JP7370196B2

JP7370196B2 - 改良されたヒアルロン酸の製造方法

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Publication number: JP7370196B2
Application number: JP2019162229A
Authority: JP
Inventors: 直樹伊澤; 慎也柴田
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2019-09-05
Filing date: 2019-09-05
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2039-09-05
Also published as: JP2021036841A

Description

IPOD

FERM BP-10879

本発明は、乳酸菌によるヒアルロン酸の改良された製造方法に関するものである。

ヒアルロン酸は、コンドロイチン硫酸やヘパリン等とともに高価なグルコサミノグルカンであり、哺乳動物の結合組織中に微量であるが広く分布し、また微生物も産生することが知られている。そして、これらから抽出、精製された高純度のヒアルロン酸は、高い保湿性、高粘性、創傷治癒性等の性質を有することから、その機能に着目して、化粧品配合素材、眼科手術の際の保護剤、関節炎治療剤等として広く使用されている。
また、近年では、食品分野においても、保健効果や機能性等、付加価値に対する消費者の関心が高まっており、ヒアルロン酸は、それが持つ機能性により種々の効果が期待できることから、食品素材の一つとしても注目されている。

従来、ヒアルロン酸の製造は、鶏冠、牛の関節もしくは鯨の軟骨からの抽出による工業的な製法で行われてきたが、生体内にはヒアルロン酸が微量にしか存在せず、しかも、組織中でタンパク質や他のムコ多糖類と複合体を形成しているため、当該タンパク質やムコ多糖との分離精製に複雑な工程を必要とするため大量に生産することは難しく、微生物を用いた培養法によるヒアルロン酸の製造方法が一般的に実施されている。

ヒアルロン酸を産生する微生物としては、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Streptococcus dysgalactiae）等のストレプトコッカス属細菌が知られている。また、本出願人は、ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭＢＰ－１０８７９）を始めとするストレプトコッカス・サーモフィルス属微生物が優れたヒアルロン酸産生能を有することを見出している（特許文献１）。

特許４９２０５５２号公報

本発明は、ストレプトコッカス・サーモフィルス属微生物を用いたヒアルロン酸のより効率的な製造方法を提供することに関する。

本発明者らは、ストレプトコッカス・サーモフィルス属微生物を用いてヒアルロン酸を製造する場合に、当該微生物を、糖類としてグルコース及びラクトースから選ばれる１種以上を含む培地で前培養し、本培養においては、当該前培養で使用した糖類とは異なる糖を含む培地で培養した場合に、ヒアルロン酸の生産量が向上することを見出した。

すなわち、本発明は以下の（１）～（４）に係るものである。
（１）下記の工程；
ａ）ストレプトコッカス・サーモフィルス属微生物を、糖類としてグルコース及びラクトースから選ばれる１種以上を含む培地で、前培養する工程、
ｂ）前記工程で前培養した微生物を、糖類として当該前培養で用いた糖とは異なる糖を含む培地に接種し、培養する工程、
を含むヒアルロン酸の製造方法。
（２）ａ工程における培地が糖類としてラクトースを含み、ｂ工程における培地が糖類としてグルコースを含む、（１）の方法。
（３）ａ工程における培地が糖類としてグルコースを含み、ｂ工程における培地が糖類としてラクトースを含む、（１）の方法。
（４）ストレプトコッカス・サーモフィルス属微生物がストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭＢＰ－１０８７９）である（１）～（３）のいずれかの方法。

本発明の方法によれば、医薬品、化粧品、飲食品等へ配合可能なヒアルロン酸を効率よく安価かつ簡便に製造することができる。

本発明のヒアルロン酸の製造方法は、下記の工程ａ及びｂを含むものである。
ａ）ストレプトコッカス・サーモフィルス属微生物を、糖類としてグルコース及びラクトースから選ばれる１種以上を含む培地で、前培養する工程、
ｂ）前記工程で前培養した微生物を、糖類として当該前培養で用いた糖とは異なる糖を含む培地に接種し、培養する工程。

本発明の方法で使用するストレプトコッカス・サーモフィルス属微生物としては、ヒアルロン酸産生能を有するものであればよく、特に制限されることなく適用することが可能であり、具体的にはストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭＢＰ－１０８７９）を挙げることができる。なお、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する前記微生物株は、独立行政法人特許微生物寄託センターに寄託されている。

１．工程ａ
本発明において、ストレプトコッカス・サーモフィルス属微生物を培養し、ヒアルロン酸を得るためには、保存菌体をまず少量の培地に接種して継代培養し、その後、大容積の培地へと順次接種を行いながらスケールアップを図ることが行われる。
本発明において、工程ａは微生物菌体を順次継代しながら行なうスケールアップ途上の段階の培養（前培養）を意味し、工程ｂはヒアルロン酸を回収するために行われる最終ステップの培養（本培養）を意味する。

本発明において、前培養は、炭素源の一つである糖類としてグルコース及びラクトースから選ばれる１種以上を含む培地で行われるが、グルコース又はラクトースをそれぞれ単独で用いるのが好ましい。培地中の当該糖類の濃度は、好ましくは０．１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌであり、より好ましくは１ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌであり、更に好ましくは１０ｇ／Ｌ～２０ｇ／Ｌである。

本発明の前培養は、糖類として前記の糖を用いる以外は、一般に乳酸菌の前培養に使用される培地成分を含有する培地で行うことができるが、工程ｂの培養へ接種する菌体をできるだけ増やす観点から、増殖能の高い栄養培地で培養するのが好ましい。
例えば、窒素源としては、肉エキス、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、胚芽、大豆粉、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩等の有機・無機窒素化合物を用いることができ、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩等の無機塩類を必要に応じて適宜添加することができる。更に、ビオチン、ビタミンＢ１、シスチン、オレイン酸メチル、ラード油等の生育促進物質の他、シリコン油、界面活性剤等の消泡剤を添加することができる。
尚、炭素源としては、前記の糖類以外の油脂類等の有機炭素化合物を含んでいてもよいが、前記糖類のみを炭素源とするのが好ましい。
具体的には、例えば、後述の表１に示す、炭素源としてラクトース又はグルコースを含むＩＬＳ培地等が挙げられる。

一般的に菌を培地に接種した後、培養を開始して菌を増殖させる第１段目の前培養が行われ、次いで、この培養液を、次段階の前培養（第２段目）の培地へ接種して、同様に培養することができる。すなわち、前培養における培養は、本培養の液量に応じて、適宜繰り返して行われ、通常２段階以上、好ましくは２～３段階行われる。また、前培養の液量は段数とともに増やすのが好ましい。本発明において、前培養で行われる培養（前培養が複数段階行われる場合は、そのうちの少なくとも１段階の任意の培養）を工程ａという。前培養が複数段階行われる場合、工程ａを連続的に又は断続的に複数回行ってもよく、少なくとも本培養の１段階前の前培養を工程ａとすることが好ましく、複数回の前培養を全て工程ａの繰り返しとして行うことがより好ましい。

培養温度は、２５～４２℃、好ましくは３０～４０℃であり、培養時間は、１２～７２時間、好ましくは２４～４８時間である。培養形態としては、静置培養、振盪培養、攪拌培養等の何れでも良いが、通気なしの攪拌培養が好ましい。
また、培地のｐＨは６～８程度に調整するのが好ましく、中性領域で行うことがより好ましい。

２．工程ｂ
本工程において、ストレプトコッカス・サーモフィルス属微生物の培養に用いる培地は、炭素源のうち、糖類として用いられる糖が、工程ａで用いた糖とは異なるものを含む。ここで、糖としては、グルコース、フルクトース等の単糖類、ラクトース、スクロース、マルトース等の二糖類、オリゴ糖類等が挙げられるが、前培養において、糖類としてラクトースを用いた場合、本工程の培地にはラクトース以外の糖、例えばグルコース、スクロース等が用いられ、好ましくはグルコースが用いられる。また、前培養において、糖類としてグルコースを用いた場合は、本工程の培地にはグルコース以外の糖、例えばラクトース、スクロース等が用いられ、好ましくはラクトースが用いられる。
培地中の当該糖類の濃度は、好ましくは１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌであり、より好ましくは５ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌであり、更に好ましくは１０ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌである。

炭素源以外の成分としては、通常の乳酸菌の培養に使用される成分を用いることができる。斯かる成分としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、亜硫酸ソーダ、チオ硫酸ソーダ、リン酸アンモニウム等の無機塩類、ポリペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー等の有機栄養源の他、必要に応じて各種アミノ酸等が挙げられる。また、ヒアルロン酸の産生量を増加させる点から、大豆ペプチドを添加することもできる。

前培養したストレプトコッカス・サーモフィルス属微生物の本工程の培地への接種量は、特に限定されるものではないが、ヒアルロン酸の生産性の点から、本培養液の０．１～５％、より好ましくは、０．５～３％、更に好ましくは１～２％である。
本工程における培養は、振盪培養、通気攪拌培養等の公知の方法から適宜選択して用いればよい。
培養温度は、２５～４２℃、好ましくは３０～４０℃が挙げられ、培養時間は、１２～７２時間、好ましくは２４～４８時間である。また、培養液のｐＨは、当該乳酸菌の発育と共に低下し、ヒアルロン酸の産生量に影響を与える場合があるため、苛性ソーダ、苛性カリ、アンモニア等の各種ｐＨ調整剤を用いておよそ６～８、好ましくは６．５～７．５に調整しておくことが好ましい。

培養終了後、ヒアルロン酸は、通常の多糖類の分離・採取方法に従って、培養液から分離・採取すればよい。例えば、培養液中の菌体などの不溶物をろ過または遠心分離により分別後、この溶液から、例えばエタノール等の溶媒沈殿剤を用いて精製ヒアルロン酸を分取することができる。

斯くして本発明の方法により得られるヒアルロン酸は、その平均分子量は、３０万～１５０万、さらに３０万～１００万程度である。また、その分子量分布は、２００万～２万程度の範囲であり、その最大ピークは４０～５０万あたりにある。

本発明の方法で得られるヒアルロン酸は、従来と同様に、医薬品や化粧品等の形態で使用することができる他、ヨーグルト等の製造に利用できるストレプトコッカス・サーモフィルス属微生物が産生するものであるため、食品の形態として投与することも可能である。例えば、本発明の方法で得られるヒアルロン酸を美容や老化防止などの効果を訴求する医薬品や栄養補助食品等の形態で用いる場合であれば、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、散剤等の固形製剤、或いはシロップ剤等の液状製剤として経口投与することができる。

以下、本発明を実施例、比較例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例等に何ら制約されるものではない。

実施例１～４、比較例１～５
（１）菌株
ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭＢＰ－１０８７９）

（２）前培養
表１に示すラクトース（Ｌ）－ＩＬＳ培地と、炭素源をグルコース（Ｇ）又はスクロース（Ｓ）に変更したＧ－ＩＬＳ及びＳ－ＩＬＳ培地を用いた。炭素源を除いた成分を混合してオートクレーブした後、ろ過滅菌した炭素源を加えて調製した。

ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４のグリセロールストックを、２ｍＬのＬ－ＩＬＳ、Ｇ－ＩＬＳまたはＳ－ＩＬＳ培地に２０μＬ植菌し、４０℃で２４時間静置培養したものを第１段目の前培養液とした。第１段目の前培養液を１０ｍＬのＬ－ＩＬＳ、Ｇ－ＩＬＳまたはＳ－ＩＬＳ培地に１００μＬ植菌し、同条件で２４時間培養したものを第２段目の前培養液とした。

（３）本培養
（２）で、Ｌ－ＩＬＳ、Ｇ－ＩＬＳ又はＳ－ＩＬＳ培地でそれぞれ培養した第２段目の前培養液を、５０ g/Lの炭素源と、２０ g/Lの酵母エキスを含む培地１２０ｍＬの培地に１％植菌して培養した。なお、培養には２００ｍＬ容８連式ミニジャー（ＢｉｏＪｒ．８、Ａｂｌｅ）を使用し、３４℃、２００ｒｐｍ、ｐＨ６．８、通気なしの条件で行った。培養開始２４時間後の培養液を用いて各種測定を行った。試験は、少なくとも２回繰り返し、その平均値を示した。

（４）ヒアルロン酸の抽出・精製
培養液に終濃度が１０％（ｗ／ｖ）になるように１００％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を加え、４℃で２時間静置した。１６，９００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清を０．４５μｍフィルターでろ過した後、等量の９９．５％冷エタノールを加え、４℃で一晩静置した。１６，９００×ｇ、４℃で３０分間遠心後、沈殿物にＲＯ水を加えて溶解し、分画分子量１２，０００の透析膜（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて透析して高分子画分を得た。これをさらに分画分子量１００，０００の限外ろ過膜（セントリコンプラス７０、Ｍｅｒｃｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分画し、高分子画分を凍結乾燥した。

（５）結果
表２にヒアルロン酸の産生量を示す。また、前培養で用いる糖をスクロースに変更し、同様に本培養した場合のヒアルロン酸産生量を比較例として併せて示す。

炭素源としてグルコース又はラクトースを前培養に用い、本培養の炭素源を変更した場合（実施例１～４）にヒアルロン酸の産生量が向上した。特にラクトースを用いて前培養し、本培養ではグルコースを用いた場合（実施例１）にヒアルロン酸の産生量が非常に高かった。一方、前培養にスクロースを用いた場合（比較例３～５）、ヒアルロン酸の産生量は低く、本培養で糖を変更すると産生量は著しく低下した。

（６）菌体濃度及び生産性
表２において、ヒアルロン酸産生量が特に高かった実施例１及び実施例３につき、濁度（ＯＤ_６６０）（菌体濃度）及び菌体あたりのヒアルロン酸産生量（生産性）を測定した結果を表３、表４に示す。なお、ＯＤ_６６０はＣａｒｙ５０（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて測定し、菌体濃度の指標とした。
表３、４に示す通り、炭素源としてグルコース又はラクトースを前培養に用い、本培養の炭素源を変更した場合（実施例１、３）に濁度（ＯＤ_６６０）（菌体濃度）及び菌体あたりのヒアルロン酸産生量（生産性）が向上した。一方、前培養にスクロースを用いた場合（比較例３、５）、濁度（ＯＤ_６６０）（菌体濃度）及び菌体あたりのヒアルロン酸産生量（生産性）は低く、本培養で糖を変更すると濁度（ＯＤ_６６０）（菌体濃度）及び菌体あたりのヒアルロン酸産生量（生産性）は著しく低下した。

Claims

下記の工程；
ａ）ストレプトコッカス・サーモフィルス属微生物を、糖類としてグルコース及びラクトースから選ばれる１種のみを含む培地で、前培養する工程、
ｂ－１）前記工程でラクトースのみを含む培地で前培養した微生物を、糖類としてグルコース又はスクロースのみを含む培地に接種し、培養する工程、又は
ｂ－２）前記工程でグルコースのみを含む培地で前培養した微生物を、糖類としてラクトースのみを含む培地に接種し、培養する工程、
を含むヒアルロン酸の製造方法であって、当該ストレプトコッカス・サーモフィルス属微生物が受託番号ＦＥＲＭＢＰ－１０８７９として寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株である、方法。