AT392905B - Verfahren zur behandlung eines blutgerinnungsfaktors viii-konzentrats - Google Patents

Description

AT 392 905 B

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Behandlung eines Blutgerinnungsfaktor VÜI-Konzentrats zum Zwecke der Minimierung der Wirkung irgendeines im Blutgerinnungsfaktor VHl-Konzentrat vorhandenen Virus. Im speziellen betrifft das erfindungsgemäße Verfahren die Wärmebehandlung von Konzentraten, um darin enthaltene unerwünschte Mikroorganismen und zwar Viren, wie den Hepatitis-Virus zu inaktivieren..

Die Verwendung von Gerinnungsfaktorenkonzentraten, welche von fraktioniertem Blutplasma für die therapeutische Behandlung in bezug auf die vererbten Blutungsanomalien, wie die Hämophilie, erhalten werden, ist als Folge des außerordentlichen Risikos für den hämophilen Patienten, daß der Hepatitis-Virus in den Konzentraten vorhanden ist, schwerstem in Frage gestellt. Zum Beispiel werden Faktor-VIII- und -IX-Konzentratzubereitungen typisch zur Erhöhung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes eines Hämophilie-Opfers verwendet, aber diese Konzentrate sind aus Plasmaansammlungen, zu denen tausende von Spendern beigetragen haben, hergestellt und enthalten das inhärente Hepatitisrisiko einer gleichen Anzahl von einzelnen Transfusionen. Wie Mc Cullen und Zuckerman gezeigt haben, vgl. Journal of Medical Virology, Bd. 8. No. 29 (1981), werden trotz strenger Prüfung der individuellen Spender in bezug auf Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg), von solchen Plasmaansammlungen eindeutig beide Hepatitisarten, B und weder -A noch -B, übertragen.

Eine Hepatitisübertragung durch Albumine und andere wärmestabile Plasmakomponenten, die nicht mit der Blutgerinnung Zusammenhängen, wurde bis jetzt dadurch vermieden, daß die Plasmakomponenten in Lösung auf 60 °C während zehn Stunden erwärmt wurden. Ähnliche Versuche, um Gerinnungsfaktorkonzentrate in Lösung aufzuwärmen, haben hingegen Wirkung gezeigt, daß dadurch die Gerinnungsfaktoraktivität in den Konzentraten merklich reduziert oder eliminiert wird und somit scheint es nicht, daß sie als eine brauchbare Lösung des Problems der Hepatitisübertragung, welches mit der gewöhnlichen Hämophilietherapie einhergeht, dienen können. In neueren Versuchen wurde hochgereinigter Faktor VIH-Niederschlag in einer Lösung von Saccharoseglycin aufgelöst und während zehn Stunden auf 60 °C aufgewärmt. Obgleich das Faktor VIII-Konzentrat, welches anschließend vom erwärmten Niederschlag abgeleitet wurde, die Gerinnungsfaktoraktivität behielt, so waren die Erträge mit diesem Verfahren sehr tief, z. B. um 8 % vgl. Heimburger et al, Hemostatis, Bd. 10 (Supplement 1), S. 204 (1981) und Heimburger et al, Blut, Bd. 44, S. 249-251 (1982).

Im Ergebnis liefert also die zur Zeit bekannte Technik keine Mittel, um wirksam Hepatitis-Virus, die in Gerinnungsfaktorenkonzentraten vorhanden sind, zu inaktivieren, noch zeigt die bekannte Technikern Mittel zur wirksamen Inaktivierung von in Gerinnungsfaktorenkonzentraten vorhandenem Hepatitis-Virus an, noch gibt sie ein Mittel an, um die Übertragung von Hepatitis-Virus an mit Gerinnungsfaktorenkonzentraten zu behandelnde Patienten zu verhindern.

Gemäß der vorliegenden Erfindung inaktiviert, reduziert oder verhindert die Wärmebehandlung von im wesentlichen trockenen Faktorzusammensetzungen, welche den Faktor VIII enthalten, die Ansteckbarkeit der Mikroorganismen, wie die Viren, die darin enthalten sind, ohne die Gerinnungsfaktoraktivität zu verringern.

Des weiteren erlaubt die Wärmebehandlung der im wesentlichen trockenen Gerinnungsfaktorkonzentrate, welche Faktor VIQ enthalten, die Inaktivierung von darin vorhandenem Hepatitis-Virus und die Erzielung guter Konzentratausbeuten ohne merkliche Reduktion der Gerinnungsfaktoraktivitäten in den Konzentraten.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Wärmebehandlung von Gerinnungsfaktorkonzentraten, welche den Faktor Vm enthalten, wobei die Konzentrate zuerst in lyophilisierter Form zur Erhöhung der Stabilität der Konzentration während der Wärmebehandlung vorbereitet werden. Wärmebehandelte lyophilisierte Plasmafraktionen liefern bevorzugt eine Zusammensetzung und einen Impfstoff, die gegen beide Hepatitis, B-Virus und weder A- noch B-Virus wirksam sind.

Verfahren zur Behandlung eines Blutgerinnungsfaktor VUI-Konzentrats zum Zwecke der Minimierung der Wirkung irgendeines im Blutgerinnungsfaktor VHI-Konzentrat vorhandenen Virus, gemäß welchem man ein Konzentrat enthaltend menschlichen Blutgerinnungsfaktor VIII lyophilisiert und sodann das lyophilisierte Blutgerinnungsfaktor VÜI-Konzentrat auf eine vorbestimmte Temperatur von wenigstens 60 °C während einer Zeitperiode erhitzt, die ausreicht, die Ansteckungsfähigkeit eines Virus, insbesondere eines non-A-non-B-Hepatitisvirus, eines mit Acquired Immune Deficiency Syndrom (AIDS) verwandten Virus, Cytomegalovirus oder Epstein-Barr Virus, zu beseitigen, dadurch gekennzeichnet, daß das lyophilisierte Blutgerinnungsfaktor VÜI-Konzentrat auf eine Temperatur zwischen 60 und 125 °C erhitzt wird und daß ein im wesentlichen von Blutgerinnungsenzymen freies Konzentrat eingesetzt wird.

Die Fähigkeit, Gerinnungs- oder Koagulationsfaktoren, die in menschlichem Blut vorhanden sind, zu isolieren, war für das Verständnis der Hämophiliepathologie und anderer erblicher Anomalien der Blutungseigenschaften unentbehrlich. Gleichzeitig hat die Entdeckung von Plasmafraktionierungsverfahren, um praktische Mengen von Gerinnungsfaktorkonzentraten zu erhalten, die medizinische Wissenschaft in die Lage versetzt, die Gerinnungsfaktorkonzentrate als therapeutische Mittel zur Behandlung von Blutungsanomalien zu verwenden. Die Transfusionstherapie, welche speziell Faktor-Vül- undFaktor-IX-Konzentrate verwendet, war bewiesenermaßen bei der Betreuung der Hämophiliepatienten recht erfolgreich. Leider verbleibt das Risiko der Hepatitisübertragung wegen der großen Anzahl von Plasmaspendem, die für die industrielle Herstellung von Gerinnungsfaktoienkonzentraten nötig ist, als das ernste Handicap, das mit der Transfusionstherapie verbunden ist. Ein typisches Plasmafraktionierungsverfahren, mitgeteilt in "Seminars in Thrombosis and Hemostatis", Bd. VI, No. 1, S. 4 (1979), liefert Kryoniederschläge und bei Zentrifugierung Obenaufschwimmendes, wobei die -2-

AT 392 905 B erste Fraktion eine Quelle für beide Faktor-VIII-Konzentrate und Fibrinogen und die letzte Fraktion eine Quelle für Faktor-IX-Konzentrate, zusätzlich zu den Faktoren -Π, -VII und I-Konzentraten, darstellt- Wie Gerety und Eyster in "Hepatitis among Hemophiliacs" Non-A, N-B Hepatitis, S. 103-106 (1981) demonstriert haben, wird das Hepatitis B-Virus, das ursprünglich im ganzen Plasma vorhanden war, an die Faktoren -VH- und IX-Derivate während des Plasmafraktionierungsvorganges verteilt. Wie auch von Maynard und Bradley "Transmission by blood products", Non-A-Non-B Hepatitis, S. 78-79 (1981) aufgezeigt wird, ist die weder A- noch B-Hepatitis sowohl in Faktor Vni- als auch Faktor IX-Präparaten vorhanden. Frühere Versuche der Wärmebehandlung der Gerinnungsfaktorkonzentrate in Lösungen mit dem Ziel, Hepatitis-Virus zu inaktivieren, waren unwirksam. Die Entwicklung von Techniken zur Lyophilisierung von Gerinnungsfaktorpräparaten hat jedoch einen neuen Forschungsweg geöffnet, speziell in bezug auf die Stabilisierung der Gerinnungsfaktorpräparaten während des Wärmebehandlungsverfahrens; somit wurde ein Mittel zur Inaktivierung von Hepatitis-Virus, das in Gerirmungsfaktorpräparaten vorhanden war, ohne die Aktivität der Gerinnungsfaktoren zu zerstören, entwickelt

In der Folge wird das Prüfverfahren zur Feststellung, daß die Aktivität der Gerinnungsfaktoren beibehalten wird, erläutert

Paare von Proben von verschiedenen lyophilisierten Plasmafraktionen, wobei jedes Paar Posten-Erkennungsnummern aufweist, wurden von verschiedenen Herstellern erhalten. Die Proben wogen im allgemeinen weniger als 100 g und waren in Fläschchen von 60 bis 90 ml gefüllt Eine Probe eines jeden Paares wurde entweder durch Erwärmen in Fläschchen mit Hilfe eines Wasserbades oder eines Trockenschrankes auf eine bestimmte Temperatur unter Normaldruck während einer bestimmten Zeit oder durch direktes Einlegen des lyophilisierten Materials in einen Trockenschrank ohne Fläschchen aufgewärmt. Die verbleibende Probe eines jeden Paares diente zur Kontrolle und war auf 4-6 °C während des Wärmebehandlungsverfahrens gekühlt Nach der Wärmebehandlung wurden beide, die Kontrollprobe und die wärmebehandelte lyophilisierte Probe mit sterilem Wasser wieder rückgebildeL

Die Rückbildung bzw. Rekonstitution wurde im allgemeinen entsprechend den Weisungen des Herstellers durchgeführt, obgleich die Löslichkeit einiger wärmebehandelter Proben wesentlich durch Erhöhung der Menge sterilen Wassers, die während der Rückbildung zusätzlich zu derjenigen verwendet wurde, die vom Hersteller empfohlen war, verbessert werden konnte. In vitro Erprobungen des Faktors VIQ wurden unter Verwendung eines einstufigen Handfibrometerverfahrens unter Verdünnungen zwischen 1:40 und 1:400 durchgeführt, um damit eine Messung der Gerinnungsaktivität des Faktors VIII zu erhalten. In einigen Experimenten wurden die riickgebildeten Plasmafraktionen in bezug auf Lichtübertragung bei 580 nm mit einem Beckman Modell 25-Spektrophotometer beobachtet. Eine Elektrophorese für "Agarose Gel" mit einer "ICL" Immunoelektrophoreseplatte wurde mit verschiedenen der Probenpaare des Faktors VIII durchgeführt, wobei Ziegenserum "antihuman”, von Hylands Diagnostics geliefert, als Standard verwendet wurde. Die Platten wurden spezifisch mit einer Buchler Stromversorgung mit 25 mA während 35 Minuten der Elektrophorese unterworfen. Nach Abschluß der Elektrophorese wurden die Platten während 18 bis 24 Stunden im Antiserum entwickelt und unter indirektem Licht untersucht. Eine Panagell-Elektrophorese mit einer "Worthingtin Diagnostic" Platte wurde an einem zusätzlichen Probenpaar des Faktors-VHI-Konzentrats durchgeführt, wobei eine wassergekühlte "Biorad" Elektrophoresenzelle verwendet wurde.

Weitere in vitro Versuche wurden unter Aufwärmen von lyophilisierten Proben des Faktors-VIII-Konzentrats in einem Wasserbad bei Raumtemperatur und bei bestimmten Temperaturen während bestimmten Zeiten durchgeführt. Der Faktor VIIIAg wurde dann bestimmt, wobei das von Laureil beschriebene Verfahren "Electroimmuno Assay", The Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, Bd. 29, S. 21-37 (1972) verwendet wurde. Faktor-VIH-Resultate wurden dann für Verdünnungen von 1:40,1: 80,1:100 und 1 : 200 durch Einträgen der Höhe der Zentrifugenbehälter der Laurell Normkurve in bezug auf den Verdünnungsprozentsatz bestimmt. Unbekannte wurden als Prozentsatz des Normalen, auf der Basis der Höhen da1 Zentrifugen-Behälter der Unbekannten in der Normkurve ausgedrückt.

Die in vivo Rückbildung der Gerinnungsfaktoraktivität für die wärmebehandelten Faktor-VIII-Konzentrate wurde durch Einspritzen von wiederhergestellten wärmebehandelten lyophilisierten Faktor-Vm-Konzentraten beziehungsweise an Hämophilie-A und Hämophilie-B-Hunde gegeben.

Resultate der in vitro Versuche, die mit Faktor-VIH-Konzentraten durchgeführt wurden, sind in Tabellen I und Π aufgeführt: -3-

AT 392 905 B TABELLET

Messungen der Aktivität des Gerinnungsfaktors nach der Wärmebehandlung des Ivonhilisiarten Faktnr-VTTT-

Konzentrats

Los Temp. Zeit Verdun. % Aktivität * A C-1081 Kontrolle 1:20 C-1081 Kontrolle 1:40 zirka 10 % Aktivitätsabnahme wurde C-1081 Kontrolle -- 1:80 bei wärmebehandel- 60 °C 10 St. 1:20 ten Proben im Ver- n 1:40 gleich zu Kontroll- 1:80 mustern beobachtet ANC-8247 Kontrolle -- 1:40 1438 1:80 1697 62°-64 °C 16.33 St. 1:40 1215 11 tt 1:80 1360 B AHF-355 Kontrolle -- 1:40 1912 -- 1:80 1600 1:160 1312 64 °C 20 St. 1:40 1080 tt 1:80 1072 74 °C 17 St. 1:40 1144 11 1:80 1024 tl 1:160 864 76 °C 17 St. 1:40 1040 tt 1:80 976 B 347 Kontrolle -- 1: 100 1180 11 -- 1:200 100 83 °C 24 St. 1:100 100 tl II 1:200 100 85 °C 24 St. 1:100 1 B 347 95 °C 7 St. 1:100 1 II 97 °C 7.5 St. 1:200 1 C Al-0470 Kontrolle 1:100 912 tl 75 °C 20 St. 1:100 2076 C Al-1080 Kontrolle -- 1:200 2080 -- 1:400 1920 80 °C 24 St. 1:200 1380 It ft 1:400 1360 A Al-1120 Kontrolle -- 1:40 2800 tt -- 1:80 2032 78 °C 21 St. 1:40 1592 tl tt 1:80 1392 80 °C 20 St. 1:40 1176 tt ff 1:80 1600 90 °C 12 St. -- geronnene Probe 100 °C 1.5 St. 1:40 1248 tt tt 1:80 1264 C Al-1150 Kontrolle -- 1:40 2176 n -- 1:80 2480 -- 1:100 1870 65 °C** 26.33 St. 1:40 1592 tt tt 1:80 1520 83 °C 24 St. 1:100 730 tt tt 1:200 620 85 °C 24 St. 1:100 1000 tt tt 1:200 1160 90 °C 10 St. 1:40 1032 -4-

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Fortsetzung TABELLE T

Los Temo. Zeit Verdiin. % Aktivität ft ff ff 1:80 1056 (f 95 °C 7 SL -- geronnene Probe ft 97 °C 7.5 St. 1:100 80 ft ft tt 1:200 100 C Al-1150 100 °c 10 St. 1:40 88 ff tt tt 1:80 48 C Al-1160 Kontrolle 1:100 3680 ft tt 1:200 3420 ft ff 1:400 3200 ft 78 °C 24 St. 1:100 2420 ff ff ff 1:200 1520 ft tt ft 1:400 1440 ff 78 °C 24 St. 1:200 1720 ft ff tt 1:400 1680 ft 80 °C 22 St. 1:200 1400 tt tt tt 1:400 1360 ff 100 °c 7 St. 1:200 1760 tt tt tt 1:400 1760 C Al-2120 Kontrolle 1:100 86 n 110 °c**** 1.5 St. 1:100 18 C Al-2531 Kontrolle -- 1:200 3500 ff ft 1:400 2700 tt 85 °C 20 St. 1:200 46 tt ff tt 1:400 43

Bemerkung: Alle Zeiten und Temperaturen sind Ungefährwerte. Nach der Wärmebehandlung bei höheren Temperaturen wurden Mengen von sterilem Wasser im Überschuß verglichen mit den Empfehlungen des Herstellers, zu einigen Konzentraten hinzugegeben, bis die Auflösung visuell festgestellt wurde. * A-Lose waren durch Cutter Laboratories hergestellt; B-Lose waren durch Michigan Red Cross hergestellt; C-Lose warm durch Alpha Therapeutics hergestellt; ** Im Trockenschrank wärmebehandelt (Probe aus dem Fläschchen entfernt); *** Im Trockenschrank wärmebehandelt (Probe im Fläschchen enthalten).

TABELLE TT

Bestimmung des Faktors ΥΙΠΛε nac_h_detWärmebehandlung von lyophilisiertem Faktor VBI-Konzentrat

Los Temp. Zeit Verdiin. Höhe des Zentri- fogakBshälters % Ag B AHF-355 Kontrolle m m 1:40 35 3720 ft tt 1:80 22 4080 tt 64 °C 20 St. 1:40 39 4240 ft tt tt 1:80 26 5120. tt 74 °C 17 St. 1:40 40 4400 tt tt ff 1:80 26 5120 C Al-1120 Kontrolle - - 1:100 15 4700 tt 90 °C 12 St. 1:100 0 0 C Al-1150 Kontrolle -- 1:200 12 7200 ft 83 °C 24 St. 1:200 12 6200 tt 85 °C 24 St. 1:200 15 9400 tt 97 °C 7.5 St. 1:200 0 0

Bemerkung: Alle Zeiten und Temperaturen sind Ungefährwerte. Nach der Wärmebehandlung bei höheren

Temperaturen wurden Mengen von sterilem Wasser im Überschuß, über die Empfehlungen des Herstellers -5-

AT 392 905 B hinaus, zu einigen Konzentraten, bis die Auflösung visuell festgestellt war, hinzugefügt. * B-Lose wurden von Michigan Red Cross hergestellt; C-Lose wurden von Alpha Therapeutics hergestellt.

Nachstehend werden ausgewählte Versuchsergebnisse diskutiert.

Die in den Tabellen I-Π zusammengefaßten Resultate können kombiniert werden um eine relative Angabe über die Beibehaltung der Gerinnungsäktivität zu erhalten, welche dem Wärmebehandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen wurden. Speziell kann die prozenmelle Aktivität der rückgebildeten Faktor-Vül-Konzentrate für individuelle Kontrollproben gemittelt und mit ähnlich gemittelten prozenmellen Aktivitäten entsprechender Probenpaare der wärmebehandelten Faktor-VIII-Konzentrate verglichen werden. Wo solche Vergleiche angestellt wurden, kann man z. B. sehen, daß lyophilisiertes Faktor-VIII-Konzentrat (Posten Nr. A NC-1081), das von einem Hersteller erhalten wurde und auf 60 °C während 10 Stunden aufgewärmt worden war, im Vergleich zu einem tingewärmten Kontrollmuster mehr als 90 % von seiner in vitro Faktor-VHI-Gerinnungsaktivität beibehalten hat. Das wärmebehandelte nickgebildete Faktor-VIII-Konzentrat weist ferner eine Absorption von 0,30 bei 580 nm im Vergleich zur Absorption von 0,20 für die nicht wärmebehandelte Kontrollprobe auf und zeigte keine Unterschiede in bezug auf die nicht aufgewärmte Kontrollprobe nach der Immunoelektrophorese mit dem antihumanen Ziegenserum. Die rückgebildeten Faktor-VIII-Konzentrate von einem anderen Posten (Posten Nr. A NC-8747) des gleichen Herstellers, die in lyophilisierter Form auf 62-64 °C während 16 Stunden erwärmt und anschließend bei 6 °C sieben Tage lang gelagert wurden, wiesen im Vergleich zu einem nicht aufgewärmten Kontrollmuster einen mehr als 80-%igen Wiederaufbau des Faktors VIII der Gerinnungsaktivität auf. Eine allgemeine Verstärkung der anodischen Wanderung war in bezug auf das nicht aufgewärmte Kontrollmuster nach der Immunoelektrophorese gegen Ziegenserum festzustellen.

In ähnlicher Weise wies das lyophilisierte Faktor-VIII-Konzentrat, welches von einem zweiten Hersteller stammte (Los Nr. C Al-1120) und wenn es auf zirka 78 °C während 21 Stunden erwärmt wurde, im Vergleich zu einem nicht erwärmten Kontrollmuster eine 62 % in vitro Beibehaltung der Gerinnungsaktivität nach der Rückbildung auf. Das rückgebildete Faktor-Vm-Konzentrat des gleichen Postens des zweiten Herstellers behielt im Vergleich zum nicht aufgewärmten Kontrollmuster noch nach einer Wärmebehandlung in lyophilisiertem Zustand bei zirka 80 °C und während 20 Stunden 57 % in vitro Gerinnungsaktivität bei, wogegen das rückgebildete Faktor-Vin-Konzentrat des gleichen Postens des zweiten Herstellers, welches vorher in lyophilisierter Form auf zirka 100 °C während eineinhalb Stunden erwärmt wurde, 52 % in vitro Gerinnungsaktivität im Vergleich zum nicht erwärmten Kontrollmuster beibehielt. Wenn ein zweiter Posten (Posten Nr. C Al-1150) des lyophilisierten Faktor-VIII-Konzentrats des zweiten Herstellers gemäß der vorliegenden Erfindung wärmebehandelt wurde, so betrug das wiedererlangte in vitro-Potential an Gerinnungsaktivität im Vergleich zu den nicht erwärmten Kontrollmustem 67 % für 65 °C während 26 Stunden und 20 Minuten als Wärmebehandlung, bei 34 % für eine Wärmebehandlung bei 83 °C während 24 Stunden und 55 % für eine Wärmebehandlung bei 85 °C während 24 Stunden. Messungen des Faktor-VHI-Antigenpegels an zwei Proben der bei 83 °C bzw. 85 °C wärmebehandelten Faktor-VIII-Konzentrate zeigten einen 15 %igen Verlust bzw. keinen Verlust im Antigenpegel an. Es sollte auch bemerkt werden, daß eine stark verbesserte Löslichkeit der letzteren Probe des wärmebehandelten Faktor-VIII-Konzentrats durch Hinzufügen von sterilem Wasser in einer Menge zwischen 50 ml und 75 ml zur Probe anstatt der nur 25 ml, die vom Hersteller empfohlen waren, erreicht wurde.

Die Wärmebehandlung der lyophilisierten Faktor-VHI-Proben, die von einem dritten Hersteller (Posten Nr. AHF-355) stammten, bestätigen die Resultate, die für die zwei ersten Hersteller beobachtet wurden. Dies ist wie folgt: eine Wärmebehandlung der lyophilisierten Faktor-VHI-Konzentrate des dritten Herstellers bei 64 °C während 20 Stunden erlaubte eine Wiedererlangung der Gerinnungsaktivität zu 61 % im Vergleich zur nicht erwärmten Kontrollprobe, eine Wärmebehandlung des gleichen Konzentrats bei 74 °C während 17 Stunden erlaubte eine Wiedererlangung der Gerinnungstätigkeit von 63 % und eine Wärmebehandlung des gleichen Konzentrats bei 76 °C während 17 Stunden eine Wiedererlangung der Gerinnungsaktivität von 57 %. Die Faktor-VIH-Antigenpegel in den rückgebildeten Proben, welche auf 64 °C und 74 °C erwärmt wurden, wiesen keine Abschwächung auf im Vergleich mit dem Pegel der nicht erwärmten Kontrollproben.

Wie früher angegeben, wurde die in vitro Prüfung der wärmebehandelten Faktor-VIII-Konzentrate mit Hilfe von Hunden mit Hämophil-A-Mangel durchgeführt. Der A-hämophile Hund erhielt rückgebildetes Faktor-VIII-Konzentrat, welches vorher in lyophilisierter Form bei 60 °C während 10 Stunden wärmebehandelt worden war. Die Resultate der in vivo Versuche sind in Tabelle ΙΠ nachstehend aufgeführt. -6-

AT 392 905 B TABELLE ΤΠ F-Vm mangelnde Hände, welche wärmebehandeltes Faktor-VIII-Konzentrat erhielten HCT % Protein gm % WBC /mm2 Platelets /mm2 FVfflRA %° FVIIIC Temp. °C At mung Puls PRE 44 6.1 3.795 330.000 106 <2 (1-2) 37,7 48 132 Infusion 20 ml gegeber in 3.5 min 40(P 15 min 46 5.9 3.180 110.000 151 12 39,1 42 138 m2 90 min 47 8.0 8.060 165.000 158,150 12 38,3 pant 108 3 St. 44 8.1 5.116 231.000 168 15 38,2 pant 104 5 St. 43 8.0 4.785 165.000 159 9! 38,0 30 114 7.5 St. 44 8.9 3.245 198.000 150 9 38,3 42 108

Die in Tabelle III aufgeführten Resultate illustrieren reichlich die klare Zunahme der Faktor-VIII-Gerinnungsaktivität für einen A-hämophilen Hund nach der Einspritzung von wärmebehandeltem Faktor-VIII-Konzentrat. Das scheinbare Ausbleiben von physiologischem Streß oder anderen hinderlichen Reaktionen, das aus den Angaben in Tabelle ΙΠ ersichtlich ist, erlaubt die Vermutung, daß die Faktor-VHI-Konzentrate, welche nach den vorstehenden Verfahrensphasen behandelt wurden, biologisch akzeptabel bleiben.

Es wurde nun bewiesen, daß Faktor-VIII-Konzentrate von verschiedenen Reinheitsgraden sicher in lyophilisierter Form bei hohen Temperaturen während längeren Zeiten wärmebehandelt werden können, ohne daß eine wesentliche Zerstörung der Gerinnungsaktivität der Konzentrate eintritt. Visuelle Beobachtungen bestätigen, daß die Löslichkeit von lyophilisierten Faktor-Vm-Konzentraten nicht gravierend durch die Wärmebehandlung beeinflußt wird, da die Menge des den lyophilisierten Konzentratproben bei der Rückbildung zugefügten sterilen Wassers einfach erhöht werden kann, bis die vollständige Auflösung erreicht ist Deswegen kann bei entsprechend gewählter Erwärmungstemperatur, Erwärmungsdauer und entsprechender Reinheit das Hepatitis-Virus der beiden Typen, der B-Typ und der weder A- noch B-Typ in Plasmafraktionen inaktiviert werden und gleichzeitig die Lebensfähigkeit und die therapeutische Integrität der Fraktionen beibehalten werden. Berücksichtigt man die zusätzliche Tatsache, daß das Hepatitis-B-Virus und wahrscheinlich das Hepatitis-weder A- noch B-Virus vorzugsweise in der Fraktion des Gerinnungsfaktors, d. h. im Faktor-VIII-Konzentrat verteilt ist, so kann die Wärmebehandlung der Fraktionen des Gerinnungsfaktors in lyophilisierter Form bei geeigneten Temperaturen und während einer geeigneten Zeitdauer auch dazu dienen, das Hepatitis-Virus sowohl zu immunisieren als auch in nichtinfektiöse Form überzuführen. Als Ergebnis können rückgebildete wärmebehandelte lyophilisierte Fäktor-Vm-Konzentrate als Hepatitis-Impfstoffe wirken und gleichzeitig die therapeutischen Vorteile, die sonstwie mit den Fraktionen des Gerinnungsfaktors Zusammenhängen, zur Verfügung stellen.

Es sollte zudem auf Grund der Extrapolation der Versuchsresultate, die in den Tabellen I-Π aufgeführt sind, klar sein, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung im wesentlichen jederzeit während des Plasmafraktionierungsverfahrens durchgeführt werden kann. Das heißt, daß in jedem Moment während dem Fraktionierungsverfahren, in welchem ein Plasmapräparat lyophilisiert werden kann, eine Wärmebehandlung des Plasmapräparats durchgeführt und das Präparat wieder gelöst oder rückgebildet werden kann, bevor das Fraktionierungsverfahren fortgesetzt wird. So können zum Beispiel, wenn letztlich ein Faktor-VIII-Konzentrat von einem Plasmafraktionierungsschema - wie von Mammen et al. in "Treatment of Bleeding Discorders with Blood Components", Reviews of Hematology, Vol. 1, S. 144 (1980) mitgeteilt -, gewonnen wird, Kryoniederschlag, der von frisch gefrorenem Plasma erhalten wurde, geklärter Extrakt, der vom Kryoniederschlag erhalten wurde, und Obenaufschwimmendes, das aus geklärtem Extrakt erhalten wurde, alle in der gleichen Art wie Faktor-VHI-Konzentrat selbst lyophilisiert und wärmebehandelt werden. Die Wahl des zweckmäßigen Augenblicks während des Plasmafraktionierungsablaufs für die Durchführung der Wärmebehandlung kann nach praktischen Gesichtspunkten, wie Kosten und Zweckmäßigkeit getroffen werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt auch, wie bereits ausgeführt wurde, die Inaktivierung anderer unerwünschter Mikroorganismen, wie eines mit Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) verwandten Virus, Cytomegalovirus oder Epstein-Barr-Virus.

Das Hinzufügen von sterilem Wasser zu trockenem oder lyophilisiertem Plasma in einem Ausmaß, das über die vom Hersteller empfohlenen Volumina hinausgeht, erzeugt Plasmalösungen mit einer größeren Verdünnung als normalerweise empfohlen; die Wirksamkeit des Plasmas und seiner Bestandteile ist jedoch nicht merkbar beeinträchtigt. Dies ist besonders nützlich, wenn die Temperaturen, auf welche die Plasmazusammensetzung zum -7-

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Zwecke der Inaktivierung der unerwünschten Mikroorganismen erwärmt werden soll, so hoch sind, daß normalerweise eine Koagulierung des rückgebildeten Plasmas eintreten würde, es sei denn, daß steriles Wasser im Überschuß hinzugefügt wird.

Eine besonders bedeutende Verwendung dieses Verfahrens ist die Behandlung von mit Anti-Hämophilie-Faktor angereicherten Zusammensetzungen (abgekürzt AHF). Solche Zusammensetzungen enthalten größere Konzentrationen von AHF bezogen auf das Gesamtproteingewicht, als die Konzentrationen, die in Proteinfraktionen des Plasmas, gefunden werden. Solche hohe AHF-Konzentrationen sind erforderlich, um zu gewährleisten, daß, wenn die Zusammensetzungen in Wasser oder einem anderen physiologisch zulässigen Träger aufgelöst sind, sie die Gerinnungsanomalien des Patienten so weit korrigieren, daß ein positiver klinischer Effekt erzielt wird, ohne daß Überschußwasser oder fremde Proteine infundiert werden müssen. Im allgemeinen kann eine therapeutisch wirksame Dosis von AHF von den Fachleuten einfach bestimmt werden. Es wird vom klinischen Zustand des Patienten abhängen, im besonderen von der Art der angetroffenen Blutung. Gewöhnlich sollte genügend AHF infundiert werden, um einen AHF-Plasmapegel des Patienten von mindestens 30 % des bei normalen Individuen vorhandenen herzustellen, obgleich bei ernsten Blutungen Pegel von 50 % und mehr vorzuziehen sind. Dies kann durch Infundierung einer Gesamtanzahl von AHF-Einheiten, gemäß der Formel: Anzahl notwendiger Einheiten = Körpergewicht (kg) x 0,4 x gewünschte AHF-Erhöhung (in % des Normalwertes), erreicht werden.

Die AHF-Konzentration in der Infusionsflüssigkeit sollte bevorzugt 34 Einheiten/ml nicht überschreiten, sollte aber größer als 15 Einheiten/ml sein. Ist die Konzentration größer als 34 Einheiten/ml, so sollten nicht mehr als 2 ml pro Minute infundiert werden. Infusionsflüssigkeiten mit weniger als 34 Einheiten können rascher infundiert werden, wie etwa in der Größenordnung von 10 bis 20 ml während einer 3-Minuten-Dauer. Eine AHF-Einheit ist definiert als die Aktivität an AHF, die in 1 ml menschlichem normal gewonnenem Plasma, das weniger als 1 Stunde alt ist, vorhanden ist.

Die an AHF angereicherten Zusammensetzungen haben gewöhnlich einen Gehalt von mehr als 20 AHF-Einheiten, normalerweise von mehr als ungefähr 300 AHF-Einheiten pro Gramm Protein. Natürlich ist das Produkt umso begehrter, je reiner es ist. Zusammensetzungen mit einem Gehalt von zirka 100 bis 2000 AHF-Einheiten pro Gramm Protein sind die gebräuchlichsten.

Die AHF-Zusammensetzungen können, je nach dem verwendeten Verfahren während des Reinigungsverfahrens von anderen Plasmaproteinen befreit und zu verschiedenen Reinheitsgraden gereinigt werden. Solche Plasmaproteine umfassen die blutkoagulierenden Enzyme (hier sowohl die inaktiven Proenzymen wie die aktivierten Enzymen eingeschlossen), wie Konzentrate von Prothrombin-Komplex oder Faktor-IX-Konzentrate (Faktoren II, VH, IX und X). Faktoren ΧΠ oder ΧΙΠ, Fibrinogen, Albumine und Gamma Globulin. Wenn eine AHF-Zusammensetzung im wesentlichen frei von blutkoagulierenden Enzymen ist, so enthält sie subtherapeutische Aktivitäten des Enzymes. Die AHF-Zusammensetzungen können bis zu einem Grad gereinigt werden, wo die Aktivität irgendeines blutkoagulierenden Enzyms auf Spurenniveau reduziert ist, im allgemeinen weniger als etwa 15 Einheiten pro Gramm Protein und bevorzugt wenig» als etwa 5 Einheiten pro Gramm Protein. Das Verhältnis der AHF-Einheiten zur Aktivität jeder individuellen Enzym-Einheit in solchen Zusammensetzungen beträgt von 10 : 1 bis 500 : 1 und ist bevorzugt größer als 300 : 1. Eine Einheit der Enzym-Aktivität für jedes der verschiedenen koagulierenden Enzyme in ihrer aktivierten oder Proenzymform ist in der PCT International Application WO 82/03871 (veröffentlicht am 11. November 1982) definiert.

Die genannten wärmebehandelten AHF-Zusammensetzungen werden an Patienten mit erblichem Mangel an AHF abgegeben. Diese Patienten versagen in der Synthetisierung von biologisch aktiven AHF und sind von denen zu unterscheiden, welche erworbene AHF-Inhibitoren (wahrscheinlich Antikörper) aufweisen, welche auch die Symptome der Hämophilie bewirken. Die letzte Gruppe ist bevorzugt mittels Zusammensetzungen mit aktivierten koagulierenden Enzymen zu behandeln. Die Zusammensetzungen mit koagulierenden Enzymen enthalten therapeutisch wirksame Mengen von den Enzymen. Die Zusammensetzungen, die hi» beschrieben werden, enthalten jedoch keine solche Mengen an blutkoagulierenden Enzymen, sondern basieren statt dessen im wesentlichen auf d» AHF-Aktivität für die Blutstillung.

Die genannten AHF-Zusammensetzungen enthalten kleinere M»igen an denaturiertem AHF als diejenigen, die nach früheren Verfahren hergestellt wurden. Im allgemeinen liegt die Menge an denaturiertem AHF unter etwa 50 % der Gesamtmenge an aktivem und denaturiertem AHF in der Zusammensetzung. Bevorzugt wird ein Verhältnis von 30 % bis 10 %. Die Menge von denaturiertem AHF ist gleich dem prozentuellen Verlust an AHF-Einheiten, nachdem die virusinfizierte Zusammensetzung dem hier beschriebenen Wärmebehandlungsverfahren unterworfen wurde.

Der Aufwärmung d» virusverseuchten AHF im trockenen Zustand kann, wie oben beschrieben, die Prüfung der AHF-Koagulierungsaktivität, und der Virusstärke folgen. Wo es schwierig ist, die Stärke des biologisch aktiven Virus zu messen, wie im Fall von Hepatitis-Viren, so kann ein Viruskandidat wie ein Bakteriophage, Sindbis-Virus, Adenovirus oder EHC-Virus verwendet w»den, wie in der PCT International Application WO 82/03871 (veröffentlicht am 11. November 1982) beschrieben. Eine Menge des Kandidaten-Virus in einer bestimmten Stärke wird einer Lösung der mit Wärme zu behandelnden Zusammensetzung eingegeben, die Lösung wird lyophilisiert und verschiedene Wärmebehandlungen w»den durchgeführt. Man wählt den Zeitpunkt, bei welchem echte Messungen oder eine Regressionsanalyse (d. h. statistische Extrapolation) den erwünschten -8-

Claims (2)

1. AT 392 905 B Grad von viraler Inaktivierung anzeigen, als Bedingungen, welche die Wärmebehandlung des Produktes bestimmen. Diese Bedingungen werden im allgemeinen Zeit und Temperatur der viralen Inaktivierung sein, obgleich der Feuchtigkeitsgehalt der Zusammensetzung auch eine Veränderliche ist, die gesteuert werden sollte. Zeit und Temperaturen wurden weiter oben beschrieben. Der Feuchtigkeitsgehalt sollte unter 5 Massen-% sein, gewöhnlich unter 1 Massen-%. Obgleich eine gewisse Inaktivierung und Denaturierung von AHF im Aufwärmeverfahren im Trockenzustand stattfindet, so geschieht dies in einem kleineren Maß als die Inaktivierung der sogar ziemlich härteren Kandidaten-Viren oder des Hepatitis-Virus. Somit kann die infizierte AHF-Zusammensetzung im wesentlichen vom Virus in infektiöser Form befreit werden. Das heißt, daß die Stärke des Virus so weit reduziert ist, daß die Infusion von therapeutischen Mengen des Produktes in mehrere normale Wirtstiere zu keiner nachweisbaren klinischen oder serologischen Evidenz der Infektion bei einer Wirtsgruppe oder zu einem merklich verzögerten Ausbruch der Infektion in einer solchen Gruppe führen wird. Dort wo ein gleichwertiger Gewebekulturversuch zur Feststellung der biologischen Ansteckbarkeit zur Verfügung steht, kann er an Stelle der normalen Tierempfänger als Indiz der Ansteckbarkeit verwendet werden. Das schonende, hier beschriebene Aufwärmeverfahren im trockenen Zustand bewahrt im wesentlichen die vollen Antigeneigenschaften der infektiösen Mikroben, d. h. die nahegelegenen typischen Aspekte der Organismen sind nicht irreversibel denaturiert. Dies steht im Gegensatz zu anderen Verfahren, welche gleichwertige Reaktionen mit chemischen Substanzen, hochenergetische Strahlung, Ausstrahlung oder starkes Erwärmen anwenden. Die Aufwärmephase kann in geschlossenen oder offenen Behältern, wie oben festgehalten, erfolgen. Das Aufwärmen kann sehr wirksam mit Hilfe von einfachen kostengünstigen Mitteln, wie durch Kontaktaufwärmen der Produktbehälter, zum Beispiel in Ofen oder in Wasser- oder Sandbädern, oder durch Infrarotbestrahlung durchgeführt werden. Aus Sicherheits- und Kostengründen ist Mikrowellenheizung nicht bevorzugt PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Behandlung eines Blutgerinnungsfaktor VHI-Konzentrats zum Zwecke der Minimierung der Wirkung irgendeines im Blutgerinnungsfaktor VIH-Konzentrat vorhandenen Virus, gemäß welchem man ein Konzentrat enthaltend menschlichen Blutgerinnungsfaktor VIII lyophilisiert und sodann das lyophilisierte Blutgerinnungsfaktor VIII-Konzentrat auf eine vorbestimmte Temperatur von wenigstens 60 °C während einer Zeitperiode erhitzt, die ausreicht, die Ansteckungsfähigkeit eines Virus, insbesondere eines non-A-non-B-Hepatitisvirus, eines mit Acquired Immune Deficiency Syndrom (AIDS) verwandten Virus, Cytomegalovirus oder Epstein-Barr-Virus, zu beseitigen, dadurch gekennzeichnet, daß das lyophilisierte Blutgerinnungsfaktor VIII-Konzentrat auf eine Temperatur zwischen 60 und 125 °C erhitzt wird und daß ein im wesentlichen von Blutgerinnungsenzymen freies Konzentrat eingesetzt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein im wesentlichen von den Faktoren Π, VH, IX, X, ΧΠ und ΧΙΠ oder deren aktivierten Formen freies Konzentrat eingesetzt wird. -9-