DE69838667T2

DE69838667T2 - Verfahren zur stabilisierung nützlicher proteine und nützliche proteinhaltige mittel

Info

Publication number: DE69838667T2
Application number: DE69838667T
Authority: DE
Inventors: Fumiyoshi Okano; Katsushige Yamada; Masatoshi Watanabe; Naomi Mishima-shi HARA; Masahiro Satoh; Tsukasa Ito; Akira Yanai
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1997-08-01
Filing date: 1998-07-31
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2018-08-01
Also published as: DE69838667D1; AU740735B2; CA2267210A1; CA2267210C; US6391296B1; WO1999006429A1; EP0950663A4; EP0950663A1; AU8462098A; EP0950663B1; NZ335005A

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Stabilisierung und Konservierung von kaninem Interferon-γ und eine Zusammensetzung, die in der Lage ist, die biologische Aktivität des kanines Interferons-γ zu erhalten.
Hintergrund der Erfindung
Proteine, insbesondere Enzyme, nützliche Proteine, die eine biologische Aktivität haben, und dergleichen können mit geringem Kostenaufwand durch rekombinante Gentechnologien in großen Mengen hergestellt werden, und werden folglich in verschiedenen Bereichen, insbesondere in der Medizin, der Diagnostik und bei Nahrungsmittels angewendet. Auf der anderen Seite werden Proteine inaktiviert, wenn ihre Primärstruktur auf Grund von Abbau beschädigt wird, und ihre Funktion hängt in hohem Masse von der höher geordneten Struktur ab. Deshalb haben Proteine auch ein Problem, weil die höher geordnete Struktur leicht durch verschiedene Faktoren (Temperatur, Veränderungen mit der Zeit, Licht und pH) zerstört wird, abhängig von den Proteintypen, und dadurch verlieren sie ihre Funktion (biologische Aktivität). Folglich werden Forschungen an einem Verfahren zur Stabilisierung der höher geordneten Struktur eines Proteins und an der Aufrechterhaltung dieser gemacht.
Derzeit umfasst ein nützliches allgemeines Verfahren zur Stabilisierung eines Proteins das Mischen mit einem anderen Protein (Gelatine, Albumin, Serum, Kollagen oder dergleichen). Das Mischen mit Gelatine oder Serum erlaubt die Konservierung über einen relativ langen Zeitraum, und es gibt viele bekannte Medikamentenprodukte von Enzymen und biologisch aktiven Proteinen, die durch ein solches Mischverfahren hergestellt werden ( japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichungen Nrn. 2-264728 , 2-49734 , 54-80406 und 56-68607 ).
Es wird eine Stabilisierung von Interferon (IFN) beschrieben, das eine biologisch aktive Substanz ist, die eine immunmodulierende und antivirale Wirkung hat und die bei medizinischen Anwendungen die Aufmerksamkeit auf sich zieht. Die japanischen nicht geprüften Patentveröffentlichungen Nrn. 60-228422 , 60-34919 , 61-137828 und 60-260523 offenbaren ein Stabilisierungsverfahren, das das Mischen mit Albumin oder Gelatine umfasst. Beispiele für bekannte Verbindungen, die die proteinstabilisierende Wirkung haben und keine Proteine sind, schließen Saccharide, insbesondere Monosaccharide, Disaccharide und Polysaccharide wie Dextran und Hydroxyethylstärke ( japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichungen Nrn. 59-18122 , 61-44826 und 60-155136 und japanische geprüfte Patentveröffentlichung Nr. 6-51641 ), Cyclodextrin und polyhydrische Zuckeralkohole ( japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung Nr. 58-92691 und japanische geprüfte Patentveröffentlichung Nr. 3-500882 ) ein. Es gibt auch ein Verfahren ein Dimer von IFN-γ dominant zu machen, das eine hohe Aktivität hat, wobei Lactobionsäure verwendet wird ( japanische geprüfte Patentveröffentlichung Nr. 3-501604 ).
Es gibt viele Berichte über Mischungen von Gummi arabicum und Proteinen, in denen eine wässrige Lösung aus Gummi arabicum als ein Dispergiermittel für eine Medizin verwendet wird ( japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung Nr. 6-321803 ). Es gibt jedoch auch bestimmte Berichtbeispiele, einschließlich eines Beispiels, in dem bei der Herstellung eine Antikörpers die Menge des hergestellten Antikörpers durch die Verabreichung einer Mischung aus einem Protein als ein Antigen und Gummi arabicum mehr erhöht wird als durch die Verabreichung eines Proteins allein ( japanische geprüfte Patentveröffentlichung Nr. 58-23847 ), eines Beispiels, in dem die Antikrebsaktivität durch eine Kombination eines Antikrebsmedikaments und einer signifikanten Menge an Gummi arabicum erhöht wird ( japanische geprüfte Patentveröffentlichung Nr. 3-127740 ), und eines Beispiels, in dem die Effizienz eines Medikamententransports (Polypeptid) zu bestimmen Zellen durch die Synthese eines Komplexes aus dem Medikament und Gummi arabicum erhöht wird (Beschreibung des U.S.P. Nr. 5554386 ). Es gibt jedoch kein bekanntes Verfahren zur Stabilisierung von kaninem Interferon-γ und keine Interferon-γ-Zusammensetzung, die durch das Mischen mit Gummi arabicum stabilisiert wird.
Wenn ein Protein als ein medizinischer Zusatzstoff verwendet wird, insbesondere als ein Zusatzstoff für ein Injektionsmedikament, ist der Zusatzstoff selbst ein heterogenes Protein für den lebenden Organismus, und folglich verursacht er möglicherweise eine Allergie, abhängig von der zugegebenen Menge des Zusatzstoffes. Ferner ist es bei Gelatine schwierig, die aus dem Rind gewonnen wird und als ein Protein bekannt ist, das aus verschiedenen Gründen zu Arzneimitteln zugegeben werden kann, mit Sicherheit zu vermeiden, dass sie mit einem Protein vermischt wird, das eine bovine spongiforme Enzephalopathie verursacht. Wie oben beschrieben wird auf mehrere Probleme hingewiesen. Deshalb gibt es einen Bedarf für eine Verbindung, die kein Protein ist, die für lebende Organismen atoxisch ist und die die Wirkung hat ein Protein zu stabilisieren. Bekannte Beispiele für solche Verbindungen schließen Saccharide, polyhydrische Alkohole und dergleichen ein. Es ist jedoch schwierig ein biologisch aktives Protein in einer Aufbewahrungsform stabil zu erhalten, wie eine wässrige Lösung oder ein gefriergetrockneter Feststoff mit einem weiten pH-Bereich, und folglich wird ein Stabilisator benötigt, der eine höhere Sicherheit und Wirkung hat.
Das WO 97/411885 lehrt die Stabilisierung von humanem Interferon in homöopathischen Tabletten mit verschiedenen Stabilisatoren, zum Beispiel mit Gummi arabicum.
Das US 4,824,938 beschreibt die Stabilisierung von proteinösen bioaktiven Substanzen in der Anwesenheit von bestimmten Polysacchariden, insbesondere Pullulan, Elasinan und ihre Teilhydrosylate.
Das EP 0 267 015 A2 beschreibt medizinische Zusammensetzungen, die einen epidermalen Wachstumsfaktor und eine stabilisierende Menge von Zellulosederivaten enthalten.
Das JP 0 300 4790 beschreibt eine Stabilisierungsverfahren durch die Zugabe einer proteinähnlichen Substanz und einem Polysaccharid zu der wässrigen Lösung, die ein proteinabbauendes Enzym enthält.
Das WO 86/03944 beschreibt ein thermisch stabiles Kochsalzsubstitut, das einen Komplex aus einem hitzestabilen Dipeptid umfasst, das wenigstens einen Cycloalkylaminosäurerest in dem Peptidmolekül und einen Polysaccharid-Gummistabilisator enthält.
Das EP 0 133 767 A1 beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung von humanem Interferon-γ durch die Lyophilisierung einer wässrigen Lösung, die einen Stabilisator enthält.
Offenbarung der Erfindung
Als ein Ergebnis intensiver Forschung haben die Erfinder herausgefunden, dass die Aktivität von kaninem Interferon-γ durch das Mischen von kaninem Interferon-γ und einer wässrigen Lösung aus Gummi arabicum, das die Grundstruktur von Arabinsäure hat, und das Gefriertrocknen der Mischung stabil aufrecht erhalten werden kann.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Zeichnung, die die Konstruktion von einem Ultraviolettbetrahlungsapparat zeigt, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Die Referenznummern 1 bis beziehungsweise 5 bezeichnen das Folgende:

1: Körper des Ultraviolettbetrahlungsapparats
2: Sterilisationslampe
3: Gehäuse
4: Pumpe
5: Insektenhämolymphe, die Baculoviren enthält

Besten Ausführungsformen der Erfindung
Kanins Interferon-γ ist ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz hat, die in der Referenz 1 gezeigt ist. Die nützlichen Proteine der vorliegenden Erfindung schließen jedoch auch Polypeptide ein, in denen die Aminosäuresequenzen teilweise substituiert oder deletiert oder einige Aminosäurereste angefügt sind, solange sie die grundlegende biologische Aktivität von Interferon-γ für Zellen haben, die aus Hunden stammen, zum Beispiel kanine MDCK-Zellen (ATCC CCL-34), wie es in Referenz 2 gezeigt ist. Ein Beispiel für solche Polypeptide ist ein Polypeptid, das aus einem Maturationsprotein besteht, das die Aminosäuresequenz hat, die durch die Sequenz Nr. 3 dargestellt ist. Ein weiteres Beispiel ist kanines Interferon-γ, das aus einem solchen Maturationsprotein besteht, wie es durch die Sequenz Nr. 27 dargestellt ist, in der die Zuckerkettenbindungsstelle deletiert ist.
Weitere Beispiele schließen kanines Interferon-γ, das aus einem solchen Maturationsprotein besteht, wie es durch die Sequenzen Nrn. 28 und 29 dargestellt ist, in denen der C-Terminus deletiert ist, und kanines Interferon-γ ein, wie es durch die Sequenz Nr. 30 dargestellt ist, in der eine Aminosäure an den N-Terminus angefügt ist.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete kanine Interferon-γ kann aus natürlichen Biomaterialien extrahiert werden und auf den benötigten Reinheitsgrad weiter aufgereinigt werden oder kann chemisch synthetisiert werden. Es kann jedoch Interferon, das unter Verwendung der rekombinanten Gentechnologie hergestellt wurde, leicht industriell verwendet werden. Die nützlichen Proteine der vorliegenden Erfindung können durch die rekombinante Gentechnologie entsprechend dem Verfahren einer herkömmlichen Methode hergestellt werden. Zum Beispiel werden die beiden Enden eines DNA-Fragments, die für ein nützlichen Protein kodieren, mit einem Restriktionsenzym verdaut und in eine geeignete Region auf einem replizierbaren Plasmid inseriert, und das Plasmid wird in Zellen eingebracht, in welchen es ausreichend repliziert wird.
Die DNA, die für das Protein von kaninem Interferon-γ kodiert und die für die Herstellung von kaninem Interferon-γ durch die rekombinante Gentechnologie benötigt wird, kann zum Beispiel durch das folgende Verfahren hergestellt werden. Es wird eine Poly-(A)-RNA aus Hundezellen extrahiert und in cDNA konvertiert, und es kann ein Gen, das für kanines Interferon-γ kodiert durch die Polymersasekettenreaktion (nachstehend mit „PCR" abgekürzt) erhalten werden, wobei ein Primer verwendet wird, der auf einer Gensequenz basiert, die für kanines Interferon-γ kodiert. Ein Beispiel für Verfahren zur Gewinnung von RNA aus kaninen Lymphozyten, die mit einem Mitogen stimuliert wurden, ist ein herkömmliches Verfahren, das zum Beispiel die Abtrennung des Polysoms, eine Saccharosedichtegradientenzentrifugation oder Elektrophorese verwendet. Als das Verfahren zur RNA-Extraktion aus den Hundezellen kann ein angemessenes Verfahren aus den Verfahren ausgewählt werden, die ein Guanidinthiocyanat-Cäsiumchlorid-Verfahren (Referenz 3), umfassend eine Guanidinthiocyanatbehandlung und dann eine CsCl-Dichtegradientenzentrifugation, ein Verfahren (Referenz 4), umfassend die Behandlung mit einem oberflächenaktiven Stoff, wobei ein Vanadiumkomplex in der Anwesenheit eines Ribonukleaseinhibitors und dann eine Phenolextraktion verwendet werden, ein Guanidinthiocyanat-Heißphenol-Verfahren, ein Guanidinthiocyanat-Guanidinhydrochlorid-Verfahren, ein Guanidinthiocyanat-Phenol-Chloroform-Verfahren, ein Verfahren, umfassend die Behandlung mit Guanidinthiocyanat und dann die Behandlung mit Lithiumchlorid, um die RNA zu präzipitieren, und dergleichen einschließen.
Die mRNA wird aus den kaninen Lymphozyten mittels eines herkömmlichen Verfahrens isoliert, zum Beispiel ein Lithiumchlorid/Harnstoff-Verfahren, ein Guanidinisothiocyanat-Verfahren, ein Oligo-dT-Cellulosesäulen-Verfahren oder dergleichen, und die cDNA wird von der auf diese Weise erhaltenen mRNA durch ein herkömmliches Verfahren synthetisiert, zum Beispiel das Gubler-Verfahren (Referenz 5), das H. Oakayam-Verfahren (Referenz 6) oder dergleichen. Obwohl die cDNA von der mRNA grundsätzlich unter Verwendung einer reversen Transkriptase wie die des Aviären Myoblastose Virus (AMV) und teilweise unter Verwendung eines Primers in Kombination mit einem Verfahren, das die DNA-Polymerase verwendet, synthetisiert werden kann, ist es zweckmäßig einen kommerziellen Synthese- oder Klonierungskit zu verwenden. Die PCR, die die cDNA als eine Vorlage und die Primer, basierend auf der Rasensequenz des kaninen Interferons-γ, verwendet, erlaubt die Herstellung von DNA, die für das Protein des kaninen Interferons-γ kodiert.
Es wird ein synthetisches Plasmid als ein Expressionsplasmidvektor, in das die auf diese Weise erhaltene DNA eingeführt wurde, in zum Beispiel Affen-COS-Zellen eingebracht, um das kanine Interferon-γ herzustellen. Auch wird DNA, die das Protein von kaninem Interferon-γ kodiert, in einem Expressionsvektor für Escherichia coli ligiert, sodass ein kanines Interferon-γ produzierendes Escherichia coli durch die Transformation mit dem auf diese Weise erhaltenen Vektor hergestellt werden kann. Zusätzlich wird ein Gen, das für das Protein von kaninem Interferon-γ kodiert, in Escherichia coli eingeführt, die eine Resistenz gegenüber dem Isoleucinantimetabolit und die Fähigkeit haben, das in dem Periplasma akkumulierte Protein in einen Kulturüberstand zu sekretieren, damit das kanine Interferon-γ in dem Kulturüberstand akkumuliert. Als die Escherichia coli, das für die Herstellung von kaninem Interferon-γ in dem Kulturüberstand verwendet werden, können irgendwelche Escherichia coli-Bakterien verwendet werden, solange sie Periplasmaproteine in den Kulturüberstand sekretieren. Escherichia coli, die die Eigenschaften haben, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, könnten auf natürlichem Weg erhalten werden, es können aber Escherichia coli, die die oben genannten Eigenschaften haben, leicht erhalten werden, indem eine Mutante entsprechend der vorliegenden Erfindung künstlich erhalten wird. Der Elternstamm für die Isolation einer Mutante ist nicht eingeschränkt und es kann irgendein Escherichia coli-Stamm als der Elternstamm verwendet werden. Es haben jedoch für die Herstellung von genrekombinanten Proteinen HB101, JM101, JM105 und JM109, die sich von dem Escherichia coli-K-12-Stamm ableiten, ausgezeichnete Eigenschaften als Genrekombinationswirte, wobei der BL21-Stamm, der sich von dem Escherichia coli-B-Stamm ableitet, bevorzugt verwendet werden kann. Es können als diese Escherichia coli-Stämme kommerzielle Stämme verwendet werden. Als die Escherichia coli, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können zum Beispiel der TI41-Stamm (FERM P-16798) und TI139-Stamm (FERN P-16797) verwendet werden, die von dem Escherichia coli-JM101-Stamm erhalten werden. Die Escherichia coli-Stämme TI41 und TI139 werden durch herkömmliche Mutationsverfahren gewonnen und haben eine Resistenz gegenüber Thiaisoleucin. Eine Mutante, die eine Resistenz gegenüber dem Isoleucinantimetabolit und die Fähigkeit hat, das in dem Periplasma akkumulierte Proteine in den Kulturüberstand zu sekretieren, kann durch Ultraviolettbestrahlung von einem Elternstamm oder durch die Behandlung mit einem Mutationsinduktionsmittel induziert werden, zum Beispiel N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Ethylmethansulfonat oder dergleichen, wobei dann ein Stamm erhalten wird, der in einem Festmedium wachsen kann, das eine Konzentration von Isoleucin enthält, bei der der Elternstamm nicht wachsen kann. Es ist von Gram-negativen Enterobakterien bekannt, die zu Providenchia, Shigella, Serratia und Citrobacter gehören, die von Standpunkt der Mikroorganismentaxonomie nahe mit Escherichia coli verwandt sind, dass sie dasselbe Periplasma wie Escherichia coli haben und diesen in der genetischen Struktur sehr ähnlich sind. Deshalb können dieselben Effekte wie in der vorliegenden Erfindung möglicherweise von den Enterobakterien erwartet werden, die eine Resistenz gegenüber einem Isoleucinantimetabolit und die Fähigkeit haben, das in dem Periplasma akkumulierte Protein in den Kulturüberstand zu sekretieren.
Als der Isoleucinantimetabolit in der vorliegenden Erfindung können irgendwelche Substanzen verwendet werden, solange sie das Wachstum von Escherichia coli hemmen und die Wachstumshemmung durch L-Isoleucin wiederhergestellt wird oder sie die Aktivität von einem Isoleucinbiosyntheseprotein hemmen oder die Expression von einem Enzymgen reprimieren und die Hemmung oder Repression durch L-Isoleucin wiederhergestellt werden kann. Beispiele für solche Substanzen schließen Thiaisoleucin, Isoleucinhydroxyamat, Norleucin, α-Aminobutylat und der dergleichen ein. Als diese Substanzen können kommerziell erhältliche Substanzen verwendet werden. Von Diesen Substanzen wird Thiaisoleucin am meisten bevorzugt verwendet.
In der vorliegenden Erfindung repräsentiert ein Stamm, der eine Resistenz gegenüber dem Isoleucinantimetabolit hat, einen Stamm, der zu einem Grad wächst, der durch den Isoleucinantimetabolit weniger vermindert ist als der des Elternstamms. Zum Beispiel wird bei einer Konzentration des Isoleucinantimetaboliten, bei der der Elternstamm einen relativen Wachstumsgrad von 30% oder weniger zeigt, vorzugsweise eine Mutante gewonnen, die einen relativen Wachstumsgrad von 60% oder mehr zeigt. Der relative Wachstumsgrad wird durch einen relativen Wert der gemessenen Absorption einer Kulturlösung bei 660 nm gegenüber 100% der Absorption ein Kulturlösung von jedem Stamm dargestellt, zu der kein Isoleucinantimetabolit zugegeben worden ist.
Das kanine Interferon-γ kann auch durch die Herstellung rekombinanter Bombyx mori Nucleopolyhedroviren hergestellt werden, die Bombyx mori infizieren, wobei ein Bombyx mori-Expressionssystem verwendet wird. Die rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedroviren können durch Cotransfektion von Bombyx mori Nucleopolyhedroviren-DNA und einem rekombinanten Plasmid, das durch die Ligation von DNA, die für das Protein von felinem Interferon oder kaninem Interferon-γ kodiert, mit einem Klonierungsvektor für Bombyx mori (Referenz 7) hergestellt wird, in etablierten Bombyx mori-Zellen hergestellt werden. Beispiele für solche genrekombinanten Nucleopolyhedroviren schließen rBNV100, mit dem die DNA rekombiniert ist, die für das Protein von felinem IFN kodiert, und rBNVγ ein, mit dem die DNA rekombiniert ist, die für das Protein von kaninem IFN-γ kodiert.
Der rBNV100 kann durch das Verfahren hergestellt werden, das in der japanischen nicht geprüften Patentveröffentlichung Nr. 4-207198 offenbart ist. Nämlich, es wird ein rekombinantes Plasmid unter Verwendung einer allgemeinen Genverfahrenstechnologie hergestellt, bei der DNA, die für das Protein von felinem IFN kodiert, erhalten von einem Plasmid, das aus einer Escherichia coli-Transformante durch ein allgemeines Verfahren extrahiert wurde, die als FERM P-1633 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology hinterlegt ist, stromabwärts von einem expressionsregulierenden Teil eines Bombyx mori Klonierungsvektors ligiert wird, zum Beispiel pBM030 (Referenz 7) oder dergleichen.
Nach der Cotransfektion des rekombinanten Plasmids und der Bombyx mori Nucleopolyhedroviren-DNA (Referenz 7) in etablierte Bombyx mori-Zellen, zum Beispiel BM-N-Stamm (Referenz 7) durch das in dieser Referenz offenbarte Verfahren, wird die Kultivierung fortgesetzt, und dann werden rekombinante Viren von nicht rekombinanten (wildtyp) Viren und rekombinanten Viren in der Kulturlösung durch ein allgemeines Verfahren manifestiert, wie eine Grenzverdünnungsanalyse oder ein Plaqueverfahren, um rekombinante Nucleopolyhedroviren zu erhalten.
Weil die rekombinanten Viren nicht die Fähigkeit haben Polyhedren zu bilden, können sie leicht von den Wildtypviren unterschieden werden. Das rBNVγ kann durch dasselbe Verfahren wie das rBNV100 erhalten werden, wobei das rekombinante Plasmid verwendet wird, das durch die Verbindung der DNA, die für das Protein von kaninem Interferon-γ kodiert, mit dem stromabwärts von einem expressionsregulierenden Teil von einem Bombyx mori Klonierungsvektors wie pBM030 erhalten wird.
Das kanine Interferon-γ wird durch das Wachstum der rekombinanten Nucleopolyhedroviren in etablierten Bombyx mori-Zellen oder lebenden Bombyx mori-Organismen hergestellt. Bei der Verwendung von etablierten Bombyx mori-Zellen werden BM-N-Zellen mit einer Kulturlösung infiziert, die die rekombinanten Viren enthält, und dann mittels einer Plattenkultur oder Float-Kultur kultiviert. Als ein Kulturmedium für die Kultivierung von BM-N-Zellen können zum Beispiel ein TC-10-Medium (Referenz 8), das fötales Rinderserum (hergestellt von Gibco Co., Ltd., nachstehend mit „FBS" abgekürzt) enthält, und ein TC-100-Medium (hergestellt von Nihon Nosankogyo Co., Ltd.) verwendet werden. Die Kultivierungstemperatur ist vorzugsweise 25 bis 28°C.
Bei der Verwendung von Bombyx mori-Organismen wird eine Kulturlösung, die die rekombinanten Viren enthält, in die Larven von Bombyx mori injiziert, die dann mit künstlicher Nahrung gefiltert werden, um das kanine Interferon-γ in der Hämolymphe herzustellen.
Für die stabilisierte kanine Interferon-γ-Zusammensetzung, die in der vorliegenden Erfindung offenbart ist, wird erwartet, dass die als ein Medikament verwendet wird. Insbesondere bei der Herstellung eines Medikaments durch das Verfahren zur Herstellung eines nützlichen Proteins unter Verwendung von Baculoviren, ist es vom Standpunkt der Sicherheit aus nötig, die verwendeten rekombinanten Baculoviren zu inaktivieren. Für die Inaktivierung der rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedroviren zur Herstellung eines nützliches Proteins ist es nötig die Infektiosität der Baculoviren zu verlieren und die Aktivität des nützlichen Zielproteins aufrecht zu erhalten.
Die Inaktivierung der Bombyx mori Nucleopolyhedroviren, die Baculoviren sind, wird im Detail durch Watanabe et al. (Referenz 9) berichtet. Ein Protein wird jedoch unter physikalischen Inaktivierungsbedingungen, wie Erhitzen, ultravioletten Strahlen, Trocknen oder dergleichen, und chemischen Inaktivierungsbedingungen, wie ein Bakterizid wie Phenol oder Formalin, Alkohol oder dergleichen, die in dieser Referenz offenbart sind, denaturiert und es ist folglich schwierig diese Bedingungen für die Herstellung eines nützlichen Proteins zu verwenden. Dieser Bericht bezieht sich auch auf die Inaktivierung von wildtyp Bombyx mori Nucleopolyhedroviren und offenbart nicht die Inaktivierung von rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedroviren.
Die japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung Nr. 4-207198 offenbart ein Verfahren zur Inaktivierung von rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedroviren, in dem der pH der Bombyx mori-Hämolymphe auf 0,5 bis 3,0 kontrolliert wird. Dieses Verfahren ist auf die Herstellung eines nützlichen Proteins beschränkt, das säurestabil ist, und ist folglich kein zufrieden stellendes Verfahren. Die Japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung Nr. 61-152276 offenbart eine Technik zur Inaktivierung rekombinanter Escherichia coli unter Verwendung von Benzalkoniumchlorid, offenbart aber nicht ein Verfahren zur Inaktivierung von rekombinanten Baculoviren. Auf der anderen Seite hängt die inaktivierende Wirkung von Benzalkoniumchlorid auf Viren von den Virustypen ab, und Yamamoto et al. berichten, dass HI-Viren durch Benzalkoniumchlorid inaktiviert werden (Referenz 10). Auf der anderen Seite berichten Watanabe et al., dass die Flacherieviren von Bombyx mori nicht durch Benzalkoniumchlorid inaktiviert werden (Referenz 11).
Die vorliegende Erfindung offenbart jedoch, dass rekombinante Baculoviren durch die Behandlung mit Benzalkoniumchlorid ohne einen Verlust der biologischen Aktivität von einem nützlichen Proteins inaktiviert werden, und offenbart das Verfahren zur Stabilisierung des nützlichen Proteins, das durch die Benzalkoniumchloridbehandlung erhalten wurde, und eine nützliche Proteinzusammensetzung davon.
Beispiele für quartäre Ammoniumsalze, die für die Inaktivierung von rekombinanten Baculoviren verwendet werden, schließen Alkyltrimethylammoniumsalze, Dialkyldimethylammoniumsalze, Alkyldimethylbenzylammoniumsalze, Alkylpyridiniumsalze, Acylaminopropyldimethylbenzylammoniumsalze und dergleichen ein. Genauer werden zum Beispiel vom Standpunkt der Wirtschaftlichkeit oder Sicherheit aus Benzalkoniumchlorid und Benzetoniumchlorid besonders bevorzugt.
Die Konzentration des verwendeten quartären Ammoniumsalzes ist vorzugsweise eine Konzentration, die für die Inaktivierung rekombinanter Baculoviren ausreichend ist und keine Aktivitätsverminderung von dem nützlichen Zielprotein verursacht. Zum Beispiel ist die Endkonzentration vorzugsweise 0,01 Gew.-% oder mehr, basierend auf dem Kulturüberstand von kultivierten Insektenzellen, die mit rekombinanten Baculoviren infiziert sind, oder der Hämolymphe von Bombyx mori-Larven, die mit rekombinanten Baculoviren infiziert sind. Die Verwendung einer übermäßig hohen Konzentration des quartären Ammoniumsalzes ist jedoch ökonomisch unvorteilhaft und verursacht Schwierigkeiten bei der Aufreinigung des nützlichen Zielproteins. Im Allgemeinen ergibt eine Behandlung mit 0,5 Gew.-% oder weniger des quartären Ammoniumsalzes gute Ergebnisse bei der Herstellung eines nützlichen Proteins.
Verfahren zur Behandlung des Kulturüberstandes von Bombyx mori-Zellen oder der Hämolymphe von Bombyx mori mit einem quartären Ammoniumsalz schließt das Verfahren ein, in dem ein quartäres Ammoniumsalz zu dem Kulturüberstand von Bombyx mori-Zellen oder der Hämolymphe von Bombyx mori zugegeben wird, das Verfahren, in dem der Kulturüberstand von Bombyx mori-Zellen oder der Hämolymphe von Bombyx mori zu einer wässrigen Lösung eines quartären Ammoniumsalzes zugegeben wird, das Verfahren, in dem inzisierte Bombyx mori direkt in einer wässrigen Lösung des quartären Ammoniumsalzes gespült werden, und dergleichen. Diese Verfahren bewirken den gleichen Effekt. Die Temperatur und die Zeit für die Behandlung mit einem quartären Ammoniumsalz sind nicht eingeschränkt, solange die rekombinanten Baculoviren ausreichend inaktiviert werden. Zum Beispiel ergibt eine Behandlung bei 0 bis 25°C für 1 bis 24 Stunden gute Ergebnisse.
Die Inaktivierung von rekombinanten Baculoviren kann auch durch ultraviolette Strahlung erreicht werden. Die ultraviolette Strahlung für die Inaktivierung der rekombinanten Baculoviren kann mit irgendeiner Wellenlänge durchgeführt werden, bei der die Baculoviren inaktiviert werden können. Die Wellenlänge ist jedoch vorzugsweise 200 bis 300 nm, besonders vorzugsweise 253,7 nm.
Der verwendete Ultraviolettbetrahlungsapparat ist vorzugsweise ein Fließtyp. Eine bevorzugte Ausführungsform des Fließtyp-Ultraviolettbetrahlungsapparats ist unten mit Bezug auf die Zeichnung beschrieben.
1 zeigt einen Ultraviolettbetrahlungsapparat in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. In 1 bezeichnet die Nummer 1 den Körper des Ultraviolettbetrahlungsapparats.
Der Bestrahlungsapparat umfasst eine Sterilisationslampe 2 für ultraviolette Strahlung und ein Gehäuse 3, an dem die Sterilisationslampe 2 montiert ist. Der Einlass und Auslass für die Lösung sind in den oberen und unteren Teilen des Gehäuses bereitgestellt, sodass der Kulturüberstand der Bombyx mori-Zellen oder die Hämolymphe von Bombyx mori zwischen der Sterilisationslampe und dem Gehäuse fließt. Wenn die Temperatur des Kulturüberstands der Bombyx mori-Zellen oder der Hämolymphe von Bombyx mori auf Grund der ultravioletten Energie während der Ultraviolettbestrahlung erhöht wird, werden der Bestrahlungsapparat und die Circulating Line der Behandlungslösung vorzugsweise gekühlt. Der Abstand der Sterilisationslampe für die Ultraviolettbestrahlung und des Gehäuses hängt von der Transmission des angewendeten ultravioletten Lichts ab, ist aber vorzugsweise etwa 5 bis 50 mm.
Wenn der Kulturüberstand von Bombyx mori-Zellen oder die Hämolymphe von Bombyx mori auf Grund von Denaturierung durch die Bindung an Metallspuren oder Luftoxidation gefärbt wird, wird die Transmission des ultravioletten Lichts vermindert, wodurch Schwierigkeiten bei der Virusinaktivierung verursacht werden. Um dieses Phänomen vorzubeugen wird vorzugsweise ein metallchelatbildendes Mittel zugegeben. Als des metallchelatbildende Mittel wird vorzugsweise Dinatriumethylendiamintetraacetat verwendet. Die zuzugebende Menge ist vorzugsweise 0,1 bis 100 mM, besonders vorzugsweise 1 bis 10 mM, relativ zu einer zu behandelnden Lösung.
Die genrekombinanten Baculoviren können auch durch eine Säurebehandlung bei einem pH 3 oder weniger oder durch eine Alkalibehandlung bei einem pH 9 oder mehr inaktiviert werden. In diesem Fall wird das Interferon-γ inaktiviert, die Aktivität wird aber wieder hergestellt, indem es bei einer niedrigen Temperatur neutral gehalten wird. Das Interferon-γ, dessen Aktivität wie oben beschrieben wieder hergestellt wird, kann für die Herstellung des stabilisierten kaninen Interferons-γ der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Als die Säure oder das Alkali, die für die Inaktivierung der genrekombinanten Baculoviren verwendet werden, können Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Natriumhydroxid und dergleichen verwendet werden, die Säure oder das Alkali sind aber nicht auf diese Materialien beschränkt. Der pH der verwendeten Säure oder des verwendeten Alkali ist vorzugsweise ein Wert, der für die Inaktivierung der genrekombinanten Baculoviren ausreicht, und ist im Allgemeinen vorzugsweise 3 bis 9. Dieses Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur durchgeführt, die höher als der Gefrierpunkt ist, vorzugsweise bei 4 bis 40°C. Die Behandlungszeit ist wenigstens 1 Minute und die Behandlung kann für eine längere Zeit durchgeführt werden. Eine Behandlung für 1 bis 12 Stunden ergibt gute Resultate.
Das kanine Interferon-γ, dessen biologische Aktivität durch die Behandlung verloren geht, kann bei neutralen Bedingungen und einer niedrigen Temperatur behandelt werden, um die Aktivität davon wieder herzustellen. Die neutralen Bedingungen schließen vorzugsweise einen pH von 6 bis 8 ein und die niedrige Temperatur ist vorzugsweise 0 bis 15°C. Die Behandlungszeit ist vorzugsweise 12 Stunden oder mehr, besonders vorzugsweise 1 bis 7 Tage.
Bei der Herstellung von kaninem Interferon-γ, wobei rekombinante Baculoviren verwendet werden, ist das Verfahren zur Isolation des kaninen Interferons-γ aus dem Kulturüberstand von Bombyx mori-Zellen oder der Larvenhämolymphe von Bombyx mori nicht eingeschränkt, und es können ein allgemeines Proteinisolationsverfahren oder -reinigungsverfahren verwendet werden. Insbesondere nachdem die rekombinanten Baculoviren mit einem quartären Ammoniumsalz inaktiviert wurden, kann das kanine Interferon-γ mittels Ultrazentrifugation isoliert werden. Gleichzeitig ist es durch die Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran möglich, die für die rekombinanten Baculoviren nicht permeabel ist, das nützliche Protein zu isolieren, das keine inaktivierten rekombinanten Baculoviren von der Seite der zu permeierenden Flüssigkeit enthält.
Bei der Ultrazentrifugation der Larvenlymphe von Bombyx mori färbt sich die Hämolymphe von Bombyx mori mit der Zeit braun und es wird eine Verschlechterung der Filtrierbarkeit bei der Ultrazentrifugation auf Grund dieser Verfärbung erkannt. Da das nützliche Zielprotein häufig eine geringe Stabilität hat, wird die Ultrazentrifugation vorzugsweise in einer so kurzen Zeit wie möglich durchgeführt. In der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die Verfärbung der Larvenhämolymphe von Bombyx mori durch die Aufrechterhaltung eines pH 6 oder weniger unterdrückt werden kann. Deshalb weist die Ultrazentrifugation bei einem pH 6 oder mehr eine gute Filtrierbarkeit auf und erlaubt die Ultrafiltrationsbeendigung innerhalb kurzer Zeit. Aber auch wenn der pH auf 6 oder weniger verringert wird, beginnt die Verfärbung der Larvenhämolymphe von Bombyx mori bei einem pH von 7 oder mehr, wodurch die Filtrierbarkeit bei der Ultrazentrifugation verschlechtert wird.
Wenn die Larvenhämolymphe von Bombyx mori, die mit rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedroviren infiziert sind, auf einen pH 7 oder mehr eingestellt werden muss, weil es für ein Verfahren zur Isolation und Aufreinigung des Zielproteins und die Stabilität davon nötig ist, ist es wirksam einen ein metallchelatbildendes Mittel zuzugeben.
Die Zugabe eines metallchelatbildenen Mittels verursacht nämlich keine Verfärbung des Larvenhämolymphe von Bombyx mori, sogar bei einem pH von 7 oder mehr und erlaubt folglich die Aufrechterhaltung einer guten Filtrierbarkeit bei der Ultrazentrifugation.
Beispiele für metallchelatbildende Mittel, die zu der Larvenhämolymphe von Bombyx mori zugegeben werden, die mit rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedroviren infiziert sind, schließen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Ethylendiamintriessigsäure, Ethylendiamindiessigsäure, trans-1,2-Cyclohexandiamintetraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, Triethylentetraminhexaessigsäure, Salze davon, o-Phenanthrolin, Diamine wie Dipyridin und dergleichen ein. Jedoch vom Standpunkt der Sicherheit aus wird EDTA für die Herstellung eines Medikaments oder dergleichen bevorzugt verwendet. Die Konzentration von dem verwendeten metallchelatbildenden Mittel ist nicht begeschränkt, solange die Verfärbung der Larvenhämolymphe von Bombyx mori unterdrückt wird, die Zugabe von 2 mM oder mehr des metallchelatbildenden Mittels unterdrückt im Allgemeinen wirksam die Verfärbung der Larvenhämolymphe von Bombyx mori. Die Temperatur für die Behandlung mit dem metallchelatbildenden Mittel ist nicht eingeschränkt, solange die Aktivität des Zielproteins aufrechterhalten wird, und die Temperatur ist vorzugsweise 0 bis 30°C.
Die Ultrafiltrationsmembran, die bei der Ultrafiltration der Larvenhämolymphe von Bombyx mori verwendet wird, die mit rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedroviren infiziert sind, ist nicht eingeschränkt, es können aber vorzugsweise industriell erhältliche Ultrafiltrationsmembranen verwendet werden, wie Cellulose- und Polyphenylsulfonderivate. Die Form der Ultrafiltrationsmembran ist auch nicht eingeschränkt und es können kommerziell erhältliche Ultrafiltrationsmembranen verwendet werden, wie eine flache Ultrafiltrationsmembran, eine Holofiber-Ultrafiltrationsmembran und dergleichen. Zusätzlich können verschiedene Typen von Ultrazentrifugationsvorrichtungen verwendet werden, abhängig von der verwendeten Ultrafiltrationsmembran, und die Verwendung von irgendeiner der Ultrafiltrationsvorrichtungen ergibt denselben Effekt.
Die Ultrafiltrationsmembran kann eine Molekulargewichtfraktionierfähigkeit haben, um die Permeation von Proteinen zu verhindern, die 80% bis 90% der Gesamtproteine ausmachen, die in der Larvenhämolymphe von Bombyx mori vorhanden sind, und die Molekulargewichte von 30000 bis 70000 in einer SDS-PAGE haben. Im Allgemeinen kann vorzugsweise eine Ultrafiltrationsmembran verwendet werden, die eine Molekulargewichtsfraktionsgröße von 50000 bis 300000 hat, die als die Leistung der Ultrafiltrationsmembran angegeben wird. Ferner wurde unerwarteter Weise gefunden, dass eine Ultrafiltrationsmembran, die eine Molekulargewichtsfraktionsgröße von 100000 oder weniger hat, permeabel für die Proteine ist, die in einer SDS-PAGE Molekulargewichte von etwa 30000 und 700000 haben und in der Larvenhämolymphe von Bombyx mori vorhanden sind. Deshalb kann, wenn das Zielprotein eine Ultrafiltrationsmembran permeiert, die eine Molekulargewichtsfraktionsgröße von 100000 hat, die Abtrennung der Hauptproteinkontamination in der Larvenhämolypmphe von Bombyx mori von dem Zielprotein ausreichend auf der Seite der permeierten Flüssigkeit erweicht werden.
Das Verfahren zur Isolation und Aufreinigung des kaninen Interferons-γ, das durch die rekombinante Gentechnologie hergestellt wurde, ist nicht eingeschränkt und es kann ein allgemeines Verfahren zur Proteinaufreinigung verwendet werden. Zum Beispiel kann das Protein durch eine Kombination einer Chromatographie, wobei ein Silicagelträger, ein Ionenaustauscherträger, ein Gelfiltrationsträger, ein Chelatträger, ein färbemittelhaltender Träger oder dergleichen verwendet wird, und einer Ultrafiltration, Gelfiltration, Dialase, Entsalzung durch Aussalzen oder Konzentration aufgereinigt und isoliert werden.
Das Gummi arabicum, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hat die folgende Struktur:
Die Verbindungen, die für die Stabilisierung von Proteinen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden und die die Grundstruktur von Arabinsäure haben, repräsentieren alle Verbindungen, die die Grundstruktur von Arabinsäure haben, die, als einen sekundären Bestandteil, keinen Bestandteil enthalten, der Proteine inaktiviert oder die stabilisierende Wirkung von Arabinsäure auf Proteine hemmt, und schließen Gummi arabicum als eine Polymerverbindung (Molekulargewicht von etwa 200000 bis 250000), in der viele Arabinsäuremoleküle verbunden sind, Abbauprodukte und modifizierte Produkte davon ein.
Die Konzentration von einer wässrigen Lösung von einer Verbindung, die die Grundstruktur von Arabinsäure hat, ist irgendein gewünschter Wert, eine zu geringe Konzentration aber hat eine geringe stabilisierende Wirkung und eine hohe Konzentration verursacht eine Kostenzunahme und eine Zunahme in der Viskosität des Gummis arabicum, wodurch Schwierigkeiten bei der Handhabung hervorgerufen werden. Deshalb ist die Konzentration vorzugsweise 0,01 bis 10 Gew.-% und besonders vorzugsweise 0,5 bis 2,0 Gew.-%.
Die biologische Aktivität eines nützlichen Proteins kann leicht durch externe Faktoren verloren gehen, wie eine Temperaturveränderung durch Gefrieren, Schmelzen, Erhitzen oder dergleichen, eine pH-Veränderung durch Extraktion, Reinigung, Lösen in einem Puffer oder dergleichen. Es wird jedoch ein nützliches Protein, vor diesen Arbeitsvorgängen, die eine Inaktivierung herbeiführen, mit einer Verbindung gemischt, die die Grundstruktur von Arabinsäure hat, um die biologische Aktivität des nützlichen Proteins signifikant aufrecht zu erhalten.
Es ist im Allgemeinen bekannt, dass, während die Reinheit von dem Zielprotein mit dem Fortschreiten der Aufreinigungsschritte von dem Vorgang zur Proteinaufreinigung zunimmt, das Protein leicht inaktiviert wird. Der Aufreinigungsvorgang ist nämlich ein Vorgang, der eine Inaktivierung induziert, die Inaktivierung aber von dem Protein auf Grund der Aufreinigung kann durch das Mischen, in einem Schritt vor der Aufreinigung oder im Verlauf der Aufreinigung, mit einer Verbindung vorgebeugt werden, die die Grundstruktur von Arabinsäure hat.
Beim Gefriertrocknen nimmt die Konservierungseigenschaft mit abnehmendem Wassergehalt zu und folglich wird die Zusammensetzung vorzugsweise auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 5% oder weniger getrocknet. Die auf diese Weise gefriergetrocknete Zusammensetzung wird vorzugsweise dunkel und kühl aufbewahrt und kann bei Raumtemperatur für ein Jahr und stabil für einen längeren Zeitraum durch eine Aufbewahrung im Kühlschrank aufbewahrt werden. Die auf diese Weise gefriergetrocknete Zusammensetzung kann für 2 Monate oder mehr bei 50°C aufbewahrt werden, grausame Bedingungen für eine Konservierung. Für die Verwendung der gefriergetrockneten Zusammensetzung wird sie wieder mit Wasser gelöst, in einigen Fällen mit einer Lösung wie einer physiologischen Kochsalzlösung. Nach dem Wiederauflösen ist das Konservierungsverfahren dasselbe wie das Verfahren zur Konservierung in einem flüssigen Stadium.
Der bevorzugte pH von einer Mischung der Verbindung, die die Grundstruktur von Arabinsäure hat, und dem nützlichen Protein hängt von der pH-Stabilität von dem nützlichen Protein selbst ab, aber der Bereich für die pH-Stabilität von dem nützlichen Protein wird durch das Mischen des nützlichen Proteins und der Verbindung, die die Grundstruktur von Arabinsäure hat, erweitert. Für eine wässrige Lösung von IFN-γ, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist bekannt, dass sie signifikant inaktiviert wird, wenn sie nicht bei einem pH von 6 bis 8 aufbewahrt wird, in dem Fall der Konservierung mit der Mischung mit einer wässrigen Lösung aus Gummi arabicum aber können 100% der Aktivität in dem pH-Bereich von 6 bis 7 und 70% oder mehr der Aktivität in dem pH-Bereich von 4,5 bis 8,0 aufrechterhalten werden. In dem Fall von Gefriertrocknen können annähernd 100% der Aktivität in dem pH-Bereich von 4,5 bis 8,0 aufrechterhalten werden.
Die Mischung aus Gummi arabicum und einem nützlichen Protein kann für verschiedene Anwendungen verwendet werden, basierend auf der Funktion, die das Protein besitzt. Wenn ein nützliches Protein für medizinische Anwendungen vorteilhaft ist und eine Qualität hat, die keine Probleme bei der medizinischen Anwendungen macht, dann wird Gummi arabicum mit Pharmaziequalität oder einer Qualität für die Zugabe zu Medikamenten verwendet, sodass die Mischung für medizinische Anwendungen verwendet werden kann.
Neben diesen Bestandteilen kann die Zusammensetzung aus dem nützlichen Protein, die eine Verbindung enthält, die die Grundstruktur von Arabinsäure hat, irgendeine Verbindungen enthalten, die die Aktivität der Proteine nicht hemmt. Zum Beispiel können Polyole wie Polyethylenglycol, ein oberflächenaktiver Stoff wie Tween 20, Saccharide wie Sorbitol, Aminosäuren wie Glycin oder Proteine wie Gelatine zugegeben werden. Da die Zugabe von Salz kein Problem verursacht, kann der osmotische Druck durch Salz kontrolliert werden, wenn die Zusammensetzung zum Beispiel als Injektionsmedikament verwendet wird.
Beispiele
Obwohl die vorliegende Erfindung unten im Detail mit Bezug auf Beispiele beschrieben wird, wird der Bereich der Erfindung durch diese Beispiele nicht eingeschränkt.
[Referenzbeispiel 1] Bildung des kaninen Interferon-γ-Gens
Es wurde ein kanines Interferon-γ-Gen durch das Verfahren hergestellt, das in der japanischen nicht geprüften Patentveröffentlichung Nr. 9-234085 offenbart ist. Nämlich, das Verfahren umfasst die folgenden beiden Schritte:
(1) Herstellung von kaniner cDNA
Es wurden die Lymphocyten von kaninem peripherem Blut abgetrennt und mit Phytohämagglutinin (PHA) für 48 Stunden mit einer Endkonzentration von 50 μg/ml stimuliert. Nach der Stimulation wurde die Gesamt-RNA unter Verwendung von ISOGEN (hergestellt von Nippon Gene Co., Ltd.) präpariert. Die auf diese Weise erhaltene RNA wurde in 10 mM Tris-Salzsäurepuffer (pH 7,5) (nachstehend mit „TE" abgekürzt) gelöst, der 1 mM EDTA enthielt, und 5 Minuten mit 70°C behandelt, und dann wurde dieselbe Menge TE zugegeben, die 1 M LiCl enthielt. Die RNA-Lösung wurde auf eine Oligo-dT-Cellulosesäule aufgetragen, die mit TE, der 0,5 M LiCl enthielt, äquilibriert war, und dann mit demselben Puffer gewaschen. Nach dem Waschen mit TE, der 0,3 M LiCl enthielt, wurde die adsorbierte Poly (A)-RNA mit 2 mM EDTA (pH 7,0), das 0,01% SDS enthielt, eluiert. Es wurde Einzelstrang-DNA synthetisiert, wobei die auf diese Weise erhaltene Poly (A)-RNA verwendet wurde. Nämlich, es wurden 5 μg Poly (A)-RNA und 0,5 μg Oligo-dT-Primer (12- bis 15-mere) in ein sterilisiertes 0,5 ml Mikrozentrifugationsröhrchen gegeben und es wurde sterilisiertes Wasser, das mit Diethylpyrocarbonat behandelt war, auf ein Gesamtvolumen von 12 μl zugegeben. Nach einer Inkubation bei 70°C für 10 Minuten, wurde das Röhrchen für 1 Minute in Eis getaucht. Es wurden zu dem Röhrchen 200 mM Tris-Salzsäurepuffer (pH 8,4), 2 μl 5000 mM KCl-Lösung, 2 μl 25 mM MgCl₂, 1 μl 10 mM dNTP und 2 μl 0,1 M DTT zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 42°C für 5 Minuten. Dann wurde 1 μl einer 200-Einheiten reversen Transkriptase (hergestellt von Gibco BRL Co., Ltd., Super Script II) zu dem Röhrchen zugegeben und dann bei 42°C für 50 Minuten weiter inkubiert, um die cDNA-Synthesereaktion zu bewirken. Nach einer weiteren Inkubation bei 70°C für 15 Minuten, wurde die Reaktion beendet und die Reaktionslösung wurde für 5 Minuten auf Eis gestellt. Zu dieser Reaktionslösung wurde 1 μl E. coli RNaseH (2 Einheiten/ml) zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 20 Minuten.
(2) Synthese des kaninem Interferon-γ-Gens
Auf der Grundlage der Basensequenzen (Referenz 1) von den N- und C-Termini des kaninen Interferons-γ wurden die folgenden zwei Primer mittels eines DNA-Synthesizers synthetisiert, in die eine EcoRI-Schnittstelle an die Enden angefügt wurde.
Es wurden 2 μl der oben unter (1) erhaltenen cDNA zu jedem 0,5 ml Mikrozentrifugationsröhrchen zugegeben, und es wurden 20 pmol von jedem Primer, ein 20 mM Tris-Salzsäurepuffer (pH 8,0), 1,5 mM MgCl₂, 25 mM KCl, 100 μg/ml Gelatine, 50 μm von jedem dNTP und 4 Einheiten ExTaqDNA-Polymerse (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) auf ein Gesamtvolumen von 100 μl zugegeben. Es wurden 30 Zyklen der Reaktion durchgeführt, wobei ein DNA Thermal Cycler, hergestellt von Perkin-Elmer Cetus Co., Ltd., und DNA-Denaturierungsbedingungen von 94°C für 1 Minute, Primeranlagerungsbedingungen von 55°C für 2 Minuten und Primerextensionsbedingungen von 72°C für 3 Minuten verwendet wurden. Die Reaktionslösung wurde einer Elektrophorese unterworfen, wobei ein 1% Agarosegel verwendet wurde, um die DNA-Fragmente mit etwa 560 bp entsprechend einem herkömmlichen Verfahren (Referenz 12) herzustellen. Die DNA-Fragmente wurden in den T-Vektor, hergestellt von Invitrogen Co., Ltd., bei 16°C für 2 Stunden ligiert, wobei der DNA-Ligationskit Ver. 1, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., verwendet wurde. Unter Verwendung dieses Produkts wurden Escherichia coli entsprechend einem allgemeinen Verfahren transformiert und die Plasmid-DNA wurde aus dem resultierenden Transformanten entsprechend einem allgemeinen Verfahren präpariert. Als nächstes wurde mittels einer PCR bestätigt, wobei dieselben Bedingungen verwendet wurden wie oben beschrieben, dass das PCR-Fragment in das Plasmid inseriert war. Es wurde auch durch einen Fluoreszenz-DNA-Sequencer (DNA Sequencer 373S, hergestellt von Perkin-Elmer Co., Ltd.) und einen Diterminator-Cycle-Sequencing-Kits, hergestellt von Perkin-Elmer Co., Ltd., entsprechend dem beiliegenden Protokolls, bestätigt, dass die resultierenden DNA-Fragmente die Rasensequenz (Sequenz Nr. 3) der kaninen Interferons-γ-DNA haben.
[Referenzbeispiel 2] Herstellung eines rekombinanten Expressionsplasmids, das DNA enthält, die für das kanine Interferon-γ kodiert
(1) Herstellung eines rekombinanten Plasmids für die Expression in Tierzellen
Die Herstellung wurde entsprechend dem Verfahren durchgeführt, das in der japanischen nicht geprüften Patentveröffentlichung Nr. 9-234086 offenbart ist. Nämlich, es wurde 1 μg Plasmid, das in dem Referenzbeispiel 1 erhalten wurden, mit 30 Einheiten Restriktionsenzym EcoRI bei 37°C für 16 Stunden verdaut und dann einer Elektrophorese unterworfen, wobei ein Agarosegel verwendet wurde, um die DNA-Fragmente des kaninen Interferons-γ mit etwa 560 bp entsprechend einem herkömmlichen Verfahren zu präparieren.
Auf der andere Seite wurde 1 μg Klonierungsvektor pCDL-SRα296 (Referenz 13) mit 30 Einheiten Restriktionsenzym EcoRI bei 37°C für 16 Stunden verdaut, gefolgt von der Dephosphorylierung der Enden, wobei eine alkalische Phosphatase (hergestellt von Takra Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde, die aus Bakterien stammte. Das Produkt wurde dann einer Elektrophorese unterworfen, wobei ein 1% Agarosegel verwendet wurde, um die DNA-Fragmente mit etwa 3,7 kb entsprechend einem allgemeinen Verfahren zu präparieren. Die Ligationsreaktion wurde dann bei 16°C für 16 Stunden unter Verwendung des DNA-Ligationskits Ver. 1 bewirkt, um die auf diese Wiese hergestellten pCDL-SRα296- und kaninen Interferon-γ-Fragmente zu verbinden. Unter Verwendung des resultierenden Produkts wurden Escherichia coli HB101 entsprechend einem allgemeinen Verfahren transformiert. Es wurden 30 PCR-Zyklen durchgeführt, wobei zwei Primertypen verwendet wurden, einschließlich eines Primers, der 27 bp von dem Initiationscodon der DNA enthielt, die für das kanine Interferon-γ kodiert, das heißt der Folgende:
eines Primers, der 30 bp von der stromabwärts gelegenen Seite der Klonierungstelle von EcoRI auf dem pCDL-SRα296 enthielt, das heißt der Folgende:
und wobei Denaturierungsbedingungen von 94°C für 1 Minute, Primeranlagerungsbedingungen von 55°C für 2 Minuten und Primerextensionsbedingungen von 72°C für 3 Minuten und der DNA Thermal Cycler, hergestellt von Perkin-Elmer Cetus Co., Ltd., verwendet wurden, um DNA-Fragmente mit etwa 650 bp zu erhalten. Als ein Ergebnis wurde ein Plasmid erhalten, in das die DNA, die für das kanine Interferon-γ kodiert, in den pCDL-SRα296 in der positiven Richtung inseriert war. Dieses rekombinante Plasmid wurde pSRαγ genannt. Die Escherichia coli, die dieses Plasmid enthielten, wurden E. coli (pSRαγ) genannt.
(2) Herstellung eines rekombinanten Plasmids für die Expression in Escherichia coli
Die Herstellung wurde entsprechend dem Verfahren hergestellt, das in der japanischen nicht geprüften Patentveröffentlichung Nr. 9-234085 offenbart ist. Nämlich, um die DNA zu erhalten, die für das reife Protein des kaninen Interferons-γ kodiert, wurden 30 PCR-Zyklen durchgeführt, wobei als die Vorlage das Plasmid, das in dem Referenzbeispiel 1 erhalten wurden, und zwei Primertypen verwendet wurden, einschließlich eines Primers, an den die Restriktionsschnittstelle für das Enzym NcoI angefügt worden war, das heißt der Folgende:
eines Primers, an den die Restriktionsschnittstelle für das Enzym BamHI angefügt worden war, das heißt der Folgende:
und wobei Denaturierungsbedingungen von 94°C für 1 Minute, Primeranlagerungsbedingungen von 55°C für 2 Minuten und Primerextensionsbedingungen von 72°C für 3 Minuten und der DNA Thermal Cycler, hergestellt von Perkin-Elmer Cetus Co., Ltd., verwendet wurden, um DNA-Fragmente mit etwa 500 bp zu erhalten. Die auf diese Weise erhaltenen Fragmente wurden mit 30 Einheiten des Restriktionsenzyms NcoI verdaut, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation. Dann wurden die Fragmente mit 30 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI verdaut und dann einer Elektrophorese unterworfen, wobei ein 1% Agarosegel verwendet wurde, um die DNA-Fragmente entsprechen dem allgemeinen Verfahren herzustellen.
Auf der anderen Seite wurde 1 μl pET8c als ein Escherichia coli Expressionsvektor mit 30 Einheiten des Restriktionsenzyms NcoI verdaut. Nach der Ethanolpräzipitation wurde der Vektor mit 30 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI verdaut und dann einer Elektrophorese unterworfen, wobei ein 1% Agarose Gel verwendet wurde, und dann mit BamHI geschnitten, um DNA-Fragmente entsprechend einem allgemeinen Verfahren herzustellen.
Die Ligationsreaktion wurde bei 16°C für 16 Stunden unter Verwendung des DNA-Ligationskits Ver. 1 bewirkt, um die DNA-Fragmente von dem pET8c, hergestellt wie oben beschrieben, und dem kaninen Interferon-γ zu verbinden. Unter Verwendung des Produkts wurden Escherichia coli HB101 entsprechend einem herkömmlichen Verfahren transformiert. Diese Escherichia coli wurden coli (pETγ) genannt.
Alternativ wurde die Herstellung entsprechend dem Verfahren durchgeführt, das in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 10-167454 offenbart ist. Nämlich, um DNA zu erhalten, die für die reifen Proteine des kaninen IFNs-γ kodiert, wurden 30 PCR-Zyklen durchgeführt, wobei als eine Vorlage die cDNA, die in dem Referenzbeispiel 1 erhalten wurden, und zwei Primertypen verwendet wurden, einschließlich eines Primers, an den die Restriktionsschnittstelle für das Enzym EcoRI angefügt worden war, das heißt:
eines Primers, an den die Restriktionsschnittstelle für das Enzym HindIII angefügt worden war, das heißt:
und wobei Denaturierungsbedingungen von 94°C für 1 Minute, Primeranlagerungsbedingungen von 55°C für 2 Minuten und Primerextensionsbedingungen von 72°C für 3 Minuten und der DNA Thermal Cycler verwendet wurden, der von Perkin-Eimer Cetus Co., Ltd. hergestellt wurde. Die auf diese Weise erhaltenen Fragmente wurden einer Elektrophorese unterworfen, wobei ein 1% Agarosegel verwendet wurde, um die DNA-Fragmente mit etwa 500 bp entsprechend einem herkömmlichen Verfahren (Referenz 12) herzustellen.
Die auf diese Weise erhaltenen Fragmente wurden mit 30 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI verdaut, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation. Dann wurden die Fragmente mit 30 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII verdaut und dann einer Elektrophorese unterworfen, wobei ein 1% Agarosegel verwendet wurde, um die kaninen Interferon-γ-DNA-Fragmente mit etwa 500 bp entsprechen einem allgemeinen Verfahren herzustellen.
Auf der anderen Seite wurde 1 μg pKK223-2 (hergestellt von Pharmacia Co., Ltd.) als ein Escherichia coli Expressionsvektor mit 30 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI verdaut. Nach der Ethanolpräzipitation wurde der Vektor mit 30 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII verdaut und dann einer Elektrophorese unterworfen, wobei ein 1% Agarose Gel verwendet wurde, um die DNA-Fragmente entsprechend einem allgemeinen Verfahren herzustellen.
Die Ligationsreaktion wurde bei 16°C für 16 Stunden unter Verwendung des DNA-Ligationskits Ver. 1 bewirkt, um die DNA-Fragmente von dem pKK223-3 und dem kaninen Interferon-γ, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, zu verbinden. Es wurde der Escherichia coli HB101-Stamm mit einem Kalzium-Chlorid-Verfahren transformiert. Aus dem Transformant, der auf einer LB-Platte wuchs, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde ein Plasmid aus Bakterien extrahiert, die für 8 Stunden in 3 ml LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert worden waren, gereinigt und dann mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII geschnitten, um ein Plasmid zu erhalten, um DNA-Fragmente mit etwa 500 bp zu erhalten. Das auf diese Wiese erhaltene rekombinante Plasmid wurde pKK-genannt und es wurden die Stämme von Escherichia coli JM101, TI41 und TI139 entsprechend einem allgemeinen Verfahren mit diesem Plasmid transformiert. Diese Stämme von Escherichia coli wurde dementsprechend Escherichia coli JM101 (pkk-γ), Escherichia coli TI41 (pkk-γ) und Escherichia coli TI139 (pkk-γ) genannt.
(3) Herstellung eines Expressionsplasmids für Bombyx mori
Es wurde 1 μg des Vektors pBM030 (Referenz 7) mit 3 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI bei 37°C für 16 Stunden verdaut und die Enden mit 1 Einheit alkalischer Phosphatase (hergestellt von Takara Shuzo, Co., Ltd.), die aus Bakterien stammt, dephosphoryliert. Das resultierende Produkt wurde einer Elektrophorese unterworfen, wobei ein 1% Agarosegel verwendet wurde, um DNA-Fragmente mit etwa 11,3 kb entsprechend einem allgemeinen Verfahren herzustellen.
Die Ligationsreaktion wurde bei 16°C für 16 Stunden unter Verwendung des DNA-Ligationskits Ver. 1 bewirkt, um die Fragmente von dem pBM030, hergestellt wie oben beschrieben, und dem kaninen Interferon-γ, hergestellt wie oben unter (2) beschrieben, zu verbinden. Unter Verwendung des Produkts wurde der Escherichia coli-Stamm HB101 transformiert. Für die Kolonien, die auf LB-Platten wuchsen, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, wurden 30 PCR-Zyklen durchgeführt, wobei zwei Primertypen verwendet wurden, einschließlich eines Primers, der 27 bp von dem Initiationscodon der DNA enthielt, die für das kanine Interferon-γ kodiert, das heißt der Folgende:
eines Primers, der 26 bp von der stromabwärts gelegenen Seite der Klonierungstelle für EcoRI auf dem pBM030 enthielt, das heißt der Folgende:
und wobei DNA-Denaturierungsbedingungen von 94°C für 1 Minute, Primeranlagerungsbedingungen von 55°C für 2 Minuten und Primerextensionsbedingungen von 72°C für 3 Minuten und der DNA Thermal Cycler, hergestellt von Perkin-Elmer Cetus Co., Ltd., verwendet wurden, um DNA-Fragmente mit etwa 650 bp zu erhalten, um einen rekombinanten Vektor zu erhalten, in den die DNA, die für das kanine Interferon-γ kodiert, in den pBM030 in der positiven Richtung inseriert worden ist. Dieses auf diese Weise erhaltene rekombinante Plasmid wurde pBMγ genannt. Die Escherichia coli, die dieses Plasmid enthalten, wurden E. coli (pBMγ) genannt.
Zusätzlich wurde ein Expressionsplasmid für kanines Interferon-γ in Bombyx mori entsprechend dem Verfahren hergestellt, das in der japanischen Patenanmeldung Nr. 10-160627 offenbart ist. Nämlich, auf der Basis der Basensequenzen (Referenz 1) der N- und C-Termini des kaninen Interferons-γ wurde der Japan Bio Service Co., Ltd. mit der Synthese von zwei Primertypen beauftragt, welche die zwei folgenden Primer umfasste:
Es wurden 2 μl der in Referenzbeispiel 1 erhaltenen cDNA in jedes 0,5 ml Mikrozentrifugationsröhrchen gegeben, und es wurden 20 pmol von jedem Primer, 10 mM Tris-Salzsäurepuffer (pH 8), 1,5 mM MgCl₂, 25 mM KCl, 100 μg/ml Gelatine, 50 μm von jedem dNTP und 4 Einheiten ExTaqDNA-Polymerse (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) zu jedem der Röhrchen auf ein Gesamtvolumen von 100 μl zugegeben. Es wurden 30 Zyklen der Reaktion unter DNA-Denaturierungsbedingungen von 94°C für 1 Minute, Primeranlagerungsbedingungen von 55°C für 2 Minuten und Primerextensionsbedingungen von 72°C für 3 Minuten durchgeführt, wobei ein DNA Thermal Cycler, hergestellt von Perkin-Elmer Cetus Co., Ltd., verwendet wurde. Das Produkt wurde einer Elektrophorese unterworfen, wobei ein 1% Agarosegel verwendet wurde, um die DNA-Fragmente mit etwa 517 bp (Sequenz Nr. 17) entsprechend einem allgemeinen Verfahren (Referenz 12) herzustellen. Die auf diese Weise erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit dem T-Vektor, hergestellt von Invitrogen Co., Ltd., entsprechend einem allgemeinen Verfahren verbunden. Unter Verwendung des Produkts wurden Escherichia coli entsprechend einem allgemeinen Verfahren transformiert, und die Plasmid-DNA wurde aus dem resultierenden Transformant entsprechend einem allgemeinen Verfahren präpariert. Als nächstes wurde unter Verwendung eines Fluoreszenz-DNA-Sequencers (DNA Sequencer 373S, hergestellt von Perkin-Elmer Co., Ltd.), entsprechend dem beiliegenden Protokolls, bestätigt, wobei ein Di-Terminator-Cycle-Sequencing-Kit verwendet wurde, der von Perkin-Elmer Co., Ltd. hergestellt wurde, dass die erhaltenen DNA-Fragmente die Basensequenz der DNA haben, die für das kanine Interferon-γ kodiert.
Als nächstes wurde eine PCR unter Verwendung einer Kombination von drei Primertypen (Sequenzen Nrn. 14 bis 19) und den DNA-Fragmenten als eine Vorlage unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben durchgeführt, um drei Typen von PCR-Amplifikationsfragmenten (Sequenzen Nrn. 20 bis 22) zu erhalten. Diese Fragmente wurden entsprechend einem allgemeinen Verfahren zurück gewonnen und dann die Fragmente, die von den Sequenzen Nrn. 20, 21 und 22 gezeigt sind, mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRV, den Restriktionsenzymen HincII und SnabI beziehungsweise den Restriktionsenzymen EcoRV und EcoRI geschnitten. Das Fragment, das in der Sequenz Nr. 19 gezeigt ist und mit den Restriktionsenzymen behandelt wurde, und das Fragment, das in der Sequenz Nr. 22 gezeigt ist und mit den Restriktionsenzymen behandelt wurde, wurden gemischt und dann in die EcoRI- und BamHI-Stellen von pUC19 entsprechend einem allgemeinen Verfahren inseriert, um einen rekombinanten Vektor zu erhalten. Der auf diese Weise erhaltene Vektor wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRV geschnitten und dann wurde das Fragment, das von der Sequenz Nr. 21 gezeigt ist, in den Vektor entsprechend einem allgemein Verfahren inseriert, um einen rekombinanten Vektor zu erhalten. Die Basensequenz der inserierten DNA (Sequenz Nr. 23) wurde durch dasselbe Verfahren wie oben beschrieben bestätigt. Dann wurde die inserierte DNA durch die Restriktionsenzyme BamHI und EcoRI zurück gewonnen und in pBM030 inseriert, der mit den Restriktionsenzymen BglII und EcoRI verdaut worden war, um einen rekombinanten Bombyx mori Expressionsvektor pBMγS2 (-) herzustellen. Die PCR wurde unter Verwendung des pBMγS2 (-) als eine Vorlage und der Primer, die von den Sequenzen Nrn. 24 und 25 gezeigt sind, durchgeführt, um die DNA-Fragmente zu erhalten, die in der Sequenz Nr. 26 gezeigt sind. Die Fragmente wurden mit einem Restriktionsenzym durch dasselbe Verfahren wie oben beschrieben behandelt und dann in die BglII- und EcoRI-Stellen von pBM030 inseriert, um pBMγS2 (-)/-20 herzustellen.
[Referenzbeispiel 3] Herstellung eines rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus, der mit DNA rekombiniert ist, die für kanines Interferon-γ kodiert
Es wurden rekombinante Vieren entsprechend dem Verfahren aus Referenz 7 hergestellt. Nämlich, es wurden 2,5 ml DNA-Mischung (die 0,25 M CaCl₂, 10 μg DNA der Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus BmNPV T3-Stämme (Referenz 7) und 65 μg DNA des rekombinanten Plasmids pYU871) tropfenweise zu 2,5 ml einer Lösung zugeben, die 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,1), 0,28 M NaCl, 0,7 mM Na₂HPO und 0,7 mM NaH₂PO₄ enthielt. Es wurden 0,5 ml der resultierenden Suspension zu einem Kulturmedium mit etwa 3 × 10⁵ BmN-Zellen zugegeben, die mittels einer Plattenkultur in 5 ml TC-10-Medium (Referenz 8), das 10% FBS enthielt, in einer 25 cm²-Flasche kultiviert worden waren, um die DNA in die Bombyx mori-Zellen einzuführen. Nach 20 Stunden wurde das Medium durch neues Medium ausgetauscht, gefolgt von einer weiteren Kultivierung für 7 Tage. Dann wurde die Kulturlösung zurück gewonnen und zentrifugiert, um einen klaren Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde verdünnt und dann zu einem Kulturmedium von BM-N-Zellen zugegeben, die mittles einer Plattenkultur kultiviert worden waren. Nach einer Kultivierung für 8 Tage, wurde ein Kulturmedium ausgewählt, in dem eine Virusinfektion durch eine mikroskopische Betrachtung beobachtet worden war und keine Polyhedren gebildet worden waren (Grenzverdünnungsverfahren).
Das Grenzverdünnungsverfahren wurde siebenmal wiederholt, um die rekombinanten Viren zu klonen. Hier wurden die rekombinanten Viren, die DNA (Sequenz Nr. 23) enthielten, die für die kanine IFN-γ-Mutante kodiert, rBNVγS2 (-) genannt, und die rekombinanten Viren, die DNA (Sequenz Nr. 3) enthielten, die für das kanine IFN-γ kodiert, wurden rBNVy genannt.
[Referenzbeispiel 5] Herstellung von rBNV-, rBNVγS2 (-)- und rBNV100-Viruslösungen
Es wurden 50 μl der Kulturlösung von BM-N-Zellen, die die rekombinanten Viren enthielten, die in den Referenzbeispielen 3 und 4 kloniert worden waren, enthielten, zu etwa 3 × 10⁵ BmN-Zellen zugegeben, die mittels einer Plattenkultur in 15 ml TC-10-Medium, das 10% FBS enthielt, auf dem Boden einer 75 cm²-Flasche kultiviert worden waren. Nach einer Kultivierung bei 27°C für 5 Tage wurde die Kulturlösung bei 3000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Der resultierende Zentrifugationsüberstand wurde jeweils als eine rBNV-, rBNVγS2 (-)- und rBNV100-Viruslösung verwendet. Die resultierende Lösung des rekombinanten Virus wurde 10 zu 7-fach verdünnt und 1 ml der verdünnten Lösung wurde zu einer Kulturlösung von BM-N-Zellen zugegeben, gefolgt von einer Kultivierung bei 27°C für 7 Tage. Als ein Ergebnis wurde eine Virusinfektion ohne die Bildung von Polyhedren durch mikroskopische Betrachtung beobachtet, und es wurde folglich bestätigt, dass rekombinante Viren erhalten wurden.
[Referenzbeispiel 6] Verfahren zur Aktivitätsmessung
Die Aktivität von Interferon wurde durch eine antivirale Wirkung gemessen. Für das kanine Interferon-γ wurde die Aktivität auch durch die expressionssteigernde Wirkung auf MHC-Klasse-II von einem kaninen Zellstamm gemessen.
Die antivirale Aktivität wurde durch das CPE-Verfahren entsprechend der Referenz 14 gemessen. Es wurden Vesikular-Stomatits-Viren als Messviren, kanine MDCK-Zellen (ATCC CCL-34) als sensitive Zellen zur Messung der antiviralen Aktivität von kaninem IFN-γ und feline FC9-Zellen (Referenz 15) als sensitive Zellen zur Messung der antiviralen Aktivität von felinem IFN verwendet. Nämlich, es wurde eine verdünnt Lösung einer Probe, die kanines IFN-γ enthielt, zu kaninen MDCK-Zellen (ATCC CCL-34) zugegeben, die bei 37°C kultiviert wurden, um ein konfluentes Wachstum auf einer 96-Loch-Mikroplatte zu bewirken, oder ähnlich, es wurde eine verdünnte Lösung einer Probe, die felines IFN enthielt, zu felinen FC9-Zellen zugegeben, die bei 37°C kultiviert wurden, um ein konfluentes Wachstum zu bewirken, gefolgt von einer weiteren Kultivierung bei 37°C für 20 bis 24 Stunden, um die antivirale Aktivität zu induzieren. Nachdem das VSV zugegeben worden war, wurde die Kultivierung bei 37°C für 24 Stunden durchgeführt, und dann wurden die kaninen MDCK- oder felinen FC9-Zellen, die auf der Mikroplatte lebten und daran hafteten, mit Kristallviolettfärbemittel, das 20% Formalin enthielt, gefärbt. Die Menge an Kristallviolett auf der Mirkoplatte wurde durch die Messung der Absorption bei 570 nm gemessen, um die Menge an kaninem IFN-γ oder felinem IFN zu bestimmen, wenn 50% der Zellen am Leben erhalten worden waren. Diese Menge kanines IFN-γ oder felines IFN wurde als eine Einheit (1 U) der antiviralen Aktivität definiert. Die Standardabweichung der antiviralen Aktivitätsdaten, die durch das oben genannte Verfahren erhalten wurden, war 32%.
Der Zellstamm FCBR1, der sich von einem kaninen Brusttumorgewebe ableitet, das den MHC-Klasse-II manifestierte, wurde entsprechend dem Verfahren etabliert, das in der Referenz 16 offenbart ist. Unter Verwendung dieses Stamms wurde die expressionssteigernde Wirkung auf dan MHC-Klasse-II gemessen. Es wurden 10⁴ FCBR1-Zellen an jedem der Löcher einer 24-Lochplatte adherent kultiviert und exprimiertes kanines Interferon-γ zu den Zellen zugegeben, gefolgt von einer Kultivierung unter Bedingungen mit 5% CO₂ bei 37°C für eine Nacht. Nach der Kultivierung wurden die Zellen mit Trypsin abgelöst und in einem 1,5 ml Mikrozentrifugationsröhrchen zentrifugiert. Zu Diesem Röhrchen wurden 10 μl Ratten anti-kaniner MHC-Klasse-II monoklonaler Antikörper (hergestellt von Stratagene Co., Ltd.) zugegeben. Nach der Suspension mit 50 μl ERDF-Medium (hergestellt von Kyokuto Seiyaku Co., Ltd.), das 10% FBS enthielt, wurde die Suspension für 1 Stunde auf Eis gestellt. Nach dem Waschen mit PBS wurde die Lösung mit 5 μl FITC-markierten Kaninchen anti-Ratten monoklonalem Antikörper (hergestellt von Stratagene Co., Ltd.) und 50 μl ERDF-Medium suspendiert, das 10% FBS enthielt, und dann für 1 Stunde auf Eis gestellt. Nach dem Waschen mit PBS wurde eine Analyse mittels eines FAC-Scan vorgenommen, der von Becton Deckson Co., Ltd. hergestellt wurde.
[Referenzbeispiel 7] Herstellung von kaninem Interferon-γ unter Verwendung von COS-1-Zellen
Es wurden 5 μg pSRαγ, der in dem Referenzbeispiel 2 erhalten wurde, zu 4 ml ERDF-Medium zugegeben, das 50 mM Tris-Salzsäurepuffer (pH 7,5), 400 μg/ml DEAE-Dextran (Pharmacia Biotech Co., Ltd.) und 100 μM Chlorokin (Sigma Co., Ltd.) enthielt, zu was 10% FBS zugegeben worden war. Auf der anderen Seite wurden COS-1-Zellen (ATCC CRL-1650) einmal mit PBS gewaschen, die zu einer 50%-igen Konfluenz in ERDF-Medium herangezogen worden waren, das 10% FBS enthielt, wobei ein Kulturgeschirr verwendet worden war, dass 10 cm Durchmesser hatte. Es wurden 4 ml der DNA-Mischung, die wie oben beschrieben erhalten wurde, zu den Zellen zugegeben, gefolgt von einer Kultivierung unter Bedingungen mit 5% CO₂ bei 37°C. Vier Stunden später wurden die Zellen mit PBS gewaschen und dann in 20 ml ERDF-Medium, das 10% FBS enthielt, unter Bedingungen mit 5% CO₂ bei 37°C für 4 Tage kultiviert, um einen Kulturüberstand zu erhalten, in dem das kanine Interferon-γ hergestellt worden war. Als ein Ergebnis der Messung der antiviralen Aktivität des auf diese Weise erhaltenen Kulturüberstands wurde eine Aktivität von 10⁴ Verdünnungseinheiten/ml oder mehr beobachtet.
[Referenzbeispiel 8] Herstellung von kaninem Interferon-γ unter Verwendung von Escherichia coli
Es wurde eine einzelne Kolonie von E. coli (pETγ), die in dem Referenzbeispiel 2 erhalten wurde, in 5 ml LB-Medium inokuliert, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Nachdem eine Kultivierung bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ von etwa 0,7 durchgeführt worden war, wurde Isopropyl-β-D thiogalactopyranosid (IPTG) mit einer Endkonzentration von 0,5 mM zu dem Kulturmedium zugegeben, gefolgt von einer weiteren Kultivierung für 1,5 Stunden.
Es wurden 1,5 ml der Kulturlösung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugationsröhrchen gegeben und bei 12000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde der Rest in 1,5 ml Tris-Salzsäurepuffer (pH 7,5) suspendiert und die Zellen auf Eis aufgebrochen, wobei ein Handy-Sonic verwendet wurde. Die Zellen wurden bei 20000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert, um eine lösliche Fraktion (überstand) zu erhalten.
Als ein Ergebnis der Messung der antiviralen Aktivität dieser Fraktion, wurde eine Aktivität von 10⁷ Verdünnungseinheiten/ml oder mehr beobachtet. Auch die Messung der expressionssteigernden Wirkung auf den MHC-Klasse-II zeigte eine Zunahme von 100% bei der Expression des MHC-Klasse-II auf dem kaninen Brusttumorzellstamm FCBR1.
[Referenzbeispiel 9] Herstellung von kaninem Interferon-γ in dem Kulturüberstand von Escherichia coli
Es wurden Mutanten durch die Isolation eines thiaisoleucinresistenten Stamms isoliert, die ein Protein, das in dem Periplasma akkumulierte, in einen Kulturüberstand sekretierten, und dann wurden Mutanten von den erhaltenen resistenten Stämmen gescreent, die die Fähigkeit haben die alkalische Phosphatase als eines der Periplasmaproteine von Escherichia coli zu sekretieren.
a) Isolation von thiaisoleucinresistenten Mutanten
Es wurden die Escherichia coli-Zellen JM101, JM105 und BL21, die in 5 ml LB-Medium (Polypepton 10 g/l, Hefeextrakt, 5 g/l, NaCl 5 g/l) bei 37°C bis zur logarithmischen Wachstumsphase kultiviert worden waren, gewonnen und zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Es wurden 5 ml Äpfelsäurepuffer (pH 6,0), der 250 μg/ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitroguanidin enthielt, zu den Zellen aus einer Suspension zugegeben, um eine Suspension zu bilden Danach wurde die Suspension für 5 Minuten auf 37°C gehalten, die Zellen durch Zentrifugation zurück gewonnen und dann zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.
Die auf diese Weise erhaltenen Zellen wurden zweckmäßig verdünnt und auf einem Plattenmedium ausplattiert, das in der Tabelle 1 gezeigt ist und zu welchem jeweils verschiedene Konzentrationen von 0,1 bis 2,0 mM Thiaisoleucin (hergestellt von Sigma Co., Ltd.) zugegeben worden waren, gefolgt von einer Kultivierung bei 37°C für eine Woche. Die gewachsenen Kolonien wurden wieder auf einer Platte ausgestrichen, die dieselbe Konzentration an Thiaisoleucin enthielt, und es wurden einzelne Kolonien isoliert, um etwa 250 Mutanten für jeden Escherichia coli-Stamm zu erhalten. Tabelle 1 Basismedium für die Separation eines thiaisoleucinresistenten Stamms

Na₂HPO₄ 12,8 g

KH₂PO₄ 3,0 g

NaCl 0,5 g

NH₄Cl 1,0 g

Glucose * 5,0 g

L-Prolin * 0,1 g

Thiamin * 20 mg

MgCl₂ * 10 mM

CaCl₂ * 1 mM

Agar * 20,0 g

*: nach getrennter Sterilisation aseptisch zugegeben

b) Separation eines die alkalische Phosphatase sekretierenden Stamms
Es wurde ein Plattenmedium (Tabelle 2) hergestellt, in dem die Konzentration der Phosphorsäure auf 3,0 mM oder darunter gehalten wurde, und es wurden alle isolierten thiaisoleucinresistenten Stämme und die Elternstämme als Referenzkontrollen (JM101, JM105 und BL21) auf dem Plattenmedium ausgestrichen, gefolgt von einer Kultivierung bei 37°C über Nacht. Es wurden gleiche Mengen 1% Agar (auf etwa 60°C abgekühlt) und 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), das 1,28 mg/ml p-Nitrophenylphosphat und 10 mM MgCl₂ enthielt, gemischt und das Plattenmedium wurde mit der resultierenden Mischung überschichtet, bevor die Mischung ausgehärtet war. Das Medium wurde dann für 1 Stunde bei 37°C gehalten, um 18 Stämme zu erhalten, bei denen eine Kolonie gelber gefärbt war, wenn man sie mit den Elternstämmen verglich.
Von diesen Stämmen wurden zwei Stämme, die sich von JM101 ableiten, mit TI41 (FERN P-16798) beziehungsweise TI139 (FERM P-16797) bezeichnet. Tabelle 1 Basismedium für das Screenen von Varianten, die die alkalische Phosphatase sekretieren

Na₂HPO₄ 0,4 g

KH₂PO₄ 0,9 g

NaCl 0,5 g

NH₄Cl 1,0 g

Glucose * 5,0 g

L-Prolin * 0,1 g

Thiamin * 20 mg

MgCl₂ * 10 mM

CaCl₂* 1 mM

Agar * 20,0 g

*: nach getrennter Sterilisation aseptisch zugegeben

c) Resistenz einer thiaisoleucinresistenten Variante

Es wurden die Escherichia coli-Stämme JM101, TI41 und TI139 bei 30°C für 24 Stunden unter Verwendung des Mediums, das in Tabelle 1 aufgeführt ist, unter Schütteln kultiviert, und die Zellen, die wuchsen, wurden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Es wurde eine Suspension der gewaschenen Bakterienzellen in 5 ml des in der Tabelle 1 gezeigten Mediums inokuliert, das 20 mg/l L-Thiaisoleucin enthielt, gefolgt vom Schütteln der Kultur für 48 Stunden bei 30°C. Dann wurde der Wachstumsgrad von jedem Stamm durch die Messung der Absorption bei 660 nm untersucht. Es wurde als ein Ergebnis aus der Tabelle 3 herausgefunden, dass das Wachstum der thiaisoleucinresistenten Stämme TI41 und TI139, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, nicht durch Thiaisoleucin gehemmt wird, wodurch sie eine hohe Thiaisoleucinresistenz aufweisen, verglichen mit dem Elternstamm JM101. Tabelle 3 Vergleich der Resistenz gegenüber Thiaisoleucin

Stamm	relativer Wachstumsgrad (%)
	keine Thiaisoleucinzugabe	Zugabe von 20 mg/l Thiaisoleucin
Escherichia coli TI41 (Beispiel dieser Erfindung)	100	95,2
Escherichia coli TI139 (Beispiel dieser Erfindung)	100	106,1
Escherichia coli JM101 (Vergleichsbeispiel)	100	17,1

(2) Sekretorische Herstellung von kaninem Interferon-γ unter Verwendung von Escherichia coli

Es wurde jeweils eine einzelne Escherichia coli-Kolonie von JM101 (pKK-γ), TI41 (pKK-γ) und TI139 (pKK-γ), die in dem Referenzbeispiel 2 erhalten worden waren, in 5 ml LB-Medium inokuliert, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Nachdem eine Kultivierung bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ von etwa 0,7 durchgeführt worden war, wurde Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid (IPTG) mit einer Endkonzentration von 1 mM zu der Kulturlösung zugeben, gefolgt von einer weiteren Kultivierung für 16 Stunden. Es wurden 1,5 ml der Kulturlösung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugationsröhrchen gegeben und dann bei 9000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert, um einen Kulturüberstand zu erhalten. Die Ergebnisse der Messung der antiviralen Aktivität des Kulturüberstands sind in der Tabelle 4 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Verwendung des Escherichia coli-Stamms TI41 oder TI139 als einen Wirt die Anhäufung einer großen Menge von kaninem Interferon-γ in dem Kulturüberstand verursacht. Tabelle 4 Sekretorische Herstellung von kaninem Interferon-γ in dem Kulturüberstand

Stamm	IFN-γ-Aktivität in dem Kulturüberstand (U/ml)
Escherichia coli TI41 (pKK-γ) (Beispiel dieser Erfindung)	3,4 × 10⁵
Escherichia coli TI139 (pKK-γ) (Beispiel dieser Erfindung)	5,9 × 10⁵
Escherichia coli JM101 (pKK-γ) (Vergleichsbeispiel)	2,1 × 10⁴

Es wurden Escherichia coli TI139 (pKK-γ) in 400 ml LB-Medium inokuliert und aerob bei 37°C kultiviert, und in der logarithmischen Wachstumsphase wurde 1 mM IPTG zu der Kulturlösung zugegeben. Nachdem die Kultivierung fortgesetzt worden war, wurden nach 3 Stunden, 5 Stunden, 8 Stunden und 21 Stunden 5 ml der Kulturlösung abgenommen. Jede der Kulturlösungen wurde für 5 Minuten bei 9000 zentrifugiert, um den Kulturüberstand und die Zellen zu trennen. Die Zellen wurden in 5 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, vollständig auf Eis durch Ultraschallwellen aufgebrochen und dann bei 12000 rpm zentrifugiert, um einen Überstand als eine lösliche Zellfraktion zu erhalten.

Die Ergebnisse der Messung der antiviralen Aktivitäten von dem auf diese Weise erhaltenen Kulturüberstand und der auf diese Weise erhaltenen löslichen Zellfraktion sind in der der Tabelle 5 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen an, dass 21 Stunden nach der Kultivierung in den Escherichia coli-Mutanten der vorliegenden Erfindung das kanine Interferon-γ größtenteils aus den Zellen sekretiert worden ist. Tabelle 5 Veränderung mit der Zeit bei der Verteilung des kaninen Interferons-γ in Escherichia coli

Kultivierungszeit (h)	IFN-Aktivität in dem Kulturüberstand (U/ml)	IFN-Aktivität in der löslichen Fraktion (innerhalb der Zellen) (U/ml)
3	4,14 × 10³	3,01 × 10⁵
5	8,64 × 10³	1,01 × 10⁶
8	5,44 × 10⁴	9,01 × 10⁵
21	8,56 × 10⁵	5,00 × 10⁴

[Referenzbeispiel 10] Herstellung von kaninem Interferon-γ unter Verwendung von etablierten Bombyx mori-Zellen
Es wurden 0,5 ml von jeder Viruslösung des rekombinanten Virus rBNVγ, der in dem Referenzbeispiel 3 erhalten wurde, zu etwa 3 × 10⁶ BmN-Zellen zugegeben, die in einer Plattenkultur in einem TC-10-Medium kultiviert wurden, das 10% FBS in einer 25-cm²-Flasche enthielt. 30 Minuten danach wurde das Medium durch 5 ml neuem TC-10-Medium ersetzt, das 10% FBS enthielt, gefolgt von einer Kultivierung bei 27°C für 3 Tage. Der Zentrifugationsüberstand der Kulturlösung wurde gesammelt, um die Aktivität zu messen. Als ein Ergebnis wurde eine antivirale Aktivität von 10⁵ U/ml erhalten.
[Referenzbeispiel 11] Herstellung von kaninem Interferon-γ in lebenden Bombyx mori-Organismen
Es wurden Bombyx mori-Larven im fünften Stadium und am zweiten Tag 50 μl/Körper eine Viruslösung der rekombinanten Viren rBNVγ oder rBNVγS2 (-) injiziert, erhalten in dem Referenzbeispiel 3, und bei 25°C für 4 Tage auf kommerziellem künstlichem Futter (hergestellt von Kanebo Silk Elegance Co., Ltd.) ernährt. Dann wurden die Abdomen von 10 Larven wurden eingekerbt und die Hämolymphe in einem eisgekühlten Eppendorfröhrchen gesammelt, und dann wurde sie zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Nach der Filtration mit einem 0,22 μm-Filter und der Sterilisation wurde die Aktivität gemessen. Als ein Ergebnis war die antivirale Aktivität der Bombyx mori-Hämolymphe etwa 2 × 10⁷ U/ml, wenn rBNVγ verwendet wurde, während die antivirale Aktivität, wenn rBNVγS2 (-) verwendet wurde, etwa 4 × 10⁷ U/ml war, was zweimal so hoch war wie bei rBNVγ. Außerdem, als ein Ergebnis der Messung der expressionssteigernden Wirkung der Bombyx mori-Hämolymphe, die durch die Inokulation von rBNVγ erhalten wurde, auf MHC-Klasse-II, war die Expressionsmenge von MHC-Klasse-II auf dem kaninen Brusttumorzellstamm FCBR1 um 100% erhöht.
[Referenzbeispiel 12] Bestimmung der Viruskonzentration mittels der zytopathogenen Wirkung
Es wurde ein Zellüberstand oder die Hämolymphe von Bombyx mori, die mit rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedroviren infiziert waren, verdünnt und dann zu einer Kulturlösung mit 5 × 10⁵/ml BM-N-Zellen zugegeben. Nach der Kultivierung bei 27°C für 10 Tage wurde durch mikroskopische Beobachtung die zytopathogene Wirkung auf die BM-N-Zellen erkannt, um die Menge der infektiösen Viren zu berechnen. Die Menge der infektiösen Viren wurde mittels der Bestimmung der TCID50 (50% Gewebekultur infektiöse Dosis) entsprechend der Referenz 7 ermittelt.
[Referenzbeispiel 13] Herstellung von kaninem Interferon-γ in lebenden Bombyx mori-Organismen und Inaktivierung von rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus durch Benzalkoniumchlorid

Es wurden Bombyx mori-Larven im fünften Stadium und am zweiten Tag 2 μl/Körper der Viruslösung des rekombinanten Virus rBNVγ injiziert, erhalten in dem Referenzbeispiel 3, und bei 25°C für 4 Tage auf kommerziellem künstlichem Futter (Kanebo Silk Elegance Co., Ltd.) ernährt. Die Abdomen von 10 Larven wurden eingekerbt, in 100 ml 50 mM Essigsäurepuffer (pH 3,5) gespült, der 0%, 0,01% oder 0,02% Benzalkoniumchlorid enthielt, und dann für 20 Stunden auf 4°C gehalten. Das resultierende Extrakt der Bombyx mori-Hämolymphe wurde bei 5000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen. Es wurde die antivirale Aktivität, die Proteinkonzentration und die Menge an infektiösen rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedroviren in dem resultierenden Überstand untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Herstellung von kaninem Interferon-γ in Bombyx mori-Larven und Inaktivierung von rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus durch Benzalkoniumchlorid

experimentelles Beispiel	Benzalkonium-chloridkonzentration (%)	Menge infektiöser Viren (TCIF₅₀/ml)	Antivirale Aktivität (U/ml)	Proteinkonzentration (mg/ml)	spezifische Aktivität (U/mg Protein)
Vergleichs-beispiel	0	8,6 × 10⁸	1,4 × 10⁶	12,5	1,1 × 10⁵
Beispiel 1 dieser Erfindung	0,01	nicht nachgewiesen	4,0 × 10⁶	7,1	5,6 × 10⁵
Beispiel 2 dieser Erfindung	0,02	nicht nachgewiesen	2,0 × 10⁶	6,6	3,0 × 10⁵

[Referenzbeispiel 15] Inaktivierung von rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus durch Benzalkoniumchlorid

Es wurden Bombyx mori-Larven im fünften Stadium und am zweiten Tag 2 μl/Körper der Viruslösung des rekombinanten Virus rBNVγ injiziert, erhalten in dem Referenzbeispiel 3, und bei 25°C für 4 Tage auf kommerziellem künstlichem Futter (Kanebo Silk Elegance Co., Ltd.) ernährt. Die Abdomen von 10 Larven wurden eingekerbt, in 100 ml 50 mM Essigsäurepuffer (pH 3,5) gespült, der 0%, 0,01% oder 0,02% Benzalkoniumchlorid enthielt, und dann für 20 Stunden auf 4°C gehalten. Der resultierende Extrakt der Bombyx mori-Hämolymphe wurde bei 5000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen. Es wurde die Menge an infektiösen rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedroviren in dem resultierenden Überstand untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 Inaktivierung von rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus durch Benzalkoniumchlorid

experimentelles Beispiel	Benzalkoniumchloridkonzentration (%)	Menge infektiöser Viren (TCIF₅₀/ml)
Vergleichsbeispiel	0	8,6 × 10⁸
Beispiel 1 dieser Erfindung	0,01	nicht nachgewiesen
Beispiel 2 dieser Erfindung	0,02	nicht nachgewiesen

[Referenzbeispiel 16] Herstellung von kaninem Interferon-γ in lebenden Bombyx mori-Organismen und Inaktivierung von rekombinanten Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus durch UV-Bestrahlung
Es wurden Bombyx mori-Larven im fünften Stadium und am zweiten Tag 2 μl/Körper der Viruslösung des rekombinanten Virus rBNVγ injiziert, erhalten in dem Referenzbeispiel 3, und bei 25°C für 4 Tage auf kommerziellem künstlichem Futter (Kanebo Silk Elegance Co., Ltd.) ernährt. Die Abdomen von 80 Larven wurden eingekerbt und die Hämolymphe jeder Larve mit 10 ml gekühltem Wasser extrahiert, das 2,5 mM/l Natriumethylendiamintetraacetat enthielt. Es wurden 800 ml des Hämolymphextrakts an den Ultaviolettbetrahlungsapparat gegeben, der in der 1 gezeigt ist, um den Extrakt mit ultravioletter Strahlung mit einer bemessenen Leistung von 7 W bei 253,7 nm zu bestrahlen, wobei die Sterilisationslampe verwendet wurde. Die maximale Distanz zu der Sterilisationslampe war 10 mm, und der Hämolymphextrakt wurde mit einer Konvektionszeit von 3 Minuten zirkuliert, um den Extrakt mit ultravioletter Strahlung zu bestrahlen. Als ein Ergebnis der Messung der ultravioletten Transmission des Hämolymphextrakts, wobei ein Spektrometer (Hitachi U-2000) verwendet wurde, war die Transmission 26% (10 min Zell).
Nach 1 Stunde und nach 2,5 Stunden wurden Proben von dem Hämolyphextrakt genommen und zusammen mit Bombyx mori-Zellen entsprechend dem Verfahren aus dem Referenzbeispiel 12 kultiviert, um das Viruswachstum zu untersuchen. In der Hämolymphextraktprobe, die nach 1 Stunde entnommen worden war (unter Berücksichtigung der Konvektionszeit, die tatsächliche Bestrahlungszeit mit ultravioletter Strahlung war 0,4 Stunden), waren 75% der Viren inaktiviert. In der Hämolymphextraktprobe, die nach 2,5 Stunde entnommen worden war (unter Berücksichtigung der Konvektionszeit, die tatsächliche Bestrahlungszeit mit ultravioletter Strahlung war 1 Stunde), waren 100% der Viren inaktiviert. Als ein Ergebnis der Titermessung des kaninen Interferons mittels eines Bioassayverfahrens, entsprechend dem Referenzbeispiel 6, war der Titer 3 × 10⁶ U/ml.
[Referenzbeispiel 17] Herstellung von kaninem Interferon-γ unter Verwendung von Bombyx mori-Larven
Es wurde Bombyx mori-Larven im fünften Stadium und am zweiten Tag die Viruslösung des genrekombinanten Baculovirus rBNVγ injiziert, offenbart in der japanischen nicht geprüften Patentveröffentlichung Nr. 9-234085 , und bei 25°C für 4 Tage auf kommerziellem künstlichem Futter (Kanebo Silk Elegance Co., Ltd.) ernährt. Die Abdomen von 50 Larven wurden eingekerbt, in 500 ml 50 mM Phosphorsäurepuffer (pH 3,5) gespült, der 0,01% Benzalkoniumchlorid enthielt, und dann für 20 Stunden auf 4°C gehalten. Der resultierende Bombyx mori-Hämolymphextrakt wurde mit 2 N NaCl neutralisiert und dann bei 5000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert, um einen Überstand zu gewinnen. Der auf diese Weise erhaltene Überstand wurde in Sulfopropylcellulose (Hochleistungstyp, hergestellt von Pharmacia Co., Ltd.) gegossen und mit einem 20 mM Phosphorsäurepuffer (pH 7,0) gewaschen. Das Adsorbat wurde dann mit Natriumchlorid mit einem linearem Konzentrationsgradienten eluiert und eine Fraktion gesammelt, die eine antivirale Aktivität hat. Das kanine Interferon-γ wurde gewonnen, über Nacht in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und dann als eine kanine IFN-γ-Probe zur Untersuchung eines Stabilisator verwendet.
[Referenzbeispiel 18] Herstellung von kaninem Interferon-γ, das eine fehlerhafte, Zuckerkette hat unter Verwendung von Bombyx mori-Larven
Es wurde eine Viruslösung des genrekombinanten Baculovirus rBNVγS2 (-), der in dem Referenzbeispiel 3 gezeigt ist, in Bombyx mori-Larven im fünften Stadium und am zweiten Tag injiziert und bei 25°C für 4 Tage auf kommerziellem künstlichem Futter (hergestellt von Kanebo Silk Elegance Co., Ltd.) ernährt. Die Abdomen von 50 Larven wurden eingekerbt, in 500 ml 50 mM Essigsäurepuffer (pH 3,5) gespült, der 0,01% Benzalkoniumchlorid enthielt, und dann für 20 Stunden auf 4°C gehalten. Der resultierende Bombyx mori-Hämolymphextrakt wurde mit 2 N NaCl neutralisiert und dann bei 5000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert, um einen Überstand zu gewinnen. Der auf diese Weise erhaltene Überstand wurde einer Ultrafiltration unterworfen, wobei ein Holofiber-Ultrafiltertyp (hergestellt von Amicon Co., Ltd., Molekulargewichtsfraktionsgröße 100000, HIP40-100) verwendet wurde. Das resultierende Filtrat wurde in eine Säule gegossen, die mit einem Sulfopropylcelluloseträger gefüllt war (Hochleistungstyp, hergestellt von Pharmacia Co., Ltd.) und mit einem 20 mM Phosphorsäurepuffer (pH 7,0) gewaschen. Das Adsorbat wurde dann mit Natriumchlorid mit einem linearem Konzentrationsgradienten eluiert und eine Fraktion gesammelt, die eine antivirale Aktivität hatte, um das kanine IFN-γ zu gewinnen. Die auf diese Weise erhaltene Fraktion wurde in eine Säule gegossen, die mit einem Blue Sepharose-Träger gefüllt war (hergestellt von Pharmacia Co., Ltd.), und mit einem 20 mM Phosphorsäurepuffer (pH 7,0) gewaschen. Das Adsorbat wurde dann mit 1 bis 1,5 M Natriumchlorid eluiert und eine Fraktion gesammelt, die eine antivirale Aktivität hatte, um das kanine IFN-γ zu gewinnen. Das auf diese Weise erhaltene kanine Interferon-γ wurde über Nacht in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und dann als eine kanine IFN-γ-Probe zur Untersuchung eines Stabilisator verwendet.
[Referenzbeispiel 19] Herstellung von kaninem Interferon-γ unter Verwendung von Escherichia coli
Es wurden Escherichia coli (Stamm BL21), in die ein Vektor (pET) eingebracht worden war, in dem ein Gen, das für das kanine IFN-γ kodiert, integriert worden war, in ein LB-Flüssigmedium inokuliert, und es wurde IPTG zu dem Medium in der logarithmischen Wachstumsphase zugegeben, sodass die Endkonzentration 1 mM war. 2 Stunden später wurden die Zellen gesammelt, in einem Volumen von 1/50 von dem zum Zeitpunkt der Kultivierung in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, mit Ultraschallwellen aufgebrochen und bei 14000 rpm zentrifugiert. Der auf diese Weise erhaltene Überstand wurde mit einem Sterilisationsfilter mit 4,5 μm gefiltert, um einen IFN-γ-Extrakt zu erhalten.
Der Extrakt wurde mit einer Sulphopropylsepharose-Säule (Hochleistungstyp, hergestellt von Pharmacia Co., Ltd.) gereinigt. Genauer, es wurde der Extrakt auf eine Säule aufgetragen, mit einem 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und ferner mit einem 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0), der 0,4 M NaCl enthielt, gewaschen. Der Extrakt wurde dann schrittweise mit Natriumphosphatpuffern eluiert, die 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M und 1,0 M NaCl enthielten. Die resultierenden Fraktionen wurden einer SDS-PAGE unterworfen, und die Fraktionen, die IFN-γ enthielten, wurden ferner mit Blue-Sepharose (Fast Flow Typ) gereinigt. Genauer, die Fraktionen, die IFN-γ enthielten, wurden gesammelt, auf die Säule aufgetragen, mit einem Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen, der 0,5 M NaCl enthielt, und weiter mit einem Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen, der 1,0 M NaCl enthielt, gefolgt von einer schrittweisen Elution mit Natriumphosphatpuffern, die 1,5 M, 2,0 M und 2,0 M NaCl enthielten. Es wurde dann eine 2,0 M eluierte Fraktion, die als eine kanine Interferon-γ-Fraktion erhalten wurde, über Nacht in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Fraktion als eine kanine Interferon-γ-Probe für die Untersuchung eines Stabilisators verwendet.
[Vergleichsbeispiel 1]
Es wurden die Veränderungen in der Aktivität der kaninen IFN-Probe (gelöst in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0), erhalten in dem Referenzbeispiel 17, untersucht, wenn die Probe ohne die Zugabe von weiteren Zusätzen, gekühlt, gefroren und gefriergetrocknet ohne die Zugabe eines Stabilisators aufbewahrt wurde. Es ist die Restaktivitätsrate der Probe gezeigt, basierend auf 100% Aktivität der Probe vor der Behandlung. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 gezeigt.
Die gefriergetrocknete Probe wurde wieder in sterilisiertem destilliertem Wasser gelöst und für die Messung der antiviralen Aktivität bereitgestellt. Tabelle 9 Aufbewahrungsverfahren und Aktivität von kaninem IFN-γ ohne zugegebenen Stabilisator

Aufbewahrungsverfahren Rate der Restaktivität (%)

Kühlaufbewahrung für 2,5 Tage 71,0

Gefrieraufbewahrung für 2,5 Tage 17,0

Gefriertrocknung 35,4
[Beispiel 1]

Die kanine IFN-Probe (gelöst in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer mit pH 7,0), die aus Bombyx mori extrahiert und in dem Referenzbeispiel 17 aufgereinigt worden ist, wurde jeweils mit 1 ml einer wässrigen Gummi-arabicum-Lösung, die verschiedene Konzentrationen (Endkonzentrationen) (5,0, 7,5, 10,0, 12,5, 15,0 und 20,0 mg/ml) hatte, in einer Glasphiole gemischt, gefriergetrocknet und dann wieder gelöst, um die Restaktivität und die Rate der Restaktivität (1,24 × 10⁵ U wurde als 100% angenommen) zu messen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10 Menge des zugegebenen Gummi arabicum und Aktivität des kaninen IFN-γ

Gummi arabicum (mg)	Restaktivität (U)	Rate der Restaktivität (%)
5,0	1,47 × 10⁵	119
7,5	1,10 × 10⁵	88
10,0	1,97 × 10⁵	158
12,5	1,39 × 10⁵	112
15,0	1,19 × 10⁵	96
20,0	1,55 × 10⁵	125

[Beispiel 2]

Es wurde 1 ml einer wässrigen Lösung, die die kanine IFN-Probe (gelöst in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH 7,0) enthält, die aus Bombyx mori extrahiert und in dem Referenzbeispiel 17 aufgereinigt worden ist, und jeweils eine wässrige Gummi-arabicum-Lösung (Endkonzentration 10,0 mg/ml) enthielt, die unterschiedliche pH-Werte aufwies, in einer Glasphiole gefriergetrocknet und dann wieder gelöst, um die Restaktivität und die Rate der Restaktivität (1,24 × 10⁵ U wurde als 100% angenommen) zu messen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 11 gezeigt. Die pH-Werte der wässrigen Gummi-arabicum-Lösungen wurden gemessen, nachdem eine angemessene Menge HCl als eine Säure oder NaOH als eine Lauge dazu zugegeben worden war, und die Messungen sind in der Tabelle gezeigt. Der Feuchtigkeitsgehalt der gefriergetrockneten Probe war etwa 1,8% (Durchschnitt von drei Messungen) und der Gummi-arabicum-Gehalt (Gew.-%) in der gefriergetrockneten Probe war etwa 98,2%. Tabelle 11 pH und Aktivität des kaninen IFN-γ mit dem zugegebenen Gummi arabicum

pH (Messung)	Restaktivität (U)	Rate der Restaktivität (%)
4,23	1,21 × 10⁵	98
4,54	1,60 × 10⁵	129
4,94	1,94 × 10⁵	156
5,22	1,38 × 10⁵	111
5,45	2,13 × 10⁵	172
6,81	2,00 × 10⁵	161
9,01	1,27 × 10⁵	102

[Beispiel 4]

Es wurde 1 ml der Lösungsmischung, die die kanine IFN-Probe (gelöst in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH 7,0) enthielt, extrahiert aus rekombinanten Escherichia coli und in dem Referenzbeispiel 19 aufgereinigt, und jede der Gummi-arabicum-Lösungen (Endkonzentrationen 10,0 mg/ml), die auf verschiedene pH-Werte eingestellt waren, in eine Glasphiole gegeben und gefriergetrocknet. Das auf diese Weise gefriergetrocknete Produkt wurde wieder gelöst, um die Restaktivität und die Rate der Restaktivität (4,0 × 10⁵ U wurde als 100% angenommen) zu messen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 13 gezeigt. Der Feuchtigkeitsgehalt der gefriergetrockneten Probe war etwa 1,7% (Durchschnitt von drei Messungen) und der Gummi-arabicum-Gehalt (Gew.-%) in der gefriergetrockneten Probe war etwa 98,3%. Tabelle 13 pH und Aktivität des kaninen IFN-γ mit dem zugegebenen Gummi arabicum

pH (Messung)	Restaktivität (U)	Rate der Restaktivität (%)
4,02	1,4 × 10⁴	3,5
4,36	2,5 × 10⁵	62,5
4,61	4,4 × 10⁵	111,0
4,86	5,6 × 10⁵	140,0
4,90	3,9 × 10⁵	97,5
5,03	6,2 × 10⁵	155,0
5,24	4,8 × 10⁵	120,0
8,20	3,5 × 10⁵	87,5

[Beispiel 5]

Die kanine IFN-γ-Probe (gelöst in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer mit pH 7,0), extrahiert aus Bombyx mori und in dem Referenzbeispiel 17 aufgereinigt, wurde mit einer wässrigen Lösung, die Gummi arabicum und Rheodol (Tween 20) enthielt, gemischt, um eine kanine IFN-γ-Lösung herzustellen, die 10 mg/ml Gummi arabicum und 0 bis 0,1% Rheodol enthielt. Ein Milliliter der auf diese Weise hergestellten kaninen IFN-γ-Lösung wurde in eine Glasphiole gegeben, gefriergetrocknet und dann wieder gelöst, um die Restaktivität und die Rate der Restaktivität (1,24 × 10⁵ U wurde als 100% angenommen) zu untersuchen. Der Feuchtigkeitsgehalt der gefriergetrockneten Probe war etwa 1,7% (Durchschnitt von drei Messungen). Die Tabelle 14 zeigt die Restaktivität und den Gummi-arabicum-Gehalt (Gew.-%) von jeder der gefriergetrockneten Proben. Tabelle 14 Konzentration und Aktivität des kaninen IFN-γ in der Anwesenheit von Gummi arabicum

Gummi arabicum (mg/ml)	Rheodol (Gew.-%)	Restaktivität (U)	verbliebene Rate (%)	Gummi-arabicumGehalt nach dem Gefriertrocknen (Gew.-%)
10,0	0	1,97 × 10⁵	158	98,1
10,0	0,01	1,78 × 10⁵	143	98,1
10,0	0,02	1,64 × 10⁵	127	98,1
10,0	0,05	1,51 × 10⁵	122	98,0
10,0	0,10	1,90 × 10⁵	153	98,0
10,0	0,20	1,85 × 10⁵	149	97,9

[Beispiel 6]

Die kanine IFN-γ-Probe (gelöst in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0), extrahiert aus Bombyx mori und in dem Referenzbeispiel 17 aufgereinigt, wurde mit einer wässrigen Lösung, die Gummi arabicum und Macrogol 4000 (Polyethylenglykol 4000) enthielt, gemischt, um eine kanine IFN-γ-Lösung herzustellen, die 10 mg/ml Gummi arabicum und 0 bis 10,0 mg/ml Macrogol enthielt. Ein Milliliter der auf diese Weise hergestellten kaninen IFN-γ-Lösung wurde in eine Glasphiole gegeben, gefriergetrocknet und dann wieder gelöst, um die Restaktivität und die Rate der Restaktivität (1,24 × 10⁵ U wurde als 100% angenommen) zu untersuchen. Der Feuchtigkeitsgehalt der gefriergetrockneten Proben war etwa 1,7% (Durchschnitt von drei Messungen). Die Tabelle 15 zeigt die Restaktivität und den Gummi-arabicum-Gehalt (Gew.-%) von jeder der gefriergetrockneten Proben. Tabelle 15 Macrogolkonzentration und Aktivität des kaninen IFN-γ in der Anwesenheit von Gummi arabicum

Gummi arabicum (mg/ml)	Macrogol (mg/ml)	Restaktivität (U)	verbliebene Rate (%)	Gummi-arabicumGehalt nach dem Gefriertrocknen (Gew.-%)
10,0	0	1,67 × 10⁵	135	98,3
10,0	2,5	1,37 × 10⁵	110	78,3
10,0	5,0	1,46 × 10⁵	118	65,0
10,0	10,0	1,52 × 10⁵	123	48,3

[Beispiel 7]

Die kanine IFN-γ-Probe (gelöst in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0), extrahiert aus Escherichia coli und in dem Referenzbeispiel 19 aufgereinigt, wurde mit einer wässrigen Lösung, die Gummi arabicum und Macrogol 4000 (Polyethylenglykol 4000) enthielt, gemischt, um eine kanine IFN-γ-Lösung herzustellen, die 0 bis 2,0 mg/ml Gummi arabicum und 5,0 mg/ml Macrogol enthielt. Ein Milliliter der auf diese Weise hergestellten kaninen IFN-γ-Lösung wurde in eine Glasphiole gegeben, gefriergetrocknet und dann wieder gelöst, um die Restaktivität und die Rate der Restaktivität (1,0 × 10⁵ U wurde als 100% angenommen) zu untersuchen. Der Feuchtigkeitsgehalt der gefriergetrockneten Proben war etwa 1,5% (Durchschnitt von drei Messungen). Die Tabelle 16 zeigt die Restaktivität und den Gummi-arabicum-Gehalt (Gew.-%) von jeder der gefriergetrockneten Proben. Tabelle 16 Menge an zugegebenem Gummi arabicum und Aktivität des kaninen IFN-γ in der Anwesenheit von Macrogol

Gummi arabicum (mg/ml)	Macrogol (mg/ml)	Restaktivität (U)	verbliebene Rate (%)	Gummi-arabicumGehalt nach dem Gefriertrocknen (Gew.-%)
0	5,0	3,81 × 10⁵	38	0
0,5	5,0	9,75 × 10⁵	97	7,5
1,0	5,0	1,12 × 10⁵	112	15,2
2,0	5,0	1,18 × 10⁵	118	27,1

[Beispiel 8]
Die kanine IFN-γ-Probe (gelöst in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH 7,0), extrahiert aus rekombinanten Escherichia coli und in dem Referenzbeispiel 19 aufgereinigt, wurde für die Herstellung wässriger kaniner IFN-γ-Lösungen verwendet, die auf verschiedene pH-Werte eingestellt waren und 10 mg/ml Gummi arabicum, 5 mg/ml Macrogol 4000 (Polyethylenglykol 4000) und 20 mM Glycin enthielten. Die auf diese Weise hergestellten Lösungen wurden gefriergetrocknet und dann wieder gelöst, um die Restaktivität zu untersuchen. Die Tabelle 17 zeigt die Raten der Restaktivität, wenn die anfängliche kanine IFN-γ-Aktivität als 100% angenommen wird. Derselbe Test wurde zweimal wiederholt und die Ergebnisse der Tests Nummer 1 und 2 sind in der Tabelle gezeigt. Der Feuchtigkeitsgehalt der gefriergetrockneten Proben war etwa 1,7% (Durchschnitt von drei Messungen) und der Gummi-arabicum-Gehalt (Gew.-%) von jeder der gefriergetrockneten Proben war etwa 58,8%. Tabelle 17 pH und Restaktivität des kaninen IFN-γ nach dem Gefriertrocknen

pH Restaktivität (%)

Test Nr. 1 Test Nr. 2

4,5 110 156

5,0 81 159

5,5 164 148

6,0 100 203

6,5 80 156

7,0 136 178
[Beispiel 9]
Die kanine IFN-γ-Probe (gelöst in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH 7,0), extrahiert aus Bombyx mori und in dem Referenzbeispiel 17 aufgereinigt, wurde mit 10 mg/ml Gummi arabicum, 5 mg/ml Macrogol 4000 (Polyethylenglykol 4000) und 10 mM Glycin gemischt. Eine Gesamtheit von 1 ml der auf diese Weise hergestellten Lösung wurde in eine Glasphiole gegeben, gefriergetrocknet und dann wieder gelöst, um die Restaktivität zu untersuchen. Als ein Ergebnis war in der wieder aufgelösten Lösung nach dem Gefriertrocknen die Aktivität 5,4 × 10⁴ U und 90% der anfänglichen kaninen IFN-γ-Aktivität von 6,0 × 10⁴ U blieben erhalten.
Industrielle Anwendbarkeit
Das Mischen mit einer Verbindung, die das Grundgerüst von Arabinsäure hat, erlaubt die stabile Aufbewahrung eines nützlichen Proteins wie Interferon oder dergleichen, ohne dieses zu inaktivieren, was dadurch Anwendungen in verschiedenen industriellen Bereichen wie dem Bereich der Medizin ermöglicht.
[Referenzen]

1. Devos et al.: J. Interferon Research, 12, 95–102 (1992)
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3. Chirgwin et al.: Biochemistry, 18, 5294 (1979)
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5. Gubler et al.: Geen, 25, 236–269 (1983)
6. Okayama et al.: Mol. Cell. Biol., 2, 161, (1982) & 3, 280, (1983)
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8. Gardiner et al.: J. Invertebrate Phathol. 25, 363–370 (1975)
9. S. Watanabe et al.: Japan I. Exp. Med., 21, 299–313 (1951)
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13. Takebe et al.: Mol. Cell. Biol., 8, 446–472 (1988)
14. Biochemical Society of Japan: Zoku Seikagaku Jikkenkoza, Band 5 (1986), S. 250–256, Tokyo Kagaku Dojin
15. Yamamoto et al.: Vetr. Immunol. and Immunopathol., 11, 1–19 (1986)
16. Whiterside et al.: J. Immunol. Methods, 90, 221–223 (1986)
17. Modern Biology Series 23, Animal Tissue Culture Method (1976), 296–300, Kyoritsu Shuppan (1976)

Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Stabilisierung von kaninem Interferon-γ, umfassend das Mischen von kaninem Interferon-γ und einer wässerigen Lösung aus Gummi arabicum, worin der pH der Mischung 4, 5 bis 8 ist, und das Gefriertrocknen der Mischung.
Verfahren zur Stabilisierung von kaninem Interferon-γ nach Anspruch 1, worin die Konzentration des Gummi arabicum in der wässerigen Lösung 0,01 bis 10,0 Gew.-% ist.
Stabilisierte gefriergetrocknete Zusammensetzung aus kaninem Interferon-γ, die Gummi arabicum enthält, welche durch ein Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 erhalten werden kann, worin der Feuchtigkeitsgehalt nach dem Gefriertrocknen 5 Gew.-% oder weniger ist.
Stabilisierte gefriergetrocknete Zusammensetzung aus kaninem Interferon-γ nach Anspruch 3, die Gummi arabicum enthält, umfassend 5,0 bis 99,9 Gew.-% Gummi arabicum, basierend auf der Zusammensetzung aus kaninem Interferon-γ.
Stabilisierte gefriergetrocknete Zusammensetzung aus kaninem Interferon-γ nach einem der Ansprüche 3 oder 4, die Gummi arabicum enthält und ferner wenigstens einen Stoff enthält, ausgewählt aus Polyethylenglykol, Glycin, Salz und Tween 20.
Medizinische Zusammensetzung zum Injizieren, umfassend eine stabilisierte gefriergetrocknete Zusammensetzung aus kaninem Interferon-γ nach einem der Ansprüche 3 bis 5, die Gummi arabicum enthält.
Stabilisierte gefriergetrocknete Zusammensetzung aus kaninem Interferon-γ nach einem der Ansprüche 3 bis 6, die Gummi arabicum enthält, worin das kanine Interferon-γ durch das Wachstum eines Transformanten erhalten wird, in den ein kanines Interferon-γ-Gen ohne Zuckerkettenbindungsstelle eingeführt ist.
Stabilisierte gefriergetrocknete Zusammensetzung aus kaninem Interferon-γ nach Anspruch 7, die Gummi arabicum enthält, worin das kanine Interferon-γ dieselbe Aminosäuresequenz wie die Sequenznrn. 29, 31 und 33 hat.