンをもつ塩の混合物を有利に用いること ができることも本発明の範 囲内である。さらに、上述と同一もしくは異なる塩の添加を有利に順次実施でき る。 本発明の発明者はここで塩の濃度を本発明による０．５Ｍ以上に増加させると 、ウイルス不活性化化学薬品乃至洗浄剤が小泡、好ましくはミセルを沈降させる 代りに溶液中に形成させることになることが予期に反してわかった。小泡の形成 と、それにより達成できるウイルス不活性化化学薬品乃至洗浄剤の濃度減少は水 性相での高塩析効果を有する塩の温度と濃度の組合わせに左右される。室温での 塩の濃度はなるべくなら１Ｍ以上であることが好ましい。温度を室温以上に上昇 させることにより、より低い塩の濃度を使用できる。より低い温度ではより高い 塩の濃度が必要となる。温度を０℃乃至７０℃にできるが、その時の塩の濃度は それぞれ１．５Ｍ以上と０．５Ｍ以上となるはずである。塩の濃度は２．５Ｍ以 上であってはならない。これが塩乃至タンパクの沈降をもたらすことになるから である。なるべくなら塩の濃度が２．０Ｍ以下であることが好ましい。 小泡は水性相からたとえば相分離、濾過もしくは遠心分離あるいはその順序、 なるべくなら相分離の後の濾過の順序が好ましい。小泡を相分離により除去する と、組成物は滞留時間の間残されて、ウイルス不活性化化学薬品乃至洗浄剤を事 実上完全に水性相の上面で回収させるか、あるいは油が共存する場合、油相中も しくは油相の上面で回収させる。このようにして油、たとえば大豆油 をなるべくなら組成物に添加してから相分離を行うことが好ましい。この方法で 、小泡をより迅速にかつより完全にタンパク含有水性相から分離する。油が共存 する適当な滞留時間は最低１０分乃至最高２時間の範囲にある。油が共存しない 適当な滞留時間は最低約１５分乃至最高４時間の範囲にある。濾過を用いて小泡 を除去する時、これはすぐに実施できる。これは小泡が本発明の慎重に選ばれた 条件下で瞬間的に形成されるからである。 用いられるウイルス不活性化化学薬品は洗浄剤の少なくとも一部分としてある ように、一般的に疎水性である。用いられるウイルス不活性化化学薬品は１乃至 １０の炭素原子を適当に備える分枝状もしくは枝なし、また置換あるいは置換し ていないアルキル基を有するジアルキル−もしくはトリアルキル基にすることが できる。適当なトリアルキルリン酸塩の実施例はアルキル基がｎ−ブチル、ｔ− ブチル、ｎ−ヘキシル、２−エチルヘキシルおよびｎ−デシルであるものである 。ウイルス不活性化化学薬品はなるべくならトリ−ｎ−ブチルリン酸塩（ＴＮＢ Ｐ）であることが好ましい。各種のジアルキルリン酸塩の混合物も各種のトリア ルキルリン酸塩と同様に使用できる。ジアルキルリン酸塩とトリアルキルリン酸 塩の混合物も本発明の範囲内での使用が可能である。 洗浄剤は適当なものとしてポリオキシエチレンエーテル、たとえばトリトン（ 登録商標）、あるいはポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノラウレー トもし くはポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノオレエートのようなポリオ キシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである。なるべくなら洗浄剤はトリトン Ｘ−１００（登録商標）であることが好ましい。 タンパクはたとえば抗血友病因子、クリスマス因子、アルブミン、トランスフ ェリン、アルフア１−酸の糖タンパク質もしくは抗トロンビンIIIにすることが できる。処理されるタンパクは血漿分離と、異なる血漿タンパク分離の一般方法 によるが、あるいは組換え方法により製造できる。 ウイルス不活性化工程には洗浄剤（たとえば、トリトン（登録商標）乃至トリ トンＸ−１００（登録商標））ならびにウイルス不活性化化学薬品たとえばトリ −ｎ−ブチルリン酸塩（ＴＮＢＰ）を水溶液中でタンパクに添加することが含ま れる。その後、水溶液を撹拌する。組成物の温度と塩濃度を調整して小泡を形成 させる。不活性化ずみ溶液になるべくなら油を添加（たとえば約５％）する。そ の後、混合物を分離装置たとえば分離漏斗で相分離できる。タンパクは水性相か ら、たとえばダイアフィルトレーション、脱塩、クロマトフラフィーもしくは沈 澱により容易に分離できる。 ＰＨは標準的には５以上、なるべくなら６以上であることが好ましい。 ウイルスの不活性化化学薬品と洗浄剤の薬学上の許容濃度は特定の化合物によ り変動する。本方法での５ｐｐ ｍ以下の洗浄剤と１ｐｐｍ以下の不活性化化学薬品は標準的には水性相で見出さ れる。これらの濃度はこのような化合物の通常認められた薬剤的許容濃度を十分 下回るものである。これはタンパクの分離以外、標準的にはさらなる沈澱工程を 必要としないことを意味し、これは血漿タンパクの製造に大きい利点である。し かしながら、アルブミンで行う場合、イオン交換もしくは親和クロマトグラフィ ーのようなさらなる浄化工程が必要と考えられる。 実施例 次の実施例は本発明の範囲を制限することなく具体的に示すものである。 実施例１ 抗トロンビンIII（ＡＴIII）をスウェーデン国のファーマシア アクチボラー グ社により血漿から製造した。前記ＡＴIIIはヘパリンセファロースのゲルを用 いて血漿から分離したものであった。 １００ｍｌの２％のＡＴIII溶液に、１．５ｇの原液（３部のＴＮＢＰと１０ 部のトリトンＸ−１００）を添加した。前記ＴＮＢＰとトリトンＸ−１００はそ れぞれドイツ国のメルク社と米国のユニオンカーバイド社製の市販品であった。 前記溶液の温度を２４℃に調整し、その溶液を少なくとも３時間の間撹拌した。 ２Ｍのクエン酸ナトリウムと０．０５Ｍの燐酸ナトリウムを含む１００ｍｌの緩 衝液を緩やかに添加した。クエン酸塩の生成 濃度は１Ｍであった。前記溶液を添加中、緩やかに撹拌した。大豆油をそこで約 ５％になるまで添加した。前記溶液を３０分間緩やかに撹拌、その後、９０分間 そのままにして相分離させた。 油相の上面中、あるいは上面にミセルが見られた。ＡＴIIIが見られる水性相 の底部におけるトリトンＸ−１００の含量は５ｐｐｍ以下、ＴＮＢＰの含量は１ ｐｐｍ以下であった。ＡＴIIIの活性度の回復率は９５％以上であった。 実施例２ スウェーデン国のファーマシア アクチボラーグ社の製造にかかるトランスフ ェリンをＦｒＩＶから「コーンの低温エタノール法」で分離し、さらにクロマト グラフィーにより浄化した。 １００ｍｌの２％のトランスフェリン溶液に１．５ｇの原液（３部のＴＮＢＰ と１０部のトリトンＸ−１００）を添加した。前記溶液の温度を２４℃に調整、 前記溶液を少なくとも３時間の間撹拌した。２Ｍのクエン酸ナトリウムと０．０ ５Ｍの燐酸ナトリウムを含む１００ｍｌの緩衝液を緩やかに添加した。クエン酸 塩の生成濃度はそれ故に１Ｍであった。前記溶液を添加中と、さらにその後３０ 分間緩やかに撹拌してからそままにして相分離させた。 前記溶液型洗浄剤処理溶液を３等分量に分割した。 第１量中のミセルを濾過により直ちに分離した。 第２量をさらなる処理を行わないでそのままに残して相分離させた。その後、 底部相のＴＮＢＰとトリトンＸ−１００の分析を行った。前記水性相の上面にミ セルが見出された。 第３量に大豆油を添加し、実施例１により引続き処理した。前記油相中あるい はその上面にミセルが見出された。 前記ミセルをタンパク溶液から分離する３つの方法のどれをとってみても、水 性相におけるトランスフェリンの回収率は９５％を上回った。前記３方法のどれ をとってみても、ＴＮＢＰの含量は１ｐｐｍ以下、そしてトリトンＸ−１００の 含量は５ｐｐｍ以下であった。 実施例３ 抗トロンビンIII（ＡＴIII）はスウェーデン国のファーマシア アクチボラー グ社により血漿から製造された。前記ＡＴIIIはヘパリンセファロースのゲルを 用いて血漿から分離されたものであった。 １００ｍｌの２％のＡＴIII溶液に、１．５ｇの原液（３部のＴＮＢＰに１０ 部のトリトンＸ−１００を加えたもの）を添加した。前記溶液の温度を２４℃に 調整し、その溶液を少なくとも３時間の間撹拌した。２Ｍの硫酸ナトリウムと０ ．０５Ｍの燐酸ナトリウムを含む１００ｍｌの緩衝液を緩やかに添加した。硫酸 塩の生成濃度はそれ故に１Ｍであった。前記溶液を添加の間とその後３０分間緩 やかに撹拌してからそれをそのままに残して相 分離した。前記溶液をそこで直ちに濾過した。濾液中の抗トロンビンIII活性度 の９５％以上が回復した。トリトンＸ−１００の含量が５ｐｐｍ以下、そしてＴ ＮＢＰの含量が１ｐｐｍ以下であった。 実施例４ スウェーデン国のファーマシア アクチボラーグ社の製造にかかるアルブミン を改良、コーンの低温エタノールにより分離した。 １００ｍｌの２％アルブミン溶液に、１．５ｇの原液（３部のＴＮＢＰに１０ 部のトリトンＸ−１００を加えたもの）を添加した。前記溶液の温度を２４℃に 調整し、その溶液を少なくとも３時間の間撹拌した。２Ｍのクエン酸ナトリウム と０．０２Ｍの酢酸ナトリウムを含む１００ｍｌの緩衝液を緩やかに添加した。 クエン酸塩の生成濃度はそれ故に１Ｍであった。前記溶液を添加の間と、その後 ３０分間緩やかに撹拌してからそれをそのままに残して相分離させた。前記溶液 をそこで直ちに濾過した。濾液中のアルブミン活性度の９５％以上が回復された 。トリトンＸ−１００の含量が２５０ｐｐｍ、そしてＴＮＢＰの含量が３５ｐｐ ｍであった。 前記アルブミン溶液中のウイルス不活性化剤のこれらの比較的高い濃度はアル ブミンの疎水剤を捕捉する能力で説明がつく。アルブミンの１つの目的は血液中 の疎水性の分子を輸送することにある。従って、アルブミンを用いると、たとえ ばクロマトグラフエ程もしくはダイア フィルトレーションのさらなる分離を必要とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/16 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/04 38/46 9455−4Ｃ 37/14 9455−4Ｃ 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）水溶性血漿タンパクを含む水性組成物中のウイルス不活性化化学薬品乃至 洗浄剤の濃度減少の方法であって、該ウイルス不活性化化学薬品乃至洗浄剤を含 む小泡をホフマイスターの順列による高塩析効果を有する塩の温度と０．５Ｍ以 上の濃度との適当な組合わせを選ぶことにより形成させ、その後、前記小泡の事 実上全てを水性相から除去し、引続きタンパクを前記水性相から分離させること を特徴とする濃度減少方法。 ２）前記塩がクエン酸塩、酒石酸塩、硫酸塩、酢酸塩もしくは燐酸塩あるいは その混合物から成る群より選ばれる陰イオンを有することを特徴とする請求の範 囲第１項に記載の濃度減少方法。 ３）前記塩がクエン酸塩もしくは燐酸塩あるいはその混合物から成る群より選 ばれる陰イオンを有することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の濃度減少方 法。 ４）前記塩の濃度が室温から７０℃までの範囲の温度で１Ｍであることを特徴 とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載の濃度減少方法。 ５）前記塩の濃度が０℃から７０℃までの範囲の温度で１．５Ｍ以上であるこ とを特徴とする請求の範囲第１項乃至第４項のいずれか１項に記載の濃度減少方 法。 ６）前記小泡を水性相から相分離、なるべくなら濾過の後に行うことにより除 去する請求の範囲第１項乃至第５項のいずれか１項に記載の濃度減少方法。 ７）前記組成物に油を添加してから前記相分離を行うことを特徴とする請求の 範囲第６項に記載の濃度減少方法。 ８）前記小泡を水性相から濾過により除去することを特徴とする請求の範囲第 １項乃至第５項のいずれか１項に記載の濃度減少方法。 ９）前記水溶性血漿タンパクを血液から浄化することを特徴とする請求の範囲 第１項乃至第８項のいずれか１項に記載の濃度減少方法。 １０）前記水溶性血漿タンパクが組換え体であることを特徴とする請求の範囲 第１項乃至第８項のいずれか１項に記載の濃度減少方法。 １１）前記ウイルス不活性化化学薬品がトリ−ｎ−ブチルリン酸塩（ＴＮＢＰ ）であることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれか１項に記載 の濃度減少方法。 １２）前記洗浄剤がポリオキシエチレンエーテルであることを特徴とする請求 の範囲第１項乃至第１１項のいずれか１項に記載の濃度減少方法。 １３）前記洗浄剤がトリトン（登録商標）、なるべくならトリトンＸ−１００ （登録商標）であることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の濃度減少方法 。 １４）前記ｐＨが５以上、なるべくなら６以上であることを特徴とする請求の 範囲第１項乃至第１３項のいずれか１項に記載の濃度減少方法。 １５）前記ウイルス不活性化化学薬品乃至洗浄剤の濃度を５ｐｐｍ以下に低下 させることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第１４項のいずれか１項に記載の 濃度減少方法。 １６）前記タンパクが抗トロンビンIIIであることを特徴とする請求の範囲第 １項乃至第１５項のいずれか１項に記載の濃度減少方法。 １７）前記タンパクがトランスフェリンであることを特徴とする請求の範囲第 １項乃至第１５項のいずれか１項に記載の濃度減少方法。 １８）前記タンパクがアルブミンであることを特徴とする請求の範囲第１項乃 至第１５項のいずれか１項に記載の濃度減少方法。 １９）前記タンパク相を前記小泡が前記水性相から除去した後、イオン交換も しくは親和カラムに適応させることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の濃 度減少方法。