FR2526660A1

FR2526660A1 - Procede de traitement thermique d'une fraction de plasma, produit obtenu et composition pharmaceutique le contenant

Info

Publication number: FR2526660A1
Application number: FR8308000A
Authority: FR
Inventors: Alan Rubinstein
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Current assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 1982-05-13
Filing date: 1983-05-13
Publication date: 1983-11-18
Also published as: AU568979B2; GB2144428B; ES8505821A1; US4456590B1; ES535745A0; ES522310A0; ES8601701A1; EP0094611A2; IE831068L; CH665125A5; GB2120254B; EP0094611B1; AU569428B2; ATA176783A; ES538802A0; DK210283D0; AR230186A1; US4456590B2; BE896724A; MX172861B

Abstract

L'INVENTION A TRAIT AU DOMAINE DE LA CHIMIE DES MEDICAMENTS. LE TRAITEMENT THERMIQUE DE COMPOSITIONS ANHYDRES, PAR EXEMPLE LYOPHILISEES, DE PLASMA, NOTAMMENT DE FRACTIONS CONTENANT DES CONCENTRES DU FACTEURVIII, INACTIVE DES MICRO-ORGANISMES INDESIRABLES TELS QUE TOUT VIRUS D'HEPATITE. LA RECONSTITUTION SUBSEQUENTE EST EFFECTUEE PAR ADDITION D'EAU STERILISEE JUSQU'A SOLUBILISATION. ON OBTIENT DES PRODUITS UTILES EN THERAPEUTIQUE ET POUR LE DIAGNOSTIC, PERMETTANT PAR EXEMPLE LA TRANSFUSION DE PLASMA A DES HEMOPHILES SANS CRAINTE DE TRANSMISSION DE L'HEPATITE.

Description

La présente invention concerne dans son ensemble du plasma traité par la

chaleur L'invention est axée en particulier sur des fractions traitées thermiquement qui peuvent être chauffées sous la forme lyophilisée en vue de l'inactivation de micro-organismes et virus indésirables tels que le virus de l'hépatite, qui sont présents dans

les fractions.

L'utilisation de concentrés de facteurs de coagu-

lation obtenus à partir de plasma sanguin fractionné, en vue d'intervenir thérapeutiquement dans des troubles hémorragiques héréditaires tels que l'hémophilie, est gravement compromise comme conséquence du risque considérable que présente pour le patient hémophile la présence du virus de l'hépatite dans les concentrés Par exemple, les

concentrés de Facteurs VIII et IX du commerce sont norma-

lement utilisés pour accrottre la capacité de coagulation du sang d'un patient hémophile, mais ces concentrés sont préparés à partir de plasma rassemblé après prélèvement sur des milliers de donneurs et ils comportent le risque

inhérent d'hépatite d'un même nombre de transfusions uni-

taires individuelles Comme McCullen et Zuckerman l'ont montré (voir Journal of Medical Virology, volume 8, N O 29

( 1981)>, malgré la sélection rigoureuse de donneurs indi-

viduels pour les antigènes de surface de l'hépatite B (H Bs Ag), ces plasmas rassemblés transmettent manifestement

à la fois l'hépatite B et l'hépatite non-A, non-B.

La transmission de l'hépatite par l'albumine et par d'autres composants du plasma stables à la chaleur sans relation avec la coagulation sanguine a été empêchée jusqu'à présent par chauffage des composants du-plasma en solution à des températures de 60 'C pendant 10 heures.

En revanche, il a été démontré que des tentatives simi-

laires de chauffage de concentrés de facteurs de coagula-

tion en solution réduisaient notablement ou éliminaient

l'activité des facteurs de coagulation dans les concen-

trés et ne paraissaient donc pas offrir une solution viable au problème de la transmission de l'hépatite lié au traitement classique de l'hémophilie Plus récemment,

un précipité de Facteur VIII hautement purifié a été-

dissous dans une solution de saccharose-glycine et chauffé pendant 10 heures à 600 C Bien que le concentré de Facteur VIII obtenu ensuite à partir du précipité chauffé conserve

effectivmnmt l'activité de facteur de coagulation, les rende-

ments obtenus en utilisant cette voie d'accès sont très faibles, par exemple d'environ 8 % (voir Heimburger et collaborateurs, Hemostatis, volume 10 (supplément 1), page 204 ( 1981) et Heimburger et collaborateurs, Blut, volume

44, pages 249-251 ( 1982).

En définitive, l'art antérieur n'offre aucun

moyen d'inactivation efficace du virus de l'hépatite pré-

sent dans des concentrés de facteurs de coagulation, pas plus qu'il n'enseigne le moyen d'empêcher la transmission

de virus de l'hépatite à des patients exposés à un traite-

ment avec des concentrés de facteurs de coagulation.

Conformément à la présente invention, le traite-

ment à la chaleur de compositions pratiquement anhydres renfermant le Facteur VIII inactive, réduit ou élimine le pouvoir infectieux des microorganismes tels que des virus qui y sont présents sans réduire l'activité des

facteurs de coagulation.

En outre, le traitement thermique de concentrés pratiquement anhydres de facteurs de coagulation renfermant le Facteur VIII inactive tout virus de l'hépatite qui y

est présent, en permettant d'obtenir un rendement impor-

tant en concentré sans réduction notable de l'activité

des facteurs de coagulation dans ce concentré.

La présente invention concerne également le

traitement thermique de concentrés de facteurs de coagu-

lation contenant le Facteur VIII, traitement selon lequel

les concentrés sont d'abord préparés sous une forme lyo-

philisée afin d'améliorer leur stabilité au cours du

processus de chauffage.

Des fractions de plasma lyophilisé traitées à la chaleur offrent avantageusement une composition et un vaccin efficaces,à la fois contre le virus de l'hépatite B

et contre le virus de l'hépatite non-A, non-B.

Ces objectifs de la présente invention, ainsi que d'autres, sont atteints par la lyophilisation de plasma entier ou de fractions de plasma comprenant un -20 concentré de Facteur VIII, ainsi que de facteurs tels qu'un

concentré de Facteur IX, du fibrinogène et un cryopréci-

pité, puis exposition du plasma entier ou des fractions de plasma lyophilisés à des températures élevées pendant

des périodes variables.

La capacité d'isolement de facteurs de coagula-

tion présents dans le sang humain a été indispensable pour la compréhension de la pathologie de l'hémophilie et d'autres troubles hémorragiques héréditaires En même temps, la mise au point de schémas de fractionnement du plasma pour l'obtention de quantités intéressantes de concentrés de facteurs de coagulation a permis à la science médicale d'utiliser les concentrés de facteurs

de coagulation comme outils thérapeutiques dans le trai-

tement de troubles hémorragiques En particulier, la thérapie par transfusion utilisant des concentrés de Facteur VIII et de Facteur IX s'est révélée tout à fait

satisfaisante à appliquer à des patients hémophiles.

Malheureusement, le risque de transmission de l'hépatite due à un grand nombre de donneurs de-plasma nécessaires pour la production commerciale de concentrés de facteurs de coagulation demeure l'inconvénient sérieux associé à

ce mode de thérapie Un schéma représentatif du fraction-

nement de plasma, révélé dans Seminars in Thrombosis and Hemostatis,' volume VI, N O 1, page 4 ( 1979), donne un

cryoprécipité et un liquide surnageant, la première frac-

tion constituant une source à la fois de concentré de Facteur VIII et de fibrinogène et la seconde fraction constituant une source de concentré de Facteur IX en plus des concentrés de Facteurs Il, VII et I Comme Gerety et Eyster l'ont démontré dans "Hepatitis Among Hemophiliacs", Non-A, Non- B Hepatitis, pages 103-106 ( 1981), le virus de l'hépatite B initialement présent dans le plasma entier est distribué aux dérivés Facteur VIII et Facteur IX pendant le processus de fractionnement du plasma Comme

démontré également par Maynarçl et Bradley dans "Trans-

mission by Blood Products", Non-A Non-B Hepatitis; pages 78-79 ( 1981), le virus de l'hépatite non-A, non-B existe dans les deux dérivés Facteur VIII et Facteur IX Des

tentatives antérieures de traitement thermique de con-

centrés de facteurs de coagulation en solution en vue d'inactiver le virus de l'hépatite ont également été inefficaces Toutefois, le développement de techniques de lyophilisation de facteurs de coagulation a ouvert une voie nouvelle d'exploration en ce qui concerne la stabilisation de facteurs de coagulation au cours du procédé de traitement thermique, établissant à son tour un moyen d'inactivation du virus de l'hépatite présent dans les facteurs de coagulation sans détruire l'activité

de ces facteurs.

On s'est procuré auprès de plusieurs fabricants

des échantillons par paires de diverses fractions lyophi-

lisées de plasma, chacune de ces paires portant des numéros de lot identiques Les échantillons pesaient généralement moins de 100 g et avaient été conditionnés dans des fioles ayant des volumes de 60 à 90 ml Un échantillon de chaque paire a été chauffé, soit par disposition de la fiole à échantillon dans un bain-marie ou dans une étuve à une température prédéterminée à la pression du laboratoire pendant une période prédéterminée, soit en plaçant la matière lyophilisée elle-même dans une étuve sans que la fiole soit présente L'échantillon restant de chaque paire a servi de témoin et a été réfrigéré à 4-60 C pendant le processus de traitement à la chaleur Après le traitement thermique, les échantillons témoins et les échantillons lyophilisés traités à la chaleur ont été reconstitués avec de l'eau stérilisée La reconstitution a été effectuée cdune manière générale conformément aux spécifications

du fabricant, bien que la solubilité de certains échan-

tillons traités à la chaleur ait été notablement améliorée par l'augmentation de la quantité d'eau stérilisée utilisée

pendant la reconstitution par rapport à la quantité recom-

mandée par le fabricant Des titrages in vitro de Facteur VIII et de Facteur IX ont été effectués en utilisant une méthode fibrinométrique manuelle directe à des dilutions comprises entre 1:40 et 1:400 pour obtenir une mesure d'activité de coagulation du Facteur VIII et du Facteur

IX La récupération in vitro de fibrinogène après recons-

titution des échantillons témoins et des échantillons de fibrinogène lyophilisé traités à la chaleur a été mesurée d'une façon similaire Dans certains des essais, on a observé pour des fractions de plasma reconstituées la

transmission de la lumière à 580 nm à l'aide d'un spectrophoto-

mètre Beckman Modèle 25 Une électrophorèse sur gel d'agarose, avec une plaque d'immuno-électrophorèse ICL, a été effectuée pour plusieurs des paires d'échantillons de Facteur VIII et de Facteur IX en utilisant comme substance de référence un sérum de chèvre anti-humain de la firme Hyland Diagnostics Les plaques ont été exposées à une électrophorèse spécifique au moyen d'une

source d'énergie Buchler réglée à 25 m A, pendant 35 minu-

tes Au terme de l'électrophorèse, on a fait incuber les plaques dans des anti-sérums pendant 18 à 24 heures et on les a examinées en lumière indirecte On a effectué une électrophorèse Panagell au moyen d'une plaque de la firme Worthington Diagnostics sur d'autres paires d'échantillons de concentré de Facteur VIII en utilisant

une cellule électrophorétique Biorad refroidie à l'eau.

D'autres essais in vitro ont été effectués par chauffage d'échantillons lyophilisés de concentré de Facteur VIII au bain-marie à la température ambiante et à des températures prédéterminées pendant des durées prédéterminées On a ensuite titré le Facteur VIII Ag en

utilisant la méthode décrite par Laurell dans "Electro-

immuno Assay", Me Scandinaviap Journal of Clinical and

Laboratory Investigation, volume 29, pages 21-37 ( 1972).

On a calculé les résultats concernant le Facteur VIII

pour des dilutions à 1:40, 1:80, 1:100 et 1:200 en re-

présentant graphiquement la variation de la hauteur des pics de la courbe de Laurell en fonction du pourcentage de dilution Les inconnues ont été exprimées par un pourcentage de la normale sur la base des hauteurs de

pics des inconnues dans la courbe de référence.

On a mesuré la récupération in vivo d'activité des facteurs de coagulation pour les deux concentrés, traités à la chaleur, de Facteur VIII et de Facteur IX par injection de concentrés lyophilisés, traités à la chaleur et reconstitués, de Facteur VIII et de Facteur IX, respectivement, à des chiens atteints d'hémophilie A et d'hémophilie B Un concentré de Facteur IX lyophilisé

traité à la chaleur a aussi été injecté à un chien témoin.

Les paramètres de laboratoire comprenant Hct, la protéine sérique, WBC, le nombre de plaquettes, l'étalement de sang, le rythme respiratoire, la température du corps, les pulsations et l'activité des facteurs de coagulation ont ensuite été déterminés pour chacun des animaux à

divers intervalles à la suite des injections.

Les résultats des essais in vitro portant sur le concentré de Facteur VIII sont reproduits sur les tableaux I et Il:

TABLEAU I

Mesures de l'activité du facteur de coagulation après traitement à la chaleur d'un concentré de Facteur VIII lyophilisé Lot Température Durée Dilution Activité, % *

A C-1081

C-1081

Témoin Témoin C-1081 Témoin H 1 M C n h e

A NC-8247

a M

B AHF-355

a Témoin n

62 -64 C

N 16,33 h Témoin et n 64 C N 74 C H N h 17 h H M 1:20 1:40 Une réduction d'activité d'environ 10 %, 1:80 par rapport au témoin a été 1:20 observée pour les échantillons 1:40 traités à la O ^ chaleur 1:ou 1:40 1:80 1:40 1:80 1:40 1:80 1:160 1: 40 1:80 1:40 1:80 1:160 n n #

152666 *

Lot

B AHF-355

w'

B 347

g et Températui 760 C Il Témoin i 830 C i' 85 OC tg 950 le 970 C C Al0470 Témoin n 750 C C Al-1080 Témoin le If C Al-1120 le Il I

8001 C

Témoin 780 C 900 C

1 001 C

Il TABLEAU I (Suit E e Durée Di 17 h I 24 h si 24 h 7 h 7,5 h h 24 h il 23 h si h fi 12 h 1,5 h i C Al-1150 Témoin le la If' et

650 C**

83 Oç I 850 C 26,33 h i' 24 h le 24 h 1 ut-i-o N Activité, %

1:40 1040

1:80 976

1:100 1180

1:200 100

1:100 100

1:200 100

1:100 1

1:200 i

1:100 912

1:100 2076

1:200 2080

1:400 1920

1:200 1380

1:400 1360

1:40 2800

1:80 2032

1:40 1592

1-:80 1392

1:40 1176

1:80 1600

Spécimen coagulé

1:40 1248

1:80 1264

1:40 2176

1:80 2480

1:100 1870

1:40 1592

1:80 1520

1:100 730

1:200 620

1:100 1000 V

I il i' ff il Lot

C AI-115

et n ou if C Al-1160 t n n N N N C Al-2121

C AI-253

N Remarque * TABLEAU I (Suite) Température Durée Dilution Activité, % 0 85 C 24 h 1:200 1160 C 10 h 1:40 1032

" " 1:80 1056

C 7 h Spécimen coagulé 97 C 7,5 h 1:100 80

" " 1: 200 100

C 10 h 1:40 88

" " 1:80 48

Témoin 1:100 3680

" 1:200 3420

n _ 1:400 3200 78 C 24 h 1:100 2420

" " 1:200 1520

l" " 1:400 1440 78 C 24 h 1:200 1720 n N 1:400 1680 C 22 h 1:200 1400 n " 1:400 1360 C 7 h 1:200 1760 il N 1:400 1760 0 Témoin 1:190 86 C**** 1, 5 h 1:100 18 1 Témoin 1:200 3500

" 1:400 2700

C 20 h 1:200 46

" " 1:400 43

: Tous les temps et toutes les températures sont apprximatifs Après traitement thermique à des

températures élevées, des quantités d'eau stéri-

lisées en excès par rapport aux recommandations

du fabricant ont été ajoutées à certains concen-

trés jusqu'à ce que la solubilisation ait été

confirmée visuellement.

Les lots A ont été fabriqués par la firme Cutter Laboratories; Les lots B ont été fabriqués par la firme Michigan Red Cross; Les lots C ont été fabriqués par la firme

Alpha Therapeutics.

Traitement thermique à l'étuve (échantillon

retiré de la fiole).

Traitement thermique en étuve (échantillon

contenu dans la fiole).

TABLEAU II

Titrage du Facteur VIII Ag après traitement thermique d'un concentré de Facteur VIII lyophilisé Lot

B AHF-355

l n n w Température Témoin 64 C n 74 C If n C Al-1120 Témoin 900 C C Al1150 Témoin 830 C i 850 C 97 o C Durée Dilution 1:40 1:80 h 1:40

" 1:80

17 h 1:40

" 1:80

: 1:100

12 h 1:100 1:200 24 h 1:200 24 h 1:200 7,5 h 1:200 Tous les temps et toutes les températures sont exprimés par des valeurs approchées Après traitement thermique à des températures élevées, des quantités d'eau stérilisée en excès par rapport aux recommandations du fabricant ont été ajoutées à certains concentrés jusqu'à ce

que la solubilisation ait été confirmée visuel-

lement. Les lots B ont été produits par la Michigan Red Cross; les lots C ont été produits par

Alpha Therapeutics.

** Hauteur de pic (mm) Activité en Ag, % -4080 o o O Remarque: * 1 1 Les résultats de l'essai portant sur le concenti de Facteur IX sont récapitulés sur le tableau III

TABLEAU III

Mesures de l'activité du facteur de coagulation après traitement thermique d'un concentré de Facteur IX lyophilisé Lot Température Durée Dilution Activité, *

A 9-C 0044

ri et l I N n fl # n n

A NC 9055

N Remarque: * ** Témoin 1:40 616

" 1:80 1200

" 1:200 2400

" 1:400 3520

C 4 h 1:40 520

" " N 1:80 1104

C 12 h 1:200 1680 "n" I 1:400 2480 C* 13 h 1:400 1640 "y** " 1:800 2560 122 C 12 h 1:200 340

"** " 1:400 480

132 C 12 h 1:200 12 "** t 1:400 24 Témoin n/a 2600 C 0,5 h n/a 2350 Tous les temps et toutes les températures sont exprimés par des valeurs approchées Après traitement thermique à des températures élevées, des quantités d'eau stérilisée en excès par rapport aux recommandations du fabricant ont été ajoutées à certains concentrés jusqu'à ce

que la solubilisation ait été confirmée visuel-

lement. Les lots A ont été produits par les Cutter Laboratories.

Traitpment thermique en étuve.

ré %

-, 526660

Les résultats de l'essai portant sur un concentré de fibrinogène sont reproduits sur le tableau IV:

TABLEAU IV

Fibrinogène recueilli après traitement thermique d'un concentré de fibrinogène sous la forme lyophilisée Lot Température Durée Dilution Fibrinogène recueilli _ _ __ _ ___ (mg/dl) *D-003678 Témoin 1:20 400

" " 1:40 680

" 60 C 10-11 h 1:20 660 i " " 1:40 680 " Témoin 1:10 195

" " 11 1:20 760

"e 1:40 700 "n 60 C 10 h 1:10 105 "Il N " " 1:10 225 n N " 1:20 250 " 600 C 17 h 1:10 190

" " " 1:20 220

*E Témoin 1:40 1280 n " 1:80 1280 "n 60 C 10 h 1:40 1520

" " " 1:80 1320

N 60 C 10 h 1:40 1860 n " " t 1:80 1520 " 65 C 10 h 1:40 1640 n " " 1:80 1400 *E 65 C 23 h 1:40 1420

I F " 1:80 1320

n Témoin 1:40 1048 n " 1:80 1064 " 100 C 3 h 1:40 788 n Il " 1:80 784 " 123,3 C** 3 h 1:5 133 Remarque Tous les temps et toutes les températures sont exprimés par des valeurs approchées Après traitement thermique à des températures élevées, des quantités d'eau stérilisée en excès par rapport aux recommandations du fabricant ont été ajoutées à certains concentrés jusqu'à ce

que la solubilisation ait été confirmée vi-

suellement. * Lots D produits par la firme Cal Biochem;

Lots E produits par la firme Kabi.

** Traitement thermique en étuve (échantillon en fiole). Commentaires sur des résultats d'essai choisis Les résultats récapitulés sur les tableaux I à IV peuvent être confrontés en vue d'obtenir une indication relative de la rétention d'activité de coagulation et

de la proportion recueillie de fibrinogène dans des frac-

tions de plasma lyophilisées exposées au procédé de trai-

tement thermique de la présente invention Plus particu-

lièrement, on peut faire la moyenne des pourcentages d'activité ou des proportions recueillies mesurées à diverses dilutions de concentrés reconstitués de Facteur

VIII, de Facteur IX et de fibrinogène pour des échantil-

lons témoins individuels et on peut comparer les résultats

avec les moyennes, effectuées de façon similaire, de pour-

centage d'activité ou de proportion recueillie mesurée

dans des paires d'échantillons correspondants de concen-

trés de Facteur VIII, de Facteur IX et de fibrinogène traités thermiquement Lorsqu'on effectue ces comparaisons, on peut constater par exemple qu'un concentré de Facteur VIII lyophilisé obtenu auprès d'un fabricant (lot No A C-1081) et chauffé à 60 'C pendant 10 heures a retenu plus de 90 % de son activité en Facteur VIII de coagulation

in vitro,comparativement à un témoin non chauffé Le con-

centré de Facteur VIII traité thermiquement a montré en outre, après reconstitution, une absorption à 580 nm de 0,30, comparativement à une absorption de 0,20 pour

l'échantillon non chauffé, et'il n'a montré aucune diffé-

rence par rapport au témoin non chauffé après une immuno-

électrophorèse effectuée avec du sérum de chèvre anti-

humain Des concentrés reconstitués de Facteur VIII pro-

venant d'un lot différent (lot No A NC-8747) du même

fabricant, qui avaient été chauffés sous la forme -lyophi-

lisée à 62-640 C pendant environ 16 heures, puis conservés à 60 C pendant 7 jours, ont montré une récupération de plus de 80 % de l'activité en Facteur VIII de coagulation comparativement à un témoin non traité Une augmentation globale de migration anodique par rapport au témoin -non

chauffé a été observée après immuno-électrophorèse vis-à-

vis de sérum de chèvre anti-humain.

D'une façon similaire, lorsqu'un concentré de Facteur VIII lyophilisé provenant d'un second fabricant (lot No C A 1-1120) a été chauffé à environ 780 C pendant 21 heures, il a présenté une rétention in vivo de 62 %

* de l'activité de coagulation après reconstitution, com-

parativement à un témoin non chauffé Un concentré de Facteur VIII reconstitué provenant du même lot du second

fabricant, après traitement thermique sous la forme lyo-

philisée pendant 20 heures à environ 80 C, gardait encore 57 % d'activité de coagulation in vitro, comparativement

à un témoin non chauffé, tandis qu'un Facteur VIII pro-

venant du même lot du second fabricant, qui avait été préalablement chauffé sous la forme lyophilisée pendant une heure et demie à environ 100 'C, gardait encore 52 % d'activité de coagulation in vitro, comparativement à un témoin non chauffé Lorsqu'un lot différent (lot N O C

Al-1150) de concentré de Facteur VIII lyophilisé prove-

nant du second fabricant a été traité thermiquement par

le procédé de la présente invention, les taux de récupé-

ration in vitro d'activité de coagulation comparativement au témoin non chauffé ont varié de 67 %, pour une durée de traitement thermique de 26 heures et 20 minutes à C, à 34 % pour un traitement thermique d'une durée

de 24 heures à 830 C et à 55 % pour une durée de traite-

ment thermique de 24 heures à 850 C Des dosages d'anti- gène relatifs au Facteur VIII pour les deux échantillons

de concentré de Facteur VIII traités thermiquement à-

83 C et à 850 C, ont montré, respectivement, une baisse de 15 % et une baisse nulle des taux d'antigène On doit également remarquer qu'une solubilisation très améliorée du second échantillon de concentré de Facteur VIII traité thermiquement a été obtenue par addition d'un volume

compris entre 50 et 75 ml d'eau stérilisée à l'échantil-

lon au lieu des 25 ml recommandés par le fabricant.

Le traitement thermique d'échantillons lyophi-

lisés de Facteur VIII provenant d'un troisième fabricant (lot N O AHF-355) a confirmé les résultats observés pour les deux premiers fabricants En fait, le traitement thermique du concentré lyophilisé de Facteur VIII du troisième fabricant pendant 20 heures à 640 C a montré,

une récupération d'activité de coagulation de 61 %, com-

parativement à un témoin non traité, un traitement thermi-

que du même concentré pendant 17 heures à 740 C a donné une récupération d'activité de coagulation de 63 % et un traitement thermique du même concentré pendant 17 heures à 760 C a donné une récupération d'activité de coagulation de 57 % Les taux d'antigène relatif au Facteur VIII dans les échantillons reconstitués chauffés à 640 C et à-740 C n'ont pas montré d'abaissement, comparativement au niveau

du témoin non chauffé.

Un échantillon de concentré de Facteur IX lyo-

philisé provenant du premier fabricant (lot N O A 9-C 0044)

et immergé dans un bain-marie à 1000 C pendant 20-30 minu-

tes a donné une récupération in vitro essentiellement totale de l'activité de coagulation, comparativement à un témoin non chauffé Le Facteur II et le Facteur VII se sont tous deux montrés stables pendant 2 heures après la reconstitution de l'échantillon traité thermiquement, tandis que le Facteur IX a baissé d'environ 20 % O dans la période de 6 jours après la reconstitution Des mesures d'absorption effectuées 2 heures après la reconstitution ont donné des valeurs de 0,006 à 0,007 à 580 nm aussi

bien pour le témoin que pour l'échantillon traité thermi-

quement Aucune différence visuelle n'a pu être appréciée entre le concentré traité thermiquement et le témoin non

chauffé, à la suite d'une immuno-électrophorèse du con-

centré de Facteur IX vis-à-vis de sérum de chèvre anti-

humain D'autres échantillons de concentré de Facteur IX

provenant du premier fabricant, qui avaient été, respec-

tivement, traités à la chaleur sous la forme lyophilisée à 1000 C pendant 12 heures et à 1100 C pendant 13 heures, ont également montré une récupération totale d'activité de coagulation du Facteur IX, bien qu'une solubilisation totale du second échantillon ait nécessité un supplément de 40 à 60 ml d'eau stérilisée, alors que le fabricant recommande un volume de 20 ml Les résultats du tableau III suggère donc que le concentré de Facteur IX sous la forme lyophilisée est très stable thermiquement pendant 4 heures à des températures comprises entre 100 et 1100 C. Un échantillon de concentré de fibrinogène lyophilisé provenant d'un quatrième fabricant (lot N O D-003678) et traité thermiquement pendant 11 heures à 600 C n'a présenté aucune perte de fibrinogène in vitro comparativement à un témoin non chauffé Un échantillon de concentré de fibrinogène lyophilisé provenant du même fabricant, après traitement thermique pendant 17 heures à 600 C, a montré un taux de récupération du fibrinogène de 97 %, comparativement au témoin non chauffé Des échantillons de concentrés de fibrinogène lyophilisés

provenant d'un cinquième fabricant (lot E), chauffés, res-

pectivement, pendant 10 et 23 heures à 60 'C et à 650 C, n'ont présenté aucune perte de fibrinogène in vitro, comparativement au témoin non chauffé, tandis qu'un échantillon de concentré de fibrinogène lyophilisé venant du cinquième fabricant a présenté une récupéra- tion de fibrinogène de 74 %, comparativement au témoin,

après traitement thermique pendant 3 heures à 100 'C.

Comme indiqué dans ce qui précède, on a effec-

tué des essais in vivo en utilisant des concentrés de Facteur VIII et de Facteur IX traités thermiquement, en

utilisant des chiens déficients en facteur anti-

hémophilique A ou Facteur VIII et en facteur anti-

hémophilique B ou Facteur IX On a administré au chien

atteint d'hémophilie A le concentré reconstitué de Fac-

teur VIII qui avait été préalablement traité à la chaleur sous la forme lyophilisée à 60 'C pendant 10 heures, tandis que le chien atteint d'hémophilie B a reçu un concentré reconstitué de Facteur IX qui -avait été préalablement traité à la chaleur à 100 'C pendant 3 à 4 heures Les résultats de l'essai in vivo sont reproduits sur les

tableaux V et VI ci-après -

T A B L E A U V

Chien déficient en Facteur VIII, recevant le concentré de traité thermiquement Facteur VIII

HCT, % Protéine, Leucocytes/ Plaquet FVIII FVIII Tempé Respi Pulsa-

moles % mm 3 tes/mm 3 RA, % C, % rature, ration tions C

PRE 44 6,1 3795 330 000 106 < 2 37,8 48 132

( 1-2)

Infusion 20 ml administrés en 3,5 min 400 minutes 45 5,9 3190 110 000 151 12 39,0 42 138 minutes 47 6,0 6050 165 000 n= 2 12 38,3 pnt 108 156, 3 heures 44 6,1 5115 231 000 168 15 38,3 pant 108 heures 43 6,0 4785 165 000 159 9 38,0 30 114 7,5 heures 44 5,9 3245 198 000 150 9 38,3 42 108 Co a Ln,. 0 %; os 0 % os os O

T A B L E A U VI Chien déficient en Facteur VIII, recevant le concentré de Facteur VIII

traité thermiquement -

HCT, % Protéine, Leucocytes/ Plaquet Temps de FVIII F-IX, Tem Res Pul-

moles % mm 3 tes/mm 3 coagula C, % % péra pira sa-

tion à ture, tion tions la throm o C bine, s

PRE 43 5,5 5840 187 000 67 < 1

( 0-6 38,6 36 150

1) Infusion 20 ml administrés en 3 min 5 524 min 42 5,6 5006 429 000 47 9 38,8 30 150 min 44 5,8 6545 263 000 5,5 59 10 38,9 48 144 3 h 40 5,7 8910 429 000 39 6 42 162 h 41 5,8 5610 231 000 6,0 64 6 37,9 42 126 7,5 h 44 5, 7 6985 363 000 95 4 38,3 36 162 w 0 % o%'

Les résultats reproduits sur le tableau V illus-

trent amplement l'élévation prononcée d'activité de coagu-

lation du Facteur VIII chez un chien atteint d'hémophilie A après injection de concentré de Facteur VIII traité thermiquement De même, les résultats reproduits sur le tableau VI illustrent amplement la récupération de Facteur IX observée chez un chien atteint d'hémophilie B après

injection de concentré de Facteur IX traité thermiquement.

L'absence évidente d'agression physiologique ou d'autre

réaction défavorable comme le font apparaître les résul-

tats des tableaux V et VI suggère que les concentrés de

Facteur VIII et de Facteur IX qui ont été traités confor-

mément aux étapes du procédé de l'invention restent biolo-

giquement acceptables.

Il a maintenant été démontré que des fractions de plasma telles que des concentrés de Facteur VIII et de Facteur IX de pureté variable pouvaient être traités thermiquement avec sûreté sous-la forme lyophilisée à des températures élevées pendant des périodes prolongées sans

altération notable de l'activité de coagulation des con-

centrés Il a en outre été démontré que des fractions de

plasma telles qu'un fibrinogène de pureté variable pou-

vaient être traitées thermiquement avec sûreté sous la forme lyophilisée à des températures élevées pendant des périodes prolongées sans altération des possibilités de récupération du fibrinogène Des observations visuelles confirment que la solubilité de concentrés lyophilisés de Facteur VIII, de Facteur IX et de fibrinogène n'est pas altérée par le traitement thermique du moment que la

quantité d'eau stérilisée ajoutée aux échantillons lyo-

philisés de concentré pendant la reconstitution peut être augmentée simplement jusqu'à ce que la solubilité totale ait été atteinte En conséquence, un ajustement correct

de la température de chauffage, de la longueur de chauf-

fage et des niveaux de pureté appliqués permet d'inactiver le virus de l'hépatite tant du type B que du type non-A, non-B dans des fractions de plasma tout en maintenant la

viabilité et l'intégrité thérapeutique des fractions.

Etant donné en outre que le virus de l'hépatite B et vraisemblablement le virus de l'hépatite non-A, non-B sont préférentiellement distribués dans les fractions de facteurs de coagulation, c'est-à-dire dans les concentrés

de Facteur VIII et de Facteur IX, le traitement thermi-

que des fractions de facteurs de coagulation sous la forme lyophilisée, à des températures et pendant des durées convenables, peut également servir à rendre le

virus de l'hépatite immunogène ainsi que non infectieux.

En conséquence, des concentrés de Facteur VIII et de

Facteur IX lyophilisés traités thermiquement et recons-

titués peuvent fonctionner comme des vaccins contre l'hépatite, tout en offrant les avantages thérapeutiques

autrement associés à des fractions de facteurs de coagu-

lation.

En outre, une extrapolation des résultats expé-

rimentaux reproduits sur les tableaux I à VI montre à l'évidence que le procédé de la présente invention peut être mis en oeuvre à un moment essentiellement quelconque au cours du processus de fractionnement du plasma En fait, à tout moment au cours du processus de fractionnement dans lequel un dérivé du plasma peut être lyophilisé, un

traitement thermique du dérivé de plasma peut être effec-

tué et le dérivé peut être resolubilisé ou reconstitué avant la poursuite du processus de fractionnement Ainsi, par-exemple, lorsque le concentré de Facteur VIII provient finalement d'un schéma de fractionnement de plasma du type décrit par Mammen et collaborateurs dans "Treatment of Bleeding Disorders with Blood Components", Reviews of Hematology, volume 1, page 144 ( 1980), le cryoprécipité obtenu à partir de plasma fraîchement congelé, l'extrait clarifié obtenu à partir du cryoprécipité et la liqueur surnageante obtenue à partir de l'extrait clarifié peuvent tous être lyophilisés et traités thermiquement de la

même manière que le concentré de Facteur VIII lui-même.

Le choix d'un stade approprié dans le schéma de fraction-

nement du plasma pour l'application du traitement thermi-

que peut alors être basé sur des considérations pragmati-

ques telles que le coût ou la commodité.

L'inactivation de micro-organismes indésirables tels qu'un virus en relation avec SDIA, c'est-à-dire le

syndrome de déficit immunitaire acquis, le cytomégalo-

virus et le virus d'Epstein-Barr, compte parmi d'autres

formes de réalisation de l'invention.

En outre, différentes techniques de déshydrata-

tion pourraient être appliquées à des compositions plas-

matiques telles que des fractions de plasma, à savoir la déshydratation par pulvérisation ou la déshydratation

sous vide.

L'addition d'eau stérilisée à du plasma anhydre ou lyophilisé à des degrés supérieurs aux volumes suggérés

par les fabricants crée des solutions de plasma de dilu-

tions supérieures à la normale recommandée; toutefois, l'efficacité du plasma et de ses constituants n'est pas notablement altérée Cela est particulièrement utile lorsque les températures auxquelles la composition de

plasma doit être chauffée pour inactiver des micro-

organismes indésirables tels que des virus est si haute

qu'une coagulation du plasma reconstitué aurait normale-

ment lieu si de l'eau stérilisée en excès n'était pas ajoutée. Une application particulièrement importante

du procédé de l'invention est le traitement de composi-

tions enrichies en facteur anti-hémophilique (FAH) De telles compositions contiennent des concentrations en FAH sur la base du poids total des protéines qui excèdent les concentrations trouvées dans le plasma ou dans d'autres fractions classiques de protéines du plasma, comme le complexe de prothrombine (concentrés de Facteur IX), la

gamma-globuline, l'albumine, le fibrinogène ou l'anti-

thrombine III D'aussi hautes concentrations en FAH sont nécessaires pour assurer que, lorsque les compositions

sont dissoutes dans l'eau ou dans un autre support phy-

siologiquement acceptable, elles puissent corriger suf-

fisamment l'anomalie de coagulation présentée par le patient pour faire preuve d'un effet clinique favorable sans nécessiter l'infusion d'eau en excès ou de protéines étrangères Généralement, une dose thérapeutiquement efficace de FAH peut être aisément déterminée par l'homme de l'art Elle dépend de l'état clinique du patient, notamment du type d'hémorragie en question Ordinairement, une quantité suffisante de FAH doit être infusée pour produire un taux plasmatique de FAH chez le patient d'au moins 30 % de la quantité présente chez des individus

normaux, bien que des taux de 50 % ou plus soient pré-

conisés pour des hémorragies graves L'opération peut être effectuée par infusion d'un nombre total d'unités de FAH tel que défini par la formule: Unités requises = poids corporel (kg) x 0,4 x élévation recherchée du taux de FAH

(en % de la normale).

La concentration en FAH dans la solution infusée ne doit avantageusement pas dépasser 34 unités/ml, mais

elle doit être supérieure à 15 unités/ml Si la concen-

tration dépasse 34 unités/ml, il ne faut pas infuser plus de 2 ml par minute L'infusion effectuée avec moins de 34 unités de FAH peut être conduite plus rapidement,

de l'ordre de 10 à 20 ml en une période de 3 minutes.

Une unité de FAH est définie comme étant l'activité en FAH présente dans 1 ml de-plasma humain normal recueilli

depuis moins de 1 heure.

Des compositions enrichies en FAH renferment

ordinairement plus d'environ 20 unités de FAH, habituel-

lement plus d'environ 300 unités de FAH par gramme de

protéine Evidemment, le produit est d'autant plus avan-

tageux que la pureté du FAH est plus grande Des com- positions contenant environ 100 à 2000 unités de FAH par gramme de protéine sont tout à fait réalisables du point

de vue commercial.

Les compositions de FAH peuvent être débarrassées d'autres protéines plasmatiques à des degrés divers au

cours du processus de purification, selon le procédé uti-

lisé Ces protéines du plasma comprennent les enzymes de coagulation du sang (on entend désigner par là, dans le présent mémoire, à la fois les pro-enzymes inactifs et les enzymes activés) comme le complexe de prothrombine ou concentré de Facteur IX (Facteurs II, VII, IX et X), les Facteurs XII ou XIII, le fibrinogène, l'albumine et la gamma-globuline Lorsqu'une composition de FAH est essentiellement dépourvue d'enzymes de coagulation du

sang, elle contient des activités enzymatiques sub-

thérapeutiques Les compositions de FAH peuvent être purifiées à un degré auquel l'activité de-tout enzyme

de coagulation du sang est à l'état de traces, générale-

ment moins d'environ 15 unités/g de protéine et de pré-

férence moins d'environ 5 unités/g de protéine Le rapport des unités de FAH à toute activité enzymatique unitaire individuelle dans lesdites compositions va ordinairement

d'environ 10:1 à 500:1 et elle est avantageusement supé-

rieure à 300:1 Une unité d'activité enzymatique pour chacun des divers enzymes de coagulation sous leurs formes activées ou formes de proenzymes est définie dans PCT

International Application WO 82/03871 (date de publica-

tion: 11 Novembre 1982); Les compositions de FAH traitées thermiquement

dont il est question dans le présent mémoire sont prin-

cipalement administrées à des patients atteints de défi-

cience congénitale en FAH Ces patients ne parviennent

pas à synthétiser lé facteur anti-hémophilique biologique-

ment actif et on doit les distinguer de ceux qui portent des inhibiteurs de FAH acquis (probablement des anticorps)

qui déclenchent également les symptômes de l'hémophilie.

Les patients de ce dernier groupe sont avantageusement traités avec des compositions d'enzymes de coagulation

activés Les compositions d'enzymes de coagulation con-

tiennent des quantités thérapeutiquement efficaces des enzymes Toutefois, les compositions de l'invention ne renferment généralement pas ces quantités d'enzymes de coagulation du sang, mais s'appuient essentiellement sur

l'activité en FAH pour l'hémostase.

Les compositions de FAH perfectionnées selon l'invention contiennent de plus faibles quantités de FAR dénaturé qu'il n'en est produit lorsqu'on utilise des procédés antérieurs Généralement, la quantité de FAH dénaturé est inférieure à environ 50 % du PAH actif et dénaturé total de la composition De préférence, cette quantité va d'environ 30 à 10 % La quantité de FAH dénaturé équivaut au pourcentage de perte d'unités de FAH après que la composition de FAH infectée par un virus a été soumise au traitement thermique décrit dans

le présent mémoire.

L'effet du chauffage à l'état sec du FAH con-

taminé par un virus peut être suivi par le titrage de l'activité de coagulation du facteur anti-hémolytique comme décrit ci-dessus, et par la détermination du titre viral Lorsqu'il est difficile de mesurer le titre viral biologiquement actif, comme dans le cas des virus de l'hépatite, on peut utiliser un virus concurrent tel que bactériophage, sindbis, adénovirus ou virus EHC, comme décrit dans PCT International Application WO 82/03871 (date de publication: 11 Novembre 1982) Un titre prédéterminé du virus concurrent est inoculé à une solution de la composition devant être traitée à la chaleur, la solution est lyophilisée et divers traitements thermiques sont entrepris On choisit le stade o des mesures réelles ou l'analyse par régres- sion (extrapolation statistique) indiquent le degré désiré d'inactivation virale, comme conditions qui régissent le traitement thermique du produit Ces conditions sont

généralement la durée et la température de l'inactiva-

tion virale, bien que la teneur en humidité de la compo-

sition constitue également une variable qui doit être maîtrisée La durée et la température sont commentées ci-dessus La teneur en humidité doit être inférieure à % en poids, ordinairement inférieure à 1 % en poids.

Bien qu'une certaine inactivation et une cer-

taine dénaturation du FAH ait lieu au cours du procédé de chauffage à l'état sec, elles apparaissent moins rapidement que l'inactivation des virus concurrents les

plus virulents ou que le virus de l'hépatite Par consé-

quent, la composition de FAH 4 nfectée peut être rendue

sensiblement dépourvue du virus sous la forme infectieuse.

Cela signifie que le titre du virus est réduit à un point tel que l'infusion de quantités thérapeutiques du produit dans plusieurs hôtes animaux normaux pour le virus ne parvient pas à faire apparaître de signes cliniques ou sérologiques d'infection dans une population d'hôtes ou retarde notablement la déclaration de l'infection dans une telle population Lorsqu'une épreuve équivalente de

culture de tissu est disponible pour déterminer l'infec-

tivité biologique, on peut l'utiliser à la place d'hôtes

animaux normaux comme indice de pouvoir infectieux.

Le procédé de chauffage modéré à l'état sec

selon l'invention maintient la quasi-totalité de l'anti-

génie des micro-organismes infectieux, c'est-à-dire que les sites épitopiques sur les micro-organismes ne sont pas dénaturés de façon irréversible Cela est en contraste

avec d'autres procédés impliquant des réactions de cova-

lence avec des substances chimiques, l'emploi de rayons

fortement énergétiques ou un chauffage excessif.

L'opération de chauffage peut être conduite en récipient clos ou ouvert, comme indiqué ci-dessus, et elle est mise en oeuvre de la façon la plus efficace par des techniques simples et peu coûteuses telles qu'un chauffage par contact des récipients contenant le produit, par exemple dans des étuves ou dans des bains-marie ou des bains de sable, ou par irradiation infrarouge On évite par sécurité et pour des raisorns de prix de revient

le chauffage par micro-ondes.

Plusieurs formes de réalisation de la présente

invention ont été illustrées dans ce qui précède Toute-

fois, il y a lieu de remarquer que diverses modifications en ce qui concerne les plages de températures, les périodes de chauffage et les degrés de pureté indiqués à propos des formes de réalisation mentiaonées ci-dessus peuvent être apportées par l'homme de l'art sans sortir du cadre de

là présente invention.

Claims

REVENDICATIONS

1 Procédé de traitement d'une composition pra-

tiquement anhydre comprenant le Facteur VIII pour réduire ou éliminer le pouvoir infectieux des micro-organismes présents dans la composition, caractérisé en ce qu'il consiste à chauffer la composition pendant une période prédéterminée à une température prédéterminée suffisante

pour réduire ou supprimer le pouvoir infectieux des micro-

organismes.

2 Procédé de traitement d'une composition pra-

tiquement anhydre renfermant le Facteur VIII pour réduire ou supprimer le pouvoir infectieux des micro-organismes présents dans la composition, caractérisé en ce qu'il consiste à chauffer la composition pendant une période prédéterminée à une température prédéterminée suffisante

pour réduire ou supprimer le pouvoir infectieux des micro-

organismes tout en retenant la quasi-totalité de l'anti-

génie des micro-organismes infectieux.

3 Procédé de traitement d'une composition prati-

quement anhydre renfermant le Facteur VIII pour réduire ou supprimer le pouvoir infectieux des micro-organismes présents dans la composition, caractérisé en ce qu'il consiste à chauffer la composition pendant une période prédéterminée à une température prédéterminée suffisante

pour inactiver les micro-organismes présents dans la compo-

sition, et à ajouter de l'eau stérilisée à la composition une fois terminée ladite opération de chauffage jusqu'à

ce que lasolubilisation de la composition ait été prati-

quement atteinte.

4 Procédé de traitement d'une fraction de plasma contenant le Facteur VIII pour inactiver quasi-totalement

tout virus de l'hépatite présent dans la fraction, caracté-

risé en ce qu'il consiste à lyophiliser la fraction du plasma pour accroître sa stabilité thermique et à chauffer la fraction de plasma lyophilisé pendant une période prédéterminée à une température prédéterminée suffisante pour rendre inactif le virus de l'hépatite présent dans

la fraction de plasma -

Procédé de traitement d'une fraction de plasma pour inactiver quasitotalement tout virus de l'hépatite présent dans la fraction du plasma, caractérisé en ce qu'il consiste à lyophiliser la fraction de plasma pour accroître sa stabilité thermique, à chauffer la fraction de plasma lyophilisé pendant une période prédéterminée à une température prédéterminée suffisante pour inactiver le virus de l'hépatite présent dans la fraction de plasma, et à ajouter de l'eau stérilisée à la fraction de plasma lyophilisé une fois terminée cette opération de chauffage jusqu'à ce que la solubilisation de la fraction lyophilisée

de plasma soit pratiquement obtenue.

6 Composition contenant des micro-organismes inactivés et au moins le Facteur VIII, caractérisée en ce que lesdits micro-organismes ont été inactivés par un

procédé qui consiste essentiellement à chauffer la composi-

tion dans un état pratiquement anhydre pour inactiver

lesdits micro-organismes, ladite composition étant prati-

quement dépourvue de la forme infectieuse active des micro-

organismes et ledit Facteur VIII étant principalement actif. 7 Composition lyophilisée, contenant un virus non infectieux de l'hépatite B et au moins le Facteur VIII, caractérisée en ce qu'elle est quasiment dépourvue dudit virus sous la forme infectieuse, ledit Facteur VIII étant

principalement actif.

8 Composition lyophilisée contenant le virus non infectieux de l'hépatite non-A, non-B et au moins le Facteur VIII, caractérisée en ce que ledit virus a

été rendu non infectieux par une opération consistant essen-

tiellement à chauffer le virus jusqu'à ce qu'il soit inactivé, ladite composition étant pratiquement dépourvue dudit virus sous la forme infectieuse et ledit Facteur

VIII étant principalement actif.

9 Procédé de désactivation d'un virus dans

une composition qui contient au moins un facteur anti-

hémophilique et qui est suspectéede contenir un virus infectieux, caractérisé en ce qu'il consiste à chauffer essentiellement la composition dans un état anhydre

jusqu'à ce que le virus ait été inactive.

Procédé de traitement d'une composition anhydre contenant le facteur hémophilique purifié au moins jusqu'à une plus grande activité en facteur anti-hémophilique par unité de poids de protéine que la concentration dudit facteur dans le plasma humain normal, et suspectée de contenir un virus infectieux, procédé caractérisé en ce qu'il consiste à chauffer la composition à l'état anhydre

jusqu'à ce que le virus ait été inactive.

11 Composition contenant un virus non infectieux et un facteur antihémophilique, caractérisée en ce que ledit virus a été rendu non infectieux par un procédé consistant essentiellement à chauffer le virus jusqu'à

ce qu'il ait été inactive, ladite composition étant prati-

quement dépourvue dudit virus sous la forme infectieuse

et le facteur anti-hémophilique étant sous la forme dénaturée.

12 Composition contenant un virus non infectieux et renfermant au moins le facteur VIII purifié au moins

jusqu'à une plus grande activité en facteur anti-

hémophilique par unité de poids de protéine que la concen-

tration dudit facteur dans du plasma humain,normal,

caractérisée en ce qu'elle est quasiment dépourvue dudit -

virus sous la forme infectieuse et dudit facteur sous la

forme dénaturée.

13 Composition caractérisée en ce qu'elle

comprend un virus non infectieux et une quantité thérapeu-

tiquement efficace de Facteur VIII, et en ce qu'elle est quasiment dépourvue dudit virus sous la forme infectieuse

et du Facteur VIII sous la forme dénaturée.

14 Procédé pour inactiver un virus dans une composition comprenant au moins le Facteur VIII en une quantité thérapeutiquement efficace, caractérisé en ce qu'il consiste à chauffer la composition à l'état anhydre

jusqu'à ce que le virus soit inactive.

Vaccin contre l'hépatite, caractérisé en ce qu'il comprend la composition d'une quantité efficace du point de vue immunogène de virus de l'hépatite inactivé dans une fraction de plasma sanguin en association avec

un véhicule correspondant.

16 Vaccin contreun virus indésirable, caracté-

risé en ce qu'il comprend la composition d'une quantité efficace du point de vue immunogène d'un virus inactivé dans une fraction de plasma sanguin en association avec

un véhicule correspondant.