JPS6143330B2 - - Google Patents
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- JPS6143330B2 JPS6143330B2 JP8176978A JP8176978A JPS6143330B2 JP S6143330 B2 JPS6143330 B2 JP S6143330B2 JP 8176978 A JP8176978 A JP 8176978A JP 8176978 A JP8176978 A JP 8176978A JP S6143330 B2 JPS6143330 B2 JP S6143330B2
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は安定性の高いIgM(人血清免疫グロブ
リンM)を工業的規模で効率よく精製する方法に
関するものである。 人血清免疫グロブリンには5種類があつてその
中でIgG,IgAおよびIgMの3つが大部分を占
め、正常人血清中でのそれぞれの濃度はIgG=
1200±200mg/dl,IgA=250±50mg/dlおよび
IgM=120±40mg/dlであり、IgGが最も高濃度に
存在し、IgMはその約1/10程度にしか存在しな
い。IgGについてはすでに工業的規模での精製が
行われ、その製剤は種々の感染症の予防および治
療薬として臨床的に広く利用されている。IgMは
免疫の初期に生体内に出現する免疫グロブリンで
あり、また細菌に対する凝集抗体価の高いことは
良く知られているが、生体内での存在量が少いた
めその単離・精製の方法はIgGに比べて遅れてい
た。 IgMの研究室での精製法には2〜3の報告があ
り、例えば 第1の方法、IgMが高濃度に含有されているマ
クログロブリン症の患者血清を出発原料とし、等
電点分画法とゲル過法を組合せたモリス(J.E.
Morris)らの方法(Bioehemistry7,2851,1968
年)第2の方法、コーンの冷アルコール分画法で
得られたコーン分画を出発原料として使用し、
ポリエチレングリコール分画と超遠心分離法を組
合せたホウベン(Van Der Hoven)らの方法
(Immunoehemistry 10,107,1973年) 第3の方法、同じコーン分画を出発原料とし
て使用し、酢酸亜塩沈澱法、ポリエチレングリコ
ール分画法およびカプリル酸沈澱法を組合せた方
法(米国特許第3808189号明細書)などがある。 しかしこれらの精製法は工業的規模で行うには
患者血清の入手に制約を受けたり、工程が複雑す
ぎて工業的製法としては不適であつたり、また工
業的規模に適した製法であつても得られたIgMの
純度や安定性が低いなどの問題点が残されてお
り、より効率的にかつ安定性の高いIiMを精製す
る方法の開発が要望されていた。 本発明者らはIgMの精製法について長年研究を
続け、ペースト状のコーン分画を出発原料とし
て使用し、アクリノール沈澱法、ポリエチレング
リコール分画法、芒硝硫安塩析法および等電点分
画法を組合せてIgMを回収する方法を完成し、こ
れにより工業的規模で収率良くかつ純度の高い
IgMを得ることに成功したのである。 本発明はペースト状のコーン分画を無機塩溶
液に懸濁してIgMを抽出させ、この懸濁液にアク
リノールを加えて生じた不純物を除去し、澄明液
に芒硝による塩析を行つて不溶物を除いたのち上
清に硫安を加えて塩析し、生じた沈澱を無機塩溶
液または蒸留水に溶かして得た溶液にポリエチレ
ングリコール分画法を行い、生じた沈澱の水溶液
を弱酸性に調整して等電点分画法を行い、IgMを
高純度に含む上清を回収するのである。 本発明は出発原料として人血漿や人血清を用い
てもよいが、これらからアルブミン、グロブリン
又はフイブリノゲンなどの臨床的に有用な蛋白質
を分画し、従来は廃業されていた残りの分画を出
発原料とすれば安価であり、この廃業分画として
はコーンの冷アルコール法で得られたペースト状
のコーン分画(J.Am.Chem.Soc.68,459,
1946年)が好適である。しかしこのコーン分画
の中にはリポ蛋白、変性蛋白又はある種の不安定
な物質が多量に含まれており、このためある程度
は工業的規模でIgMを精製できたとしても、得ら
れたIgMの安定性が低く、例えば長期安定化に有
効な凍結乾燥を行うと不溶性化するなどの欠点が
あつた。 本発明者らはこれらの不安定な因子を除くこと
も目標としてIgMの精製法を研究し、安定性の高
いIgMを工業的規模で効率よく精製することに成
功したのである。 本発明に係るIgMの精製法は始めにペースト状
のコーン分画を無機塩の溶液に懸濁してIgMを
抽出するのである。この無機塩には特に高価なも
のを用いる必要はなく、塩化ナトリウムやリン酸
塩のようなありふれた無機塩でよい。又その濃度
は例えば塩化ナトリウムの場合は0.5〜2.0W/V
%の溶液、リン酸塩の場合は0.05〜0.20Mの溶液
が適しており、無機塩の濃度がこの範囲よりも低
くなるとIgMの抽出効率が低下する。コーン分画
をこれらの無機塩溶液に5〜20W/V%の濃度
に、より好ましくは8〜13W/V%濃度に懸濁す
る。この懸濁液には不溶性物質も混存している
が、次工程でのアクリノール沈澱法で容易に除く
ことができるから遠心や過などで分離しておく
必要はなく、この点から見ても本発明の精製法が
工業的規模に適した簡易な方法であることが判
る。 ここで得られた懸濁液には前記の如く多量のリ
ポ蛋白やその他の不安定化因子が含まれており、
これらのものが以後の精製工程の妨げとなり、か
つこれらの1部が少量でも混入してくると得られ
たIgMの安定性が著しく低下するから、初期の段
階でリポ蛋白や不安定化因子を極力除去して澄明
にしておく必要がある。その目的で本発明者らは
研究を続けた結果、アクリノールを懸濁液に添加
し、これらリポ蛋白や不安定因子を不溶性にして
析出させることが最も効果的であることを実験的
に見出した。またアクリノールを添加して析出し
てくる不溶物は沈降速度が早くかつ形態も大きい
ので、遠心や過による分離が極めて容易であ
り、工業的規模で分離を行つても短時間に処理で
きることが判つた。更に詳しく研究を続けてゆく
間に、アクリノールの添加量および添加時のPHを
特定しておくことがこの析出工程における重要な
要件であり、特定の条件を保つことにより効率よ
く精製を行いうることを知つた。例えば第1表に
示すようにアクリノールの添加量とPHを種々に変
えてIgMの純度3%の懸濁液を処理し、得られた
IgMの純度と収量を調べた結果、PHは4.7でアク
リノール添加量は0.05%が最適条件であることが
判つた。
リンM)を工業的規模で効率よく精製する方法に
関するものである。 人血清免疫グロブリンには5種類があつてその
中でIgG,IgAおよびIgMの3つが大部分を占
め、正常人血清中でのそれぞれの濃度はIgG=
1200±200mg/dl,IgA=250±50mg/dlおよび
IgM=120±40mg/dlであり、IgGが最も高濃度に
存在し、IgMはその約1/10程度にしか存在しな
い。IgGについてはすでに工業的規模での精製が
行われ、その製剤は種々の感染症の予防および治
療薬として臨床的に広く利用されている。IgMは
免疫の初期に生体内に出現する免疫グロブリンで
あり、また細菌に対する凝集抗体価の高いことは
良く知られているが、生体内での存在量が少いた
めその単離・精製の方法はIgGに比べて遅れてい
た。 IgMの研究室での精製法には2〜3の報告があ
り、例えば 第1の方法、IgMが高濃度に含有されているマ
クログロブリン症の患者血清を出発原料とし、等
電点分画法とゲル過法を組合せたモリス(J.E.
Morris)らの方法(Bioehemistry7,2851,1968
年)第2の方法、コーンの冷アルコール分画法で
得られたコーン分画を出発原料として使用し、
ポリエチレングリコール分画と超遠心分離法を組
合せたホウベン(Van Der Hoven)らの方法
(Immunoehemistry 10,107,1973年) 第3の方法、同じコーン分画を出発原料とし
て使用し、酢酸亜塩沈澱法、ポリエチレングリコ
ール分画法およびカプリル酸沈澱法を組合せた方
法(米国特許第3808189号明細書)などがある。 しかしこれらの精製法は工業的規模で行うには
患者血清の入手に制約を受けたり、工程が複雑す
ぎて工業的製法としては不適であつたり、また工
業的規模に適した製法であつても得られたIgMの
純度や安定性が低いなどの問題点が残されてお
り、より効率的にかつ安定性の高いIiMを精製す
る方法の開発が要望されていた。 本発明者らはIgMの精製法について長年研究を
続け、ペースト状のコーン分画を出発原料とし
て使用し、アクリノール沈澱法、ポリエチレング
リコール分画法、芒硝硫安塩析法および等電点分
画法を組合せてIgMを回収する方法を完成し、こ
れにより工業的規模で収率良くかつ純度の高い
IgMを得ることに成功したのである。 本発明はペースト状のコーン分画を無機塩溶
液に懸濁してIgMを抽出させ、この懸濁液にアク
リノールを加えて生じた不純物を除去し、澄明液
に芒硝による塩析を行つて不溶物を除いたのち上
清に硫安を加えて塩析し、生じた沈澱を無機塩溶
液または蒸留水に溶かして得た溶液にポリエチレ
ングリコール分画法を行い、生じた沈澱の水溶液
を弱酸性に調整して等電点分画法を行い、IgMを
高純度に含む上清を回収するのである。 本発明は出発原料として人血漿や人血清を用い
てもよいが、これらからアルブミン、グロブリン
又はフイブリノゲンなどの臨床的に有用な蛋白質
を分画し、従来は廃業されていた残りの分画を出
発原料とすれば安価であり、この廃業分画として
はコーンの冷アルコール法で得られたペースト状
のコーン分画(J.Am.Chem.Soc.68,459,
1946年)が好適である。しかしこのコーン分画
の中にはリポ蛋白、変性蛋白又はある種の不安定
な物質が多量に含まれており、このためある程度
は工業的規模でIgMを精製できたとしても、得ら
れたIgMの安定性が低く、例えば長期安定化に有
効な凍結乾燥を行うと不溶性化するなどの欠点が
あつた。 本発明者らはこれらの不安定な因子を除くこと
も目標としてIgMの精製法を研究し、安定性の高
いIgMを工業的規模で効率よく精製することに成
功したのである。 本発明に係るIgMの精製法は始めにペースト状
のコーン分画を無機塩の溶液に懸濁してIgMを
抽出するのである。この無機塩には特に高価なも
のを用いる必要はなく、塩化ナトリウムやリン酸
塩のようなありふれた無機塩でよい。又その濃度
は例えば塩化ナトリウムの場合は0.5〜2.0W/V
%の溶液、リン酸塩の場合は0.05〜0.20Mの溶液
が適しており、無機塩の濃度がこの範囲よりも低
くなるとIgMの抽出効率が低下する。コーン分画
をこれらの無機塩溶液に5〜20W/V%の濃度
に、より好ましくは8〜13W/V%濃度に懸濁す
る。この懸濁液には不溶性物質も混存している
が、次工程でのアクリノール沈澱法で容易に除く
ことができるから遠心や過などで分離しておく
必要はなく、この点から見ても本発明の精製法が
工業的規模に適した簡易な方法であることが判
る。 ここで得られた懸濁液には前記の如く多量のリ
ポ蛋白やその他の不安定化因子が含まれており、
これらのものが以後の精製工程の妨げとなり、か
つこれらの1部が少量でも混入してくると得られ
たIgMの安定性が著しく低下するから、初期の段
階でリポ蛋白や不安定化因子を極力除去して澄明
にしておく必要がある。その目的で本発明者らは
研究を続けた結果、アクリノールを懸濁液に添加
し、これらリポ蛋白や不安定因子を不溶性にして
析出させることが最も効果的であることを実験的
に見出した。またアクリノールを添加して析出し
てくる不溶物は沈降速度が早くかつ形態も大きい
ので、遠心や過による分離が極めて容易であ
り、工業的規模で分離を行つても短時間に処理で
きることが判つた。更に詳しく研究を続けてゆく
間に、アクリノールの添加量および添加時のPHを
特定しておくことがこの析出工程における重要な
要件であり、特定の条件を保つことにより効率よ
く精製を行いうることを知つた。例えば第1表に
示すようにアクリノールの添加量とPHを種々に変
えてIgMの純度3%の懸濁液を処理し、得られた
IgMの純度と収量を調べた結果、PHは4.7でアク
リノール添加量は0.05%が最適条件であることが
判つた。
【表】
本発明の第1段階はコーン分画と無機塩溶液
からなる懸濁液にアクリノールを添加し、生じた
不溶物を分離して澄明液を得るのである。この澄
明液には多少のアクリノールが残存しているの
で、適当な方法、例えば酸性白土を0.5〜2.0W/
V%%に加え、アクリノールを酸性白土に吸着さ
せることにより簡単に除去できる。ここで得られ
た澄明液は微青黄色を呈し、免疫電気泳動法や二
元免疫拡散法等で分析するとIgM以外の血清蛋白
としてIgG,IgA,α2―マクログロブリンおよ
びアルブミン等が混在しておりこれらの血清蛋白
を除いてIgMの純度を高めるための研究を引続き
行い、芒硝と硫安を用いた塩析法が有効であるこ
とを見出した。芒硝の添加濃度は12〜16W/V%
が好適であり、より好ましい添加濃度は13W/V
%である。この濃度範囲になるように澄明液に固
形の芒硝を添加し、析出してきた不溶物を分離す
る。分離の方法としてはシヤープレス型遠心分離
機を用いてもよいし、過法を用いても容易に分
離することができる。ここで分離される不溶物は
主にIgGとα2―マクログロブリンであり、IgM
の大部分は上清中に残る。上清中のIgMを回収し
濃縮するために硫安を添加して塩析させる。硫安
の添加濃度は5〜12W/V%で十分であり、PHは
5.5〜8.5より好ましくは中性付近である。この際
硫安の濃度を上記の範囲以上に高めると共存して
いるアルブミン等も同時に塩析されてIgMの純度
を低下させるから、硫安を不必要に高濃度に添加
することは好ましくない。得られた塩析沈澱は上
記と同様にしてシヤープレス型遠心機又は過に
より簡単に採集することができる。塩析沈澱を塩
化ナトリウムやリン酸塩のように無機塩溶液か蒸
留水に溶解した時のIgMの純度は30〜35%で収量
は77〜85%であつた。常法に従つてIgM以外の血
清蛋白の混入状況を分析すると、α2―マグログ
ロブリンとIgMが芒硝塩析前の約30〜50%残存し
ており、特にα2―マクグロブリンの混入量は総
蛋白質の15〜22%を占めることが判つた。このよ
うに芒硝硫安塩析法は主な不純蛋白IgGを除去す
るのに効果的であり、この工程でのIgMの収量は
80%以上と高く、また大量の希薄溶液から出発し
ても高蛋白濃度のIgM溶液が得られるから、多く
の点で芒硝硫安塩析法は工業的規模での濃縮法と
して有効である。 次の工程としてイオン交換吸着法やアルコール
分画法も考えられるが、本発明者らは研究の結果
工業的規模でかつ再現性の高い分画法としてポリ
エチレングリコール分画法が効率的であることを
見出した。芒硝硫安塩析沈澱を無機塩溶液又は蒸
留水に溶かした溶解液にポリエチレングリコール
を5〜10W/V%の濃度に加え、ゆるやかに撹拌
しながらポリエチレングリコールを溶解すると白
色の沈澱が生じてくる。用いるポリエチレングリ
コールとしては分子量が4000〜6000のものが適し
ており、とりわけ4000の方が精製効果は高いが、
6000のものでも添加量をやや少くすることにより
同様の精製効果を得ることができる。この時の溶
液のPHはアルカリ性よりも微酸性が良く、好まし
くはPH5〜6.5が好適である。析出した不溶蛋白
を一般的な分離方法例えば遠心分離法又は過法
で除去し澄明な上清を得る。 次にこの上清中に残つたIgMを濃縮する目的で
ポリエチレングリコールを5〜10W/V%濃度に
加え前回と同様にして析出してきた白色の沈澱を
分離して上清を廃棄する。この時の上清中の主な
蛋白質はα2―マクログロブリンとIgAであり、
回収されたIgMの収量は60〜68%であつた。 ここで得られたIgMの沈澱は冷蒸留水に容易に
溶解することができ、そのまま液状で室温にて放
置しても1〜2ケ月間安定であるが、ロツトによ
つては微細な沈澱を生じたり、微黄色を帯びてく
ることがある。しかしこの不安定な物質や着色し
てくる物質は、単にPHを変化させるだけで容易に
除去できることを実験的に見出した。そこで等電
点分画法によりPH条件とこれら不安定物質の除去
状況との関係をさらに詳しく実験した結果、図面
に示すようにPH5.2〜5.4付近に調整することが最
も有効であることを見出した。 この方法は単にIgM水溶度のPHを弱酸性に調整
するだけであて何ら特別の試薬や装置を必要とし
ない。またここで析出してくる不溶物は極めて沈
降速度が早いから少時間静置するだけでも不溶物
を除去できるが、遠心分離から過で分離すれば
より速やかである。このような不安定物質の除去
処理は芒硝硫安塩析およびポリエチレングリコー
ル分画後に行うのが効果的であつて、α2―マク
ログロブリンやIgMなどが大量に存在する時点で
行つても不安定物質を完全に除去できない。 本発明に係る精製法はいずれの工程においても
処理が簡単であるから工業的規模で行うのに適し
ており、遠心や過などの分離操作も高粘稠によ
る分離の困難さや目詰りによる過時間の延長な
ども少く、従来の方法に比べて極めて短時間に操
作できる利点がある。本発明にて得られたIgMの
総蛋白質に対する純度は50〜60%、コーン分画
の懸濁液からの収率は32〜40%であり、これらは
血清蛋白の精製法としては高い値を示すものであ
る。また液状での安定性は室温に長期間放置して
も何ら変化を認めず、凍結乾燥を行つた場合も不
純物は析出せず、安定性の高い製剤が得られた。 本発明によるIgM溶液を種々の条件で凍結乾燥
を行い、乾燥の前後および長期間にわたる吸光度
の変化を調べて安定性試験を行つた。その成績は
第2表および第3表の通りであり、極めて安定性
の高いIgM製剤が得られたことが判る。なお、
IgM5%液の乾燥前の吸光度はE450nm=0.158,
E720nm=0.021であり、第2表はE450nmにおけ
る吸光度の変化を示し、第3表はE720nmにおけ
る吸光度の変化を示す。
からなる懸濁液にアクリノールを添加し、生じた
不溶物を分離して澄明液を得るのである。この澄
明液には多少のアクリノールが残存しているの
で、適当な方法、例えば酸性白土を0.5〜2.0W/
V%%に加え、アクリノールを酸性白土に吸着さ
せることにより簡単に除去できる。ここで得られ
た澄明液は微青黄色を呈し、免疫電気泳動法や二
元免疫拡散法等で分析するとIgM以外の血清蛋白
としてIgG,IgA,α2―マクログロブリンおよ
びアルブミン等が混在しておりこれらの血清蛋白
を除いてIgMの純度を高めるための研究を引続き
行い、芒硝と硫安を用いた塩析法が有効であるこ
とを見出した。芒硝の添加濃度は12〜16W/V%
が好適であり、より好ましい添加濃度は13W/V
%である。この濃度範囲になるように澄明液に固
形の芒硝を添加し、析出してきた不溶物を分離す
る。分離の方法としてはシヤープレス型遠心分離
機を用いてもよいし、過法を用いても容易に分
離することができる。ここで分離される不溶物は
主にIgGとα2―マクログロブリンであり、IgM
の大部分は上清中に残る。上清中のIgMを回収し
濃縮するために硫安を添加して塩析させる。硫安
の添加濃度は5〜12W/V%で十分であり、PHは
5.5〜8.5より好ましくは中性付近である。この際
硫安の濃度を上記の範囲以上に高めると共存して
いるアルブミン等も同時に塩析されてIgMの純度
を低下させるから、硫安を不必要に高濃度に添加
することは好ましくない。得られた塩析沈澱は上
記と同様にしてシヤープレス型遠心機又は過に
より簡単に採集することができる。塩析沈澱を塩
化ナトリウムやリン酸塩のように無機塩溶液か蒸
留水に溶解した時のIgMの純度は30〜35%で収量
は77〜85%であつた。常法に従つてIgM以外の血
清蛋白の混入状況を分析すると、α2―マグログ
ロブリンとIgMが芒硝塩析前の約30〜50%残存し
ており、特にα2―マクグロブリンの混入量は総
蛋白質の15〜22%を占めることが判つた。このよ
うに芒硝硫安塩析法は主な不純蛋白IgGを除去す
るのに効果的であり、この工程でのIgMの収量は
80%以上と高く、また大量の希薄溶液から出発し
ても高蛋白濃度のIgM溶液が得られるから、多く
の点で芒硝硫安塩析法は工業的規模での濃縮法と
して有効である。 次の工程としてイオン交換吸着法やアルコール
分画法も考えられるが、本発明者らは研究の結果
工業的規模でかつ再現性の高い分画法としてポリ
エチレングリコール分画法が効率的であることを
見出した。芒硝硫安塩析沈澱を無機塩溶液又は蒸
留水に溶かした溶解液にポリエチレングリコール
を5〜10W/V%の濃度に加え、ゆるやかに撹拌
しながらポリエチレングリコールを溶解すると白
色の沈澱が生じてくる。用いるポリエチレングリ
コールとしては分子量が4000〜6000のものが適し
ており、とりわけ4000の方が精製効果は高いが、
6000のものでも添加量をやや少くすることにより
同様の精製効果を得ることができる。この時の溶
液のPHはアルカリ性よりも微酸性が良く、好まし
くはPH5〜6.5が好適である。析出した不溶蛋白
を一般的な分離方法例えば遠心分離法又は過法
で除去し澄明な上清を得る。 次にこの上清中に残つたIgMを濃縮する目的で
ポリエチレングリコールを5〜10W/V%濃度に
加え前回と同様にして析出してきた白色の沈澱を
分離して上清を廃棄する。この時の上清中の主な
蛋白質はα2―マクログロブリンとIgAであり、
回収されたIgMの収量は60〜68%であつた。 ここで得られたIgMの沈澱は冷蒸留水に容易に
溶解することができ、そのまま液状で室温にて放
置しても1〜2ケ月間安定であるが、ロツトによ
つては微細な沈澱を生じたり、微黄色を帯びてく
ることがある。しかしこの不安定な物質や着色し
てくる物質は、単にPHを変化させるだけで容易に
除去できることを実験的に見出した。そこで等電
点分画法によりPH条件とこれら不安定物質の除去
状況との関係をさらに詳しく実験した結果、図面
に示すようにPH5.2〜5.4付近に調整することが最
も有効であることを見出した。 この方法は単にIgM水溶度のPHを弱酸性に調整
するだけであて何ら特別の試薬や装置を必要とし
ない。またここで析出してくる不溶物は極めて沈
降速度が早いから少時間静置するだけでも不溶物
を除去できるが、遠心分離から過で分離すれば
より速やかである。このような不安定物質の除去
処理は芒硝硫安塩析およびポリエチレングリコー
ル分画後に行うのが効果的であつて、α2―マク
ログロブリンやIgMなどが大量に存在する時点で
行つても不安定物質を完全に除去できない。 本発明に係る精製法はいずれの工程においても
処理が簡単であるから工業的規模で行うのに適し
ており、遠心や過などの分離操作も高粘稠によ
る分離の困難さや目詰りによる過時間の延長な
ども少く、従来の方法に比べて極めて短時間に操
作できる利点がある。本発明にて得られたIgMの
総蛋白質に対する純度は50〜60%、コーン分画
の懸濁液からの収率は32〜40%であり、これらは
血清蛋白の精製法としては高い値を示すものであ
る。また液状での安定性は室温に長期間放置して
も何ら変化を認めず、凍結乾燥を行つた場合も不
純物は析出せず、安定性の高い製剤が得られた。 本発明によるIgM溶液を種々の条件で凍結乾燥
を行い、乾燥の前後および長期間にわたる吸光度
の変化を調べて安定性試験を行つた。その成績は
第2表および第3表の通りであり、極めて安定性
の高いIgM製剤が得られたことが判る。なお、
IgM5%液の乾燥前の吸光度はE450nm=0.158,
E720nm=0.021であり、第2表はE450nmにおけ
る吸光度の変化を示し、第3表はE720nmにおけ
る吸光度の変化を示す。
【表】
【表】
また凍結乾燥後のIgM製剤を無菌蒸留水に溶解
し、マウスの腹腔内に2000mg/Kgを投与して7日
間の観察を行なつたが、生理食塩水投与のものと
比べて異常は認められなかつた。 次に本発明を実施例により具体的に説明する
が、本発明はこの実施例に限定されるるものでは
ない。 実施例 コーンの冷アルコール分画法で得たペースト状
のコーン分画10Kgに、生理食塩溶液100を加
えて均一な懸濁液とする。予め混和機を用いてコ
ーン分画を混和しておけばより速やかに懸濁で
きる。この懸濁液にアクリノール(日本薬局法)
を終濃度0.045%になるように加え、PHを4.7に調
整した後約20分間ゆるやかに撹拌する。析出して
きた黄色沈澱をシヤープレス型連続遠心機を用い
て分離し、次に酸性白土(半井化学薬品製)を遠
心上清1当り15gの割合で添加し、4℃にて少
時ゆるやかに撹拌すると残余のアクリノールが酸
性白土へ吸着されてくる。アクリノールを吸着し
た酸性白土は東洋紙製のNo.2紙を用いて過
し、澄明な液を分離する。過助剤としてハイ
フロースーパーセルを少量用いてもよい。 分離した液を1規定の水酸化ナトリウム液で
PH7.0±0.5に修正し、芒硝を12.5W/V%になる
ように添加する。芒硝が溶解するに従つて沈澱が
生じてくるので少時撹拌した後、シヤープレス型
連続遠心機を用いてこの沈澱を除き澄明な上清を
得る。遠心上清に固形の硫安を8W/V%濃度に
加え生じたIgMの沈澱を同様にして回収する。こ
のIgMの沈澱を0.9%塩化ナトリウム溶液に溶解
すると澄明な液となる。1規定の塩酸でPHを6.5
に修正しながら、ポリエチレングリコール4000
(キシダ化学製)を徐々に加えて終濃度8.2W/V
%にすると、不純蛋白が沈澱してくる。前記と同
様にしてシヤープレス型連続遠心機を用いてこの
沈澱を除く。遠心上清に再度ポリエチレングリコ
ール4000を加え、生じたIgMの沈澱をシヤープレ
ス型連続遠心機で分離して上清は廃棄する。 ここで得られたIgMの沈澱を、塩化ナトリウム
の0.01〜0.06W/V%の溶液に溶解し、少量の1
規定塩酸を用いてPH5.3に修正すると、うすく白
濁してくるので、東洋紙製のNo.6紙を用いて
静かに過し、澄明なIgM溶液とする。過時に
少量のハイフロスパーセルを過助剤として用い
てもよく、また白濁した不純蛋白を塩心分離法で
除いてもよい。さらにミリポアフイルター(ミリ
ポア社)のHAタイプの過膜を用いて除菌を澄
明化とを兼ねた過を行うとより効果的である。 このようにして得られたIgMの収率はコーン分
画の懸濁液を100%として37%であり、純度は
総蛋白質量を100%として58%であつた。この
IgM溶液にグリシンを2W/V%濃度に加え、PH
を7.0±0.1に調整した後無菌的に分注して凍結乾
燥を行つた。凍結乾燥後のIgM粉末に注射用蒸留
水を加えると速やかに溶解し、不純物や白濁は認
められなかつた。 凍結乾燥後のIgM粉末の5W/V%溶液を20g
±2gのマウスの腹腔内に0.5ml(約125mg/Kg)
を注射し、7日間観察を続けたが異常は認められ
なかつた。また同じ5W/V%溶液を2〜3Kgの
家兎の腹腔内に250mg/Kg相当量を注射し、24時
間の観察を行つたが、発熱性物質の存在は認めら
れなかつた。
し、マウスの腹腔内に2000mg/Kgを投与して7日
間の観察を行なつたが、生理食塩水投与のものと
比べて異常は認められなかつた。 次に本発明を実施例により具体的に説明する
が、本発明はこの実施例に限定されるるものでは
ない。 実施例 コーンの冷アルコール分画法で得たペースト状
のコーン分画10Kgに、生理食塩溶液100を加
えて均一な懸濁液とする。予め混和機を用いてコ
ーン分画を混和しておけばより速やかに懸濁で
きる。この懸濁液にアクリノール(日本薬局法)
を終濃度0.045%になるように加え、PHを4.7に調
整した後約20分間ゆるやかに撹拌する。析出して
きた黄色沈澱をシヤープレス型連続遠心機を用い
て分離し、次に酸性白土(半井化学薬品製)を遠
心上清1当り15gの割合で添加し、4℃にて少
時ゆるやかに撹拌すると残余のアクリノールが酸
性白土へ吸着されてくる。アクリノールを吸着し
た酸性白土は東洋紙製のNo.2紙を用いて過
し、澄明な液を分離する。過助剤としてハイ
フロースーパーセルを少量用いてもよい。 分離した液を1規定の水酸化ナトリウム液で
PH7.0±0.5に修正し、芒硝を12.5W/V%になる
ように添加する。芒硝が溶解するに従つて沈澱が
生じてくるので少時撹拌した後、シヤープレス型
連続遠心機を用いてこの沈澱を除き澄明な上清を
得る。遠心上清に固形の硫安を8W/V%濃度に
加え生じたIgMの沈澱を同様にして回収する。こ
のIgMの沈澱を0.9%塩化ナトリウム溶液に溶解
すると澄明な液となる。1規定の塩酸でPHを6.5
に修正しながら、ポリエチレングリコール4000
(キシダ化学製)を徐々に加えて終濃度8.2W/V
%にすると、不純蛋白が沈澱してくる。前記と同
様にしてシヤープレス型連続遠心機を用いてこの
沈澱を除く。遠心上清に再度ポリエチレングリコ
ール4000を加え、生じたIgMの沈澱をシヤープレ
ス型連続遠心機で分離して上清は廃棄する。 ここで得られたIgMの沈澱を、塩化ナトリウム
の0.01〜0.06W/V%の溶液に溶解し、少量の1
規定塩酸を用いてPH5.3に修正すると、うすく白
濁してくるので、東洋紙製のNo.6紙を用いて
静かに過し、澄明なIgM溶液とする。過時に
少量のハイフロスパーセルを過助剤として用い
てもよく、また白濁した不純蛋白を塩心分離法で
除いてもよい。さらにミリポアフイルター(ミリ
ポア社)のHAタイプの過膜を用いて除菌を澄
明化とを兼ねた過を行うとより効果的である。 このようにして得られたIgMの収率はコーン分
画の懸濁液を100%として37%であり、純度は
総蛋白質量を100%として58%であつた。この
IgM溶液にグリシンを2W/V%濃度に加え、PH
を7.0±0.1に調整した後無菌的に分注して凍結乾
燥を行つた。凍結乾燥後のIgM粉末に注射用蒸留
水を加えると速やかに溶解し、不純物や白濁は認
められなかつた。 凍結乾燥後のIgM粉末の5W/V%溶液を20g
±2gのマウスの腹腔内に0.5ml(約125mg/Kg)
を注射し、7日間観察を続けたが異常は認められ
なかつた。また同じ5W/V%溶液を2〜3Kgの
家兎の腹腔内に250mg/Kg相当量を注射し、24時
間の観察を行つたが、発熱性物質の存在は認めら
れなかつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 ペースト状のコーン分画を無機塩溶液に懸
濁してIgMを抽出させ、この懸濁液にアクリノー
ルを加えて生じた不溶物を除去し、澄明液に芒硝
による塩析を行つて不溶物を除いたのち上清に硫
安を加えて塩析し、生じた沈澱を無機塩溶液また
は蒸留水に溶かして得た溶液にポリエチレングリ
コール分画法を行い、生じた沈澱の水溶液を弱酸
性に調整して等電点分画法を行い、IgMを高純度
に含む上清を得ることを特徴とするIgMの精製
法。 2 IgMを抽出する無機塩溶液が0.5〜2.0W/V
%の塩化ナトリウム溶液又は0.05〜0.20Mのリン
酸塩溶液である特許請求の範囲第1項に記載の
IgMの精製法。 3 芒硝の添加濃度が12〜16W/V%である特許
請求の範囲第1項に記載のIgMの精製法。 4 硫安の添加濃度が5〜12W/V%である特許
請求の範囲第1項に記載のIgMの精製法。 5 ポリエチレングリコールが分子量4000〜6000
であり、その濃度が5〜10W/V%である特許請
求の範囲第1項に記載のIgMの精製法。 6 等電点分画法のPHが5.2〜5.4である特許請求
の範囲第1項に記載のIgMの精製法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8176978A JPS559036A (en) | 1978-07-04 | 1978-07-04 | Purification of igm |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8176978A JPS559036A (en) | 1978-07-04 | 1978-07-04 | Purification of igm |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS559036A JPS559036A (en) | 1980-01-22 |
JPS6143330B2 true JPS6143330B2 (ja) | 1986-09-26 |
Family
ID=13755661
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8176978A Granted JPS559036A (en) | 1978-07-04 | 1978-07-04 | Purification of igm |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS559036A (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07107159B2 (ja) * | 1986-12-26 | 1995-11-15 | ライオン株式会社 | 浴室および風呂釜用洗浄剤組成物 |
JP5089924B2 (ja) * | 2006-06-15 | 2012-12-05 | 株式会社カネカ | IgM型抗体の精製方法、IgM型抗体認識抗原の吸着材 |
US9988419B2 (en) * | 2013-02-06 | 2018-06-05 | Agency For Science, Technology And Research | Protein purification methods |
-
1978
- 1978-07-04 JP JP8176978A patent/JPS559036A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS559036A (en) | 1980-01-22 |
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