JPS5913730A - 抗菌性蛋白、その製造法およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １′Ｉ］発明の背景 技術分野 本発明は、双翅目または膜翅目に属する昆虫の幼虫の体
表傷害時にその幼虫の体液中に誘導される抗菌性蛋白お
よびその製造法ならびにその用途に関する。

従来技術 昆虫などの無を推動物では、ワクチン接種により、体液
中に抗菌活性物質が出現することが幾つか報告されてい
る。′）・２入す・りこの物質は、抗体産生能を持たな
い動物の生体防御にとって重要な役割を担っていると考
えられるが、一般にその誘導機構や、物質の性状、抗菌
作用のメカニズム等については、まだ十分に明らかにさ
れていない８ところで、センチニクバエ（５ａｒｃｏｐ
ｈａＦａ　ｐｅｒｅ−ｇｒｌｒ＋；＋　）　幼虫では、
体表に傷害を与えろことによって、体液中に、大腸菌や
枯草菌に対し、顕著な抗菌活性を持つ蛋白が出現するこ
とが、本発明者らによって既に明らかにされている。′
）これは、体表傷害時に、細菌感染を防ぐ為に誘導され
る、一種の生体防御物質であると考えられる、この昆虫
では、同じく体表傷害時に、食細胞の活性能を持つ、細
胞凝集性蛋白も出現することから　Ｉｆ）、７）これら
の蛋白が相互に関連しあって、センチニクバエの生体防
御機構全構成しているものと思われる。一方、近年高等
哺乳動物でも、精液９）中や血ｆｔ１０昂に、抗菌力が
強（て幅広いスペクトル金持つ抗菌性蛋白の存在が明ら
かとなり、一般に動物体液中の抗菌性蛋白が重要視され
ている。

センチニクバエの抗菌性蛋白については、さらに本発明
者らによって、３種類あることが報告されている。′１
）シかしながら、これらの蛋白の精製・分離方法は確立
されておらず、物質の性状等の理化学的性状は明らかに
されていない。したがって、これらの蛋白性物質が単一
なまでに精製・分離でき、さらに、これら昆虫由来の蛋
白がヒトなどのを椎動物の生体防御機構に働（となれば
、例えば医学・薬学的見地からも寄与するところは太き
い。

要旨 本発明は、双翅目または膜翅目に属する昆虫、とりわけ
センチニクバエ幼虫、の体表傷害時にその体液中に抗菌
性蛋白が誘導されること全確認し、また前記のように混
合物として得られて（・た東この蛋白の一成分について
電気泳動的に単一でかつ抗菌比活性がＩｎ、０ｆ）０倍
以上、特にほぼ３０．Ｑｆｌｒ１倍、に上昇した蛋白に
まで精製することに成功したことに基づ（ものである、
。

したがって、本発明による抗菌性蛋白は、双翅目または
膜翅目に属する昆虫の幼虫の体表傷害時にその幼虫の体
液中に誘導され、下記の性質を有するものである。

（１）分子量　約４（１（１０〜７５（ＩＦＩ（２）熱
安定性（１０〜Ｏｏ分間、１．００℃）（３）含水メタ
ノールに可溶 （４）　　１０％ウシ血清添加培地中でも抗菌活性をも
つ。

（５）アミノ酸組成（モル％） アスパラギン酸またはアスパラギン７．８　＋　２．３
、スレオニン６．０±Ｌ８、セリン２．７±０．８、グ
ルタミン酸またはグルタミン１０．１±３．０、グリシ
ン１１．５±３．４、アラニン１２．３±３．７、ノ々
リン５．９±１．８、シスチンまたはシスティン（０，
５（シスチンとして）、メチオニンＬ５±０．４、イン
ロイシン６．７±２．０、ロイシン４．１±１．２、チ
ロシン２．６±０．８、フェニルアラニン１．３±０．
４、リジン１０．４±３．Ｊ、ヒスチジン３．９±１．
２、アルギニン６．８±２．０、ゾロリン４．５±１．
４、トリプトファン１．５±０．５６ また、本発明による抗菌性蛋白θ）製造法け、双翅目ま
たは膜翅目に属する昆虫の幼虫Ｑ）体表に傷害を与え、
その後得られる体液より体液細胞および脂肪体を除去し
たものから上記の性質を有する抗菌性蛋白を取得するこ
と、を特徴とするものである。

さらにまた、本発明による可食性抗菌剤は、双翅目また
は膜翅目に属する昆虫σ）幼虫の体表傷害時にその幼虫
の体液中に誘導され、上記σ）性質を有する抗菌性蛋白
を有効成分とするものである。

発明の効果 本発明による抗菌性蛋白はそれ自体抗菌性金有し、しか
も毒性は殆んどない、したがってこの件ηを利用できろ
種りの用途が考えられるが、特にこれらの物質を有効成
分とする医薬品製剤としての応用、あるいは食品添加物
としての利用が期待できる。

とりわけセンチニクバエ幼虫より製造したタン・ξりは
、熱安定性であり、熱による加工Ｔ程金含む用途には特
に期待できるものである。

本発明で対象とする昆虫は、双翅目または膜翅目に属す
る昆虫である。具体的には、ハエ、力、ハチ、アブなど
がある、これらのうちでは、ニクノ々工科のハエ、特に
センチニクバエ、が好ましい。

対象昆虫は、幼虫でなければならない。ここで１−幼虫
−１とは、昆虫の完全変態の過程において、岬化後、輔
化前のものをいう。本発明で適当なものは、三令に同調
しである幼虫、特にセンチニク・マエ幼虫、である。

抗菌性蛋白全誘導すべく昆虫体表に傷害全厚える操作は
、結果的に感染の危険全増大させる任意の方法が可能で
ある。１体表−１といっても体表のみ全意味するもので
はな（、注射針の貫通のように体内にも傷害を与える操
作音も包含１−ることはいうまでもない。傷害を与える
べき体表は、昆虫の体のどこであってもよい力積通常は
頭部を除く部分である。

傷害全厚えて０〜５日後、望ましくは約２日後、体液金
しぼり出し、遠心分離により体液細胞全除波、遠心上清
を取り、出発材料とする。

２、抗菌性蛋白の精製・分離 一般の高分子蛋白類の分画と精製に常用されるさまざま
な方法が適用できる。しかしながら活性成分をすべて含
んだままで精製を進め、夾雑物質が少な（なったところ
で各々の成分（そのうちの−が本発明で対象とするもの
である）全分離する方法が望ましい。本発明にお℃・て
、特にセンチニク・Ｚ工幼虫金用℃・石場合、イオン交
換樹脂処理および熱処理の二つの精製手段により活性成
分全すべて含んだままで精？！！ヲ進め、限外濾過にて
濃縮し、次にゲル濾過およびイオン交換樹脂処理によっ
て、本発明蛋白その他の成分全分離する方法が好適であ
る　また、この種の抗菌性物質はトリプシン処理によっ
て失活することから蛋白性物質であることは明らかであ
るところ、上記精製にあたっては蛋白あたりの比活性が
上昇することを指標にし、上記分離にあたっては各々の
活性成分全体としての比活性が下がらないこと全指標と
するのが好ましい。

各成分分離後、その−成分をさらに本発明の単一な物質
にまで精製する場合、上記同様さまざまな方法が考えら
れ、例えばイオン交換樹脂処理、吸着クロマトグラフィ
ー、電気泳動などを適宜用いて目的を達することが可能
であるが、この時、本発明の実施例のように、二つの原
理の異なる電気泳動システムで単一・々ン）″全形成す
ること、及びその各々のバンドに活性が対応′ｆること
、の二つの条件を満たすこと全指標にして操作を進めろ
と好適である。電気泳動の具体的な実施に関しては、後
記の実験例を参照されたい。

また、本発明の抗菌性蛋白は耐熱性が良好であるので、
粗標品を加熱することによって純化して比活性？高める
ことかできろ、すなわち、粗標品を８０〜１２（ピＣ１
好ましくは１００℃前後、で１０〜（５０分間程度の熱
処理に付すと好都合である、３　抗菌性蛋白 本発明による抗菌性蛋白は、体表傷害という刺激によっ
て幼虫体液中に誘導されるものである、このことは、幼
虫体液を例えば電気泳動にかけ、さらに大腸菌等を吹き
つけて放置し、菌のコロニー形成の阻止されたバンドが
出現イーるか否かを、体表傷害を与えた体液と正常体液
とを比較することによって確認できるっ また前述のように、このバンドの物質が例えばトリプシ
ン処理によって失活することにより、蛋白性物質である
ことも確認できる。

本発明による抗菌性蛋白は、前記の分子用およびアミノ
酸組成を持つものである、 分子道は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動お
よびゲル濾過（セファデックスＧ−５０）によって測定
したものである− アミノ酸組成は、アミノ酸分析計（日立８３５型、高分
離法）によって測定したものである一添付の第１図は、
本発明蛋白の成分アミノ酸の吸収を示すクロマトグラム
を模写したものである本発明による抗菌性蛋白は、電気
泳動的に単一な蛋白である　この場合の電気泳動け、未
変性条注下のポリアクリルアミ）１１ゲル市気泳動（２
００Ｖ一定、３時間）を用いたものである　添付の第２
図は、屯気泳動図全模写したものである（条件は」二記
の通り）。

また、この抗菌性蛋白は含水メタノールに可溶である、 また、この抗菌性蛋白は、凍結乾燥を行なうと白色粉末
として得られる、 本発明による抗菌性蛋白は十分に純化されていて、その
比活性は原体液から１０，０００倍以上、通常はけＭ２
Ｏ，０００倍に上昇している　なお、比活性は、中−位
蛋白量あたりの抗菌活性の値であろ４、用途 本発明による抗菌性蛋白は、その抗菌性を生かして抗菌
剤として有用である、丁なわち、それ自身として、ある
いは適当な液体、固体または気体の相体ないし希釈剤と
組合せた形態で、あるいは他の薬剤と組合せた形態で、
抗菌剤として使用することができる、後記実験例に示″
［ように、本発明抗菌性蛋白は抗菌スペクトルが広（、
ダラム陰性菌および陽性菌のいずれに対しても有効な抗
菌作用を示す１、 したがって、本発明抗菌性蛋白は、たとえば、細菌性疾
患に対する薬剤として使用することができる。その場合
は、投与の剤型およびその投与駿については、患者およ
び疾患の種類、症状等全勘案して、本発明による抗菌効
果が認められる限り任意の選択が可能である。このよう
な薬剤は血清中で活性が失なわれないことが大切である
が、本発明抗菌性蛋白は血清存在下で抗菌活性が認めら
れろ点に価値がある。

本発明抗菌性蛋白は蛋白質そのものであるところ、その
毒性は少な（とも結果的に経口にて摂取されるとぎには
、はとんどないと考えられろ。従って、この抗菌性蛋白
は、ヒトおよび動物用の薬剤および食品ないし飼料添加
物として利用することができる５たとえば、本発明によ
る抗菌性蛋白は食品添加物としての抗菌剤、換言すれば
可食性抗菌剤、として有用である、 実施例 ］）実験用材料および測定法 本実験で用いた材料と方法は以下の通りである、（１）
出発材料 センチニクバエ幼虫は、（ｌｈｔｕｋｉらの方法に従い
、体表ケ水でぬらすことによって、四槽殻形成を阻止し
、三令に同調しであるものを用いた。

体表に傷害を与える操作は、三令幼虫を氷上に置いて動
き金にふくし、これ全ガラス板上に並べ、第一体筒下部
に対し、テルモ注射針（Ｓ、Ｂ、２６ＧＸ％″）全貫通
させる、という方法を用いた。傷害を与えて２日後、幼
虫の頭部を手術用パサミで切り落とし、氷上で冷やしで
あるガラス製ロート（φ９　ｃｒｎ　）　　の内壁に、
幼虫全弁し当て体液をしぼり出しだへこれをスピッツチ
ューブに採集し、３．００Ｏｒｐｍ　（５分間、４℃、
国産１０３Ｒ型）の遠心により体液細胞を除き、その上
清全体液標品として一８０°Ｃで保存した。この標品を
精製材料とする場合は、保存したものヲ３７℃の湯浴中
で融解させたのち、混入している脂肪体を更に除くため
、１０．０００　ｇ　（１０分間、４°Ｃ１久保田ＲＡ
−２）遠心上清をとった。

（２）緩衝液 使用した緩衝液は、下記の組成のものである、Ａ　　　
　　　　　１０　　ｍＭ　　　　　　　　　　　ＯｍＭ
Ｂ　　　　　　　　　”　　　　　　　　　　　　　　
２５ｍＭ８　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
３０ｍ、ＭＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２６０　　ｍＭＥ　　　　　　　　　”　　　　　
　　　　　　　５２０　　ｍＭ（３）抗菌活性単位 ２ｍｌの液体培地（０，２％ＢＳＡ　ｋ含む緩衝液８１
　ｍｌ　、　　］　、７５％アンチノ２イオテイツクミ
デアム（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｍｅｄｌｕｍ　３、Ｄ
ｉ　ｆ　ｃｏ社）（以下ＡＭ３培地という。）　１　ｍ
ｌ　）　　において、１０細胞のＥ、　ｃｏｌｉ（Ｋ　
−１２ＳＭｒ）　０）３７℃／１４０分間振と５培養後
の成長全５０チ阻害する活性量を１単位とした、（４）
抗菌活性の測定法 大腸菌に−１２（５９４）（ストレプトマイシン耐性）
を、抗菌活性の測定用に用いた。ＡＭ３培地（１，７５
％、モノ−試験管）にて、３７℃で対数増殖期まで振と
５培養したのち、水中で冷却し、１０．０００　ｇ　（
１０分間、４℃、久保田ＲＡ−２）の遠心で培地を除き
、緩衝液Ｓで希釈して、０Ｄ６５ｏ二０．３とした。位
相差顕微鏡によるカウントよりこの濃度の菌液は２．５
　Ｘ　１０８ｃｅｌｌ　／ＩＴＩＩと計算された。

次いで、この菌液１０μｍ、ＡＭ３培地１９０μｌ　及
び被測定サンプル２００μｍを混合、３７°Ｃで１４０
分間培養後、氷冷して菌の成長を止め、０Ｄ６５ｏ　を
測定した。この測定系においては、被測定サンプルの０
Ｄ６５０　ｋコントロールに対するチで表示した。

したがって、この測定法によれば、サンプルの殺菌作用
及び制菌作用を合わせた成長阻害活性全測定することに
なる。

（５）精製用カラムの調製法 （イ）　ＣＭ−セルロースおよびハイドロキシルアパタ
イト ・ぞウダーをイオン交換水に懸濁したのち、デカンテー
ション（３回）で細粒を除く８使用する緩衝液にかえて
洗浄したのち、カラムにつめ、ＣＭ−セルロースの場合
はカラム容積の１０倍、ハイドロキシルア・ぞタイトの
場合はカラム容積の加倍以上、の緩衝液で洗浄する。

（ロ）セファデックスＧ−関 ・ξウダーをイオン交換水に懸濁後、デカンテーション
（３回）で細粒を除く。緩衝液Ｓにかえて洗浄したのち
、沸騰水浴上に３時間放置して膨潤させる。カラムにつ
めてのち、カラム容積の５倍以上の緩衝液Ｓで洗浄する
、こσ〕カラムは、試料金離してのち、緩衝液Ｓで洗浄
して、再使用したー（６）電気泳動法 （イ）未変性条件下のスラブ式１５％ポリアクリルアミ
ドゲル′亀気泳動 溶液Ａ（ＩＮ水酸化カリウム４．８　ｍｌ、酢酸１７．
２ｍｌ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ’−テトラメチルエチレンジア
ミン４．Ｏｍｌに水を船上そ１００　ｍｌとしたもの）
２．５ｍｌ、溶液Ｂ（７クリ／Ｉ／７ミｒ６ｏｇ、Ｎ、
Ｎ’−メチレンビスアクリルアミ＋’０．８ｇに水を加
えて１００　ｍｌとしたもの）５ｍｌ、溶液Ｃ（過硫酸
アンモニウム０．２８ｇに水ヲ加えて１００　ｍｌとし
だもの）１０ｍｌ及び水２．５　ｍｌ　ｆ混合したのち
すばやく脱気してスラブ式電気泳動装置に注入する。次
に、アプライ用コーム金さし、室温に４０分間放置して
ゲル化させる、試料１００μｌに対し５μｇ／ｍｌのメ
チルグリーン金倉む酢酸（ＩＭ）５０μｌ及び５０％グ
リセロール加μｌｋ加え、このうち１０〜５０μｌｋコ
ーム全ぬいた跡にアプライ後、２００ｖで６時間泳動さ
せた。泳動緩衝液は、β−アラニン３．１２ｇおよび酢
酸０．８ｍｌに水を加えて１リツトルとしたものを用い
た。

抗菌活性バンドは以下の方法で検出した、すなわち、泳
動終了後、ゲル全ガラス板より取り出し、１００μｇ／
ｍｌ　　ストレプトマイシン及び緩衝液Ｆｉ含む、１．
７５％ハＢ培地にこれをひたして、３７℃で関分間加温
するーこの後、ガラスシャーレ上にゲルを広げ、ただち
に、１０５細胞の）’：、　ｃｏｌｉ（Ｋ　−１２８Ｍ
’、）、及びｍ衝ｉＦ’ｉ含む０．６’ｌｙ＝ニートリ
エンドアガー（ソフトアガー）を重層する１、ソフトア
ガーは、あらかじめ４７℃に加温して液状にしておぎ、
重層後は３７℃にて固化させる。この上にＦ；　ｃｎｌ
ｉ　ｋ、含まない同じアガーを重層し、３７℃で一晩放
置した。その後、シャーレの下に黒い紙をしき、横から
ライトをあてて、生じたＦ’、、　ｃｎｌｉのコロニー
を光らせることにより、コロニー形成の阻止されたスポ
ット金観察した８ （ロ）　　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（
スラブ式、１５％） レムリ゛′占の方法に従い、ポリアクリルアミドの濃度
が１５％のゲルを用いた。

染色及び脱色は、フェア・マンクス１３）らの方法に従
った。ただし、本研究で扱う抗菌性蛋白は、ゲルに固定
されに（いりで、染色および脱色に要する時間は、３７
℃加温の東件で１０時間を越えないこととした、 （カ　タン・ぞり定量 通常は、ローリ−の方法１０ヲ修正して行なった。

すなわち、適当量の試料（５〜２０μｇ）に緩衝液を加
え、最終的に緩衝液Ｓの％の塩濃度にし、その２００μ
ｌ　に対して１０％トリクロロ酢酸２００μｌ’を加え
、７０℃で加分間加温したのち、水中によ）分間以上放
置する。３．０００　ｒｎｍ　（１５分間、４℃、国産
１０３Ｒ）の遠心により沈殿をとり、ローリ−法用の溶
液Ｃ２００μｌ　およびイオン交換水２００μｍ　を加
え、１．０分間室温放置後、フェノール試薬側μｌを加
え、３７℃で４０分間加温後、久保田１５０−０２光度
計で０Ｄ７ｏｏ全測定した、定量は牛血清アルブミン金
スタンダードとし、ＯＤ２，８：６，６７のとき１０ｍ
ｇ／ｍｌとした。

精製操作で、ハイドロキシルア・ぞタイト以降の試料に
ついては、久保田１５０−０２　光度計で０Ｄ２１５及
び０Ｄ２２５を測定し、０Ｄ２１５−ＯＤ２２５の値に
１４４を乗じたもの全μｇ／／ｍ１とした。この方法に
より、約０．５μｇ／ｍｌまでのタンパクを、試料を損
なうことな（定量することができた。′５）・１６）２
）抗菌活性蛋白およびその誘導 傷害後２日目の幼虫体液を、未変性条件下のスラブ式、
１５チポリアクリルアミドゲル（ｐＨ４）上で電気泳動
し、生じたバンドの抗菌活性を検出した。アプライした
体液は４μｍ　（０，８ｕｎｉｔ　）で、これに３’ｉ
’ｔの１Ｍ酢酸を加えて酸性にした。泳動は２００　Ｖ
　（電圧一定）　テ、■より、ｅＫ６時間オコなった、
泳動終了後、ゲル上に、Ｆ、、ｃｎｌｉ　　（Ｋ　−１
２８Ｍ’）を含んだソフトアガーを重層し、３７℃で一
晩放置すると、菌のコロニー形成が阻止されたスポット
が、３種検出された。そこで、分子量の大きい順にそれ
ぞれの活性物質を、第一成分、第二成分、第三成分と定
めた、一方、正常体液は、当量アゾライしてもこり）よ
うなスポットは全（検出されず、この３種の活性成分は
、すべて、体表傷害という刺激によって、誘導されてき
たものであることがわかったー また、これらの活性成分は、トリプシン処理によって失
活するところから、蛋白性物質であることがわかった。

３）抗菌性蛋白の分離・精製 （１）三成分の分離 精製の出発材料としては、最も抗菌活性の高い時の幼虫
体液として、傷害後２日後のものとした。

幼虫約２０　、０００匹より体液を採集し、これを出発
材料として以下の操作を行なった。

幼虫体液２０ｍ１　　ｆ緩衝液Ａで５倍に希釈後、ＣＭ
−セルロースのカラムにアプライしたヘアプライ後、十
分肴の緩衝液Ｂで洗い、溶出液の０Ｄ２８ｏ＜　０．０
１　　となったところで、緩衝液Ｅで、段階的に蛋白全
溶出させた。２〜３ｍｌ　　ずつ分画し、その一定量全
分取して緩衝液で希釈し、全量２００μｌ　として測定
した７フラクシヨンＮｎ、３３〜４０の分画に活性が回
収され、収率は９７チ、比活性は１００倍に上昇した。

次いで、この分画を沸騰水浴中に１０分間放置（熱処理
）し、水中で冷却後、その４０，０００　ｇ（１０分間
、４℃、久保田ＲＡ−３）遠心上清をとってその活性音
調べ、この分画の抗菌性物質は、熱安定性であること、
活性回収率は９５％、比活性上昇はほぼ５倍であること
がわかり、同時にこの熱処理が抗菌性物質の精製手段と
して有用であることが判明した、この熱安定性にっ℃・
ては、細菌の成長をほぼ１０％阻害する活性１１（１，
５単位）をとり、１００℃で１時間加熱処理しても活性
がかわらなかったことによっても確認された１、以上二
つの精製手段により、抗菌性蛋白は慣）％以上回収され
、比活性はほぼ５００倍に上昇した。

この分画は一２０’Ｃに凍結保存すると少なくとも半年
間は安定であった８この分１ｉｆＩＩ？、未変性条件下
のポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析したところ、
この精製段階までは、三種の活性成分が回収されている
ことが示された。

熱処理上清分画６０ｍ１　　ｋ、分画分子量ｉ、ｏｏｏ
のメンプラン（５ＰＦＪＣＴＲＡ／ＰＯＲｔＪＦ　ＤＩ
ＳＣ８φ４３ｍｍ）を用いて限外濾過して（４°Ｃ１４
ｋｇ／ｅｍ２）、２ｍｌ　　にまで濃縮した。濃縮操作
の活性回収率は印〜１００チであった。濃縮した熱処理
上清分画を、セファデックスＧ−関カラム（φ１．５　
＞：６０　ｃｍ　）にアプライした、セファデックスＧ
−５０は、アラかじめ、カラム客車の５倍以上の緩衝液
Ｓで平衡釈して２００μｌ　としたのち、測定した。活
性はゼイドと分子１６〜７キロダルトン付近との二つの
ピーク全形成して回収された。高分子側活性分画をＧ−
１、低分子側活性分画１Ｇ−２分画とした。

Ｇ−１分画については、更に、高速液体クロマトグラフ
ィーによるゲルｐ過（ウォーターズ、１）ｒｏｔｅｌｎ
　Ｃｏｌｕｍｎ　Ｔ−１２５φ７．８Ｘ３ｔＪｒｒｎ　
　２本能列）金貸なったところ、分子線６８キロダルト
ンの１＜１ｎｄｅｒａｅｒｔ＋ｍ　Ａ１１ｎ＋ｍｉｎと
４５キロダルトンの１６＋ｌ＋ｎｅｒｅｉＡｌｂｕｍｉ
ｎ　の溶出位（ｄの間に活性のピークか回収されて、分
子量約５４　、０００と算定された。Ｇ−２分画につい
ては希釈度をあげて測定したところ、はぼ単一の活性ピ
ークとなった。さて、Ｇ−１およびＧ−２の谷分画を、
未変性条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析
すると、Ｇ−１分画に第一成分、Ｇ−２分画に第二成分
と第三成分とが検出された、これより第一成分は分子量
約５４　、０００の蛋白であり、第二成分、第三成分は
、ともに分子量のよ（似た６〜７キロダルトンの蛋白で
あると考えられろ。Ｇ−１分画の活性回収率は、アプラ
イした試料の１９％、Ｇ−２分画のそれは８；３チであ
った。Ｇ−１分画の比活性は低下したが、Ｇ−２分画の
比活性は約２倍に上昇し、合計の比活性はほぼ同じであ
ったーしたがって、同時にこの操作が精製分離手段とし
て有用であることがわかった、 第二および第三成分を含むＧ−２分画を緩衝液Ａで５倍
に希釈し、これをＣＭ−セルロースにアプライした（カ
ラムφ２．ＯＸ　４　ｃ７＋１　）　、アプライ後、カ
ラム容量の２倍の緩衝液Ａで洗浄し、次に緩衝液Ｓでタ
ンパクを段階的に溶出させた〜０Ｄ２１（０￥０となっ
たところで、更に緩衝液りでタン、ｅりを段階的に溶出
させた、２〜４．ｍｌずつ分画し、測定した、緩衝液Ｓ
の溶出分画、緩衝液りの溶出分画それぞれに活性が回収
されたー緩衝液Ｓによる低塩濃度側活性分画をＣ−１分
画、緩衝液りによる高塩濃度側活性分画１ｃ−２分画と
した、未変性条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動
による解析により、Ｃ−１分画に第二成分、Ｃ−２分画
に第三成分が回収されたことが示されたーアプライした
試料に対し、Ｃ−１分画の活性回収率は２チ、Ｃ−２分
画の活性回収率は（イ）チであった。

また、Ｃ−１分画の比活性は下がったが、Ｃ−２分画の
比活性は約６倍に上昇し、全体では約１．６倍に上昇し
た。よってこの操作が分離手段の一つとして有用である
ことが同時に判明した。

三成分ともに精製を進めたのち、二つの分離操作によっ
て、Ｇ−１、Ｃ−１、Ｃ−２の３種の活性分画が得られ
たことになる７、 このようにして得られた三種の活性分画の未変性条件下
のポリアクリルアミドゲル′電気泳動の結果全第２図の
レーンＧ−１、Ｃ−１およびＣ−２に示す。なお、レー
ンＨは、精製の出発材料である幼虫体液をアプライした
ものである。図のように、体液中にみられる三種の活性
成分のうち、第一成分がＧ−１分画 第二成分がＣ−１分画 第三成分がＣ−２分画 にそれぞれ分離されていることが明らかである。

活性の相互のコンタミネーションは検出されない、以上
から、体液の三種の活性成分の分離法が確立されたと判
断した。ここまでの精製、分離の操作により、第一成分
は収率１２チ／比活性１１０倍、第二成分は収率１チ／
比活性４４倍、第三成分は収率４５％／比活性７，３０
０倍に精製された、活性回収率から判断して、体液中の
主要な活性成分は第三成分と考えられろ （２）第三成分σ）精製 次いで、次の判断基準をもとにして、上記第三成分の精
製を行なった ■　二種印の原理の異なる電気泳動システムで単一・々
ンドを与えるようにすること ＠　それぞれの電気泳動でバンドとなろ蛋白に、抗菌活
性が対応する９ まず、第三成分を含むＣ−２分画１８ｍ１ｔ緩衝液Ａで
１０倍に希釈し、これをハイドロキシルア、ｅタイトカ
ラム（φ２，０Ｘ２Ｌ’ｍ）にアプライした７、アプラ
イ後、カラム容量の２倍の緩衝液Ａで洗浄し、次に４０
　ｒｎ　Ｉ　Ｏ，）　５０　ｍＭリン酸緩衝液（Ｎａ２
ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４ｐ）（６）で洗浄したのち、
１００　ｍＭリン酸緩衝’／（１，ｐＨ６で段階的にタ
ンツクを溶出させたところ、分画番号・１５〜５９に抗
菌活性が検出された１、この分画の活性回収率はアプラ
イした試料の３０チであり、比活性は５倍に上昇した ハイトロキシルアパタイト分画はタンパク濃度が希薄で
あって、電気泳動等の解析に不便であるため、ＣＭ−セ
ルロースによって濃縮した、ノ・イドロキシルア、ｏタ
イト分画全当量のイオン交換水で希釈し、これ全６開−
セルロースカラム（φ１．１　ｘ　１　ｔｘ　）にアプ
ライした。ＣＭ−セルロースカラムは、あらかじめカラ
人容量の５倍以上の緩衝ＭＡで平衡化してお℃・た。ア
プライ後、カラム容清の４倍の緩衝液Ａで洗浄し、緩衝
液Ｅで段階的にタンノξりを浴出させ、１ｍｌずつ分画
した。

この結果、緩衝液Ｅによる溶出分画の２分画目にのみ、
タンパクが回収された（６７％）。この分画の活性回収
率は１５％であり、タンパクの回収率とほとんど一致し
た。よって、この操作では比活性は変化せず（この前の
段階で精製が完了している）、全くの濃縮操作であると
いえる。これにより３１Ｊｍｌのハイドロキシルア、ｅ
タイト分画を、１ｍｌ　　にまで濃縮した。

第三のＣＭ−セルロース分画金、未変性条件下のポリア
クリルアミドゲル電気泳動で解析した。

すなわち、分画乙μＩ　（１，２μｇ）アゾライし、泳
動は■→ｅに、２００Ｖ’亀圧一定で３時間おこなった
ところ、クマシプリリアントブルーによる染色で、単一
のバンドのみか検出された　同時に泳動したＣＭ−セル
ロース分画について、ゲル上に大腸菌を含むソフトアガ
ーを重層して抗菌活性音調べたところ、染色によるバン
ドのイ■萱に対応して、大腸菌のコロニーが阻害された
スポットが生じた、これより、ＣＭ−セルロース分画を
、精製の最終漂品と考え、以下、この標品の精製度につ
いて倹約した。

ＣＭ−セルロース分画を、レムリの系によるスラブ式Ｓ
ＤＳ、？リアクリルアミ）’　（１５チ）ゲル電気泳動
によって解析した一ｊなわち、分画刃μｌ（２，４μｇ
）をアプライし、５０Ｖ電圧一定で約１２時間泳動した
。その結果、この系においても、クマシプリリアントブ
ルーによる染色で一本のバンド全形成した。マーカーの
移動度より、分子量は５．０００前後と推定した。

次に、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で得ら
れた単一バンドに抗菌活性が対応するか否かを調べるた
めに、ＣＭ−セルロース分画を、セファデックスＧ−５
０によってゲル濾過した１、すなわち、分画５００　ｕ
＋　ｆφ１．ｌＸ６０αのカラムにアプライし、緩衝液
Ｓで溶出させた、カラムは、あらかじめカラム容積の５
倍以上の緩衝液Ｓで洗浄し、十分に平衡化しておいた。

分画番号３５ヲ中心に、はぼ対称なタン、ｅりのピーク
が得られた。

そして、このタン・ぞりの消長と一致して、抗菌活性が
回収された。タン・ぞりの回収率及び活性の回収率は、
ともにおよそ３０％であった。このピークの３分画につ
いて、凍結乾燥ののち、５ＤＳ−ポリアクリルアミド（
１５チ）ゲル電気泳動を行なうと、ゲル濾過にアプライ
前と同じ移動度の単一バンドが得られたつこのことより
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一パン
Ｆ′ヲ形成する蛋白が、抗菌活性を有するものと判断し
た９各種分子量マーカーの溶出位置より、この抗菌性蛋
白のゲル濾過におげろ分子量は約５，０００と算定した
。

以上から、第三のＣＭ−セルロース分画は、未変性条件
下のポリアクリルアミドゲル電気泳動及び５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動という二つの原理の異なる
電気泳動システムにおいて単一ノ々ンＹ２与え、各々の
・々ンドに抗菌活性が対応することが示された。これは
はじめに定めた精製完了の判断基準をみた丁ものであり
、幼虫体液中の抗菌活性の第三成分は、精製が完了した
ものと判断した。

以上の結果により、体表に傷害ｆｃ５けて２日後の幼虫
約２０　、０００匹より採集した体液１３０ｍ１’ｊ５
出発材料とし、３種の抗菌性成分を確認したが、特に第
三成分につ℃・ではハイトロキシルアパタイト分画の段
階で、最終的に約７０μｇ得た。この成分の比活性は約
３０　、０００倍に上昇しており、活性収率は１４チで
あった。最終標品の比活性２７　、０００単位／ｍｇ　
より、第三成分はｏ、ｉμｇで】ｏ７オーダーの大腸菌
に対し致死的に作用するものと計算された。これは一般
の抗生物質とくらべても、強い抗菌力であると（・える
。

以上の精製操作をまとめると次表のようになる。

／ ３）抗菌性蛋白の性質 （］）第第三外の抗菌スペクトル 試料は、２単位を用い、エーテルで滅菌後、エーテルを
とばし、滅菌プラスチックシャーレに入れ、これにオー
トクレーブで滅菌し液状になっている（〜６０℃）　Ｐ
、’＋ｕｅｌｌｅｒ−ｈｌｎｔｎｎ培地９ｍｌ’ｚそそ
ぎ（全１１１０ｍｌ）、ただちに攪拌して試料と混合し
た後３０℃に放置して培地を固化させた。この上にあら
かじめ２日間前培養しておいた５６種の菌液を各り約１
０′細胞ずつ一定間隔をおいて接種した。

３７℃〜・晩装置し、各画のコロニー形成全観察し、コ
ントロールと同程度のコロニーを形成した場合４、著し
く小さいコロニーを形成した場合ト、コロニーが形成さ
れない場合−１と判定した。ただし、Ｍ、６０７の菌の
みは、２日間培養したのち、同様の判定をした。なおコ
ントロールは、試料と同容量の０，２％牛血清アルブミ
ンを含む緩衝液Ｓについて測定したものである。

この結果をまとめたのが次表である。

第２表 （イ）コロニー形成　有 （＠〃無 第２表（続き） 一第２表（続き） 第２表（続き） この結果、第三成分は、大腸菌及びその近縁のバクテリ
アに対し特に強い抗菌力を持っていることがわかったー
また、Ｆ；、　ｃｏｌｔ　Ｋ　−１２につ見・ては、種
々の薬剤耐性株（アミノ配糖体系抗生物質）に対し抗菌
力を示していることから、この物質の作用カー既存のア
ミノ配糖体系の抗生物質とはタイプの異なるものである
ことを示唆している。

一般に、抗菌性物質はＧｒａｍ　ｊ＠　　菌に効果的で
あるものが多い。その意味からもＧｒａｍＨ菌に効果的
であり、一部Ｇｒａ＋Ｊ＋→菌にも作用するということ
は、その抗菌作用のメカニズムを考える上で興味深いも
のである〜 （２）抗菌性蛋白のアミノ酸分析 前述の精製操作によって得られた第三成分のうち、１６
４μｇについてアミノ酸分析を行なった。

試料は、６Ｎの塩酸で１１ｒｌ’Ｃ２２時間加水分解し
た（β−インドールプロピオン酸添加）。分析は、日立
８３５型アミノ酸分析計を用いて高分離法で行なった、
結果全下表に示す。

モルチ アスノぞラギン酸　　　　　　７．８４スレオニン　　
　　　　　　６．０４ セリン　　　　　　　　２７３ グルタミン酸　　　　　　　１０．０６グリシン　　　
　　　　　１１．４８ アラ０ン　　　　　　　　１２，２５ ノ２リン　　　　　　　　　　　　５，８７シスチン　
　　　　　　　　ｏ、３８ メチオニン　　　　　　　　１．４８ インロイシン　　　　　　　６７４ ０イシン　　　　　　　　　４．１０ チロシン　　　　　　　　　２．５６ フエニルアラニン　　　　　１２７ リジン　　　　　　　　　１０３７ ヒスチジン　　　　　　　　３，９１ アルギニン　　　　　　　　６．７８ ノロリン　　　　　　　　　４５４ 計　　　　１００ 参考文献 （１）ネーチャー、２２２，６９５　（１９６９）（２
）ジャーナル、オシ、インバーチプレート１．ｅソロジ
ー、３２．１７１　（１，９７８）（３）・ジャーナル
、オシ、インセクト、フィジオロ、ジー、１４．１０２
５　（１９６８）（４）ユーロビアン、ジャーナル、オ
シ、バイオケミストリー、１０６．７　（１９８０）（
５）・ジャーナル、オシ、インセクト、フィジオロジー
、乙、１１６９　（１９７７） （６）ザ、ジャーナル、オシ、バイオロジカル、ケミス
トリー、２５５．２９１９　（，１９８０）（７）ザ、
・ジャーナル、オシ１．フイオロジカル、ケミストリー
、２５６．７０８７　（１９８１）（９）ネーチャー、
２７９．７２５・７２８　（１９７９）（１０）バイオ
ケミストリー、加、５９７３　（１９８１）（１１）日
本薬学会第１０１回年会（１９８１）（１２）ネーチャ
ー、２２７．６８０　（１９７０）（１３）バイオケミ
ストリー、１０．　２６０６　（１９７１）（１４）ジ
ャーナル、オシ、ノマイオヶミストリー、１９３、２６
５　　Ｃ１９５１） （１５）ノルディスク、メデイスン、５８．１１１８８
（１９５７） （＋６）、ジャーナル、オシ、バイオケミストリー、４
６．５１７　（１９５９）

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明抗菌性蛋白のアミノ酸成分を示すクロ
マトグラムを模写したものである２第２図は、センチニ
クノク工体液からの三種の分画の電気泳動図を模写した
ものである（ここで、Ｈは傷害後２日目の幼虫体液０．
８単位、Ｃ−２、Ｃ−１、Ｇ−１各分画はそれぞれ０，
２．１．０および０．４即位を用いた）。 出願人代理人　　　猪　股　　　　清 手続補正書 昭和団年４月　！：４ 特許庁長官　　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１２３２９８号 ２、発明の名称 抗菌性蛋白、その製造法および その用途 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 湧永製薬株式会社 ７、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ８、補正の内容 （１）明細書第１６頁下から第５行 「四槽殻形成ｊを「囲輛殻形成」と補正する。 （２）同第３１直下から第７行 「１５チ」を、「６５％」と補正する。 （３）第脂頁の第２表を、下記の通りに補正する。 ［第２表 抗菌スペクトル （−＋−１コロニー形成　有 （→〃無 （ＡＴＣＵ　　ｂｂｊ３Ｊ 手続補正書 昭和間作り月上λ日 特許庁長官　　若　杉　和　夫　殿 ］、小件の表示 昭和５７年特許願第１２３２９８号 ２、発明の名称 抗菌性蛋白、その製造法および その用途 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 湧水製薬株式会社 ７、補正の対象 昭和郭年４月１５日提出の手続補正臀の「補正の内容」
の欄 ８、補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、双翅目または膜翅目に属する昆虫の幼虫の体表傷害
   時にその幼虫の体液中に誘導され、下記の性質金有する
   抗菌性蛋白。 （１）分子数　約４００Ｑ〜７５００ （２）熱安定性（１０〜６０分間、Ｉｏｎ　”Ｃ）（３
   ）含水メタノールに可溶 （４）　　１０％ウシ血清添加培地中でも抗菌活性をも
   つ。 （５）アミノ酸組成（モルチ） アス、ｅラギン酸またはアスノラギン７．８±２．３、
   スレオニン６．０±１．８、セリン２７±０．８、グル
   タミン酸またはグルタミン１０．１±３、（）、グリシ
   ン１１．５±３，１、アラニン１２．３士３．７、ツマ
   リン５．９±１．８、シスチンまたはシスティンど「）
   −Ｉ（シスチンとして）、メチオニン１．５　十（１，
   ４、イソロイシン６７±２．０、ロイシン／ｌ、＋　＋
   　Ｉ、９、チロシジン、６　＋ｆ）、）（、フェニルア
   ラニン１，３１０，４、リジン１０．　ｌ　＋３．　Ｉ
   、ヒスチジン３．ｑ　ｌ　ｌｊ、アルギニン６Ｈ＋　２
   ．０、プロリン４．５　＋　Ｉ、ｌＩ、トリプトファン
   １．５　＋　ｎ、５２、双翅目または膜翅目に属する昆
   虫がセンチニク、ｚ工（Ｓａｒｃｏｐｈａｇｑ　ｎｅｒ
   ｅｇｒｉｎＲ）である、特許請求の範囲第１項記載の抗
   菌性蛋白。 ３幼虫が三令幼虫である、特許請求の範囲第１〜２項記
   載の抗菌性蛋白。 ４、幼虫の体液が体表傷害後Ｏ・〜５日経過後のもので
   お金、特許請求の範囲第１〜．３項記載の抗菌性蛋白６ ５゜双翅目または膜翅目に属する昆虫の幼虫の体表に傷
   害ケ与え、その後得られる体液より体液細胞および脂肪
   体を除去したものから下記の性質を有する抗菌性蛋白を
   取得すること？特徴とする、抗菌性蛋白の製造法。 （１）分子量　約４（１００〜７５００（２）熱安定性
   （１，０〜印分間、１００℃）（３）含水メタノールに
   可溶 （４）　　１０％ウシ血清添加培地中でも抗菌活性金も
   つ （５）アミノ酸組成（モル％） アスパラギン酸またはアスパラギン７．８」２．３、ス
   レオニン６、＋１　＋ＩＪ、セリン゛ζ７１（）、８、
   グルタミン酸またはグルタミン１０．１（：吃、（）、
   グリシン１１．５　ｔ　３．ｌ＄、アラニン１２．３＋
   ；３７、バリン５．９±１．８、シスチンまたはシステ
   ィン（咀＋ｉ　＜シスチンとじ−〔）、メチオニン１．
   ５　ｉ：　ｎ、４、イソロイシン６．７ト礼Ｃ）、ロイ
   シン４，１　＋　１．２、チロシン２．６＋　＋１．＋
   （、フェニルアラニン１．３　ｆ　Ｏ，４、リジン１υ
   ４す３．１、ヒスチジン：う、９ｔ　１．２、アルギニ
   ン１ｉｔ（−ｔ　２．ｎ、プロリン４．５±１．４、ト
   リットファン１．５　＋−ｆｌ、５６、双翅目または膜
   翅目に属する昆虫がセンチニクバエ（８ａｒｃｏｐｈｕ
   ｃＣａ　ｐｅｒｅｇｒｌｎａ　）である、特許請求の範
   囲第５項記載の製造法、 ７幼虫が三令幼虫である、特許請求の範囲第５８、幼虫
   の体液が体表傷害後０〜５日経過後のものである、特許
   請求の範囲５〜７項記載の製造法。 ９、目的蛋白の取得工程において、材料ヲ８（）〜１２
   （ピＣの熱処理に付す操作を含む、特許請求の範囲第５
   〜８項記載の製造法。 １０、双翅目または膜翅目に属する昆虫の幼虫の体表傷
   害時にその幼虫の体液中に誘導され、下記の性ＩＦｊｆ
   ｆｉ有する抗菌性蛋白を有効成分とする可食性抗菌剤、 （１）分子１片　約４ｎｌ’ｌｎ〜７５Ｆ１０（２）熱
   安定性（１０〜６０分間、１００℃）（３）含水メタノ
   ールに可溶 （４）　　１０％ウシ血清添加培地中でも抗菌活性金も
   つ。 （５）アミノ酸組成 アスパラギン酸またはアスパラギン７ρト２３、スレオ
   ニ：／　Ｃ，、（１＋　１．８、セリン２．７＋０．８
   、グルタミン酸またはグルタミンＨＪ、　１　ｔ：６．
   ７±２．０、ロイシン４．１±１．２、チロシン２．６
   トＯ＞’＋、フェニルアラニン１．３　＋（１，４、リ
   ジン１０．４：＋３，１、ヒスチジン３．９　Ｊ、−１
   ，，２、アルギニン６．８　＋　２．０、プロリン４，
   ６土１．４、トリプトファン１．５±０．５ １１、双翅目または膜翅目に属する昆虫がセンチニクバ
   エ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ　ｐｅｒｅｔｒｒｉｎａ　）
   である、特許請求の範囲第１Ｏ項記載の可食性抗菌剤、
   １２、幼虫が三令幼虫である、特許請求の範囲第１０〜
   １・１・項記載の可食性抗菌剤。 １３、幼虫の体液が体表傷害後０〜５日経過後のもので
   ある、特許請求の範囲１０〜１２項記載の可食性抗菌剤
   。