LU84804A1

LU84804A1 - Traitement thermique du plasma,produit obtenu et composition pharmaceutique le contenant

Info

Publication number: LU84804A1
Application number: LU84804A
Authority: LU
Inventors: Alan Rubinstein
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 1982-05-13
Filing date: 1983-05-13
Publication date: 1983-11-17
Also published as: AR230186A1; IE55008B1; FR2526660B1; FR2526660A1; CA1203165A; AU569428B2; DK210283D0; EP0171506B1; ES8505821A1; EP0094611B1; AU5766086A; ZA833315B; IE831068L; DK210283A; ES8501627A1; ATA176783A; GB2120254A; DE3382716T2; GB8312915D0; GB2144428A

Description

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La présente invention concerne dans son ensemble du plasma traité par la chaleur. L'invention est axée en particulier sur des fractions traitées thermiquement qui . peuvent être chauffées sous la forme lyophilisée en vue 5 de l'inactivation de micro-organismes et virus indésirables tels que le virus de l'hépatite, qui sont présents dans les fractions.

L'utilisation de concentrés de facteurs de coagulation obtenus à partir de plasma sanguin fractionné, en 10 vue d'intervenir thérapeutiquement dans des troubles hémorragiques héréditaires tels que l'hémophilie, est gravement compromise canne conséquence du risque considérable » que présente pour le patient hémophile la présence du virus de l'hépatite dans les concentrés. Par exemple, les 15 concentrés de Facteurs VIII et IX du commerce sont normalement utilisés pour accroître la capacité de coagulation du sang d'un patient hémophile, mais ces concentrés sont préparés à partir ce plasma rassemblé après prélèvement sur des milliers ce donneurs et ils comportent le risque 20 inhérent d'hépatite d'un même nombre de transfusions unitaires individuelles. Comme McCullen et Zuckerman l'ont montré (voir Journal of Medical Virology, volume 8, S° 2S ^ (1981)), malgré la sélection rigoureuse de donneurs indi viduels pour les antigènes de surface de l'hépatite B 25 (HBsAg), ces plasmas rassemblés transmettent manifestement à la fois l'hématite B et l'hématite non-A, non-B. / if.

3

La transmission de l'hépatite par l'albumine et par d'autres composants du plasma stables à la chaleur sans relation avec la coagulation sanguine a été empêchée jusqu'à présent par chauffage des composants du plasma 5 en solution à ces températures de 60°C pendant 10 heures. En revanche, il a été démontré que des tentatives similaires de chauffage de concentrés de facteurs de coagula-• tion en solution réduisaient notablement ou éliminaient l'activité des facteurs de coagulation dans les concen-10 très et ne paraissaient donc pas offrir une solution viable au problème de la transmission de l'hépatite lié au traitement classique de l'hémophilie. Plus récemment, un précipité de Facteur VIII hautement purifié a été dissous dans une solution de saccharose-glycine et chauffé 15 pendant 10 heures à 60°C. Bien que le concentré de Facteur VIII obtenu ensuite à partir du précipité chauffé conserve effectivement l'activité de facteur de coagulation, les rendements obtenus en utilisant cette voie d'accès sont très faibles, par exemple d'environ 8 % (voir Heimburger et 20 collaborateurs, Hemostatis, volume 10 (supplément 1), page 204 (1981) et Heimburger et collaborateurs, Blut, volume 44, pages 249-251 (1982).

En définitive, l'art antérieur n’offre aucun moyen d'inactivation efficace du virus de l'hépatite pré-25 sent dans des concentrés de facteurs de coagulation, pas plus qu'il n'enseigne le moyen d'empêcher la transmission de virus de 1'hépatite à des patients exposés à un traite-» ment avec des concentrés de facteurs de coagulation.

Conformément à la présente invention, le traite-30 ment à la chaleur de compositions pratiquement anhydres renfermant le Facteur VIII inactive, réduit ou élimine le pouvoir infectieux des micro-organismes tels que des j virus qui y sont présents sans réduire l'activité des j facteurs de coagulation. f h 1.

d

En outre, le traiv-ament thermique ce concentrés pratiquement arbydres de facteurs ce coagulation renfermant ; le Facteur VIII inactive tout virus ce l’hépatite qui y \ est présent, en permettant d’obtenir un rendement irr.por- ! 5 tant en concentré sans réduction notable ce l'activité i ,j des facteurs de coagulation dans ce concentré.

i j |j La présente invention concerne également le 5 traitement thermicue de concentrés de facteurs ce coagu- ! lation contenant le Facteur VIII, traitement selon lequel , · 10 les concentrés .sont d'abord préparés sous une forme lyo- i philisée afin d'améliorer leur stabilité au cours du | c processus de chauffage.

! Des fractions de plasma lyophilisé traitées à | la chaleur offrent avantageusement une composition et un 15 vaccin efficaces,à la fois contre le virus de l'hépatite B et contre le virus de l'hépatite non-A, non-B.

I Ces objectifs de la présente invention, ainsi i j que d'autres, sont atteints par la lyophilisation de j plasma entier ou de fractions de plasma comprenant un j; 20 concentré de Facteur VIII, ainsi que de facteurs tels qu'un j concentré de Facteur IX, du fibrinogène et un cryopréci- ; pité, puis exposition du plasma entier ou des fractions ! de plasma lyophilisés à des températures élevées pendant | des périodes variables.

! 25 La capacité d'isolement de facteurs de coagula- ί tion présents dans le sang humain a été indispensable pour la compréhension de la pathologie de l'hémophilie et d'autres troubles hémorragiques héréditaires. En même temps, la mise au point de schémas de fractionnement du 30 plasma pour l'obtention de quantités intéressantes de concentrés de facteurs de coagulation a permis à la science médicale d'utiliser les concentrés de facteurs de coagulation comme outils thérapeutiques dans le trai-, tement de troubles hémorragiques. En particulier, la j 35 thérapie par transfusion utilisant des concentrés de / ,y 7 .

i

Facteur VIII et ce Facteur IX s'est révélée tout à fait satisfaisante à appliquer à des patients hémophiles. Malheureusement, le risque ce transmission ce l'hépatite due à un grand nombre de donneurs de plasma nécessaires 5 pour la production commerciale ce concentrés de facteurs de coagulation demeure 1'inconvénient sérieux associé à ce mode de thérapie. Un schéma représentatif eu fraction-’ nement de plasma, révélé dans Seminars in Thrombcsis and

Hemostatis, volume VI, N° 1, page 4 (1979), donne un 10 cryoprécipité et un liquide surnageant, la première fraction constituant une source à la fois de concentré de * Facteur VIII et de fibrinogène et la seconde fraction constituant une source de concentré de Facteur IX en plus des concentrés de Facteurs II, VII et I. Comme Gerety et 15 Eyster l'ont démontré dans "Hepatitis Amonç Kemophiliacs", Non-A, Non-B Hepatitis, pages 103-106 (1981), le virus de l'hépatite B initialement présent dans le plasma entier est distribué aux dérivés Facteur VIII et Facteur IX pendant le processus de fractionnement du plasma. Comme 20 démontré également par Maynard et Bradley dans "Transmission by Blood Products", Non-A Non-B Hepatitis, pages 78-79 (1981), le virus de l'hépatite non-A, non-B existe dans les deux dérivés Facteur VIII et Facteur IX. Des tentatives antérieures de traitement thermique de con-25 centrés de facteurs de coagulation en solution en vue d'inactiver le virus de l'hépatite ont également été inefficaces. Toutefois, le développement de techniques ; de lyophilisation de facteurs de coagulation a ouvert une voie nouvelle d'exploration en ce gui concerne la 30 stabilisation de facteurs de coagulation au cours du

procédé de traitement thermique, établissant à son tour un moyen d’inactivation du virus de l'hépatite présent / dans les facteurs de coagulation sans détruire l'activité de ces facteurs. f J

H

ί-\

On s'est procure auprès de plusieurs fabricants des échantillons par paires ce diverses fractions lyophilisées de plasma, chacune de ces paires portant des numéros de lot identiques. Les échantillons pesaient généralement 5 moins de 100 g et avaient été conditionnés dans ces fioles ayant des volumes ce 60 à 90 ml. Un échantillon ce chaque paire a été chauffé, soit par disposition de la fiole à échantillon dans un bain-marie ou dans une étuve à une température prédéterminée à la pression du laboratoire 10 pendant une période prédéterminée, soit en plaçant la matière lyophilisée elle-même dans une étuve sans que la fiole soit présente. L'échantillon restant de chaque paire a servi de témoin et a été réfrigéré à 4-6 °C pendant· le processus de traitement à la chaleur. Après le traitement 15 thermique, les échantillons témoins et les échantillons lyophilisés traités à la chaleur ont été reconstitués avec de l'eau stérilisée. La reconstitution a été effectuée d'une manière générale conformément aux spécifications du fabricant, bien que la solubilité de certains échan-; 20 tillons traités à la chaleur $it été notablement améliorée j par l'augmentation de la quantité d'eau stérilisée utilisée î | pendant la reconstitution par rapport à la quantité recom- ï mandée par le fabricant. Des titrages in vitro de Facteur i i VIII et de Facteur IX ont été effectués en utilisant une I 25 méthode fibrinométricue manuelle directe à des dilutions comprises entre 1:40 et 1:400 pour obtenir une mesure ί d'activité de coagulation du Facteur VIII et du Facteur : . IX. La récupération in vitro de fibrinogène après recons- I titution des échantillons témoins et des échantillons de 30 fibrinogène lyophilisé traités à la chaleur a été mesurée d'une façon similaire. Dans certains des essais, on a observé pour des fractions de plasma reconstituées la transmission de la lumière à 580 nm à l'aide d'un spectrophoto-| mètre Beckman Modèle 25. Une électrophorèse sur gel j | 35 d'agarose, avec une plaque d'immuno-électrophorèse ICL/ / j y'.

/ a été effectués peur plusieurs des paires d'échantillons ; de Facteur VIII et de Facteur IX Ά utilisant comme , substance de référence un sérum ce chèvre anti-humain ' de la firme Hyland Diagnostics. Les claques ont été j 5 exposées à une électrophorèse spécifique au moyen d'une Ί source d’éneraie Buchler réclée à 25 irA, rendant 35 minu- i| tes. Au terme de l'électrophorèse, on a fait incuber les j 1 ' plaques dans des anti-sérums pendant 18 à 24 heures et

If on les a examinées en lumière indirecte. On a effectué }| 10 une électrophorèse Panagell au moyen d'une plaque de J la firme Worthington Diagnostics sur d'autres paires ! c d'échantillons de concentré de Facteur VIII en utilisant j| une cellule électrophorétique Biorad refroidie à l'eau.

I D'autres essais in vitro ont été effectués 15 par chauffage d'échantillons lyophilisés de concentré I de Facteur VIII au bain-marie à la temoérature ambiante Îf| j! et à des températures prédéterminées pendant des durées : ! prédéterminées. On a ensuite titré le Facteur VIIÏ^ en j j utilisant la méthode décrite par Laurell dans "Electro- 20 immuno Assay”, Ihe Scandinavian Journal of Clinical and

Laboratory Investigation, volume 29, pages 21-37 (1972).

; On a calculé les résultats concernant le Facteur VIII

; pour des dilutions à 1:40, 1:80, 1:100 et 1:200 en re- j présentant graphiquement la variation de la hauteur des j 25 pics de la courbe de Laurell en fonction du pourcentage ! de dilution. Les inconnues ont été exprimées par un : pourcentage de la normale sur la base des hauteurs de i _ pics des inconnues dans la courbe de référence.

j On a mesuré la récupération in vivo d'activité 30 des facteurs de coagulation pour les ceux concentrés,

i| traités à la chaleur, de Facteur VIII et de Facteur IX

! par injection‘de concentrés lyophilisés, traités à la ! chaleur et reconstitués, de Facteur VIII et de Facteur IX, * resoectivement, à des chiens atteints d'hémophilie A et / 1 / I 35 d'hémophilie B. Un concentré de Facteur IX Ivoohilise / / i 4f ! ' traité à la chaleur a aussi été injecté à un chien témoin.

Les paramétrés de xaDoratoire comprenant Kct, la protéine sérique, WBC, le nombre de plaquettes, 1 * étalement ce | sang, le rythme respiratoire, la température du corps, ! 5 les pulsations et l'activité des facteurs de coagulation \ ont ensuite été déterminés pour chacun des animaux à ,i divers intervalles à la suite des injections.

j jj · Les résultats des essais in vitro portant sur ' le concentré de Facteur VIII sont reproduits sur les 10 tableaux I et II :

» TABLEAU I

| 1 Mesures de l'activité du facteur de coagulation après

ij traitement à la chaleur d'un concentré de Facteur VIII

; _lyophilisé_ j i5 Lot Température Durée Dilution Activité, % ij * I A C-1081 Témoin -- 1:20 jj C-1081 Témoin — 1:40 Une réduction S d'activité H d'environ 10 %, s 20 C-1081 Témoin — 1:80 par rapport au j , témoin a été |j fipop 10 h i.20 observée pour !j 60 C 10 n - les échantillons j| " " " 1:40 traités à la f „ „ ,, 1;80 chaleur t; | 25 A NC-8247 Témoin — 1 :40 1438 I ·* » — 1 :80 1697 Ü I " 62 °-64 °C 16,33 h 1:40 1215 i * « " ” 1:80 1360 ij j , B AHF-355 Témoin — 1:40 1912 !30 " " — 1 :80 1600 1:160 1312 I ’ *' 64°C 20 h 1 :40 1080 I «' « " 1 :80 1072

Ij " 74°C 17 h 1 :40 1144 jj 35 " " " 1 :80 1024 j : » « " 1 :160 864 ri ί a / * i- ! TABLEAU I (Suite)

Bot Température Duree Dilution Activité, % IB AHF-355 76 °C 17 h 1 :40 1 04 0 " " " 1:80 976 5 B 347 Témoin — 1:100 1180 " " — 1:200 100 " S3°C 24 h 1:100 100 " " " 1:200 100 " 85°C 24 h 1:100 1 ' 10 " 95°C 7 h 1:100 1 " 97°C 7,5 h 1 :200 1 C Al-0470 Témoin — 1:100 912 " 75°C 20 h 1:100 2076 I C Al-1080 Témoin — 1:200 2080 | 15 " -- 1:400 1920 I " 80°C 24 h 1 :200 1380 J " " " 1:400 1360 | C Al-1120 Témoin — 1 :40 2800 |· " ” -- 1 :80 2032 I 20 " 78 °C 21 h 1 :40 1592 I " " " 1:80 1392 I " 80 °C 20 h 1:40 1176 I" " " 1:80 1600 90°C 12 h — Spécimen 25 coagulé " 100°C 1,5 h 1:40 1248 I " " " 1:80 1264 C Al-1150 Témoin — 1 :40 2176 " " — 1:80 2480 j 30 " " — 1:100 1870 ! " 65 °C** 26,33 h 1 :40 1592 " " 1:80 1520 I " 83°C 24 h 1 :100 730 ” " " 1 :200 620 / i 35 " 85°C 24 h 1 :100 1000 f j | Uj I / - ij.

10 TABLEAU I (Suite) L°t Température Durée Dilution Activité, % C Al-1150 85°C 24 h 1:200 1160 :i " 3 0 °C 10 h 1:40 1032 ' j :j 5 " " " 1:80 1056 Î" 9 5°C 7 h — Spécimen coagulé " 97°C 7,5 h 1:100 80 ! « « " 1:200 100 10 " 100°C 10 h 1:40 88 « " " 1:80 48 il . C Al-1160 Témoin -- 1 :100 3680 ! * " — 1 :200 3420 ·' — 1 :400 3200 jj 15 " 78°C 24 h 1 :100 2420 | " " " 1:200 1520 !> " " " 1 :400 1440 " 78°C 24 h 1:200 1720 " " 1:400 1680 20 " 80°C 22 h 1 :200 1400 " " " 1:400 1360 " 100°C 7 h 1:200 1760 j! " " " 1 :400 1760 | C Al-2120 Témoin — 1:100 . 86 ! 25 " 110°C**** 1,5 h 1:100 18 j C Al-2531 Témoin — 1:200 3500 i ” " 1:400 2700 i « 85°C 20 h 1:200 46 ; ^ " " " 1:400 43 30 Remarque : Tous les temps et toutes les températures sont approximatifs. Après traitement thermique à des 1 températures élevées, des quantités d'eau stéri lisées en excès par rapport aux recommandations i 35 du fabricant ont été ajoutées à certains concen trés jusqu'à ce que la solubilisation ait été . confirmée visuellement- f « * Les lots A ont été fabriqués par la firme - fj ; Cutter Laboratories ; j f.

: y ·

TjOc lots 3 O7’"'· t ét"3 ^UP-fqUaS par ia Cj-Pme Michigan Red Cross ;

Les lots C ont été fabriqués par la firne Alpha Theraoeutics.

5 ** Traitèrent therr.iÇte à l'étuve (échantillon retiré de la fiole)· *** Traitement therrr.içts sn etuve (ecnantillon contenu dans la fiole).

TASLSAU I1 -10 Titrage du Facteur VIlIj« après traitement thermique d'un concentré de Facteur VIII lyophilxsé

Lot Température Durée Dilution Hauteur Activité de pic en Ag, _ (mm)__%_ 15 B AHF-355 Témoin — 1 :40 35 3720 » « __ 1 :80 22 4080 « 64°C 20 h 1:40 39 4240 ·· " " 1 :80 26 5120 « 74°C 17 h 1 :40 40 4400 20 " " " 1:80 26 5120 C Al-1120 Témoin — 1:100 15 4700 « 90°C 12 h 1:100 0 0 C Al-1150 Témoin — 1:200 13 7200 « 83°C 24 h 1:200 12 6200 25 " 85°C 24 h 1 :200 15 9400 " 97°C 7,5 h 1 :200 0 0

Remarque : Tous les temps et toutes les températures sont exprimés par des valeurs approchées. Après traitement thermique à des températures élevées, 30 des quantités d'eau stérilisée en excès par rapport aux recommandations du fabricant ont été ajoutées à certains concentrés jusqu'à ce que la solubilisation ait été confirmée visuellement.

35 * Les lots B ont été produits par la Michigan /

Red Cross ; les lots C ont été produite par / Alpha Therapeutics. j Λ 1- η -~·

TjÆc -résultats de l'essai portant sur le concentré de Facteur IX sont récapitulés sur le tableau III : tr·’ pp£0” 121 ; Mesures ce 1 'activité du facteur ce coagulation après

I 5 traitement thermique c’ur. concentré ce Facteur IX

lyophilisé

Lot Tem.uérature Durée Dilution Activité, % * A 9-C0044 Témoin — 1:40 616 10 " " — 1:80 1200 « « — 1 :200 2400 « — 1 :400 3520 " 100°C 4 h 1:40 520 1:80 1104 \ ' 15 " 100°C 12 h 1:200 1680 ! « « " 1:400 2480 | " 110°C* 13 h 1r400 1640 ! « '·** " 1 :800 2560 \ " 122°C 12 h 1 :200 340 ! 20 " "** " 1:400 480 I " 132°C 12 h 1 :200 12 ) I " «** " 1:400 24 ! I A NC9055 Témoin — n/a 2600 [ " 100°C 0,5 h n/a 2350 | 25 Remarque : Tous les temps et toutes les températures sont [ exprimés par des valeurs approchées. Après traitement thermique à des températures élevées, | des quantités d'eau stérilisée en excès par , - rapport aux recommandations du fabricant ont 30 été ajoutées à certains concentrés jusqu'à ce i ' - que la solubilisation ait été confirmée visuel- i | lement.

| * Les lots A ont été produits par les Cutter J

: Laboratories. „ / b' f / • 35 ** Traitement thermique en étuve. / h j \jf 13

Les résultats de l'essai portant sur un concentré ï de fibrinogène sont reproduits sur le tableau IV : ji Fibrinogène recueilli après traitement thermique d'un jj 5 concentré ce fibrinogène sous la forme lyophilisée i Lot Tenoérature Durée Dilution Fibrinoaène j - ...-.

I recueilli | _ _ _ _ (mg/dl) S *D-003678 Témoin — 1:20 400 10 " M — 1 :40 680 “ ' " 60°C 10-11 h 1:20 660 J " ” " 1:40 680 | " Témoin — 1:10 195 I " " -- 1:20 760 15 " " -- 1:40 700 \ " 60°C 10 h 1:10 105 ? " ” " 1:10 225 i " " " 1:20 250 " 60°C 17 h 1:10 190 20 " " " 1:20 220 *E Témoin — 1 :40 1280 ! " " -- 1:80 1280 | " 60 °C 10 h 1 :40 1520 I" " " 1:80 1320 25 " 60°C 10 h 1 :40 1860 " " " 1:80 1520 " 65°C 10 h 1 :40 1640 " " " 1:80 1400 *E 65°C 23 h 1 :40 1420 30 " " " 1:80 1320 " Témoin — 1 :40 1048 " " -- 1:80 1064 " 100°C 3 h 1:40 788 " " " 1:80 784 j Π . 35 " 123,3°C** 3 h 1:5 133 / / j 11/ uf il

Remarque : Tous les temps eu toutes les températures sort exprimés par des valeurs approchées. Après traitement thermique à des températures élevées, des quantités d'eau stérilisée en excès par .

5 rapport aux recommandations du fabricant ont été ajoutées à certains concentrés jusqu'à ce que la solubilisation ait été confirmée visuellement.

* Lots D produits par la firme Cal Biochem ; TO Lots E produits par la firme Kabi.

** Traitement thermique en étuve (échantillon en fiole).

Commentaires sur des résultats d'essai choisis

Les résultats récapitulés sur les tableaux I à 15 IV peuvent être confrontés en vue d'obtenir une indication relative de la rétention d'activité de coagulation et de la proportion recueillie de fibrinogène dans des fractions de plasma lyophilisées exposées au procédé de traitement thermique de la présente invention. Plus particu-20 lièrement, on peut faire la moyenne des pourcentages d'activité ou des proportions recueillies mesurées à diverses dilutions de concentrés reconstitués de Facteur VIII, de Facteur IX et de fibrinogène pour des échantillons témoins individuels et on peut comparer les résultats 25 avec les moyennes, effectuées de façon similaire, de pourcentage d'activité ou de proportion recueillie mesurée dans des paires d'échantillons correspondants de concentrés de Facteur VIII, de Facteur IX et de fibrinogène traités thermiquement. Lorsqu'on effectue ces comparaisons, 30 on peut constater par exemple qu'un concentré de Facteur VIII lyophilisé obtenu auprès d'un fabricant (lot N° A C-1081) et chauffé à 60°C pendant 10 heures a retenu plus de 90 % de son activité en Facteur VIII de coagulation / in vitro,comparativement à un témoin non chauffé. Le con- j φ ; 35 centré de Facteur VIII traité thermiquement a montré en/ j (i / * / outre, après reconstitution, une absorption à 5S0 nm de 0,30, comparativement à une absorption ce 0,20 pour 1 'échantillon non chauffé, et il n'a montré aucune différence par rapport au témoin non chauffé apres une immunc-5 électrophorèse effectuée avec du sérum de chèvre anti-humain. Des concentrés reconstitués de Facteur VIII provenant d'un lot différent (lot N° A NC-8747) du même fabricant, qui avaient été chauffés sous la forme lyophilisée à 62-64°C pendant environ 16 heures, puis conservés 10 à 6°C pendant 7 jours, ont montré une récupération de plus de 80 % de l'activité en Facteur VIII de coagulation comparativement à un témoin non traité. Une augmentation globale de migration anodique par rapport au témoin non chauffé a été observée après immuno-électrophorèse vis-à-15 vis de sérum de chèvre anti-humain.

D'une façon similaire, lorsqu'un concentré de Facteur VIII lyophilisé provenant d'un second fabricant (lot N° C A1-1120) a été chauffé à environ 78°C pendant 21 heures, il a présenté une rétention in vivo de 62 % 20 l'activité de coagulation après reconstitution, com parativement à un témoin non chauffé. Un concentré de Facteur VIII reconstitué provenant au même lot du second fabricant, après traitement thermique sous la forme lyophilisée pendant 20 heures à environ 80°C, gardait encore 25 57 % d'activité de coagulation in vitro, comparativement à un témoin non chauffé, tandis qu'un Facteur VIII provenant du même lot du second fabricant, qui avait été préalablement chauffé sous la forme lyophilisée pendant une heure et demie à environ 100°C, gardait encore 52 % 30 d'activité de coagulation in vitro, comparativement à un témoin non chauffé. Lorsqu'un lot différent (lot N° C A1-1150) de concentré de Facteur VIII lyophilisé provenant du second fabricant a été traité thermiquement par le procédé de la présente invention, les taux de récupé- j 35 ration in vitro d'activité de coaculation comoarativemenif j i * 16 au témoin non chauffé ont varié de 67 S, pour une durée de traitement thermique de 26 heures et 20 minutes à 65°C, à 34 % pour un traitement thermique d'une durée de 24 heures à 33°C et à 55 % pour une durée de traite-5 ment thermique de 24 heures à 85cC. Des dosages d'antigène relatifs au Facteur VIII pour les deux échantillons de concentré de Facteur VIII traités thermiquement à 83°C et à 85°C, ont montré, respectivement, une baisse de 15 % et une baisse nulle des taux d'antigène. On doit 10 également remarquer qu'une solubilisation très améliorée du second échantillon de concentré de Facteur VIII traité . thermiquement a été obtenue par addition d'un volume compris entre 50 et 75 ml d'eau stérilisée à l'échantillon au lieu des 25 ml recommandés par le fabricant.

T5 Le traitement thermique d'échantillons lyophi lisés de Facteur VIII provenant d'un troisième fabricant (lot N° AHF-355) a confirmé les résultats observés pour les deux premiers fabricants. En fait, le traitement thermique du concentré lyophilisé de Facteur VIII du 20 troisième fabricant pendant 20 heures à 64°C a montré.

une récupération d'activité de coagulation de 61 %, comparativement à un témoin non traité, un traitement thermique du même concentré pendant 17 heures à 74°C a donné une récupération d'activité de coagulation de 63 % et un 25 traitement thermique du meme concentré pendant 17 heures à 76°C a donné une récupération d'activité de coagulation de 57 %. Les taux d'antigène relatif au Facteur VIII dans les échantillons reconstitués chauffés à 64°C et à 74°C n'ont pas montré d'abaissement, comparativement au niveau 30 du témoin non chauffé.

Un échantillon de concentré de Facteur IX lyophilisé provenant du premier fabricant (lot N° A 9-C0044) et immergé dans un. bain-marie à 100°C pendant 20-30 minu- / tes a donné une récupération in vitro essentiellement _ j r j 35 totale de l'activité de coagulation, comparativement s.

i * 17 témoin non chauffé. Le Facteur II et le Facteur VII se sont tous deux montrés stables pendant 2 heures après la reconstitution de 1'échantillon traité thermiquement, tandis que le Facteur IX a baissé c'environ 20 % dans 5 la période de 6 jours après la reconstitution. Des mesures d'absorption effectuées 2 heures après la reconstitution ont donné des valeurs de 0,006 à 0,007 à 580 nm aussi bien pour le témoin que pour l'échantillon traité thermiquement. Aucune différence visuelle n'a pu être appréciée 10 entre le concentré traité thermiquement et le témoin non chauffé, à la suite d'une immuno-électrophorèse du concentré de Facteur IX vis-à-vis de sérum de chèvre antihumain. D'autres échantillons de concentré de Facteur IX provenant du premier fabricant, qui avaient été, respec-15 tivement, traités à la chaleur sous la forme lyophilisée à 100°C pendant 12 heures et à 110°C pendant 13 heures, ont également montré une récupération totale d'activité de coagulation du Facteur IX, bien qu'une solubilisation totale du second échantillon ait nécessité un supplément 20 de 40 à 60 ml d'eau stérilisée, alors que le fabricant recommande un volume de 20 ml. Les résultats du tableau III suggère donc que le concentré de Facteur IX sous la forme lyophilisée est très stable thermiquement pendant 4 heures à des températures comprises entre 100 et 110°C.

25 Un échantillon de concentré de fibrinogène lyophilisé provenant d'un quatrième fabricant (lot N° D-0G3678) et traité thermiquement pendant 11 heures à 60°C n'a présenté aucune perte de fibrinogène in vitro comparativement à un témoin non chauffé. Un échantillon 30 de concentré de fibrinogène lyophilisé provenant du même fabricant, après traitement thermique pendant 17 heures à 60°C, a montré un taux de récupération du fibrinogène de 97 %, comparativement au témoin non chauffé. Dos échantillons de concentrés de fibrinogène lyophilisés / 35 provenant d'un cincuième fabricant (lot E) , chauffés, rez-f /7 ! 'î 13 pectivement, pendant 10 et δ3 neuves a éu°C er à 65°C, n’ont présenté aucune perte de rimnogene m vitro, comparativement au témoin non chautre, rancis qu'un échantillon de concentré de fibrinogène lyophilisé 5 venant du cinquième fabricant a presente une récupération de fibrinogène de 74 %, comparativement au témoin, après traitement thermique pendant 3 heures à 100°C.

Comme indiqué dans ce qui précède, on a effectué des essais in vivo en utilisant des concentrés de 10 Facteur VIII et de Facteur IX traités thermiquement, en utilisant des chiens déficients en facteur anti-hémophilique A ou Facteur VIII et en facteur anti-hémophilique B ou Facteur IX. On a administré au chien atteint d'hémophilie A le concentré reconstitué de Fac-15 teur VIII qui avait été préalablement traité à la chaleur sous la forme lyophilisée à 60°C pendant 10 heures, tandis que le chien atteint d'hémophilie B a reçu un concentré reconstitué de Facteur IX qui avait été préalablement traité à la chaleur à 100°C pendant 3 à 4 heures. Les 20 résultats de l'essai in vivo sont reproduits sur les / tableaux V et VI ci-après. /” j ‘l 1 î ! !

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Les résultats reproduits sur le tableau V illustrent amplement l'élévation prononcée d'activité de coaçu-!’ lation du Facteur VIII chez un chien atteint d'hémophilie ^ A après injection de concentré ce Facteur VIII traité ; 5 thermiquement. De même, les résultats reproduits sur le : tableau VI illustrent amplement la récupération de Facteur IX observée chez un chien atteint d'hémophilie B après ; injection de concentré de Facteur IX traité thermiquement.

L'absence évidente d'agression physiologique ou d'autre 10 réaction défavorable comme le font apparaître les résultats des tableaux V et VI suggère que les concentrés de j Facteur VIII et de Facteur IX qui ont été traités confor- jj mément aux étapes du procédé de l'invention restent biolo- >| giquement acceptables.

15 II a maintenant été démontré que des fractions de plasma telles que des concentrés de Facteur VIII et ; de Facteur IX de pureté variable pouvaient être traités thermiquement avec sûreté sous la forme lyophilisée à des températures élevées pendant des périodes prolongées sans 20 altération notable de l'activité de coagulation des concentrés. Il a en outre été démontré que des fractions de plasma telles qu'un fibrinogène de pureté variable pou-! vaient être traitées thermiquement avec sûreté sous la : forme lyophilisée à des températures élevées pendant des i 25 périodes prolongées sans altération des possibilités de récupération du fibrinogène. Des observations visuelles confirment que la solubilité de concentrés lyophilisés de Facteur VIII, de Facteur IX et de fibrinogène n'est : pas altérée par le traitement thermique du moment que la 30 quantité d'eau stérilisée ajoutée aux échantillons lyo-I philisés de concentré pendant la reconstitution peut être ! augmentée simplement jusqu'à ce que la solubilité totale ait été atteinte. En conséquence, un ajustement correct : ’ de la température de chauffage, de la longueur de chauf- / 35 fage et des niveaux de pureté appliqués permet g’inactiv*^ f ' *7 ο le virus de l'hépatite tant du type B eue gu type non-A, non-B dans des fractions de plasma tout en maintenant la viabilité et l'intégrité thérapeutique des fractions.

Etant donné en outre que le virus ce l'hépatite B et ; 5 vraisemblablement le virus ce l’hépatite non-A, non-B

i sont préférentiellement distribués dans les fractions de ·, - facteurs de coagulation, c'est-à-dire dans les concentrés I ‘4 j * de Facteur VIII et de Facteur IX, le traitement thernti- . if que des fractions de facteurs de coagulation sous la -¾ 10 forme lyophilisée, à des températures et pendant des durées convenables, peut également servir à rendre le virus de l'hépatite immunogène ainsi que non infectieux, i En conséquence, des concentrés de Facteur VIII et de ; i Facteur IX lyophilisés traités thermiquement et recons- Î15 titués peuvent fonctionner comme des vaccins contre l'hépatite, tout en offrant les avantages thérapeutiques | ,Mv§ autrement associés à des fractions de facteurs de coagu- I -1-1¾ lation.

i ;>! En outre, une extrapolation des résultats expé- hjâ» 20 rimentaux reproduits sur les tableaux I à VI montre à ' l'évidence que le procédé de la présente invention peut •hff être mis en oeuvre à un moment essentiellement quelconque J au cours du processus de fractionnement du plasma. En fait, à tout moment au cours du processus de fractionnement ' if 25 dans lequel un dérivé du plasma peut être lyophilisé, un | 1 Ψ traitement thermique du dérivé de plasma peut être effec- ! I tué et le dérivé peut être resolubilisé ou reconstitué I _j| avant la poursuite du processus de fractionnement. Ainsi, ! ï‘ par exerrrale, lorsoue le concentré de Facteur VIII provient i i ‘ , . 30 finalement d'un schéma de fractionnement de plasma du type i ·’·| décrit par Mammen et collaborateurs dans "Treatment of ÎBleeding Disorders with Blood Components", Reviews of

Hematology, volume 1, page 144 (1980), le cryoprécipité / . ï / I obtenu à partir de plasma fraîchement congelé, l'extrait / : '· ’‘S /* ! i i 35 clarifié obtenu à partir du crvoorécioité et la liqueur Λ • ' 1/ : · -7-¾ ! , βΓ *

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Ο - surnageante obtenue à partir de l'extrait clarifié peuvent tous être lyophilisés et traités thermiquement de la meme manière que le concentré de Facteur VIII lui-même.

Le choix d’un stade approprié dans le schéma de fraction-5 nement du plasma pour l'application du traitement thermique peut alors être basé sur des considérations pragmatiques telles que le coût ou la commodité.

L'inactivation de micro-organismes indésirables tels qu'un virus en relation avec SDIA, c'est-à-dire le 10, syndrome de déficit immunitaire acquis, le cytomégalovirus et le virus d'Epstein-Barr, compte parmi d'autres formes de réalisation de l'invention.

En outre, différentes techniques de déshydratation pourraient être appliquées à des compositions plas-15 matiques telles que des fractions de plasma, à savoir la déshydratation par pulvérisation ou la déshydratation sous vide.

L'addition d'eau stérilisée à du plasma anhydre ou lyophilisé à des degrés supérieurs aux volumes suggérés 20 par les fabricants crée des solutions de plasma de dilutions supérieures à la normale recommandée ; toutefois, l'efficacité du plasma et de ses constituants n'est pas notablement altérée. Cela est particulièrement utile lorsque les températures auxquelles la composition de 25 plasma doit être chauffée pour inactiver des microorganismes indésirables tels que des virus est si haute qu'une coagulation du plasma reconstitué aurait normale-, ment lieu si de l'eau stérilisée en excès n'était pas ajoutée.

30 Une application particulièrement importante du procédé de l’invention est le traitement de compositions enrichies en facteur anti-hémophilique (FAH). De telles compositions contiennent des concentrations en FAH sur la base du poids total des protéines" qui excèdent les i 35 concentrations trouvées dans le plasma ou dans d'autre^-/ L/ff ^ A.

fractions classiques de crciéines du plasma, corme le ' complexe de prothrombine (concentrés de Facteur IX), la gamma-globuline, l'albumine, le fibrinogène ou l'antithrombine III. D'aussi hautes concentrations en FAH sent 5 nécessaires pour assurer eue, lorsque les compositions sont dissoutes dans l'eau ou dans un autre support physiologiquement acceptable, elles puissent corriger suffisamment l'anomalie de coagulation présentée par le patient pour faire preuve d’un effet clinique favorable 10 sans nécessiter l'infusion d'eau en excès ou de protéines étrangères. Généralement, une dose thérapeutiquement efficace de FAH peut être aisément déterminée par l'homme de l'art. Elle dépend de l'état clinique du patient,· notamment du type d'hémorragie en question. Ordinairement, 15 une quantité suffisante de FAH doit être infusée pour produire un taux plasmatique de FAH chez le patient d'au moins 30 % de la quantité présente chez des individus normaux, bien que des taux de 50 % ou plus soient préconisés pour des hémorragies graves. L'opération peut être 20 effectuée par infusion d'un nombre total d'unités de FAH tel que défini par la formule :

Unités requises = poids corporel (kg) x 0,4 x élévation recherchée du taux de FAH (en % de la normale).

25 La concentration en FAH dans la solution infusée ne doit avantageusement pas dépasser 34 unités/ml, mais elle doit être supérieure à 15 unités/ml. Si la concentration dépasse 34 unités/ml, il ne faut pas infuser plus de 2 ml par minute. L'infusion effectuée avec moins 30 de 34 unités de FAH peut être conduite plus rapidement, de l'ordre de 10 à 20 ml en une période de 3 minutes.

Une unité de FAH est définie comme étant l'activité en ) FAH présente dans 1 ml de plasma humain normal recueilli / depuis moins de 1 heure. / j / ' > 25

Des compositions enrichies en FAH renferment ordinairement plus d'environ 20 unités de FAH, habituellement plus d'environ 300 unités de FAH par gramme de protéine. Evidemment, le produit est d'autant plus avan-5 tageux que la pureté du FA.H est plus grande. Des compositions contenant environ 100 à 2000 unités de FAH par gramme de protéine sont tout à fait réalisables du point de vue commercial.

Les compositions de FAH peuvent être débarrassées 10 d'autres protéines plasmatiques à des degrés divers au cours du processus de purification, selon le procédé utilisé. Ces protéines du plasma comprennent les enzymes de coagulation du sang (on entend désigner par là, dans le présent mémoire, à la fois les pro-enzymes inactifs 15 et les enzymes activés) comme le complexe de prothrombine ou concentré de Facteur IX (Facteurs II, VII, IX et X), les Facteurs XII ou XIII, le fibrinogène, l'albumine et la gamma-globuline. Lorsqu'une composition de FAH est essentiellement dépourvue d'enzymes de coagulation du 20 sang, elle contient des activités enzymatiques subthérapeutiques. Les compositions de FAH peuvent être purifiées à un degré auquel l'activité de tout enzyme de coagulation du sang est à l'état de traces, généralement moins d'environ 15 unités/g de protéine et de pré-25 férence moins d'environ 5 unités/g de protéine. Le rapport des unités de FAH à toute activité enzymatique unitaire individuelle dans lesdites compositions va ordinairement d'environ 10:1 à 500:1 et elle est avantageusement supérieure à 300:1. Une unité d'activité enzymatique pour 30 chacun des divers enzymes de coagulation sous leurs formes activées ou formes de pro-enzymes est définie dans PCT International Application WO 82/03871 (date de publication : 11 Novembre 1982).-

Les compositions de FAH iraité'es thermiquement / 35 dont il est question dans le présent mémoire sont prin/ / / * / 2 6 j cipalement administrées à ces patients atteints de défi- i [ cience concénitale en FAH. Ces patients ne parviennent: i * * t pas à synthétiser le facteur ar.ti-héncphilique bioloçiuue- | ment actif et on doit les distinguer de ceux qui portent 5 des inhibiteurs de FAH acquis (probablement des anticorps) qui déclenchent également les symptômes de l’hémophilie.

Les patients de ce dernier groupe sont avantageusement 7 traités avec des compositions d'enzymes de coagulation activés. Les compositions d’enzymes de coagulation con-1 0 tiennent des quantités thérapeutiquement efficaces des enzymes. Toutefois, les compositions de l'invention ne renferment généralement pas ces quantités d'enzymes de coagulation du sang, mais s'appuient essentiellement sur l'activité en FAH pour l'hémostase.

15 Les compositions de FAH perfectionnées selon

l'invention contiennent de plus faibles quantités de FAH dénaturé qu4il n'en est produit lorsqu'on utilise des procédés antérieurs. Généralement, la quantité de FAH

(dénaturé est inférieure à environ 50 % du FAH actif et 20 dénaturé total de la composition. De préférence, cette quantité va d'environ 30 à 10 %. La quantité de FAH dénaturé équivaut au pourcentage de perte d'unités de FAH après que la composition de FAH infectée par un virus a été soumise au traitement thermique décrit dans 25 le présent mémoire.

L'effet du chauffage à l'état sec du FAH contaminé par un virus peut être suivi par le titrage de l'activité de coagulation du facteur anti-hémolytique comme décrit ci-dessus, et par la'détermination du titre 30 viral. Lorsqu'il est difficile de mesurer le titre viral biologiquement actif, comme dans le cas des virus de l'hépatite, on peut utiliser un virus concurrent tel que bactériophage, sindbi-s, adenovirus ou virus EHC, comme ‘décrit dans PCT International Application/ J 35 WO 82/03871 (date de publication : 11 Hoverir^^ s 2 7 1982}. Un titre prédéterminé du virus concurrent est inoculé à une solution de la composition devant être traitée à la chaleur, la solution est lyophilisée et divers traitements thermiques sont entrepris. On choisit 5 le stade où des mesures réelles ou l'analyse par régression (extrapolation statistique) indiquent le degré désiré d'inactivation virale, comme conditions qui régissent le traitement thermique du produit. Ces conditions sont généralement la durée et la température de l'inactiva-; 10 tion virale, bien que la teneur en humidité de la compo- I sition constitue également une variable qui doit être I maîtrisée. La durée et la temoérature sont commentées I “ I ci-dessus. La teneur en humidité doit être inférieure à I 5 % en poids, ordinairement inférieure à 1 % en poids.

15 Bien qu'une certaine inactivation et une cer taine dénaturation du FAH ait lieu au cours du procédé de chauffage à l'état sec, elles apparaissent moins rapidement que l'inactivation des virus concurrents les plus virulents ou que le virus de l'hépatite. Par consé-20 quent, la composition de FAH infectée peut être rendue sensiblement dépourvue du virus sous la forme infectieuse. Cela signifie que le titre du virus est réduit à un point tel que l'infusion de quantités thérapeutiques du produit dans plusieurs hôtes animaux normaux pour le virus ne 25 parvient pas à faire apparaître de signes cliniques ou sérologiques d'infection dans une population d'hôtes ou retarde notablement la déclaration de l'infection dans une telle population. Lorsqu'une épreuve équivalente de culture de tissu est disponible pour déterminer l'infec-30 tivité biologique, on peut l'utiliser à la place d'hôtes animaux normaux comme indice de pouvoir infectieux.

Le procédé de chauffage modéré à l'état sec selon l'invention maintient la quasi-totalité de l'antigénie des micro-organismes infectieux, c-'est-à-dire que J 35 les sites épitopicrues sur les micro-orcanismes ne sont paé/ // 28 ! ! j dénaturés de façon irréversible. Cela est en contraste | avec d'autres crocédés impliquant ces réactions de cova- r lence avec des substances chimiques, l'emploi de rayons fortement énergétiques ou un chauffage excessif.

| 5 L'opération de chauffage peut être conduite en i récipient clos ou ouvert, corne indiqué ci-dessus, et i elle est mise en oeuvre de la façon la plus efficace par | . des techniques simples et peu coûteuses telles qu'un chauffage par contact des récipients contenant le produit, ! , = 10 par exemple dans des étuves ou dans des bains-marie ou des bains de sable, ou par irradiation infrarouge. On évite par sécurité et pour des raisons de prix de revient le chauffage par micro-ondes.

Plusieurs formes de réalisation de la présente 15 invention ont été illustrées dans ce qui précède. Toute-I fois, il y a lieu de remarquer que diverses modifications I en ce qui concerne les plages de températures, les périodes de chauffage et les degrés de pureté indiqués à propos des formes de réalisation mentionnées ci-dessus peuvent être .

20 apportées par l'homme de l'art sans sortir du cadre de / là présente invention. /y 7 / f t ' t

X

Claims

1. Procédé de traitement d'une composition pra tiquement anhydre comprenant le Facteur VIII pour réduire ; ou éliminer le pouvoir infectieux des micro-organismes j 5 présents dans la composition, caractérisé en ce qu'il s consiste à chauffer la composition pendant une période prédéterminée à une température prédéterminée suffisante j . pour réduire ou supprimer le pouvoir infectieux des micro- j: ! organismes. j , 10 2. Procédé de traitement d'une composition pra- itiquement anhydre renfermant le Facteur VIII pour réduire ou supprimer le pouvoir infectieux des micro-organismes 1 présents dans la composition, caractérisé en ce qu'il i | consiste à chauffer la composition pendant une période I 15 prédéterminée à une température prédéterminée suffisante Ipour réduire ou supprimer le pouvoir infectieux des micro-^ organismes tout en retenant la quasi-totalité de l'anti- j| génie des micro-organismes infectieux. j| 3. Procédé de traitement d'une composition prati- 2. quement anhydre renfermant le Facteur VIII pour réduire 1 ou supprimer le pouvoir infectieux des micro-organismes '1 présents dans la composition, caractérisé en ce qu'il N j consiste à chauffer la composition pendant une période | prédéterminée à une température prédéterminée suffisante I 25 pour inactiver les micro-organismes présents dans la compo sition, et à ajouter de l'eau stérilisée à la composition une fois terminée ladite opération de chauffage jusqu'à !ce que la solubilisation de la composition ait été pratiquement atteinte.

4. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- Îtions 1, 2 et 3, caractérisé en ce que la composition est une fraction.

5. Procédé suivant l'une quelconque des revendica-J tions 1, 2 et 3, caractérisé en ce que la composition est 3. chauffée par un procédé autre que l'irradiation par f / // i micro-ondes.

6. Procédé suivant l’une quelconque des revendica tions 1, 2 et 3, caractérisé en ce que le chauffage est effectué par contact avec une substance chauffée ou par 5 irradiation infrarouge.

7. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- ; tions 1, 2 et 3, caractérisé en ce que la composition est j „ un cryoprécipité.

8. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- i . - 10 tions 1, 2 et 3f caractérisé en ce que la composition est j la liqueur surnageante anhydre d'un cryoprécipité,

9. Procédé suivant l'une des revendications 1 et I; 2, caractérisé en ce qu'il comporte la reconstitution de i-j il la composition jusqu'à ce que la solubilisation de cette ίί >! 15 composition soit pratiquement obtenue après ledit chauffage | de la composition pendant ladite période prédéterminée l à ladite température prédéterminée. | .10. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- | tions 1, 2 et 3, caractérisé en ce que ladite composition I! 20 est un concentré du Facteur VIII et ladite température prédéterminée est d'au moins 60°C.

11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé ien ce que ladite température prédéterminée se situe dans une plage de 60 à 100°C.

12. Procédé suivant l'une quelconque des revendi cations 1 à 3, caractérisé en ce que ladite composition s comprend un concentré de Facteur IX et ladite température prédéterminée est d'au moins 100°C.

13. Procédé suivant la revendication 12, caracté-30 risé en ce que ladite température prédéterminée se situe dans une plage de 100 à 110°C. i ‘14. Procédé suivant l^.une quelconque des reven- Idications 1 à 13, caractérisé en ce que ladite composition/ comprend du fibrinogène. / j j Ί i /

15. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que ladite température prédéterminée se situe dans une plage de 60 à 125°C. :! 16. Procédé suivant l'une quelconque des revendi- :j 5 cations 1 à 15, caractérisé en ce qu'il consiste en outre y à lyophiliser la composition de manière à obtenir la compo- Isition pratiquement anhydre. . 17. Procédé suivant l'une quelconque des revendica tions 1, 2 et 3, caractérisé en ce que le pouvoir infectieux . 10 du micro-organisme est réduit ou supprimé uniquement par j j chauffage de la composition.

18. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- I tions 1, 2 et 3, caractérisé en ce que le pouvoir infectieux du micro-organisme est réduit ou supprimé par chauffage 15 de la composition.

19. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1, 2 et 3, caractérisé en ce que la composition est essentiellement dépourvue d'enzymes de coagulation du sang.

20. Procédé suivant la revendication 19, caracté risé en ce que la composition est essentiellement dépourvue de FacteursII, VII, IXj X, XII et XIII ou de leurs formes activées.

21. Procédé suivant la revendication 20, caracté-25 risé en ce que la composition contient moins d'environ 15 unités de l'un quelconque des Facteurs II, VII, IX, X» XII ou XIII ou de leurs formes activées, par gramme de protéine. I22. Procédé suivant la revendication 18, caracté-30 risé en ce que le pouvoir infectieux du micro-organisme n'est pas réduit ou supprimé par l'action d'un gaz toxique quel qu'il soit.

23. Procédé suivant la revendication 18, caracté- risé en ce que la comoosition est dépourvue d'une concen- r / 35 tration thérapeutiquement suffisante d'enzyme de coagulation ! I du sang.

24. Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce que la composition contient des unités anti-hémophiliques de tout enzyme de coagulation du sang dans ; 5 un rapport d'environ 10:1 à 500:1. ;i 25. Procédé suivant l'une quelconque des revend!- IJ cations 1 a 24, caractérisé en ce que le micro-orqanisme !l û . est un virus. S , || 26. Procédé suivant la revendication 25, caracté- il | - 10 rise en ce que le virus est tout virus de l'hépatite.

27. Procédé suivant la revendication 26, caracté- | risé en ce que le virus est un virus humain de l'hépatite.

28. Procédé suivant la revendication 26, caracté- I risé en ce que le virus est celui de l'hépatite B ou I 15 l'hépatite non-A, non-B. y ^ ^

29. Procédé de traitement d'une fraction de plasma I contenant le Facteur VIII pour inactiver quasi-totalement I tout virus de l'hépatite présent dans la fraction, caracté- | risé en ce qu'il consiste à lyophiliser la fraction du ir; I 20 plasma pour accroître sa stabilité thermique et à chauffer ! * la fraction de plasma lyophilisé pendant une période I prédéterminée à une température prédéterminée suffisante | pour rendre inactif le virus de l'hépatite présent dans l la fraction de plasma. j 25 30. Procédé de traitement d'une fraction de plasma I pour inactiver quasi-totalement tout virus de l'hépatite présent dans la fraction du plasma, caractérisé en ce qu'il consiste à lyophiliser la fraction de plasma pour accroître sa stabilité thermique, à chauffer la fraction Î30 de plasma lyophilisé pendant une période prédéterminée à une température prédéterminée suffisante pour inactiver Ile virus de l'hépatite présent dans la fraction de plasma, et à ajouter de l'eau stérilisée à la fraction de plasma *1 ) |! lyophilisé une fois terminée cette opération de chauffage / h / 3. jusqu'à ce que la solubilisation de la fraction lyophili^e^ S / £ de plasma soit pratiquement obtenue.

31. Composition contenant des micro-organismes inactivés et au moins le Facteur VIII, caractérisée en que lesdits micro-organismes ont été inactivés par un 5 procédé qui consiste essentiellement à chauffer la composition dans un état pratiquement anhydre pour inactiver lesdits micro-organismes, ladite composition étant pratiquement dépourvue de la forme infectieuse active des microorganismes et ledit Facteur VIII étant principalement » · 10 actif.

32. Composition suivant la revendication 31, caractérisée en ce que le micro-organisme inactivé est un virus.

33. Composition suivant la revendication 32, 15 caractérisée en ce que le virus est tout virus de l'hépatite.

34. Composition suivant la revendication 33, caractérisée en ce que le virus de l'hépatite est le virus de l'hépatite B ou de l'hépatite non-A, non-B.

35. Composition suivant l'une quelconque des 20 revendications 31 à 34, caractérisée en ce qu'elle est pratiquement anhydre.

36. Composition suivant la revendication 35, caractérisée en ce qu'elle est lyophilisée.

37. Composition suivant la revendication 35, 25 caractérisée en ce qu'elle est un cryoprécipité.

38. Composition suivant la revendication 35, caractérisée en ce qu'elle est la liqueur surnageante anhydre d'un cryoprécipité.

39. Composition suivant l'une quelconque des reven-30 dications 31 à 34, caractérisée en ce qu'elle est solubilisée dans de l’eau stérilisée.

40. Composition suivant l'une quelconque des revendications 31 à 39, caractérisée en ce qu'elle comprend/ un concentré de Facteur VIII. T

41. Composition suivant l'une quelconque des revendications 31 à 40, caractérisée en ce qu'elle comprend un concentré de Facteur IX. : 42. Composition suivant l'une quelconque des 5 revendications 31 à 41, caractérisée en ce qu'elle comprend I du fibrinogène, ï

43. Composition lyophilisée, contenant un virus non infectieux de l'hépatite B et au moins le Facteur VIII, caractérisée en ce qu'elle est quasiment dépourvue dudit ; 10 virus sous la forme infectieuse, ledit Facteur VIII étant ; principalement actif.

44. Composition lyophilisée, contenant le virus I non infectieux de l'hépatite non-A, non-B et au moins ] le Facteur VIII, caractérisée en ce que ledit virus a 15 été rendu non infectieux par une opération consistant essentiellement à chauffer le virus jusqu'à ce qu'il soit J inactivé, ladite composition étant pratiquement dépourvue ! I dudit virus sous la forme infectieuse et ledit Facteur VIII étant principalement actif.

45. Procédé de désactivation d'un virus dans une composition qui contient au moins un facteur anti-hémophilique et qui est suspectée de contenir un virus infectieux, caractérisé en ce qu'il consiste à chauffer I ^ ! essentiellement la composition dans un état anhydre I 25 jusqu'à ce que le virus ait été inactivé. il 46. Procédé de traitement d'une composition anhydre ;| ‘ contenant le facteur hémophilique purifié au moins jusqu'à jf une plus grande activité en facteur anti-hémophilique ! - par unité de poids de protéine que la concentration dudit f 30 facteur dans le olasma humain normal, et suspectée de V J; :i contenir un virus infectieux, procédé caractérisé en ce f qu'il consiste à chauffer la composition à l'état anhydre 1 jusqu'à ce que le virus ait été inactivé. ί 47. Procédé suivant la revendication 46, caracté-/ i , / I 35 risé en ce que le virus est tout virus de l'hépatite. ^ / I il j η. i!

48. Procédé suivant la revendication 46, caractérisé en ce que le titre en virus infectieux n'est pas prédéterminé.

49. Procédé suivant la revendication 46, caracté-5 risé en ce que la composition est dépourvue de micro- organismes cellulaires.

50. Composition contenant un virus non infectieux ; et un facteur anti-hémophiligue, caractérisée en ce que ledit virus a été rendu non infectieux par un procédé » 10 consistant essentiellement à chauffer le virus jusqu'à ce qu'il ait été inactivé, ladite composition étant pratiquement dépourvue dudit virus sous la forme infectieuse et le facteur anti-hémophilique étant sous la forme dénaturée.

51. Composition suivant la revendication 50, 15 caractérisée en ce qu'une proportion de moins d'environ 50. du facteur anti-hémophilique est sous la forme dénaturée.

52. Composition suivant la revendication 51, caractérisée en ce qu’une proportion d'environ 30 à 10 % 20 du facteur anti-hémophilique est sous la forme dénaturée.

53. Composition contenant un virus non infectieux et renfermant au moins le Facteur VIII purifié au moins jusqu'à une plus grande activité en facteur anti-hémophilique par unité de poids de protéine que la concen- 25 tration dudit facteur dans du plasma humain normal, caractérisée en ce qu'elle est quasiment dépourvue dudit virus sous la forme infectieuse et dudit facteur sous la forme dénaturée.

54. Composition caractérisée en ce qu'elle 30 comprend un virus non infectieux et une quantité thérapeutiquement efficace de Facteur VIII, et en ce qu'elle est quasiment dépourvue dudit virus sous la forme infectieuse et du Facteur VIII sous la forme dénaturée.

55. Composition suivant la revendication 54, j 35 caractérisée en ce que le Facteur VIII est présent evf/ Ί- i » uns quantité supérieure à environ 20 unités par gramme de protéine contenue dans la composition.

56. Composition suivant la revendication 55, ) caractérisée en ce que le Facteur VIII est présent en 5 une quantité d'environ 100 à 2000 unités par gramme Ide protéine présent dans la composition.

57. Procédé pour inactiver un virus dans une i| composition comprenant au moins le Facteur VIII en une ! quantité thérapeutiquement efficace, caractérisé en ce _ 10 qu'il consiste à chauffer la composition à l'état anhydre 3. jusqu'à ce que le virus soit inactivé. Î58. Vaccin contre l'hépatite, caractérisé en ce qu'il comprend la composition d'une quantité efficace . du point de vue immunogène de virus de l'hépatite inactivé 15 dans une fraction de plasma sanguin en association avec J un véhicule correspondant.

59. Vaccin contre un virus indésirable, caracté- I risé en ce qu'il comprend la composition d'une quantité | efficace du point de vue immunogène d'un virus inactivé J 20 dans une fraction de plasma sanguin en association avec | un véhicule correspondant. * i I Dessins : —planches ! __.âfe... pages dont -.....Λ— page de garde 1 ,.....:¾¾.... pages de description !_ .3...... pages de revendications abrégé descriptif Luxembourg, le t3 MA11983 I Charles München t j i j i