PT700300E

PT700300E - Purificacao de proteinas do plasma

Info

Publication number: PT700300E
Application number: PT94915731T
Authority: PT
Inventors: Sven Isaksson; Stefan Winge
Original assignee: Biovitrum Ab
Priority date: 1993-05-07
Filing date: 1994-05-06
Publication date: 2002-03-28
Also published as: CA2161804C; NO313084B1; ES2164702T3; AU677332B2; JP3771935B2; CA2161804A1; DE69428356T2; SE9301582D0; JPH08509746A; FI955306A; NO954428L; ATE205719T1; NZ266234A; EP0700300B1; FI113779B; DE69428356D1; WO1994026287A1; FI955306A0; NO954428D0; DK0700300T3

Description

DESCRIÇÃO "PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DO PLASMA" A presente invenção refere-se a um processo para a redução de químicos e/ou detergentes desactivadores de vírus numa composição aquosa que contém proteína do plasma solúvel na água, mais especificamente antitrombina III ou transferrina. Ao seleccionar-se uma combinação adequada de temperatura e concentração acima de 0,5 M de um sal com um elevado efeito de salga de acordo com a série de Hofmeister, formam-se vesículas que contêm os químico e/ou detergentes desactivadores de vírus, Essas vesículas são removidas da fase aquosa, por exemplo através de separação ou filtração de fase e depois disso a proteína é isolada da fase aquosa. Quando a fase aquosa compreende um salde citrato ou sulfato niuna concentração superior a 1 M à temperatura ambiente, a redução do químico ou detergente desactivador de vírus pode ser tão elevada quanto 2000 vezes ou mais, proporcionando uma concentração final inferior a 5 ppm.

Fundamento da Invenção A desactivação de vírus em produtos sanguíneos como sejam factor VIII, albumina, factor IX e antitrombina é um problema conhecido dos fabricantes. Ele tem sido normalmente resolvido por meio de aquecimento. Se o produto não for desactivado por tal processo pode ser usado o acrescentamento de químicos desactivadores dos vírus. No entanto, neste caso há a necessidade de remover os químicos adicionados antes da utilização dos produtos medicinais. A EP-A-0 218 090 (Miles Laboratories) relata um processo para a separação e recuperação de proteínas ou ácidos nucleícos a partir de um sistema aquoso que também contém um componente com capacidade para criar duas fases líquidas por meio da utilização de tecnologia de repartição salina. Neste processo, um polímero e um sal solúvel na água, como seja o fosfato de potássio ou de sódio ou o sulfato de amónio, são 2

"VJL adicionados à proteína ou ao ácido nucleíco, após o que a solução resultante é deixada separar-sc. Falta informação accrca dos químicos ou detergentes que dcsactivam os vírus, tal como acerca de técnicas para reduzir a concentração de tais compostos a um nível farmacologicamente aceitável. A EP-A-0 239 859 (New York Blood Center) refere-se a um método para a remoção de químicos de processamento solúveis em lípidos, como sejam solventes e/ou detergentes desactivadores de vírus, de materiais biológicos, por meio do contacto do ^material biológico com um extracto oleoso, agitação da mistura resultante, separação numa fase superior e numa fase inferior por sedimentação ou centrifugação, e decantação da fase superior que contém o óleo e os químicos de processamento extraídos. Não há informação acerca da adição de sais orgânicos ou inorgânicos com um elevado efeito de salga ou da possível vantagem derivada da sua presença. A falta desses sais na fase aquosa necessita de um complicado processo, com repetidos passos de extraeção, para chegar a um nível suficientemente baixo dos solventes e/ou detergentes desactivadores dos vírus.

Na EP-A-0 131 740 (New York Blood Center) encontra-se descrito outro método , no qual uma composição contendo proteína é desactivada quanto aos vírus por meio do contacto da composição com fosfato di- ou trialquilo, preferivelmente em presença de um detergente não iónico. De acordo com esta descrição, o fosfato di- ou trialquilo é removido por precipitação da proteína com glicína e cloreto de sódio. O detergente pode ser removido por meio de diversos passos, escolhidos entre diafiltração, adsorsão sobre suportes cromatográficos e precipitação.

Estes métodos podem ser laboriosos, demorados e podem muitas vezes não fornecer uma redução satisfatória dos detergentes e dos químicos desactivadores dos vírus.

De um artigo da autoria de R A Ramelmeier e outros, Bioseparation 2; 315-324, 1991, sabe-se que uma enzima hidrófoba pode ser purificada a partir de caldos de fermentação num sistema aquoso de duas fases à base de detergente, por meio de, por exemplo, variação da temperatura e da concentração de sais. Não foi usada uma concentração de i 3 sais superior a 0,2 Μ. A enzima é recuperada na fase detergente e pode ser recuperada até 80-90%.

Descrição da Invenção

Verificou-se agora, surpreendentemente que, quando a concentração de determinados sois é aumentada acima de 0,5 M numa composição que contenha antitrombina ou transferrina (seja fraccionadas do plasma ou recombinantes produzidas), um químico desactivador de vírus, preferivelmente fosfato de tri-n-butilo (TNBP) e/ou detergente, preferivelmente um Trinton®, a concentração de TBNP pode ser reduzida a menos de 1 ppm e a concentração de Triton pode ser reduzida a menos de 5 ppm na fase aquosa.

Foi assim encontrado um processo para purificar uma composição de proteínas a que foram adicionados químicos ou detergentes desactivadores ou suas misturas. Este processo de um único passo é mais fácil de executar do que os processos de passos múltiplos anteriormente conhecidos. Além disso, o presente processo pode ser executado rapidamente, uma vez que a formação de vesículas será quase instantânea. O processo fornece também uma quantidade inferior ou igual de químicos e detergentes desactivadores de vírus no produto final à dos processos anteriormente conhecidos. A invenção refere-se portanto a um processo para a redução da concentração de químicos e/ou detergentes desactivadores de vírus numa composição aquosa que contém uma proteína do plasma solúvel na água seleccionada do grupo constituído por antitrombina III e transferrina, caracterizado pela formação de vesículas contendo o químico e/ou detergente desactivador de vírus através da selecção de uma combinação adequada de temperatura e concentração de 0,5 M a 2,5 M de um sal com um elevado efeito de salga de acordo com a série de Hofineister e depois disso remoção de praticamente todas as vesículas da fase aquosa, e subsequentemente isolamento da proteína a partir da fase aquosa. A presente invenção pode ser levada a efeito a uma temperatura da composição situada dentro dos limites de 0°C até 70°C, estando a composição gelada ou pelo menos com elevada viscosidade. Acima de 70° C é provável que as proteínas sejam desnaturadas 4

mais ou menos completamente, perdendo por isso a sua actividade. A temperatura dia composição situa-sc, adcquadamcntc, dentro dos limites dos 10°C a 50° C c preferivelmente entre 20° C e 30° C.

Geralmente, a adição de grandes quantidades de electrólitos de sóis liofílicos, isto é composições contendo partículas hidrófilas muito pequenas, resulta na precipitação da substância dispersa. O efeito é chamado de "salga". O efeito de salga depende da natureza dos iões, principalmente do anião mas também do catião envolvidos. Os iões podem ser distribuídos de acordo com a sua capacidade para remover substâncias liofílicas de soluções coloidais. Isto é frequentemente chamado a série de Hofmeister ou, mais geralmente, a série liotrópica. Faz-se referência a S. Glasstone, Textbook of Physical Chemistry, Van Nostand Co., Toronto, 2a edição, Abril 1946, p. 1254-1259. Sais com um elevado efeito de salga de acordo com a série de Hofmeister são aqueles que possuem um anião com um efeito de salga mais alto do que o ião cloreto. Os aniões situados nessa região incluem os aniões mono-, bi- e trivalentes. Os aniões bi- ou trivalentes são adequadamente usados na presente invenção, preferivelmente aniões trivalentes. Os maiores exemplos dos aniões nessa região são citrato, tartarato, sulfato, acetato, fosfato e fluoreto, com citrato, tartarato e sulfato a serem preferidos. Catiões que podem ser usados com vantagem na presente invenção são catiões monovalentes, tais como os de lítio, sódio, amónio e potássio. Por razões de simplicidade e de aditivos farmacologicamente aceitáveis são preferidos os de sódio, amónio ou potássio, com o sódio a ser o mais preferido. Assim, sais especialmente preferidos na presente invenção são o citrato de sódio, o tartarato de sódio e o sulfato de sódio. Está também dentro do âmbito da presente invenção, que misturas de sais com diferentes aniões e/ou catiões conforme descrito acima, posam ser usadas com vantagem. Também a adição dos mesmos ou de diferentes sais conforme descrito acima pode ser levada a efeito sequencialmente com vantagem.

Os inventores da presente invenção verificaram agora surpreendentemente que, quando a concentração de sal é aumentada acima de 0,5 M de acordo com a presente invenção, o químico e/ou detergente desactivador de vírus formará vesículas, preferivelmente micelas, na solução em vez de ser precipitado. A formação de vesículas e a redução na 5 ( concentração de químicos e/ou detergentes desactivadores de vírus assim obtenível está dependente da combinação de temperatura c concentração do sal com um elevado efeito de salga na fase aquosa. A temperatura ambiente a concentração de sal é, de preferência, superior a 1 M. Por meio do aumento da temperatura acima da temperatura ambiente pode ser utilizada uma concentração mais baixa de sal. A temperaturas mais baixas é necessária uma concentração mais elevada de sal. A temperatura pode 3Ítuar-sc entre 0o C e 70° C e a concentração de sal deverá portanto situar-se acima de 1,5 e 0,5 M, respectivamente. A concentração de sal não deverá exceder 2,5 M, uma vez que isso traria a precipitação do sal e/ou da proteína. Preferivelmente, a concentração de sal· é inferior a 2,0 M.

As vesículas podem ser removidas da fase aquosa, por exemplo através de separação de fase, filtração ou centrifugação ou suas sequências, preferivelmente uma sequência de separação de fase seguida por filtração. Quando as vesículas são removidas por meio de separação de fase, a composição é deixada descansar durante um tempo de residência tal que o químico e/ou detergente desactivador do vírus seja praticamente recuperado na sua totalidade na superfície superior da fase aquosa ou, se estiver presente óleo, na ou sobre a superfície superior da fase oleosa. Assim, um óleo, por exemplo óleo de soja, é preferivelmente adicionado à composição antes da separação de fase. Dessa maneira as vesículas são separadas mais depressa e mais completamente da fase aquosa que contém a proteína. Um tempo de residência adequado com a presença de óleo situa-se entre os limites de cerca de 10 minutos até cerca de 2 horas. Uma tempo de residência adequado sem estar presente óleo situa-se entre os limites de cerca de 15 minutos e cerca de 4 horas. Quando é usada a filtração para remover as vesículas, esta pode ser executada quase imediatamente, uma vez que as vesículas são formadas instantaneamente sob as condições cuidadosamente escolhidas da presente invenção.

Os químicos desactivadores de vírus usados são geralmente de natureza hidrófoba, como o é pelo menos uma parte das moléculas de detergente. Os químicos desactivadores de vírus usados podem ser fosfatos dialquilo ou trialquilo possuidores de grupos alquilo ramificados ou não ramificados, substituídos ou não substituídos, adequadamente com 1 a 10 átomos de carbono. Exemplos de fosfatos trialquilo adequados são aqueles em que o grupo alquilo é n-butilo, t-butilo, n-hexilo, etilhexilo-2 e n-dccilo. O químico dcsactivador do vírus 6 preferivelmente fosfato tri-n-butilo (TNBP). Misturas de diversos fosfatos dialquilo podem também ser usadas, bem como misturas de diversos fosfatos trialquilo. É possível utilizarem-se misturas de fosfatos dialquilo e fosfatos trialquilo no âmbito da presente invenção. O detergente é, adequadamente, um detergente não iónico, como seja um éter - -polioxietileno, por exemplo um Triton®, ou um éster ácido gordo de, polioxietileno sorbitano, como seja o monolaurato de polioxietileno-(20)-sorbitano ou o monoleato de polioxietileno-(20)-sorbitano. De preferência o detergente é Triton® X-100. A proteína a ser tratada pode ser produzida de acordo com métodos genéricos para o fraccionamento do plasma e separação das diferentes proteínas do plasma, ou por meio de métodos de recombinação. O passo de desactivação dos vírus incluem a adição de um detergente (por exemplo um Tween® e/ou Triton® X-100) e de um químico desactivador, por exemplo fosfato de tri-n-butilo (TNBP) à proteína, numa solução aquosa. Depois disso, a solução aquosa é agitada. Posteriormente, a temperatura e a concentração salina da composição são ajustadas para formar vesículas. Preferivelmente é adicionado um óleo à solução desactivada (por exemplo, cerca de 5%). Depois disso podem separar-se as fases da mistura num dispositivo de separação, como seja um funil e separação. A proteína pode ser facilmente isolada da fase aquosa, por exemplo, através de diafiltração, dessalinização, cromatografia ou precipitação. O pH é normalmente superior a 5, preferivelmente superior a 6. A concentração farmacologicamente aceitável de químicos desactivadores de vírus e de detergentes varia, dependendo do composto em causa. Com o presente processo, menos de 5 pm de detergente e menos de 1 ppm de químico desactivador de vírus são normalmente encontrados na fase aquosa. Estas concentrações situam-se bem abaixo das vulgarmente das concentrações reconhecidas como farmacologicamente aceitáveis 7

nestes compostos. Isto significa que não é necessário mais nenhum passo de purificação para além do isolamento da proteína, o que c uma grande vantagem na produção dc proteínas do plasma.

Os Exemplos que se seguem pretendem ilustrar a invenção, sem limitar o âmbito da mesma invenção.

Exemplo 1:

Antitrombina III (AT Hl) foi produzida por Pharmacia AB da Suécia, a partir de plasma do sangue. A AT III tinha sido separada do plasma por meio da utilização de um gel de Heparin Sepharose. A 100 ml de uma solução a 2% de AT III, foram adicionados 1,5 g de solução normal (3 partes de TNBP + 10 partes de Triton® X-100). O TNBP e o Triton® X-10 foram, respectivamente, fornecidos pela Merck da Alemanha e pela Union Carbide dos EEUU. A temperatura da solução foi ajustada para 24° C e a solução agitada durante pelo menos 3 h. Foram lentamente adicionados 100 ml de tampão contendo 2 M de citrato de sódio e 0,05 M de fosfato de sódio. A concentração de citrato resultante foi assim de 1 Μ. A solução foi agitada lentamente durante a adição. Óleo de soja foi então adicionado a cerca de 5 %. A solução foi lentamente agitada durante 30 minutos e depois deixada para se separar em fases durante 90 minutos.

Verificou-se a presença de micelas na ou sobre a superfície da fase oleosa.

Na fase aquosa do fiando onde se encontrava a AT III, o conteúdo de Triton® X-100 foi inferior a 5 ppm e o conteúdo de TNBP foi inferior a 1 ppm.. A recuperação da actividade da AT III foi de mais de 95%.

Exemplo 2:

Transferrina, produzida pela Pharmacia AB da Suécia, foi isolada de FrIV segundo o "método de etanol frio de Cohn" e purificado suplementarmente por meio de cromatografia. 8 A 10 ml de solução de transferrina a 2%, foram adicionados 1,5 g de solução normal (3 partes de TNBP + 10 partes de Triton® X-100). A temperatura da solução foi ajustada para 24° C e a solução foi agitada durante pelo menos 3 h. Foram lentamente adicionados 100 ml de tampão contendo 2 M de citrato de sódio e 0,05 M de fosfato de sódio. A concentração resultante de citrato foi assim de 1 Μ. A solução foi lentamente agitada durante a dição e 30 minutos depois disso, antes dc ser deixada scparar-sc cm fases A solução solvente tratada com detergente foi separada em três volumes iguais. - No primeiro volume as micelas foram separadas imediatamente através de filtração. - O segundo volume foi deixado separar-se m fases sem mais nenhum tratamento. A fase do fundo foi então analisada para detecção do TNBP e do Triton® X-100. Foram encontradas micelas na ou sobre a fase aquosa. - Adicionou-se óleo de soja ao terceiro volume, o qual foi posteriormente tratado de acordo com o Exemplo 1.Micelas foram encontradas na ou sobre a superfície superior da fase oleosa.

Com qualquer dos três métodos para separar as micelas da solução de proteína, a recuperação da actividade da transferrina oi de mais de 95%. O conteúdo de YNBP foi inferior a 1 ppm e o conteúdo de Triton® X-100 foi inferior a 5 ppm com qualquer dos três métodos.

Exemplo 3:

Antitrombina III (AT III) fo9i produzida por Pharmacia AB da Suécia, a partir de plasma sanguíneo. A AT III tinha sido separada do plasma por meio da utilização de um gel de Heparin Sepharose. A 100 ml de uma solução de AT III a 2% foram adicionados, 1,5 g de solução normal (3 partes de TNBP + 10 partes de Triton® X-100). A temperatura da solução foi ajustada para 24° C e a solução foi agitada durante pelo menos 3 h. Adicionaram-se lentamente 100 ml de tampão contendo 2 M de sulfato de sódio e 0,05 M de fosfato de sódio. A concentração resultante de sulfato foi assim de 1 Μ. A solução foi lcntamcntc agitada durante a adição e durante 30 minutos depoÍ3 disso, antes de ser deixada separar-se em fases. A solução foi então imediatamente filtrada. No filtrado foi recuperada mais de 95% da actividade da antitrombina III. O conteúdo de Triton® X-100 foi inferior a 5 ppm e o conteúdo em TNBP foi inferior a 1 ppm.

Exemplo para comparação:

Albumina, produzida por Pharmacia AB da Suécia, foi isolada por meio de um. . "método de etanol frio de Cohn" modificado. A 100 ml de uma solução de albumina a 2% foram adicionados, 1,5 g de solução normal (3 partes de TNBP +10 partes de Triton® X-100). A temperatura da solução foi ajustada para 24° C e a solução agitada durante pelo menos 3 h. Foram lentamente adicionados 100 ml de tampão contendo 2 M de citrato de sódio e 0,02 M de acetato de sódio. A concentração resultante de citrato foi assim de 1 Μ. A solução foi lentamente agitada durante a adição e 30 minutos depois disso, antes de ser deixada separar-se em fases. A solução foi então imediatamente filtrada. No filtrado foi recuperada mais de 95% da actividade da albumina. O conteúdo de Triton® X-100 foi de 250 ppm e do TNBP de 35 ppm.

Estas concentrações mais elevadas de agentes desactivadores de vírus na solução de albumina podem ser explicadas pela capacidade da albumina para se ligar a agentes hidrófobos. Uma finalidade da albumina é transportar as moléculas hidrófobas presentes no sangue. Por isso, com a albumina é necessária mais uma separação, por exemplo um passo de cromatografia ou diafiltração.

Lisboa, t 9 DEZ. 2001

Maria Silvina Ferreira ADVOGADA

Agente Oficial de Propriedade Industrial R. Castilho, 50 - 5! - 1250 - 071 LISBOA Tel. 2138150 50 - Fax. 21383 11 50

Claims

3.

REIVINDICA ÇÕES 1. Processo para purificar uma proteína do plasma solúvel na água, sclcccionada do grupo constituído por antitrombina III e transferrina, numa composição aquosa que compreende ainda químicos e/ou detergentes desactivadores de vírus formadores de vesículas, compreendendo o referido processo: (i) a adição à referida composição aquosa, a uma temperatura de entre 0o e +70°C, de um sal possuidor de um elevado efeito de salga de acordo com a série de Hofmeister até uma concentração de 0,5 M a 2,5 M, de modo que vesículas contendo os químicos e/ou detergentes desactivadores dos vírus sejam formadas; (ii) remoção de essencialmente todas as referidas vesículas da fase aquosa; e facultativamente (iii) isolamento da referida proteína.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido sal compreender um anião seleccionado do grupo constituído por citrato, tartarato, sulfato, acetato ou fosfato, ou suas misturas.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o referido sal compreender o sódio como catião.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o referido sal ser adicionado à temperatura ambiente até uma concentração de 0,5 a 2 M.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a referida proteína ser antitrombina III.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a referida proteína ser transferrina. Lisboa, 1 9 DEZ, 2001 __ Maria Silvina Ferreira ADVOGADA Agente Oficial de Propriedade Industrial R. Castilho. 50-5?- 1250 - 071 LISBOA Tel. 2138150 50 - Fax. 21383 11 50