CH665125A5 - Verfahren zur inaktivierung der viren in einer ahf-angereicherten zusammensetzung. - Google Patents

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Inaktivierung der Viren in einer AHF-angereicherten Zusammensetzung, die zur Herstellung eines medikamentösen Mittels zur Behandlung von Blutungen verwendbar ist.

Die Verwendung von Gerinnungsfaktorenkonzentrate, welche von fraktioniertem Blutplasma für die therapeutische Behandlung in bezug auf die vererbten Blutungsanomalien, wie die Hämophilie, erhalten werden, ist schwerstens in Frage gestellt, als Folge des ungeordneten Risikos für den hä-mophilen Patienten, dass der Hepatitis-Virus in den Konzentraten vorhanden ist. Zum Beispiel fabrizierte Faktor-VIII- und -IX-Konzentrate werden typisch verwendet zur Erhöhung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes eines Hämophilie Opfers, aber diese Konzentrate sind mit Plasmaansammlungen. denen tausende von Spendern beigetragen haben, vorbereitet und enthalten das inherente Hepatitisrisiko einer gleichen Anzahl von einfachen Transfusionen. Wie Mc Cullen und Zuckerman gezeigt haben, cf. Journal of Medicai Virology, Vol. 8, No. 29 (1981), werden trotz strenger Prüfung der individuellen Spendern in bezug auf Hepatitis B Oberflächen Antigen (HBsAg), von solchen Plasmaansammlungen klar beide Hepatitisarten, B und weder-A noch-B, übertragen.

Hepatitisübertragung durch Albumine und anderen wärmestabilen Plasmakomponenten, die nicht mit der Blutgerinnung zusammenhängen, wurde bis jetzt dadurch vermieden, dass die Plasmakomponente in Lösungen auf Temperaturen von 60 C während zehn Stunden aufgewärmt wurden. Ähnliche Versuche um Gerinnungsfaktorkonzentrate in Lösung aufzuwärmen, haben mittels Kontrastwirkung gezeigt, dass sie die Gerinnungsfaktoraktivität in den Konzentraten merklich reduzierten oder eliminierten und somit scheint es nicht, dass sie als eine brauchbare Lösung des Problems der Hepatitisübertragung, welches mit der gewöhnlichen Hämo-philietherapie einhergeht, verwendet werden können. In neueren Versuchen wurde hochgereinigter Faktor-VIII-Niederschlag in eine Sucrose-Glycine aufgelöst und während zehn Stunden auf 60 C aufgewärmt. Obgleich das Faktor-

VlII-Konzentrat, welches anschliessend vom gewärmten Niederschlag abgeleitet wurde, die Gerinnungsfaktoraktivität behielt, so waren die Erträge mit diesem Verfahren sehr tief, z.B. um 8 &. Cf. Heimburger et al., Hemostatis, Vol. 10 (Supplement 1), p. 204 (1981) und Heimburger et al., Blut, Vol. 44, p. 249-251 (1982).

Als Bilanz, die zur Zeit bekannte Technik liefert keine Mittel um wirksam Hepatitis-Virus, die in Gerinnungsfaktorenkonzentrate vorhanden sind, inaktiv zu machen; noch zeigt die bekannte Technik ein Mittel an, um wirksam Hepatitis-Virus, die in Gerinnungsfaktorenkonzentrate vorhanden sind, inaktiv zu machen; noch zeigt die bekannte Technik ein Mittel an, um die Übertragung von Hepatitis-Virus an mit Gerinnungsfaktorenkönzentrate zu behandelnde Patienten zu verhindern.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, welches im Anspruch 1 definiert ist. Erfindungsgemäss wird eine AHF-angereicherte Zusammensetzung hergestellt, die zur Herstellung eines medikamentösen Mittels zur Behandlung verwendbar ist.

Das obenerwähnte Verfahren besteht darin, dass die lyophilisierte AHF-angereicherte Zusammensetzung, die ein Human-Faktor-VIII-Konzentrat umfasst, das im wesentlichen frei von blutgerinnenden Enzymen ist, auf einer Temperatur von mindestens 60 "C während einer gegebenen Zeitspanne so erwärmt wird, dass der genannte Human-Faktor-VIII sowohl vor wie nach dem Erwärmen eine AHF-Rein-heit von mehr als 1500 AHF-Einheiten/g Protein aufweist und dass der unerwünschte Virus im wesentlichen in inaktiver Form vorliegt.

Des weiteren erlaubt die Wärmebehandlung der im wesentlichen trockenen Gerinnungsfaktorkonzentrate, welche Faktor VIII enthalten, jeden Hepatitis-Virus, der darin vorhanden ist, inaktiv zu machen, womit ein wesentlicher Ertrag der Konzentrate ohne merkliche Reduktion der Gerinnungsfaktoraktivitäten in den Konzentraten möglich ist.

Wärmebehandelte lyophilisierte Plasmafraktionen liefern vorzugsweise eine Zusammensetzung und einen Impfstoff, der wirksam gegen beide Hepatitis, B-Virus und non-A non-B-Virus.

Diese und andere Eigenschaften sind erreicht durch lyo-philisieren, entweder des ganzen Plasmas oder der Plasmafraktionen, welche das Faktor VIII-Konzentrat enthalten, sowie des Faktor-IX-Konzentrats, des Fibrinogens und der ICryoniederschläge und durch anschliessender Behandlung des lyophilisierten ganzen Plasmas oder der Plasmafraktionen mit hohen Temperaturen während verschiedenen Zeitdauern.

Die Fähigkeit, Gerinnungs- oder Koagulationsfaktoren, die in menschlichem Blut vorhanden sind, zu isolieren, war für das Verständnis der Hämophiliepatologie und anderer erblichen Anomalien der Blutungseigenschaften unentbehrlich. Gleichzeitig hat die Entdeckung yon Plasmafraktionie-rungsverfahren, um praktische Mengen von Gerinnungsfaktorkonzentrate zu erhalten, die medizinische Wissenschaft in die Lage versetzt, die Gerinnungsfaktorkonzentrate als therapeutische Mittel zur Behandlung von Blutungsanomalien zu verwenden. Die Transfusionstherapie, welche speziell Faktor-VIII- und Faktor-IX-Konzentrate verwendet, war bewiesenermssen recht erfolgreich bei der Betreuung der Hä-mophiliepatienten. Leider verbleibt das Risiko der Hepatitisübertragung wegen der grossen Anzahl von Plasmaspendern, die für die industrielle Herstellung von Gerinnungsfaktorenkonzentrate nötig ist, als das ernste Handicap, das mit der Transfusionstherapie verbunden ist. Ein typisches Plas-mafraktionierungsverfahren, mitgeteilt in «Seminars in Thrombosis and Hemostatis», Vol. VI, No. 1, S. 4 (1979), liefert ICryoniederschläge und bei Zentrifugierung Obenauf5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

•3

665 125

schwimmendes, wobei die erste Fraktion eine Quelle für beide Faktor-VIII-Konzentrate und Fibrinogen und die letzte Fraktion eine Quelle für Faktor-IX-Konzentrate zusätzlich zu den Faktoren-II, -VII und -I-Konzentrate darstellt. Wie Gerety und Eyster in «Hepatitis among Hemophiliacs» Non-A, Non-B Hepatitis, S. 103 — 106 (1981) demonstriert haben, wird der Hepatitis B-Virus, der ursprünglich im ganzen Plasma vorhanden war, an die Faktoren-VII- und IX-Derivate während dem Plasmafraktionierungsvorgang verteilt. Wie auch von Maynard und Bradley «Transmission by blood products»., Non-ANon-B Hepatitis, S. 78 — 79 (1981) demonstriert, existiert, die weder A- noch B-Hepatitis in beiden Faktor-VIII- und Faktor-IX-Derivate. Frühere Versuche der Wärmebehandlung der Gerinnungsfaktorkonzentrate in Lösungen mit dem Ziel, Hepatitis-Virus zu inaktivieren, waren unwirksam. Die Entwicklung von Techniken zur Lyo-philisierung von Gerinnungsfaktorenableitungen hat jedoch einen neuen Forschungsweg geöffnet, speziell in bezug auf die Stabilisierung der Gerinnungsfaktorenableitungen während dem Wärmebehandlungsverfahren; somit wurde ein Mittel zur Inaktivierung von Hepatitis-Virus, der in Gerinnungsfaktorenableitungen vorhanden war, ohne die Aktivität der Gerinnungsfaktoren zu zerstören, aufgebaut.

Folgendes kann über die Prüfverfahren zur Feststellung, dass die Aktivität der Gerinnungsfaktoren beibehalten wird, gesagt werden.

Paare von Mustern von verschiedenen lyophilisierten Plasmafraktionen, wobei jedes Paar Erkennungslosnummern aufweist, wurden von verschiedenen Herstellern erhalten. Die Muster wogen im allgemeinen weniger als 100 gr und waren in Fläschchen von 60 bis 90 ml gefüllt. Ein Muster in jedem Paar wurde aufgewärmt, entweder in Fläschchen mit Hilfe eines Wasserbades oder eines Trockenofens auf eine bestimmte Temperatur unter Raumdruck während einer bestimmten Zeit oder durch direktes Einlegen des lyophilisierten Materials in einen Trockenofen ohne Fläschchen. Das verbleibende Muster in jedem Paar diente zur Kontrolle und war auf 4—6 °C während dem Wärmebehandlungsverfahren gekühlt. Nach der Wärmebehandlung wurden beide, das Kontroll- und wärmebehandelte lyophilisierte Muster mit sterilem Wasser wieder zusammengesetzt.

Die Wiederzusammensetzung wurde im allgemeinen entsprechend den Weisungen des Herstellers durchgeführt, obgleich die Löslichkeit einiger wärmebehandelter Muster wesentlich durch Erhöhung der Menge sterilen Wassers, die während der Wiederzusammensetzung zusätzlich zu derjenigen, die vom Hersteller empfohlen war, verbessert war. In vitro Erprobungen der Faktoren VIII und IX wurden unter Verwendung eines einstufigen Handfibrometerverfahrens unter Verdünnung zwischen 1:40 und 1:400 durchgeführt, um damit eine Messung der Gerinnungstätigkeit des Faktors VIII und des Faktors IX zu erhalten. In vitro Wiederherstellung von Fibrinogen nach der Wiederzusammensetzung der beiden Muster, des Kontroll- und des wärmebehandelten lyophilisierten Fibrinogenmusters, wurden in ähnlicher Weise gemessen. In einigen Experimenten wurden die wiederzu-5 sammengesetzten Plasmafraktionen in bezug auf Lichtübertragung bei 580 nm mit einem Beckman Modell 25 Spektro-photometer beobachtet. Eine Elektrophorese für «Agarose ' Gel» mit einer «ICL» Immunoelektrophoreseplatte wurde mit verschiedenen der gepaarten Mustern der Faktoren V41 io und IX durchgeführt, wobei Ziegenserum «antihuman», von Hylands Diagnostics geliefert, als Standard verwendet wurde. Die Platten wurden spezifisch elektrophoresiert mit einer Bucher Stromversorgung mit 25 mA während 35 Minuten. Nach Abschluss der Elektrophorese wurden die Platten wäh-ls rend 18 bis 24 Stunden im Anti«enim entwickelt und unter indirektem Licht untersucht. Panagell-Elektrophorese mit einer «Worthingtin Diagnostic»-Platte wurde an einem zusätzlichen Musterpaar des Faktors-VIII-Konzentrats durchgeführt, wobei eine «Biorad» wassergekühlte Elektrophore-20 senzelle verwendet wurde.

Weitere in vitro Versuche wurden mit Aufwärmen von lyophilisierten Mustern des Faktors-VIII-Konzentrats in einem Wasserbad bei Raumtemperatur und bei bestimmten Temperaturen während bestimmten Zeiten durchgeführt. 25 Faktor VIIlAg wurde dann bestimmt, wobei das von Laureil beschriebene Verfahren «Electroimmuno Assay», The Scan-dinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, Vo. 29, S. 21 — 37 (1972) verwendet wurde. Faktor-VIII-Resultate wurden dann für Verdünnungen von 1:40,1:80, 30 1:100 und 1:200 durch Eintragen der Höhe der Zentrifugenbehälter der Laureil Normkurve in bezug auf den Verdün-_ nungsprozentsatz bestimmt. Unbekannte wurden als Prozentsatz des Normalen, auf der Basis der Höhen der Zentrifugenbehälter der Unbekannten in der Normkurve ausge-35 drückt.

Die in vivo Wiederherstellung der Gerinnungsfaktoraktivität für beide wärmebehandelten Faktor-VIII- und Faktor-IX-Konzentrate wurde durch Einspritzen von wiederhergestellten wärmebehandelten lyophilisierten Faktor-VIII- und 40 Faktor-IX-Konzentraten beziehungsweise an Hämophilie-A- und Hämophilie-B-Hunde gegeben. Ein wärmebehandeltes, lyophilisiertes Faktor-IX-Konzentrat wurde auch einem Kontrollhund eingespritzt. Laborparameter, welche Häma-tokryt (HCT), Serum-Protein, weisse Blutkörperchen 45 (WBC), Blutplättchenzählung, Blutausstrich, Atemrhythmus, Körpertemperatur, Puls, Gerinnungsfaktoraktivität einschliessen, wurden anschliessend für jedes Tier in verschiedenen Zeitintervallen nach den Einspritzungen festgehalten.

so Resultate der in vitro Versuche, die mit Faktor-VIII-Konzentrate durchgeführt wurden, sind in Tabellen I und II aufgeführt:

Tabelle I

Messungen der Aktivität des Gerinnungsfaktors nach der Wärmebehandlung des lyophilisierten

F aktor-VIII-Konzentrats

Los

Temp,

Zeit

Verdün.

% Aktivität

A C-1081 C-1081 C-1081 C-1081 C-1081 C-1081 ANC-8247.

Kontrolle Kontrolle Kontrolle 60 C 60-C 60 "C Kontrolle

10 St. 10 St. 10 St.

1:20 1:40 1:80 1:20 1:40 1:80 1:40

zirka 10% Aktivitätsabnahme wurde bei wärmebehandelten Mustern im Vergleich zu Kontrollmustern beobachtet

1438

665 125 4

Tabelle I (Fortsetzung)

Messungen der Aktivität des Gerinnungsfaktors nach der Wärmebehandlung des lyophilisierten

F aktor-VIII-Konzentrats

Los

Temp.

Zeit

Verdün.

% Aktivität

ANC-8247

Kontrolle

1

80

1697

ANC-8247

62 -64 C

16.33 St.

1

40

1215

ANC-8247

62 -64 C

16.33 St.

1

80

1360

B AHF-355

Kontrolle

-

1

40

1912

B AHF-355

Kontrolle

-

1

80

1600

B AHF-355

Kontrolle

-

1

160

1312

B AHF-355

64 ~C

20 St.

1

40

1080

B AHF-355

64 ~C

20 St.

1

80

1072

B AHF-355

74 C

17 St.

1

40

1144

B AHF-355

74 ;C

17 St.

1

80

1024

B AHF-355

74 "C

17 St.

1

160

864

B AHF-355

76 ~C

17 St.

1

40

1040

B AHF-355

76 "C

17 St.

1

80

976

B 347

Kontrolle

-

1

100

1180

B 347

Kontrolle

-

1

200

100

B 347

83'C

24 St.

1

100

100

B 347

83 C

24 St.

1

200

100

B 347

85 :C

24 St.

1

100

1

B 347

95 ~C

7 St.

1

100

1

B 347

97 ;C

7.5 St.

1

200

1

C A1-0470

Kontrolle

-

1

100

912

C A1-0470

75 rC

20 St.

1

100

2076

C Al-1080

Kontrolle

-

1

200

2080

C Al-1080

Kontrolle

-

1

400

1920

C Al-1080

80 C

24 St.

1

200

1380

C Al-1080

80 ;C

24 St.

1

400

1360

A A1-1120

Kontrolle

-

1

40

2800

A A1-1120

Kontrolle

-

1

80

2032

A A1-1120

78 'C

21 St.

1

40

1592

A Al-1120

78 ~C

21 St.

1

80

1392

A Al-1120

80-C

20 St.

1

40

1176

A Al-1120

80 C

20 St.

1

80

1600

A Al-1120

90 rC

12 St.

-

Gerinnungsmuster

A Al-1120

100 C

1.5 St.

1

40

1248

A Al-1120

100 ;C

1.5 St.

1

80

1264

C A1 -1150

Kontrolle

-

1

40

2176

C A1-1150

Kontrolle

-

1

80

2480

C A1-1150

Kontrolle

-

1

100

1870

C A1-1150

65 'C**

26.33 St.

1

40

1592

C AI-! 150

65 'C**

26.33 St.

1

80

1520

C Al-1150

83 'C

24 St.

1

100

730

C Al-1150

83 rC

24 St.

1

200

620

C Al-1150

85 X

24 St.

1

100

1000

C Al-1150

85 ~C

24 St.

1

200

1160

C Al-1150

90 "C

10 St.

1

40

1032

C rt.1-1150

90 C

10 St.

1

80

1056

C Al-1150

95 "C

7 St.

Gerinnungsmuster

C Al-1150

97 C

7.5 St.

1

100

80

C Al-1150

97 C

7.5 St.

1

200

100

C Al-1150

100 C

10 St.

1

40

88

C Al-1150

100 C

10 St.

1

80

48

C A1-1160

Kontrolle

-

1

100

3680

C A1-1160

Kontrolle

-

1

200

3420

C A1-1160

Kontrolle

-

1

400

3200

C A1-1160

78 "C

24 St.

1

100

2420

C A1-1160

78 X

24 St.

1

200

1520

C A1 -1160

78 ;C

24 St.

1

400

1440

C A1 -1160

78 ;C

24 St.

1

200

1720

C Al-1160

78 :C

24 St.

1

400

1680

C Al-1160

80 "C

22 St.

1

200

1400

C Al-1160

80 "C

22 St.

1

400

1360

5 665125

Tabelle I (Fortsetzung)

Messungen der Aktivität des Gerinnungsfaktors nach der Wärmebehandlung des lyophilisierten

Faktor-VIII-Konzentrats

Los Temp. Zeit Verdün. % Aktivität c

Al-1160

100 DC

7 St.

1:200

1760

c

Al-1160

100 °C

7 St.

1:400

1760

c

Al-2120

Kontrolle

—

1:100

86

c

Al-2120

110°C***

1.5 St.

1:100

18

c

Al-2531

Kontrolle

1:200

3500

c

Al-2531

Kontrolle

1:400

2700

c

Al-2531

85 °C

20 Sì.

1:200

46

c

Al-2531

85 °C

20 St.

1:400

43

Bemerkungen:

Alle Zeiten und Temperaturen sind Ungefährwerte. Nach der Wärmebehandlung bei höheren Temperaturen wurden Mengen von sterilem Wasser im Überschuss, verglichen mit den Empfehlungen des Herstellers, einige Konzentrate hinzugegeben, bis die Löslichkeit von Auge bestätigt wurde.

* A-Lose waren durch Cutter Laboratories hergestellt;

B-Lose waren durch Michigan Red Cross hergestellt;

C-Lose waren durch Alpha Therapeutics hergestellt:

** Im Trockenofen wärmebehandelt (Muster aus dem Fläschchen entfernt);

*** Im Trockenofen wärmebehandelt (Muster im Fläschchen enthalten)

Tabellen

Bestimmung des Faktors VIIIAg gemäss Wärmebehandlung von lyophilisiertem Faktor VIII-Konzentrat

Los

Temp.

Zeit

Verdün.

Höhe des Zentrifugen-Behälters

%Ag

B

AHF-355

Kontrolle

_

1:40

35

3720

B

AHF-355

Kontrolle

-

1:80

22

4080

B

AHF-355

64 °C

20 St.

1:40

39

4240

B

AHF-355

64 °C

20 St.

1:80

26

5120

B

AHF-355

74 °C

17 St.

1:40

40

4400

B

AHF-355

74 °C

17 St.

1:80

26

5120

C

Al-1120

Kontrolle

1:100

15

4700

C

Al-1120

90 °C

12 St.

1:100

0

0

C

Al-1150

Kontrolle

1:200

12

7200

C

Al-1150

83 °C

24 St.

1:200

12

6200

C

Al-1150

85 °C

24 St.

1:200

15

9400

C

Al-1150

97 °C

7.5 St.

1:200

0

0

Bemerkungen:

Alle Zeiten und Temperaturen sind Ungefahrwerte. Nach der Wärmebehandlung bei höheren Temperaturen wurden Mengen von sterilem Wasser im Überschuss, über die Empfehlungen des Herstellers hinaus, zu einigen Konzentraten, bis die Löslichkeit von Auge bestätigt war, hinzugefügt.

* B-Lose wurden von Michigan Red Cross hergestellt;

C-Lose wurden von Alpha Therapeutics hergestellt.

Resultate der Versuche mit Faktor-IX-Konzentrat sind in Tabelle III zusammengefasst:

Tabelle III

Messungen der Aktivität des Gerinnungsfaktors nach der Wärmebehandlung von lyophilisiertem Faktor

IX-Konzentrat

Los Temp. Zeit Verdün. % Aktivität

*

A

9-C0044

Kontrolle

—

1

40

616

A

9-C0044

Kontrolle

-

1

80

1200

A

9-C0044

Kontrolle

-

1

200

2400

A

9-C0044

Kontrolle

1

400

3520

A

9-C0044

100 °C

4 St.

1

40

520

A

9-C0044

100 °C

4 St.

1

80

1104

665 125 6

Tabelle III (Fortsetzung)

Messungen der Aktivität des Gerinnungsfaktors nach der Wärmebehandlung von lyophilisiertem Faktor

IX-Konzentrat

Los

Temp.

Zeit

Verdün.

% Aktivität

A

9-C0044

100 °C

12 St.

1:200

1680

A

9-C0044

100 °C

12 St.

1:400

2480

A

9-C0044

110°C*

13 St.

1:400

1640

A

9-C0044

110°C**

13 St.

1:800

2560

A

9-C0044

122 °C

12 St.

1:200

340

A

9-C0044

122 °C**

12 St.

1:400

480

A

9-C0044

132 °C

12 St.

1:200

12

A

9-C0044

132 °C**

12 St.

1:400

24

A

NC9055

Kontrolle

-

n/a

2600

A

NC9055

100 °C

0.5 St.

n/a

2350

Bemerkungen:

Alle Zeiten und Temperaturen sind Ungefährwerte. Nach der Wärmebehandlung bei höheren Temperaturen wurden Mengen von sterilem Wasser Überschuss, über die vom Hersteller empfohlenen Mengen zu einigen Konzentraten, bis die Löslichkeit von Auge bestätigt war, hinzugefügt.

* A-Lose von Cutter Laboratories hergestellt;

** Wärmebehandelt im Trockenofen.

Die Resultate der Versuche, die mit Fibrinogenkonzentrate durchgeführt wurden, sind in Tabelle IV zusammengefasst:

Tabelle IV

Wiederaufbau des Fibrinogens nach der Wärmebehandlung von Fibrinogenkonzentrat in lyophilisierter

Form

Los

Temp.

Zeit

Verdün.

Rückgewinnung mg/dl

*D-003678

Kontrolle

_

1:20

400

*D-003678

Kontrolle

-

1:40

680

*D-003678

60 °C

10-11 St.

1:20

660

*D-003678

60 °C

10-11 St.

1:40

680

*D-003678

Kontrolle

-

1:10

195

*D-003678

Kontrolle

-

1:20

760

*D-003678

Kontrolle

-

1:40

700

*D-003678

60 °C

10 St.

1:10

105

*D-003678

60 °C

10 St.

1:10

225

*D-003678

60 °C

10 st.

1:20

250

*D-003678

60 °C

17 St.

1:10

190

*D-003678

60 °C

17 St.

1:20

220

*E

Kontrolle

-

1:40

1280

*E

Kontrolle

-

1:80

1280

*E

60 °C

10 St.

1:40

1520

*E

60 °C

10 St.

1:80

1320

*E

60 °C

10 St.

1:40

1860

*E

60 °C

10 St.

1:80

1520

*E

65 °C

10 St.

1:40

1640

*E

65 °C

10 St.

1:80

1400

*E

65 °C

23 St.

1:40

1420

*E

65 °C

23 St.

1:80

1320

*E

Kontrolle

-

1:40

1048

*E

Kontrolle

-

1:80

1064

*E

100 °C

3 St.

1:40

788

*E

100 °C

3 St.

1:80

784

*E

123 °C

3 St.

1:5

133

Bemerkungen:

Alle Zeiten und Temperaturen sind Ungefährwerte. Nach der Wärmebehandlung bei höheren Temperaturen wurden Mengen von sterilem Wasser im Überschuss über die vom Hersteller empfohlenen Mengen zu einigen Konzentraten, bis die Löslichkeit von Auge bestätigt war, hinzugefügt.

* D-Lose von Cal Biochem hergestellt;

E-Lose von Kabi hergestellt;

** Im Trockenofen wärmebehandelt (Muster im Fläschchen enthalten).

7

665 125

Nachstehend werden ausgewählte Versuchsergebnisse diskutiert.

Die in den Tabellen I —IV zusammengefassten Resultate können kombiniert werden um eine relative Angabe über die Beibehaltung der Gerinnungsaktivität und der Fibrinogen-Rückgewinnung in lyophilisierten Plasmafraktionen zu erhalten, welche dem Wärmebehandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen wurden. Speziell kann die prozentuale Aktivität oder der gemessene Wiederaufbau bei verschiedenen Verdünnungen der wiederzusammengesetzte Faktor-VIII-, Faktor-IX- und Fibrinogen-Konzentrate für individuelle Kontrollmuster gemittelt werden und mit ähnlich gemittelten prozentualen Aktivitäten oder gemessenen Rückgewinnung in entsprechenden gepaarten Mustern der wärmebehandelten Faktor-VIII-, Faktor-IX- und Fibrinogen-Konzentrate verglichen werden. Wo solche Vergleiche angestellt wurden, kann man z.B. sehen, dass lyophilisiertes Faktor-VIII-Konzentrat (Los Nr. A C-1081), das von einem Hersteller erhalten wurde und auf 60 °C während 10 Stunden aufgewärmt wurde, mehr als 90% von seiner in vitro Faktor-VIII-Gerinnungsaktivität beibehalten hat, im Vergleich zu einem ungewärmten Kontrollmuster. Das wärmebehandelte wiederzusammengesetzte Faktor-VIII-Konzentrat weist ferner eine Absorption von 0,30 bei 580 nm im Vergleich zur Absorption von 0,20 für das nicht wärmebehandelte Kontrollmuster und wies keine Unterschiede auf in bezug auf das nicht aufgewärmte Kontrollmuster gemäss Immunoelektrophorese mit dem antihumanen Ziegenserum. Die wiederzusammengesetzten Faktor-VIII-Konzentrate von einem verschiedenen Los (Los Nr. A NC-8747) des gleichen Herstellers, welches in lyophilisierter Form auf 62 — 64 °C während 16 Stunden aufgewärmt wurden, und anschliessend bei 6 °C sieben Tage lang gespeichert wurde, wiesen einen grösseren als 80% Wiederaufbau des Faktors VIII der Gerinnungsaktivität auf, im Vergleich mit einem nicht aufgewärmten Kontrollmuster. Eine allgemeine Verstärkung in anodischer Wanderung war in bezug auf das nicht aufgewärmte Kontrollmuster nach der Immunoelektrophorese gegen Ziegenserum festzustellen.

In ähnlicher Weise wies das lyophilisierte Faktor-VIII-Konzentrat, welches von einem zweiten Hersteller stammte (Los Nr. C Al-1120) und wenn es auf zirka 78 °C während 21 Stunden aufgewärmt wurde, eine 62% in vitro Beibehaltung der Gerinnungsaktivität nach Wiederzusammensetzung im Vergleich mit einem nicht aufgewärmten Kontrollmuster auf. Das wiederzusammengesetzte Faktor-VIII-Konzentrat des gleichen Loses des zweiten Herstellers behielt noch nach einer Wärmebehandlung in lyophilisiertem Zustand bei zirka 80 °C und während 20 Stunden 57% in vitro Gerinnungsaktivität im Vergleich zum nicht aufgewärmten Kontrollmuster, wogegen der wiederzusammengesetzte Faktor VIII des gleichen Loses des zweiten Herstellers, welcher vorgängig in lyophilisiertem Zustand auf zirka 100 °C während anderthalb Stunden aufgewärmt wurde, 52% in vitro Gerinnungsaktivität im Vergleich zum nicht aufgewärmten Kontrollmuster beibehielt. Wenn ein zweites Los (Los Nr. C Al-1150) des lyophilisierten Faktor-VIII-Konzentrats des zweiten Herstellers gemäss der vorliegenden Erfindung wärmebehandelt wurde, so befand sich das wiedererlangte in vitro Potential von Gerinnungsaktivitäten im Vergleich zu den nicht aufgewärmten Kontrollmustern bei 67% für 65 °C während 26 Stunden und 20 Minuten als Wärmebehandlung, bei 34% für 83 3C während 24 Stunden als Wärmebehandlung und bei 55% für 85 °C während 24 Stunden als Wärmebehandlung. Messungen der Faktor-VIII-Antigen für zwei Muster der Faktor-VIII-Konzentrate, bei 83 °C bzw. 85 °C wärmebehandelt zeigten einen 15% Verlust bzw. keinen Verlust im Antigenpegel an. Es sollte auch bemerkt werden, dass eine stark verbesserte Löslichkeit des letzteren Musters des wärmebehandelten Fakt or-VIII-Konzentrats durch Hinzufügen von sterilem Wasser in einer Menge zwischen 50 ml und 75 ml zum Muster anstatt die nur 25 ml, die vom Hersteller empfohlen waren, erreicht wurden.

Die Wärmebehandlung der lyophilisierten Faktor-VIII-Muster, die von einem dritten Hersteller (Los Nr. AHF-355) stammten, bestätigen die Resultate die für die zwei ersten Hersteller beobachtet waren. Dies ist wie folgt: eine Wärmebehandlung der lyophilisierten Faktor-VIII-Konzentrate des dritten Herstellers bei 64 C während 20 Stunden erlaubte eine Wiedererlangung der Gerinnungsaktivität zu 61% im Vergleich zum nicht aufgewärmten Kontrollmuster, eine Wärmebehandlung des gleichen Konzentrats bei 74 C während 17 Stunden erlaubte eine Wiedererlangung der Gerinnungstätigkeit von 63% und eine Wärmebehandlung des gleichen Konzentrats bei 76 CC während 17 Stunden erlaubte eine Wiedererlangung der Gerinnungsaktivität von 57%. Die Pegel des Faktor-VIII-Antigens in den wiederzusammengesetzten Mustern, welche auf 64 C und 74 "C aufgewärmt wurden, wiesen keine Abschwächung auf im Vergleich mit dem Pegel des nicht aufgewärmten Kontrollmusters.

Ein Muster von lyophilisiertemn Faktor-IX-Konzentrat, vom ersten Hersteller stammend (Los Nr. A 9-C0044) und in ein Wasserbad von 100 CC während 20 — 30 Minuten getaucht, erreichte im wesentlichen volle in vitro Wiedererlangung der Gerinnungsaktivität im Vergleich zum nicht aufgewärmten Kontrollmuster. Faktor II und Faktor VII erschienen beide als stabil iwei Stunden nach der Wiederzusammensetzung des wärmebehandelten Musters, wogegen Faktor IX ungefähr um 20% abnahm innerhalb der 6 Tage nach der Wiederzusammensetzung. Absorptionsmessungen, die 2 Stunden nach der Wiederzusammensetzung gemacht wurden, lieferten Werte von 0,006 bis 0,007 bei 580 nm für beide Muster, das Kontroll- und das wärmebehandelte. Kein Unterschied war von Auge festzustellen zwischen dem wärmebehandelten Konzentrat und dem nicht aufgewärmten Kontrollmuster nach der Immunophorese des Faktor-IX-Konzentrats gegen ziegenantihumanem Serum. Zusätzliche Muster der Faktor-IX-Konzentrate des ersten Herstellers, welche in lyophilisierter Form bei 100 °C während 12 Stunden und bei 110 °C während 13 Stunden wärmebehandelt wurden, zeigten auch volle Wiedererlangung der Faktor-IX-Gerinnungsaktivität, obgleich die vollständige Löslichkeit des letzten Musters 40 bis 60 ml mehr steriles Wasser im Gegensatz zu den vom Hersteller empfohlenen 20 ml verlangte. Die Angaben der Tabelle III legen auf diese Weise nahe, dass das Faktor-IX-Konzentrat in lyophilisierter Form gut wärmestabil während 4 Stunden bei Temperaturen von 100 —110 °C ist.

Ein Muster von lyophilisiertem Fibrinogen-Konzentrat, von einem vierten Hersteller stammend (Los Nr. D-003678) und bei 60 CC während 11 Stunden wärmebehandelt, wies keinen in vitro Verlust von Fibrinogen im Vergleich zum nicht aufgewärmten Kontrollmuster auf. Ein Muster von lyophilisiertem Fibrinogen-Konzentrat, vom gleichen Hersteller stammend, zeigte nach einer Wärmebehandlung bei 60 C während 17 Stunden eine Fibrinogen-Wiedererlan-gung von 97% im Vergleich zum nicht wärmebehandelten Kontrollmuster. Muster von lyophilisierten Fibrinogen-Konzentrate, die von einem fünften Hersteller stammten (Los E), zeigten nach einer Wärmebehandlung bei 60 :C und 65 "C während 10 bzw. 23 Stunden keinen in vitro Verlust von Fibrinogen im Vergleich zum nicht aufgewärmten Kontrollmuster, während ein Muster eines lyophilisierten Fibri-nogen-Konzentrats eines fünften Herstellers eine 74% Fibrinogen-Wiedererlangung aufwies, verglichen mit dem Kon-

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Tabelle V

F-VIII mangelnde Hunde, welche wärmebehandeltes Faktor-VIII-Konzentrat erhielten

HCT %

Protein gm %

WBC/mm3

Blutplättchen/ mnr

FVIII RA

%;

FVIII C

%;

Temp "C

Atmung

Puls

PRE

44

6.1

3,795

330,000

106

<2(1-2)

37,7

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132

Infusion

20 ml gegeben in 3.5

i min.

400°

15 min

45

5.9

3,190

110,000

151

12

39,1

42

138

90 min

47

6.0

6,050

165,000

n-2

12

38,3

pant

108

156, 159

3 Std.

44

6.1

5,115

231,000

168

15

38,2

pant

108

5 Std.

43

6.0

4,785

165,000

159

9!

38,0

30

114

7.5 Std.

44

5.9

3,245

198,000

150

9

38,3

42

108

Tabelle VI

F-IX mangelnde Hunde, welche wärmebehandeltes Faktor-VIII-Konzentrat erhielten

HCT %

Protein gm %

WBC/mm3

Blutplättchen/ mm'

Thrombin Ge-rinungsperiode (Sek.)

FVIII C %=

F-IX %°

Temp °C

Atmung

Puls

PRE

43

5.5

5,840

187,000

5,5

67

<1

38,6

36

150

(0-5-1)

Infusion

20 ml gegeben in 3 min.

5C

524°

15 min

42

5.6

5,005

429,000

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9

38,7

30

150

90 min

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6,545

253,000

5,5

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10

38,8

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144

3 Std.

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5.5

8,910

429,000

6,0

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5 Std.

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5.8

5,610

231,000

6,0

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6

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7,5 Std.

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5.7

6,985

363,000

5,5

95

4

38,3

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162

trollmuster, und dies nach einer Wärmebehandlung bei 100 C während 3 Stunden.

Wie früher angegeben, wurde die in vitro Prüfung der wärmebehandelten Faktor-VIII- und Faktor-IX-Konzentrate mit Hilfe von Hämophil-A oder Faktor-VIII mangelnden und Hämophil-B oder Faktor-IX mangelnde Hunde durchgeführt. Der A-hämophile Hund erhielt wiederzusammengesetztes Faktor-VIII-Konzentrat, welches vorgängig in lyophilisierter Form bei 60 =C während 10 Stunden wärmebehandelt war, während der B-hämophile Hund wiederzusammengesetztes Faktor-IX-Konzentrat, welches vorgängig bei 100 :C während 3 bis 4 Stunden wärmebehandelt war, erhielt. Die Resultate der in vivo Versuche sind in Tabelle V und VI aufgeführt.

Die in Tabelle V aufgeführten Resultate illustrieren reichlich die klare Zunahme der Faktor-VIII-Gerinnungs-aktivität für einen A-hämophilen Hund nach der Einspritzung von wärmebehandeltem Faktor-VIII-Konzentrat. Ähnlich illustrieren die in Tabelle VI aufgeführten Resultate reichlich die Faktor-IX-Wiedererlangung, die bei einem B-hämophilen Hund nach der Einspritzung von wärmebehandeltem Faktor-IX-Konzentrat beobachtet wurde. Das scheinbare Fernbleiben von physiologischem Stress oder anderen hinderlichen Reaktionen, wie zu sehen an den Angaben in Tabellen V und VI, erlaubt die Vermutung, dass die Faktor-VIII- und Faktor-IX-Konzentrate, welche nach den vorstehenden Verfahrensphasen behandelt wurden, biologisch akzeptabel bleiben.

Es wurde nun bewiesen, dass Plasmafraktionen, wie Faktor-VIII- und Faktor-IX-Konzentrate, von verschiedenen Reinheitsgraden sicher in lyophilisierter Form bei hohen Temperaturen während längeren Zeiten wärmebehandelt werden können, ohne bedeutende Vernichtung der Gerinnungsaktivität der Konzentrate. Es wurde ferner bewiesen, dass Plasmafraktionen wie Fibrinogen von verschiedener

Reinheit sicher in lyophilisierter Form bei hohen Tempera-35 turen während längerer Zeit wärmebehandelt werden können ohne die Wiederherstellbarkeit des Fibrinogens zu zerstören. Beobachtungen mit dem Auge bestätigen, dass die Löslichkeit von lyophilisierten Faktor-VIII-, Faktor-IX-und Fibrinogen-Konzentrate nicht gravierend durch die 40 Wärmebehandlung tangiert ist, insofern die Menge des den lyophilisierten Konzentratmustern während der Wiederzusammensetzung zugefügten sterilen Wassers einfach erhöht werden kann bis die vollständige Löslichkeit erreicht ist. Deswegen kann, dank passender Aufwärmungstemperatur, 45 dank der Dauer der Aufwärmung und der beteiligten Reinheitsgrade der Hepatitis-Virus der beiden Typen, der B-Typ und der non-A- non-B-Typ in Plasmafraktionen inaktiviert werden und gleichzeitig die Lebensfähigkeit und die therapeutische Vollständigkeit der Fraktionen beibehalten wer-50 den. Berücksichtigt man die zusätzliche Tatsache, dass der Hepatitis-B-Virus und wahrscheinlich der Hepatitis-non-A-non-B-Virus vorzugsweise in den Fraktionen des Gerinnungsfaktors verteilt ist, d.h. in Faktor-VIII- und Faktor-IX-Konzentrate, so kann die Wärmebehandlung der Frak-55 tionen des Gerinnungsfaktors in lyophilisierter Form in geeigneten Temperaturen während geeigneten Zeitdauern auch dazu dienen, den Hepatitis-Virus sowohl immunisierend wie auch nichtinfektiös zu machen. Als Ergebnis können wiederzusammengesetzte wärmebehandelte lyophilisierte Faktor-60 VIII- und Faktor-IX-Konzentrate als Hepatitis-Impfstoffe wirken und gleichzeitig die therapeutischen Vorteile, die sonstwie mit den Fraktionen des Gerinnungsfaktors zusammenhängen, zur Verfügung stellen.

Es sollte zudem auf Grund der Extrapolation der Ver-65 suchsresultate, die in den Tabellen I —IV aufgeführt sind, klar sein, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung im wesentlichen jederzeit während dem Plasmafraktionierungs-verfahren durchgeführt werden kann. Das heisst, dass in je

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dem Moment während dem Fraktionierungsverfahren, in welchem eine Plasmaableitung lyophilisiert werden kann, eine Wärmebehandlung der Plasmaableitung durchgeführt und die Ableitung wieder löslich gemacht oder zusammengesetzt werden kann, bevor das Fraktionierungsverfahren fortgesetzt wird. So können zum Beispiel, wenn letztlich Faktor-VIII-Konzentrat von einem Plasmafraktionierungsschema

— wie von Mammen und and. in «Treatment of Bleeding Discorders with Blood Components», Reviews of Hematolo-gy, Vol. 1, S. 144 (1980) mitgeteilt —, abgeleitet wird, Kryo-niederschlag, das von frisch gefrorenem Plasma erhalten wurde, geklärter Extrakt, der vom Kryoniederschlag erhalten wurde, und Obenaufschwimmendes, das aus geklärtem Extrakt erhalten wurde, so können alle in der gleichen Art wie Faktor-VIII-Konzentrat selbst lyophilisiert und wärmebehandelt werden. Die Wahl des zweckmässigen Augenblicks während dem Plasmafraktionierungsablauf für die Durchführung der Wärmebehandlung kann nach praktischen Gesichtspunkten wie Kosten und Bequemlichkeit getroffen werden.

Im Rahmen anderer vorbildlicher Ausführungen der Erfindung ist die Inaktivierung des unerwünschten Virus, der mit AIDS verbunden ist (AIDS = «Acquired Immune Defi-ciency Syndrome»), ein Cytomegalovirus und ein Epstein-Barr-Virus.

Des weiteren konnten verschiedene Trocknungsverfahren für die Plasmazusammensetzungen, wie Plasmafraktionen, verwendet werden, nämlich Sprühtrocknen und Vakuumtrocknen.

Das Hinzufügen von sterilem Wasser zu trockenem oder lyophilisiertem Plasma in einem Ausmass über die vom Hersteller empfohlenen Volumina hinaus erzeugt Plasmalösun- _ gen mit einer grösseren Verdünnung als normalerweise empfohlen; die Wirksamkeit des Plasmas und seiner Bestandteile ist jedoch nicht merkbar beeinträchtigt. Dies ist besonders nützlich wenn die Temperaturen, auf welche die Plasmazusammensetzung um die unerwünschten Mikroorganismen zu inaktivieren aufgewärmt werden soll, so hoch sind, dass die Koagulierung des wiederzusammengesetzten Plasmas normalerweise passieren würde, es sei denn, dass steriles Wasser im Überschuss hinzugefügt wird.

Eine besonders bedeutende Verwendung dieses Verfahrens ist die Behandlung von mit Anti-Hämophilie-Faktor angereicherte Zusammensetzungen (abgekürzt AHF). Solche Zusammensetzungen enthalten grössere Konzentrationen von AHF bezogen auf das Gesamtproteingewicht, als die Konzentrationen, die in Proteinfraktionen des Plasma,

— wie komplexes Prothrombin (Faktor-IX-Konzentrat), Gamma Globuline, Albumine, Fibrinogen oder Antithrombin III —, gefunden wurden. Solche hohe AHF-Konzentra-tionen sind benötigt um zu gewährleisten, dass, wenn die Zusammensetzungen in Wasser oder andere physiologisch annehmbare Träger aufgelöst sind, sie genügend die Gerinnungsanomalien des Patienten korrigieren, um einen positi-venen klinischenen Effekt zu bewirken, ohne dass Überschusswasser oder fremde Proteine infundiert werden müssen. Im allgemeinen kann eine therapeutisch wirksame Dosis von AHF von den Fachleuten einfach bestimmt werden. Es wird vom klinischen Zustand des Patienten abhängen, im besonderen von der Art der angetroffenen Blutung. Gewöhnlich sollte genügend AHF infundiert werden, um einen AHF-Plasmapegel des Patienten von mindestens 30% von dem bei normalen Individuen vorhandenen herzustellen, obgleich bei ernsten Blutungen Pegel von 50% und mehr vorgezogen werden. Dies kann durch Infundierung einer Gesamtzahl von AHF-Einheiten, gemäss der Formel: Anzahl notwendiger Einheiten = Körpergewicht (kg) x 0,4 x gewünschte AHF-Vergrösserung (in % des normalen), erreicht werden.

Die AHF-Konzentration in der Infusionsflüssigkeit sollte bevorzugt 34 Einheiten/ml nicht überschreitet?, aber sollte grösser als 15 Einheiten/ml sein. Ist die Konzentration grösser als 34 Einheiten/ml, so sollte nicht mehr als 2 ml pro Minute infundiert werden. Infusionsflüssigkeit mit weniger als 34 Einheiten kann rascher infundiert werden, in der Grös-senordnung von 10 bis 20 ml während einer 3-Minuten-Dauer. Eine AHF-Einheit ist definiert als die in 1 ml menschlichem Plasma einer normalen Sammlung, das weniger als 1 Stunde alt ist, vorhandene AHF-Aktivität.

Die AHF angereicherten Zusammensetzungen werden einen Gehalt von mehr als 1500 AHF-Einheiten pro Gramm Protein haben. Natürlich ist das Produkt umso begehrter, je reiner es ist. Zusammensetzungen mit einem Gehalt von 1500 bis 2000 AHF-Einheiten pro Gramm Protein sind die gebräuchlichsten.

Die AHF-Zusammensetzungen können während dem Reinigungsverfahren von anderen Plasmaproteinen in verschiedenen Reinheitsgraden befreit werden, je nach dem verwendeten Verfahren. Solche Plasmaproteine umfassen die blutkoagulierenden Enzyme (hier sowohl die inaktiven Proenzymen wie die aktivierten Enzymen bezeichnend), wie Konzentrate von Prothrombin-Komplex oder Faktor IX (Faktoren II, VII, IX und X). Faktoren XII oder XIII, Fibrinogen, Albumine und Gamma Globulin. Wenn eine AHF-Zusammensetzung im wesentlichen frei von blutkoagulierenden Enzyme ist, so enthält sie subtherapeutische Aktivitäten des Enzymes. Die AHF-Zusammensetzungen können bis auf einen Pegel gereinigt werden, wo die Aktivität irgendeines blutkoagulierenden Enzyms auf Spurenniveau ist, d.h. weniger als 5 Einheiten pro. Gramm Protein. Das Verhältnis der AHF-Einheiten zur Aktivität jeder individuellen Enzym-Einheit in solchen Zusammensetzungen ist grösser als 300:1. Eine Einheit der Enzym-Aktivität für jedes der verschiedenen koagulierenden Enzymen in ihrer aktivierten oder Proenzymform ist in PCT International Application WO 82/03871 (publiziert 11. November 1982) definiert.

Die wärmebehandelten AHF-Zusammensetzungen, die hier beschrieben sind, werden an Patienten mit erblichem Mangel an AHF abgegeben. Diese Patienten versagen in der Synthetisierung von biologisch aktiven AHF und sind von denen zu unterscheiden, welche AHF-Inhibitoren (wahrscheinlich Antikörper) erworben haben, welche auch die Symptome der Hämophilie bewirken. Die letzte Gruppe ist bevorzugt mittels Zusammensetzungen mit aktivierten koagulierenden Enzyme zu behandeln. Die Zusammensetzungen mit koagulierenden Enzymen enthalten therapeutisch wirksame Mengen von den Enzymen. Die Zusammensetzungen, die hier behandelt werden, werden jedoch keine solche Mengen von blutkoagulierenden Enzymen enthalten, aber statt dessen für die Blutstillung im wesentlichen auf die AHF-Aktivität zählen.

Die verbesserten AHF-Zusammensetzungen, die hier beschrieben sind, enthalten ziemlich kleinere Mengen von denaturiertem AHF als diejenige, die durch frühere Verfahren produziert wurden. Im allgemeinen ist die Menge des denaturierten AHF kleiner als zirka 50% der totalaktiven und denaturierten AHF in der Zusammensetzung. Bevorzugt wird ein Verhältnis von 30% bis 10%. Die Menge von denaturiertem AHF ist gleich dem prozentualen Verlust an AHF-Einheiten, nachdem die virusinfizierte Zusammensetzung dem hier beschriebenen Wärmebehandlungsverfahren unterworfen wurde.

Die Aufwärmung der virusverseuchten AHF im trockenen Zustand kann von der Prüfung der AHF-koagulieren-den Aktivität, wie oben beschrieben, und von der Virusstär5

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ke gefolgt werden. Wo es schwierig ist, die Stärke des biologisch aktiven Virus zu messen, wie im Fall von Hepatitis-Viren, so kann Kandidat Virus wie Bakteriophage, «sind-

Us», Adenovirus oder ESM-^'rus verwendet werden, wie in PCT International Application WO 82/03871 (am 11. November 1982 publiziert) beschrieben. Eine Menge des Kandidaten-Virus in einer bestimmten Stärke wird einer Lösung der mit Wärme zu behandelnder Zusammensetzung eingegeben, die Lösung wird lyophilisiert und verschiedene Wärmebehandlungen werden durchgeführt. Man wählt den Zeitpunkt, bei welchem echte Messungen oder eine Regressionsanalyse (d.h. statistische Extrapolation) den erwünschten Grad von viraler Inaktivierung anzeigen, als Bedingungen, welche die Wärmebehandlung des Produktes bestimmen. Diese Bedingungen werden im allgemeinen Zeit und Temperatur der viralen Inaktivierung sein, obgleich der Feuchtigkeitsgehalt der Zusammensetzung auch eine Veränderliche ist, die gesteuert werden sollte. Zeit und Temperaturen wurden weiter oben beschrieben. Der Feuchtigkeitsgehalt sollte unter 5 Gew.% sein, gewöhnlich unter 1 Gew.%.

Während dem einige Inaktivierung und Denaturierung von AHF im Aufwäraieverfahren des Trockenzustandes stattfindet, so passiert dies in einem kleineren Mass als die Inaktivierung der sogar ziemlich härteren Viren der Kandidaten oder des Virus der Hepatitis. Somit kann die infizierte AHF-Zusammensetzung im wesentlichen vom Virus in infektiöser Form befreit werden. Das heisst, dass die Stärke des Virus so weit reduziert ist, dass die Infusion von therapeutischen Mengen des Produktes in mehrere normale Tiere, als Virusempfänger, versagen wird um klinische oder serologische Evidenz der Infektion bei einer Empfängergruppe zu beweisen oder wird den Ausbruch der Infektion in einer solchen Gruppe merklich verzögern. Dort wo ein gleichwertiger Gewebekulturversuch um die biologische Ansteckbarkeit festzustellen, zur Verfügung steht, kann er an Stelle der normalen Tierempfänger als Indiz der Ansteckbarkeit verwendet werden.

Das sanfte Aufwärmeverfahren im trockenen Zustand, das hier beschrieben ist, schont im wesentlichen die vollen Antigeneigenschaften der infektiösen Mikroben, d.h. die nahegelegenen typischen Aspekte der Organismen sind nicht irreversibel denaturiert. Dies steht im Gegensatz zu anderen Verfahren, welche gleichwertige Reaktionen mit chemischen Substanzen, Hochenergie, Ausstrahlung und übermässiges Aufheizen enthalten.

Die Aufwärmephase kann in geschlossenen oder offenen Behältern, wie oben festgehalten, geschehen und ist sehr wirksam mit Hilfe von einfachen kostengünstigen Mitteln wie durch Kontaktaufwärmen der Produktbehälter, zum Beispiel in Ofen oder Wasser- oder Sandbäder, oder durch infrarote Anstrahlung. Aus Sicherheits- und Kostengründen ist Mikrowellenheizung nicht bevorzugt.

Verschiedene Ausführungen der vorliegenden Erfindung sind hier vorgängig illustriert worden. Es muss jedoch klar sein, dass verschiedene Änderungen an den Temperaturbereichen, den Aufwärmezeiten und den Reinheitsgraden im Zusammenhang mit den weiter oben beschriebenen Ausführungen von Fachleuten gemacht werden können, ohne den Rahmen und Sinn der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Es ist deswegen die Absicht des Erfinders, sich nicht anderswie zu binden als durch die Grenzen der Ansprüche.

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Claims (5)

665 125 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Inaktivierung der Viren in einer AHF-angereicherten Zusammensetzung, die zur Herstellung eines medikamentösen Mittels zur Behandlung von Blutungen verwendbar ist, durch Erwärmen der lyophilisierten AHF-angereicherten Zusammensetzung, die ein Human-Faktor-VIII-Konzentrat umfasst, das im wesentlichen frei von blutgerinnenden Enzymen ist, auf eine Temperatur von mindestens 60 C während einer gegebenen Zeitspanne, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Human-Faktor-VIII sowohl vor wie nach dem Erwärmen, eine AHF-Reinheit von mehr als 1500 AHF-Einheiten/g Protein aufweist und dass die genannte Zusammensetzung erwärmt wird, um einen unerwünschten Virus im wesentlichen in inaktiver Form vorzulegen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der unerwünschte Virus mit dem erworbenen Immun-mangelsyndrom AIDS verwandt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der unerwünschte Virus ein Hepatitis B Virus ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der unerwünschte Virus ein non-A — non-B-Hepatitis Virus ist.

5. AHF-angereicherte Zusammensetzung hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4.