JP4920552B2 - ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
また、近年では、食品分野においても、保健効果や機能性等、付加価値に対する消費者の関心が高まっており、ヒアルロン酸は、それが持つ機能性により種々の効果が期待できることから、食品素材の一つとしても注目されている。
しかしながら、これらの微生物のうちランスフィールド(Lancefield)血清群のA型菌やパスツレラは、ヒトに対する病原菌として知られており、また、これら何れの菌もストレプトリジン(可溶性溶血素)を生成し、β−溶血性を示すことから、これらの微生物を利用した工業的なヒアルロン酸の製造方法に関しては、安全性を確保するため、無毒化した菌株を利用する他、当該微生物が産生したヒアルロン酸から有害物を除去する工程により精製するなどの別途の手段を講じる必要が生じ、製造面でも作業性はあまりよいとはいえない。
更に言えば、一般に、微生物を用いた培養法によるヒアルロン酸の製造法は、生産性が低いことが指摘されていることから、これを改善するための手段も必要であり、これまでにも多くの報告がなされているが、未だに安価かつ簡便にヒアルロン酸を生産する技術を確率するまでには至っていないのが現状でもある(特許文献5−8参照)。
ここで、培地に添加して使用する大豆ペプチドとは、大豆タンパク質を加水分解或いは発酵することにより得られるアミノ酸が複数個結合した物質である。
本発明において使用できる大豆ペプチドは、特に限定されるものではないが、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌のヒアルロン酸産生能に与える作用を考慮して、遊離のアミノ酸が2%以下の大豆ペプチドを使用することが望ましい。
なお、このような大豆ペプチドとしては、例えば、ハイニュートD1やハイニュートDHなどを挙げることができ、これらは不二製油(株)社等により入手することが可能である。
(1)菌株及び培養
ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT2084株(FERM BP−10879)を下記方法に従って培養した。
10%スキムミルク溶液に1%大豆ペプチド(ハイニュートDH、不二製油(株)社製)を添加した培地(1L)をオートクレーブで121℃、15分間滅菌し、これにストレプトコッカス・サーモフィルスYIT2084株(FERM BP−10879)のスターターを0.1%接種し、35℃で24時間培養した。このときの培養は、培地のpHを8Nの水酸化ナトリウム水溶液を用いて6.8付近に調節しながら、回転数100rpmの条件で攪拌して行った。
前記により得た培養液(1L)を氷中で冷却し、終濃度が10%w/vになるようにトリクロロ酢酸(以下「TCA」という)を加え、4℃で2時間静置した。これを18,700Gの条件で30分遠心分離し、生じた沈殿を除去した後、上清にさらに99%冷エタノールを等量加えて、4℃で一晩静置した。静置後、18,700Gの条件で30分遠心分離して生じた沈殿を分離し、これに純水を加えて溶解し、Spectra/Por Membrane(MWCO3500)を用いて透析を行い、凍結乾燥してIPSを得た。
前記して得たIPSをSephacryl S−400HR(φ16mm×900mm)GPCカラムクロマトグラフィーにて、流速0.25mL/minのNH4HCO3で溶出させて精製した。この精製IPS5mgに重水0.6mLを加えて溶解し、アセトンを内部標準としてJOEL ECA-500FT-NMR装置(TH5FG2型オートチューン磁場勾配型検出器)により、30℃で1H-NMRおよび13C-NMRスペクトルを測定した。なお、1H-NMRスペクトルは、ダンテパルスによるプリサチュレーション(presaturation)法により水信号を消去しながら測定し、13C-NMRスペクトルは完全デカップル法で測定した。
また、比較対照として、ヒアルロン酸標準品(ヒアルロン酸ナトリウム;和光純薬工業(株)社製)についても同様に1H-および13C-NMRスペクトルを測定した。測定した各NMRスペクトルはそれぞれ図1〜4に示した。また、13C-NMRスペクトルについては、化学シフト(δppm)値を比較したので、その結果を表1に示した。なお、ヒアルロン酸は下記式(1)構造を有する化合物である。
一方、図3に示した通り、IPSの13C-NMRスペクトルには、14の明確なシグナルが検出され、これも図4に示すヒアルロン酸標準品の13C-NMRスペクトルと良く似ていた。更に、表1からも明らかなとおり、13C-NMRスペクトルについては、化学シフト(δppm)値の比較においてもほぼ同様の値を示しており、このことから、IPSとヒアルロン酸標準品とがほぼ同一の構造を有することが示唆された。
(2)で得られたIPS10mgをネジ口試験管に秤量し、5%塩酸メタノール1mLを加えて密栓し、100℃で2時間加熱した。冷却後、2500rpmで5分遠心分離し、上清を分取した。なお、生じた沈殿はメタノールを加えて洗浄し、上澄み液を前記上清に加えた。
前記して得たメタノール溶液をエバポレーターで濃縮し、残さに4Mのトリフルオロ酢酸(TFA)を1mL加えて100℃で1時間加熱し、さらにエバポレーターで濃縮した。濃縮残さにMilliQ水1mLを加えて酸加水分解試料溶液とした。この酸加水分解試料溶液200μlに0.5M 1−フェニル−3−メチル−5−ピラゾロン(PMP)メタノール200μlと0.6M水酸化ナトリウム溶液100μlを加えて攪拌し、70℃で30分間加熱した。冷却後、0.1M塩酸600μlを加え、更にクロロホルム1mLを加えて、未反応のPMPを分液により抽出し、水相を以下の通りHPLCに供した。
(2)で得られたIPSを10mg/mLとなるように50mM塩化ナトリウム溶液で溶解し、以下の通りHPLCに供した。また、同条件でヒアルロン酸標準品(ヒアルロン酸ナトリウム;和光純薬工業(株)社製)についてもHPLCを測定した。その結果を図5に示した。
(1)菌株及び培養
ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT2084株(FERM BP−10879)を下記方法に従って培養した。
10%スキムミルク溶液に0.1%大豆ペプチドを添加した培地(1L)をオートクレーブで121℃、15分間滅菌し、これにストレプトコッカス・サーモフィルスYIT2084株(FERM BP−10879)のスターターを0.1%接種し、35℃で24時間培養した。このときの培養は、培地のpHを8Nの水酸化ナトリウム水溶液を用いて6.8付近に調節しながら、回転数100rpmの条件で攪拌して行った。また、比較対照として大豆ペプチドを添加しない培地を調製し、ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT2084株(FERM BP−10879)のスターターを0.1%接種し、同様の条件で培養した。
なお、大豆ペプチドとしては、ハイニュートD1またはハイニュートDH(いずれも不二製油(株)社製)を使用した。
前記により得た各培養液(1L)を氷中で冷却し、終濃度が10%w/vになるようにTCAを加え、4℃で2時間静置した。これを18,700Gの条件で30分遠心分離し、生じた沈殿を除去した後、上清にさらに99%冷エタノールを適量加えて、4℃で一晩静置した。静置後、18,700Gの条件で30分遠心分離して生じた沈殿を分離し、これに純水を加えて溶解し、Spectra/Por Membrane(MWCO3500)を用いて透析を行い、凍結乾燥してIPSを得た。得られたIPSの収量を表4に示した。
(1)菌株及び培養
ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT2084株(FERM BP−10879)を下記方法に従って培養した。
10%スキムミルク溶液に0.1%および1.0%の大豆ペプチド(ハイニュートDH、不二製油(株)社製)を添加した培地(1L)をオートクレーブで121℃、15分間滅菌し、これにストレプトコッカス・サーモフィルスYIT2084株(FERM BP−10879)のスターターを0.1%接種し、35℃で24時間培養した。このときの培養は、培地のpHを8Nの水酸化ナトリウム水溶液を用いて6.8付近に調節しながら、回転数100rpmの条件で攪拌して行った。
前記により得た各培養液(1L)を氷中で冷却し、終濃度が10%w/vになるようにTCAを加え、4℃で2時間静置した。これを18,700Gの条件で30分遠心分離し、生じた沈殿を除去した後、上清にさらに99%冷エタノールを適量加えて、4℃で一晩静置した。静置後、18,700Gの条件で30分遠心分離して生じた沈殿を分離し、これに純水を加えて溶解し、Spectra/Por Membrane(MWCO3500)を用いて透析を行い、凍結乾燥してIPSを得た。得られたIPSの収量を表5に示した。
(1)菌株及び培養
ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT2084株(BP−10879)を下記方法に従って培養した。
10%スキムミルク溶液(1L)をオートクレーブで121℃、15分間滅菌して培地とし、これにストレプトコッカス・サーモフィルスYIT2084株(FERM BP−10879)のスターターを0.1%接種し、35℃で24時間培養した。このときの培養は、培地のpHを8Nの水酸化ナトリウム水溶液を用いて所定の範囲に調節しながら、回転数100rpmの条件で攪拌して行った。
前記により得た各培養液(1L)を氷中で冷却し、終濃度が10%w/vになるようにTCAを加え、4℃で2時間静置した。これを18,700Gの条件で30分遠心分離し、生じた沈殿を除去した後、上清にさらに99%冷エタノールを適宜加えて、4℃で一晩静置した。静置後、18,700Gの条件で30分遠心分離して生じた沈殿を分離し、これに純水を加えて溶解し、Spectra/Por Membrane(MWCO3500)を用いて透析を行い、凍結乾燥してIPSを得た。得られたIPSの収量を表6に示した。
(1)菌株及び培養
試験例1と同様の方法により、培地の溶存酸素量を調整しながらストレプトコッカス・サーモフィルスYIT2084株(FERM BP−10879)を培養した。なお、溶存酸素の調整は、酸素の通気量と攪拌回転数を制御して行った。
前記により得た各培養液(1L)を氷中で冷却し、終濃度が10%w/vになるようにTCAを加え、4℃で2時間静置した。これを18,700Gの条件で30分遠心分離し、生じた沈殿を除去した後、上清にさらに99%冷エタノールを適宜加えて、4℃で一晩静置した。静置後、18,700Gの条件で30分遠心分離して生じた沈殿を分離し、これに純水を加えて溶解し、Spectra/Por Membrane(MWCO3500)を用いて透析を行い、凍結乾燥してIPSを得た。得られたIPSの収量を表7に示した。
Claims (4)
- ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を培地に接種して培養することを特徴とするヒアルロン酸の製造方法。
- ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌がストレプトコッカス・サーモフィルスYIT2084株(FERM BP−10879)である請求項1記載のヒアルロン酸の製造方法。
- 大豆ペプチドを添加した培地を用いることを特徴とする請求項1又は2記載のヒアルロン酸の製造方法。
- 培地が更に乳成分を含む培地であることを特徴とする請求項1、2又は3記載のヒアルロン酸の製造方法。
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