DK171796B1

DK171796B1 - Fremgangsmåde til behandling af et blodstørkningsfaktor VIII koncentrat

Info

Publication number: DK171796B1
Application number: DK210283A
Authority: DK
Inventors: Alan Rubenstein
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 1982-05-13
Filing date: 1983-05-11
Publication date: 1997-06-02
Also published as: CH665125A5; ES8601701A1; ES8501627A1; ES538802A0; GB2120254B; DE3364057D1; DK210283A; GB2120254A; AR230186A1; EP0094611B1; EP0171506B1; AU569428B2; BR8302504A; CA1203165A; IE55008B1; ES8601700A1; EP0094611A3; AU5765986A; ZA833315B; US4456590A

Description

i DK 171796 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til behandling af et blodstørkningsfaktor VIII koncentrat, der i alt væsentligt er frit for blodstørkningsenzymer, for at minimere virkningen af uønskede vira i form af 5 AIDS virus, CMV virus og Epstein-Barr virus, til stede i blodstørkningsfaktor VIII koncentratet.

Anvendelse af størkningsfaktorkoncentrater opnået ud fra fraktioneret blodplasma med det formål at gribe terapeutisk ind over for nedarvede blødersygdomme, såsom hæmofi-10 li, bringes i alvorlig fare som følge af den uforholdsmæssige risiko, som den hæmofile patient udsættes for ved tilstedeværelsen af vira i koncentraterne. F.eks. anvendes i handelen tilgængelige faktor VIII og IX koncentrater typisk til at forøge størkningsevnen for en hæmofi-15 lisk patients blod, men disse koncentrater fremstilles ud fra forråd af plasma stammende fra tusinder af donorer og indeholder den medfølgende risiko for virussygdomme svarende til et lignende antal enkelte blodtransfusioner.

Som vist af McCullen og Zuckerman, se Journal of Medical 20 Virology, bind 8, nr. 29 (1981), overfører sådanne plasmaforråd helt klart såvel hepatitis B som non-A, non-B hepatitis trods streng sortering af individuelle donorer for hepatitis B overfladeantigener (HBsAg).

Hepatitisoverføring med albumin og andre varmestabile 25 plasmakomponenter, der ikke vedrører blodkoagulering, er hidtil blevet undgået ved at opvarme plasmakomponenterne i opløsning ved temperaturer på 60 °C i 10 timer. Lignende forsøg på at opvarme størkningsfaktorkoncentrater i opløsning har modsætningsvis vist sig i mærkbar grad at 30 reducere eller eliminere størkningsfaktoraktiviteten i koncentraterne og synes således ikke at give en levedygtig løsning på problemet med hepatitisoverføring forbundet med konventionel hæmofiliterapi. For nylig er højrenset faktor VIII præcipitat blevet opløst i en opløsning 35 af saccharoseglycin og opvarmet i 10 timer ved 60 °C. Skønt det faktor VIII koncentrat, der senere afledes fra 2 DK 171796 B1 det opvarmede præcipitat, bevarer størkningsfaktoraktivi-teten, er de udbytter, der opnås under anvendelse af dette forslag, meget lave, f.eks. ca. 8%. Se Heimburger, et al., Hemostatis, bind 10 (supplement 1), p. 204 (1981) og 5 Heimburger, et al., Blut, bind 44, p. 249-251 (1982).

PCT ansøgning nr. WO 82/03871 angår en fremgangsmåde til behandling af et blodstørkningsenzympræparat ved at opvarme dette til inaktivering af tilstedeværende vira, mens den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde 10 til behandling af et faktor VIII præparat, der er i alt væsentligt frit for blodstørkningsenzymer. WO 82/03871 angår ikke faktor VIII præparater, men derimod andre faktorpræparater .

Ved den foreliggende opfindelse inaktiverer, reducerer 15 eller eliminerer varmebehandlingen af et blodstørknings-faktor VIII koncentrat virkningen af eventuelt tilstedeværende vira i form af AIDS virus, CMV virus og Epstein-Barr virus uden at reducere størkningsfaktoraktiviteten.

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmå-20 de til fremstilling af et blodstørkningsfaktor VIII koncentrat, der i alt væsentligt er frit for blodstørkningsenzymer, for at minimere virkningen af uønskede vira i form af AIDS virus, CMV virus og Epstein-Barr virus til stede i blodstørkningsfaktor VIII koncentratet.

25 Fremgangsmåden er ejendommelig ved, at den omfatter lyo-philisering af blodstørkningsfaktor VIII koncentratet, opvarmning af det lyophiliserede blodstørkningsfaktor VIII koncentrat ved en forudbestemt temperatur på mindst ca. 60 °C op til 125 °C i et tilstrækkeligt langt tidsrum 30 til at minimere virkningen af eventuelt tilstedeværende vira i form af AIDS virus, CMV virus og Epstein-Barr virus i det humane blodstørkningsfaktor VIII koncentrat, idet opvarmningstiden almindeligvis falder, når den forudbestemte temperatur øges, under opretholdelse af en ak-35 tivitet på over 50%.

3 DK 171796 B1

En særlig fordelagtig udførelsesform for den foreliggende opfindelse er ejendommelig ved, at den omfatter lyophili-sering af blodstørkningsfaktor VIII koncentratet, opvarmning af det lyophiliserede blodstørkningsfaktor VIII kon-5 centrat i et forudbestemt tidsrum ved en forudbestemt temperatur på mindst ca. 60 °C op til 125 °C til inaktivering af uønskede mikroorganismer i form af AIDS virus, CMV virus og Epstein-Barr virus i blodstørkningsfaktor VIII koncentratet, idet opvarmningstiden almindeligvis 10 falder, når temperaturen øges, og rekonstituering af den lyophiliserede blodstørkningsfaktor VIII ved at forøge fugtindholdet deri til en forudbestemt mængde uden hensyn til den mængde fugt, der blev fjernet ved lyophilisering af blodstørkningsfaktor VIII, hvilken forudbestemt mængde 15 er tilstrækkelig til fuldstændigt at solubilisere den varmebehandlede, lyophiliserede blodstørkningsfaktor VIII, under opretholdelse af en aktivitet på over 50%.

Isoleringen af størkningsfaktorer til stede i menneskeblod har været uundgåelig ved forståelse af patologien 20 for hæmofili og andre arvelige blødersygdomme. Jævnsides hermed har opdagelsen af plasmafraktionssystemer til opnåelse af praktiske mængder størkningsfaktorkoncentrater gjort det muligt for den medicinske videnskab at anvende størkningsfaktorkoncentrater som terapeutisk værktøj ved 25 behandling af blødersygdomme. Transfusionsterapi under anvendelse af faktor VIII og faktor IX koncentrater har i særdeleshed vist sig helt tilfredsstillende til afhjælpning af hæmofile patienter. Uheldigvis bliver risikoen for hepatitisoverføring på grund af det store antal plas-30 madonorer, der kræves til kommerciel produktion af størkningsfaktorkoncentrater, tilbage som en vanskelig ulempe forbundet med transfusionsterapi. Et typisk plasmafraktionsskema omhandlet i "Seminars in Thrombosis and Hemo-statis", bind VI, nr. 1, p. 4 (1979) giver cryopræcipitat 35 og supernatant, hvor den første fraktion udgør en kilde for såvel faktor VIII koncentrat som fibrinogen, og sidstnævnte fraktion udgør en kilde for faktor IX koncen- 4 DK 171796 B1 trat foruden for faktor II, VIII og I koncentrater. Som vist af Gerety og Eyster i "Hepatitis Among Hemophiliacs", Non-A, Non-B Hepatitis, p. 103-106 (1981) fordeles hepatitis B virus oprindeligt til stede i helplasma 5 til faktor VIII og faktor IX derivater under plasmafraktioneringsprocessen. Som også vist af Maynard og Bradley, "Transmission by Blood Products", Non-A, Non-B Hepatitis, p. 78-79 (1981) forekommer non-A, non-B hepatitis i såvel faktor VIII som faktor IX derivater. Hidtidige forsøg på 10 at varmebehandle størkningsfaktorkoncentrater i opløsning med det formål at inaktivere hepatitis virus har vist sig ineffektive. Udviklingen af teknik til lyophilisering af størkningsfaktorderivater har imidlertid åbnet en ny vej til forskning med hensyn til stabilisering af størknings-15 faktorderivater under varmebehandlingsprocessen, hvilket igen giver et middel til inaktivering af vira til stede i størkningsfaktorderivaterne uden at ødelægge størkningsfaktoraktiviteten.

Prøveprocedurer til verificering af retention af størk-20 ningsfaktoraktivitet

Parrede prøver af forskellige lyophiliserede plasmafraktioner, hvor hvert sådant par har identiske prøvenumre, blev modtaget fra forskellige leverandører. Prøverne vejede almindeligvis mindre end 100 g og var pakket i medi-25 cinflasker med volumina på 60 ml til 90 ml. En prøve af hvert par blev opvarmet, enten ved at anbringe prøveflasken i et vandbad eller en tørreovn ved en forud bestemt temperatur under omgivelsernes tryk i et forud bestemt tidsrum, eller ved at anbringe det lyophiliserede materi-30 ale som sådant i en tørreovn uden flasken. Den tilbageblevne prøve i hvert par gemmes som kontrol og blev afkølet ved 4 °C til 6 °C under varmebehandlingsprocessen. Efter varmebehandling blev både kontrolprøven og den var-mebehandlede lyophiliserede prøve rekonstitueret med ste-35 rilt vand. Rekonstituering blev almindeligvis udført efter leverandørens specifikationer, skønt opløseligheden DK 171796 B1 s af nogle varmebehandlede prøver blev mærkbart forbedret ved at forøge mængden af sterilt vand anvendt under rekonstitueringen ud over den af leverandøren anbefalede mængde. In vitro faktor VIII afprøvninger blev udført un-5 der anvendelse af en éttrins manuel fibrometermetode ved fortyndinger liggende i området mellem 1:40 og 1:400 til opnåelse af et mål for faktor VIII og faktor IX størkningsaktivitet. Agarosegelelektroforese med en ILC-immu-noelektroforeseplade blev udført for flere af de parrede 10 faktor VIII prøver under anvendelse af antihumant gedese-rum fra Hyland Diagnostics som standard. Pladerne blev specifikt elektroforeseret med en Buchler-strømkilde indstillet på 25 ma i 35 minutter. Efter fuldendt elektrofo-rese blev pladerne inkuberet i antisera i 18-24 timer og 15 undersøgt under indirekte lys. Panagell-elektroforese med en Worthington Diagnostics plade blev udført på yderligere parrede prøver af faktor VIII koncentrat under anvendelse af en Biorad vandkølet elektroforesecelle.

Yderligere in vitro eksperimenter blev foretaget ved op-20 varmning af lyophiliserede prøver af faktor VIII koncentrat i et vandbad ved stuetemperatur og ved forud bestemte temperaturer i forud bestemte tidsrum. Faktor VIlIAg blev derpå bestemt under anvendelse af den metode, der er beskrevet af Laurell, "Electroimmuno Assay", The Scandi-25 navian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, bind 29, pp. 21-37 (1972). Faktor VIII resultater blev beregnet for fortyndinger på 1:40, 1:80, 1:100 og 1:200 ved afbildning af højderne for toppene for Laurell-stan-dardkurven mod den procentvise fortynding. Ukendt blev 30 udtrykt som en procentdel af normal, baseret på tophøjderne for de ukendte i standardkurven.

In vivo genvinding af størkningsfaktoraktivitet for varmebehandlede faktor VIII koncentrater blev målt ved at indsprøjte rekonstituerede, varmebehandlede lyophilisere-35 de faktor VIII koncentrater i hunde med hæmofili A. Labo-ratorieparametre, herunder Hct, serumprotein, WBC, plade- 6 DK 171796 B1 tælling, blodudsmøring, respirationshastighed, legemstemperatur, puls og størkningsfaktoraktivitet blev derefter bedømt for hvert af dyrene ved forskellige intervaller efter injektionerne.

7 DK 171796 B1

Resultater af in vitro afprøvning foretaget på faktor VIII koncentrat er summariseret i tabel I og II.

TABEL I

Målinger af størkningsfaktoraktivitet efter varmebehandling af lyophiliseret faktor VIII koncentrat

Prøve Temp. Tid, timer Fortynding Aktivitet, % * A C-1081 Kontrol — 1:20 C—1081 Kontrol — 1:40 For varmebehandlede prøver blev der i C-1081 Kontrol — 1:80 forhold til kontrol len observeret en " 60°C. 10 1:20 forøgelse på ca.

" " " 1:40 10».

" " " 1:80 A NC-8247 Kontrol — 1:40 1438 " ” — 1:80 1697 " 62°-64°C. 16,33 1:40 1215 1:80 1360 B AHF-355 Kontrol — 1:40 1912 " " — 1:80 1600 " " — 1:160 1312 " 64 °C 20 1:40 1080 " " " 1:80 1072 74°C. 17 1:40 1144 " " " 1:80 1024 " " " 1:160 864 " 76°C. 17 1:40 1040 1:80 976 B 347 Kontrol — 1:100 1180 1:200 100 " 83°C. 24 1:100 100 " " " 1:200 100 " 85°C. 24 · 1:100 1 8 DK 171796 B1 T ABEL I, fortsat

Prøve Temp. Tid , timer F ortyndinq Aktivitet, % B 347 95°C. 7 1:100 1 " 91°C. 7,5 1:200 1 C Al-0470 Kontrol — 1:100 912 " 75°C. 20 1:100 2076 C Al-1080 Kontrol — 1:200 2080 " " -- 1:400 1920 " 80 ° C. 24 1 :200 1380 1:400 1360 C Al-1120 Kontrol — 1:40 2800 " " — 1:80 2032 " 78 °C. 21 1 :40 1592 " " " 1:80 1392 " 80 ° C. 20 1 :40 1176 " ” " 1:80 1600 " 90°C. 12 — Størknet prøve " 100°C. 1,5 1:40 1248 ” n " 1:80 1264 C Al-1150 Kontrol — 1:40 2176 " " — 1:80 2480 " " — 1:100 1870 " 65 ° C.** 26,33 1:40 1592 " " " 1:80 1520 83 °C. 24 1:100 730 " " " 1:200 620 " 85 °C. 24 1:100 1000 " " " 1:200 1160 " 90°C. 10 1:40 1032 " " " 1:80 1056 " 95°C. 7 — Størknet prøve " 91°C. 7,5 1:100 ’ 80 " " " 1:200 100 " 100°C. 10 1:40 88 " " " 1:80 48 9 DK 171796 B1 TABEL I, fortsat

Pr øv e Temp. Tid, timer F ortyndinq Aktivitet, % C Al-1160 Kontrol — 1:100 3680 " " — 1:200 3420 " " — 1:400 3200 " 78°C. 24 1:100 2420 " " " 1:200 · 1520 μ η it 1:400 1440 " 78°C. 24 1:200 1720 " " » 1:400 1680 " 80 °C 22 1:200 1400 " " " 1:400 1360 " 100°C. 7 1:200 1760 ti ti i· 1:400 1760 C Al-2120 Kontrol — 1:100 8 6 " 110°C**** 1,5 1:100 18 C Al-2531 Kontrol — 1:200 3500 » « — 1: 400 27 0 0 " 85°C. 20 1:200 46 i it ii 1:400 43

Note: Alle tider og temperaturer er tilnærmelsesvise.

Efter varmebehandling ved højere temperaturer blev der til nogle koncentrater sat sterilt vand i overskud ud over leverandørens anbefalinger, indtil en solubilisering kunne bekræftes visuelt.

* A-prøver blev fremstillet af Cutter Laboratories, B-prøver blev fremstillet af Michigan Red Cross, C-prøver blev fremstillet af Alpha Therapeutics.

** Varmebehandlet i en tørreovn (prøve fjernet fra flasken).

*** Varmebehandlet i en tørreovn (prøve indeholdt i flasken).

10 DK 171796 B1

TABEL II

Bestemmelse af faktor VIII efter Ag

Varmebehandling af 1 yophi 1 i seret faktor VIII koncentrat

Prøve T emp ♦ Tid, timer F ortyndinq Tophøjde, mm Ag ,-% B AHF-355 Kontrol — 1:40 35 3720 " " — 1:80 22 4080 " 64 °C. 20 1:40 39 4240 1:80 26 5120 " 74°C, 17 1:40 40 4400 " " " 1:80 26 5120 C Al-1120 Kontrol — 1:100 15 4700 " 90°C. 12 1:100 0 0 C Al-Il50 Kontrol — 1:200 13 7200 " 83°C. 24 1:200 12 6200 " 85°C. 24 1:200 15 9400 " 97°C. 7,5 1:200 0 0

Note: Alle tider og temperaturer er tilnærmelsesvise.

* B-prøver blev fremstillet af Michigan Red Cross, C-prøver blev fremstillet af Alpha Therapeutics.

11 DK 171796 B1

Diskussion af udvalgte prOveresultater

De resultater, der er samlet i tabel I-II, kan kombineres til tilvejebringelse af en relativ indikation af størk-5 ningsaktivitetsretentionen i lyophiliserede plasmafraktioner underkastet den omhandlede varmebehandlingsproces. Mere specielt kan den procentvise aktivitet eller målte udvinding af forskellige fortyndinger af rekonstitueret faktor VIII koncentrater bestemmes som gennemsnit for en-10 kelte kontrolprøver og sammenlignes med lignende procentvise gennemsnitsaktiviteter eller målt udvinding i tilsvarende parrede prøver af varmebehandlet faktor VIII koncentrat. Hvor sådanne sammenligninger foretages, vil det ses, at f.eks. lyophiliseret faktor VIII koncentrat 15 opnået fra én leverandør (Lot A C-1081) og opvarmet ved 60 °C i 10 timer bibeholdt mere end 90% af sin in vitro faktor VIII størkningsaktivitet i sammenligning med en uopvarmet kontrol. Det rekonstituerede, varmebehandlede faktor VIII koncentrat udviste yderligere en absorbans på 20 0,30-580 nm i sammenligning med en absorbans på 0,20 for den uopvarmede kontrol og udviste ingen forskelle over for den uopvarmede kontrol efter immunoelektroforese med antihumant gedeserum. Rekonstituerede faktor VIII koncentrater fra en anden prøve (Lot A NC-8747) fra samme leve-25 randør, som var blevet opvarmet på lyophiliseret form ved 62-64 °C i ca. 16 timer og derpå opbevaret ved 6 °C i 7 dage, udviste mere end 80%'s udvinding af faktor VIII størkningsaktivitet i sammenligning med en uopvarmet kontrol. En total forøgelse i anodal vandring i forhold til 30 den uopvarmede kontrol blev noteret efter immunoelektroforese med antihumant gedeserum.

På lignende måde udviste lyophiliseret faktor VIII koncentrat opnået fra en anden leverandør (Lot C Al-1120), 35 når det blev opvarmet ved ca. 78 °C i 21 timer, 22%'s retention af størkningsaktivitet in vitro efter konstitue- 12 DK 171796 B1 ring sammenlignet med en uopvarmet kontrol. Rekonstitueret faktor VIII koncentrat fra samme prøve fra den anden leverandør bibeholdt, efter varmebehandling på lyophili-seret form i 20 timer ved ca. 80 °C, stadig 57%'s størk-5 ningsaktivitet in vitro sammenlignet med en uopvarmet kontrol, hvorimod rekonstitueret faktor VIII fra samme prøve fra den anden leverandør, som forud var blevet opvarmet på lyophiliseret form i 1,5 time ved ca. 100 °C, bibeholdt ca. 52%'s størkningsaktivitet in vitro sammen-10 lignet med en uopvarmet kontrol. Når en anden prøve (Lot C Al.1150) lyophiliseret faktor VIII koncentrat fra den anden leverandør blev varmebehandlet i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, lå genvindingen af størkningsaktivitet i sammenligning med den ubehandlede 15 kontrol fra 67% for varmebehandling i 26 timer og 20 minutter ved 65 °C til 34% ved varmebehandling i 24 timer ved 83 °C til 55% ved varmebehandling i 24 timer ved 85 °C. Målinger af faktor VIII antigen for de to prøver af faktor VIII koncentrat varmebehandlet ved henholdsvis 83 20 og 85 °C viste et tab på 15% og intet tab i antigenkoncentration. Det skal også bemærkes, at der blev opnået i høj grad forbedret solubilisering af sidstnævnte prøver af varmebehandlet faktor VIII koncentrat ved at tilsætte mellem 50 ml og 75 ml sterilt vand til prøven frem for 25 25 ml som anbefalet af leverandøren.

Varmebehandling af lyophiliseret faktor VIII prøver opnået fra en tredje leverandør (Lot AHF-355) bekræftede resultater observeret for de første to leverandører. Det 30 vil sige, at varmebehandling af den tredje leverandørs lyophiliserede faktor VIII koncentrat i 20 timer ved 64 °C gav en størkningsaktivitetsgenvinding på 61% i sammenligning med en ubehandlet kontrol, varmebehandling af samme koncentrat i 17 timer ved 74 °C gav størkningsak-35 tivitetsgenvinding på 63% og varmebehandling af samme koncentrat i 17 timer ved 76 °C gav størkningsaktivitets- 13 DK 171796 B1 genvinding på 57%. Faktor VIII antigenkoncentrationerne i de rekonstituerede prøver opvarmet ved 64 °C og 74 °C udviste ingen nedgang i sammenligning med koncentrationen i den uopvarmede kontrol.

5

Som tidligere anført blev in vivo afprøvning af varmebe-handlede faktor VIII koncentrater udført under anvendelse af hæmofili A eller faktor VIII manglende hunde. Hunden med hæmofili A modtog rekonstitueret faktor VIII koncen-10 trat, som forud var blevet varmebehandlet på lyophilise-ret form ved 60 °C i 10 timer. Resultaterne af in vivo afprøvningen er rapporteret i tabel III.

03 14 DK 171796 B1 *-H Osl CO CO CO 00

Z3 ΓΑ fA O O <-H O

O «-Η 1—Λ «-Η r-H f“H «-1 C c ic ω cd

Ή o C C

Q. Ή CO CM C C o CM

CO -U

0) ® CD CO

4-> oz u

CD

Ch · O ΓΛ O CT\ iA O

jjq. - ~ ~ ~ ~ ~ C E Li. O CM —i O O ^4 ω <Doo ooooo

O H— *—I r—{ r—\ r-H hH

C

o x o

HH HH X—N

•—i hh _.CNO Cs] CH lA CTs ØN

HH HH β® I CO *“H *“H <—l =3 DS V hh <J· I ^ ti u.

0 -H> j* <c CO oz o\

U- LA

hh \D r—i csi l CO On O

H-J *-H O LA II SOIAlA

O HH r-H »-H C ·* r-H *—I i-H

'-H > CO

TO 1 LA

C U_ *~H

CD

M r

^ CD

^ -O

CD fA

—1 E u e o OOOOO

ti-1 t-, (DEOtiOOOOO

°9 cd O OCDOOOOO

** > CO'O-tJOcn^HiACO

^Ht-il^aJiHvOr^vDOs -U Ql. Q„ ΙΆ D ( c—< fsj »-H

CD C

> -A

•Ή £ cr “D ΓΑ la

C ElA - OOlAiAlA

•Ή OEONfAOvLAHHCOvJ· CO Γ*- —C O r~i CN4

“D 3.rA'ArA\0iA<jrA

C Ch D Q. -u)

-C CD

> 0) C ·Ή TO ·Η O' C 0)eS<—CTOOnO*—lOtfs (DoJ *s c ^ *- ** ·*> ·>

♦—l O O' n£5 ·ή iA v0 \0 lA

σ u CD. ·-(

co E

E

O

I—« å? CM

HI

HH I— <J- l/~\ r-~ <f KN <t > ο <t <t <r <r <f 1 x u.__

1-4 Ch U

C CD CD CD

Ο · · E E E

•Ή C C Ή ·Ή *»H

CO -H *H M-> 4J «Η>

3 E E

Ld Ch. fA lA lA

£T C ιΑ O

Ot. *-h ·—1 On I— 15 DK 171796 B1

De i tabel III rapporterede resultater illustrerer rigeligt den udprægede forøgelse i faktor VIII størkningsaktiviteten for en hæmofili A hund efterfulgt af injektion af varmebehandlet faktor VIII koncentrat. Det tilsynela-5 dende fravær af fysiologisk spænding eller anden uheldig reaktion som ses fra data i tabel III antyder, at faktor VIII koncentrater, som er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, forbliver biologisk acceptable.

10 Det er nu blevet vist, at faktor VIII koncentrater sikkert kan varmebehandles på lyophiliseret form ved forhøjede temperaturer i længere tid uden væsentlig ødelæggelse af størkningsaktiviteten for koncentraterne.

15 Ved opfindelsen kan man inaktivere uønskede mikroorganismer, såsom virus, der står i relation til AIDS, nemlig Acquired Immune Deficiency Syndrome, cytomegalovirus og Epstein-Barr virus.

20 Endvidere kan der anvendes forskellige tørringsmetoder for faktor VIII koncentrater nemlig sprøjtetørring eller vakuumtørring.

Tilsætningen af sterilt vand til tørt eller lyophiliseret 25 faktor VIII koncentrat i mængder større end de volumina, der foreslås af leverandørerne, danner faktor VIII koncentratopløsninger med større fortynding end normalt anbefalet; men effektiviteten af faktor VIII koncentrat ødelægges ikke mærkbart. Dette er særlig nyttigt, hvor de 30 temperaturer, til hvilke faktor VIII koncentratpræparatet skal opvarmes for at gøre uønskede mikroorganismer inaktive, såsom vira, er så høj, at størkning af det rekonstituerede faktor VIII koncentrat normalt ville forekomme, med mindre der tilsættes overskud af sterilt vand.

35 16 DK 171796 B1

Almindeligvis kan en terapeutisk effektiv dosis af AHF let bestemmes af fagmanden på området. Den vil afhænge af patientens kliniske tilstand, især af den type tapning, der regnes med. Almindeligvis skal der infuseres en til-5 strækkelig mængde AHF til at give et patientplasma-AHF-niveau på mindst 30% af det, der findes i normale individer, skønt 50% er mere foretrukkent ved alvorlige forblødninger. Dette kan ske ved infusion af et totalt antal AHF-enheder som defineret ved: enheder påkrævet ® legems-10 vægt (kg) x 0,4 x ønsket AHF-forøgelse (i % af det normale).

AHF-koncentrationen i infusatet skal helst ikke overskride 34 enheder/ml, men være større end 15 enheder/ml. Hvis 15 koncentrationen overskrider 24 enheder/ml, kan der ikke infuseres mere end 2 ml pr. minut. Infusater med mindre end 34 AHF-enheder kan infuseres hurtigere, af størrelsesordenen 10-20 ml i løbet af 3 minutter. En AHF-enhed er defineret som aktiviteten af AHF til stede i 1 ml nor-20 malt samlet humant plasma, der er mindre end 1 time gammelt .

AHF-præparaterne kan befries for andre plasmaproteiner i varierende grad under rensningsprocessen, afhængigt af, 25 hvilken proces, der anvendes. Sådanne plasmaproteiner indeholder blodstørknende enzymer (heri brugt i betydningen såvel inaktive proenzymer som aktiverede enzymer), såsom prothrombin-kompleks eller faktor IX koncentrat (faktorer II, VII, IX og X). Faktorer XII eller XIII, fibrinogen, 30 albumin og gammaglobulin. Når et AHF-præparat er i alt væsentligt frit for blodstørkende enzymer, indeholder det subterapeutiske aktiviteter for enzymerne. AHF-præparater kan renses i en sådan grad, at aktiviteten af ethvert blodstørknende enzym er på sporstofniveau, almindeligvis 35 mindre end ca. 15 enheder/g protein og foretrukkent mindre end ca. 5 enheder/g protein. Forholdet mellem AHF- 17 DK 171796 B1 enheder og en vilkårlig individuel enzymenheds aktivitet i sådanne præparater ligger almindeligvis på ca. 10:1 til 500:1 og er foretrukkent større end 300:1. En enhed for enzymaktivitet for hver af de forskellige størkningsen-5 zymer i deres aktiverede eller proenzymformer er defineret i PCT ansøgning nr. WO 82/03871.

De varmebehandlede AHF-præparater administreres hovedsagelig til patienter med medfødt mangel på AHF. Disse pa-10 tienter kan ikke syntetisere biologisk aktivitet AHF og må skelnes fra de, der har erhvervet AHF-inhibitorer (sandsynligvis antistoffer), som også forårsager symptomer på hæmofili. Sidstnævnte gruppe behandles foretruk-kent med aktiverede størkningsenzympræparater. Størk-15 ningsenzympræparaterne indeholder terapeutisk aktive mængder af enzymerne.

De heri omhandlede forbedrede AHF-præparater indeholder således lavere mængder denatureret AHF end produceret un-20 der anvendelse af hidtil anvendte processer. Almindeligvis er mængden af denatureret AHF mindre end ca. 50% af den totale mængde aktivt og denatureret AHF i præparatet.

Den ligger foretrukkent i området ca. 30-10%. Mængden af denatureret AHF svarer til det procentvise tab i AHF-en-25 heder efter underkastelse af det virus-inficerede AHF-præparat for varmebehandlingsmetoden som heri beskrevet.

Virkningen af opvarmning af virus-contamineret AHF på tør form kan følges ved at prøve AHF-størkningsaktiviteten, . 30 som beskrevet i det foregående, og den virale titer. Hvor det er vanskeligt at måle biologisk aktiv viral titer, som det er tilfældet med hepatitis vira, anvendes candi-dat-vira, såsom bakteriofage, sindbis, adenovirus eller EHC-virus, som omhandlet i PCT ansøgning nr. W0 82/03871.

35 En forud bestemt titer for candidat-virus podes i en opløsning af det præparat, der skal varmebehandles, opløs- 18 DK 171796 B1 ningen lyophiliseres, og forskellige varmebehandlinger foretages. Man vælger det punkt, ved hvilket faktiske målinger eller regressionsanalyser (statistisk extrapolation) indikerer den ønskede grad af viral inaktivering ef-5 ter forholdene, som vil styre varmebehandlingen af produktet. Disse betingelser vil generelt være tiden og temperaturen for viral inaktivering, skønt fugtindholdet for præparatet også vil være en variabel, der kan kontrolleres. Tid og temperatur er beskrevet i det foregående.

10 Fugtindholdet skal helst være under 5 vægt-%, almindeligvis mindre end 1 vægt-%.

Skønt nogen inaktivering og denaturering af AHF finder sted i den tørre tilstand under opvarmningsprocessen, 15 sker det i lavere grad end inaktiveringen af selv de mere robuste candidat-vira eller hepatitisvirus. Således kan det inficerede AHF-præparat gøres i alt væsentligt frit for virus på infektiøs form. Dette betyder, at titeren for virus reduceres i så høj grad, at infusion af tera-20 peutiske mængde af produktet i et flertal af normale dy-reværter for viruset ikke vil give klinisk eller serologisk sandsynlighed for infektion i en værtspopulation eller vil i betydelig grad udskyde igangsætningen af infektionen i en sådan population. Hvor en ækvivalent vævskul-25 turprøve er tilgængelig til at bestemme den biologiske infektivitet, kan den anvendes i stedet for normale dyre-værter som indikation for infektivitet.

Den milde tørstadieopvarmningsproces som heri omhandlet 30 bevarer i alt væsentligt hele antigeniciteten for de in-fektiøse mikrober, det vil sige de epitopiske steder for organismerne denatureres ikke irreversibelt. Dette er i modsætning til andre metoder, der involverer covalente reaktioner med kemiske stoffer, højenergibestråling eller 35 yderliggående opvarmning.

19 DK 171796 B1

Opvarmningstrinnet kan udføres i lukkedé eller åbne beholdere, som anført i det foregående, og udføres mest effektivt ved enkel, ikke-kostbar teknik, såsom kontaktopvarmning af produktbeholdere, som ovne eller vand- eller 5 sandbade, eller ved infrarød bestråling. Af hensyn til sikkerhed og på grund af prisen foretrækkes mikrobølgeopvarmning ikke.

Adskillige udførelsesformer for den foreliggende opfin-10 delse er blevet beskrevet i det foregående. Det vil imidlertid forstås, at der kan foretages forskellige modifikationer af temperaturområderne, opvarmningsperioderne og renhedsniveauerne som anført i forbindelse med de før nævnte udførelsesformer af fagmanden på området uden at 15 afvige fra opfindelsens ramme.

Claims

1. Fremgangsmåde til behandling af et blodstørkningsfaktor VIII koncentrat, der i alt væsentligt er frit for 5 blodstørkningsenzymer, for at minimere virkningen af uønskede vira i form af AIDS virus, CMV virus og Epstein-Barr virus til stede i blodstørkningsfaktor VIII koncentratet, hvilken fremgangsmåde er kendetegnet ved, at den omfatter lyophilisering af blodstørk-10 ningsfaktor VIII koncentratet, opvarmning af det lyophi-liserede blodstørkningsfaktor VIII koncentrat ved en forudbestemt temperatur på mindst 60 °C op til 125 °C i et tilstrækkeligt langt tidsrum til at minimere virkningen af eventuelt tilstedeværende vira i form af AIDS virus,

15 CMV virus og Epstein-Barr virus i det humane blodstørkningsfaktor VIII koncentrat, idet opvarmningstiden almindeligvis falder, når den forudbestemte temperatur øges, under opretholdelse af en aktivitet på over 50%.

2. Fremgangsmåde til behandling af et blodstørkningsfak-20 tor VIII koncentrat, der i alt væsentligt er frit for blodstørkningsenzymer, for at minimere virkningen af uønskede vira i form af AIDS virus, CMV virus og Epstein-Barr virus til stede i blodstørkningsfaktor VIII koncentratet, hvilken fremgangsmåde er kendeteg-25 net ved, at den omfatter lyophilisering af blodstørkningsfaktor VIII koncentratet, opvarmning af det lyophiliserede blodstørkningsfaktor VIII koncentrat i et forudbestemt tidsrum ved en forudbestemt temperatur på mindst ca. 60 °C op til 125 °C til inaktivering af uøn-30 skede mikroorganismer i form af AIDS virus, CMV virus og Epstein-Barr virus i blodstørkningsfaktor VIII koncentratet, idet opvarmningstiden almindeligvis falder, når temperaturen øges, og rekonstituering af den lyophiliserede blodstørkningsfaktor VIII ved at forøge fugtindholdet 35 deri til en forudbestemt mængde uden hensyn til den mængde fugt, der blev fjernet ved lyophilisering af blodstørkningsfaktor VIII, hvilken forudbestemt mængde er DK 171796 B1 tilstrækkelig til fuldstændigt at solubilisere den varme-behandlede, lyophiliserede blodstørkningsfaktor VIII, under opretholdelse af en aktivitet på over 50%.