JP5858566B2 - ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する乳酸菌を、培地で培養することを特徴とする、ヒアルロン酸の製造方法;
(2)乳酸菌がラクトコッカス(Lactococcus)属に属する乳酸菌である、上記(1)に記載のヒアルロン酸の製造方法;
(3)乳酸菌がラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)に属する乳酸菌である、上記(2)に記載のヒアルロン酸の製造方法;
(4)乳酸菌が、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ガラクトース、マンノースおよびN−アセチルグルコサミンからなる群から選択される1以上の糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する、上記(1)〜(3)のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法;
(5)培地が、果実、野菜、穀物、いも、海藻、豆、キノコおよびこれらの処理物からなる群から選択される1以上の食品原料を炭素源として含有する、上記(1)〜(4)のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法;
(6)培養が、20〜30℃の温度下、嫌気的条件で行われる、上記(1)〜(5)のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法;
(7)前記乳酸菌が、以下の(a)または(b)に記載のタンパク質をコードする遺伝子:
(a)配列番号15に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;または
(b)配列番号15に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質;
あるいは、以下の(c)〜(e)のいずれかに記載のDNAからなる遺伝子:
(c)配列番号14に記載の塩基配列からなるDNA;
(d)配列番号14に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;および
(e)配列番号14に記載の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;
を有する、上記(1)〜(4)のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法;
(8)乳酸菌が、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)K3041株(FERM P−21970)である、上記(3)〜(7)のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法;
(9)上記(1)〜(8)のいずれかに記載の方法により得られるヒアルロン酸;
(10)上記(1)〜(8)のいずれかに記載の方法により得られる、ヒアルロン酸含有飲食品またはヒアルロン酸含有組成物;
(11)果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)K3041株(FERM P−21970);
(12)以下の(a)または(b)に記載のタンパク質であるヒアルロン酸合成酵素:
(a)配列番号15に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;または
(b)配列番号15に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質;ならびに
(13)以下の(c)〜(e)のいずれかに記載のDNAからなる遺伝子:
(c)配列番号14に記載の塩基配列からなるDNA;
(d)配列番号14に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;および
(e)配列番号14に記載の塩基配列において、1若しくは数個のDNAが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;
に関する。
〔1〕培地が、果糖を炭素源として含有する、上記(1)〜(8)のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法;
〔2〕培地が、果実、野菜、穀物、いも、豆およびこれらの処理物からなる群から選択される1以上の食品原料を炭素源として含有する、上記(1)〜(8)のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法;
〔3〕培地が、果糖、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ガラクトース、マンノースおよびN−アセチルグルコサミンからなる群から選択される1以上の糖を炭素源として含有する、上記(1)〜(8)のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法;
〔4〕乳酸菌が、ブドウ糖およびショ糖からなる群から選択される1以上の糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有し、培地が、果糖、ブドウ糖およびショ糖からなる群から選択される1以上の糖を炭素源として含有する、上記(1)〜(8)のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法;
〔5〕乳酸菌が、ガラクトースおよびマンノースからなる群から選択される1以上の糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有し、培地が、いも、海藻、豆およびこれらの処理物からなる群から選択される1以上の食品原料を炭素源として含有する、上記(1)〜(8)のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法;
〔6〕乳酸菌が、N−アセチルグルコサミンを資化してヒアルロン酸を生産する能力を有し、培地が、キノコ、魚介類およびその残渣ならびにこれらの処理物からなる群から選択される1以上の食品原料を炭素源として含有する、上記(1)〜(8)のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法;
〔7〕培養が、培地のpHの下限値をpH6.5以上に制御して行われる、上記(1)〜(8)のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法;
〔8〕培地が乳糖を含有する、上記(2)〜(8)のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法;
〔9〕上記(12)に記載のヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子;又は
上記(13)に記載の遺伝子
を含有する組換えベクター;
〔10〕上記(14)に記載の組換えベクターを含有する形質転換体;
〔16〕上記(14)に記載の形質転換体を培地で培養し、ヒアルロン酸を含有する培養物を得る工程を含むヒアルロン酸の製造方法; 〔17〕重量平均分子量(Mw)50万〜80万である、上記(9)に記載のヒアルロン酸;ならびに
〔18〕重量平均分子量(Mw)60万〜70万である、上記(9)に記載のヒアルロン酸;
にも関する。
本発明において、乳酸菌とは、発酵によって糖類から乳酸を産生する菌であれば特に限定されない。本発明で用いられる乳酸菌(以下、「本発明菌」とも称する)は、果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する乳酸菌である限り、特に制限されない。例えば、ラクトコッカス属細菌(例えば、ラクトコッカス ラクティス等)、ストレプトコッカス属細菌(例えば、ストレプトコッカス サーモフィルス等)、ラクトバチルス属細菌(例えば、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバチルス アシドフィルス、ラクトバチルス ガッセリ、ラクトバチルス デルブルッキィ サブスピーシズ ブルガリカス、ラクトバチルス デルブルッキィ サブスピーシズ デルブルッキィ等)、ロイコノストック属細菌(例えば、ロイコノストック メセンテロイテス、ロイコノストック ラクティス等)、エンテロコッカス属細菌(例えば、エンテロコッカス フェカーリス、エンテロコッカス フェシウム等)、ビフィドバクテリウム属細菌(例えば、ビフィドバクテリウム ビフィダム、ビフィドバクテリウム アドレッセンティス等)、ペディオコッカス属細菌(例えば、ペディオコッカス ペントサセウス、ペディオコッカス ハロフィルス等)等が挙げられる。
(a)配列番号15に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;または
(b)配列番号15に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質;
(c)配列番号14に記載の塩基配列からなるDNA;
(d)配列番号14に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;および
(e)配列番号14に記載の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
上記配列番号15に記載のアミノ酸配列は、ラクトコッカス ラクティスに属する乳酸菌(より特定すれば、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティス K3041株(FERM P−21970))由来のヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列である。これまでラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティスに属する特定の乳酸菌(IL1403株)が該配列を有することは知られていたが、ヒアルロン酸合成酵素との関係は全く知られていなかった。なお、後述の比較例5および6にも記載の通り、既知のヒアルロン酸合成酵素(hasA)との相同性(類似性)のみを指標とするだけでは、ヒアルロン酸生産菌を見出すことはできない。また、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティスに属する菌において、ヒアルロン酸合成能の有無の違いは、ヒアルロン酸合成酵素ホモログのアミノ酸配列のわずかな違いに基づく可能性があり、配列の相同性(類似性)からその機能を推定することは難しいと考えられる。
上記(b)のタンパク質のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号15に記載のアミノ酸配列において、ヒアルロン酸合成酵素活性に関与しない一部のアミノ酸を欠失、置換または付加させたアミノ酸配列が挙げられる。性質の似たアミノ酸への置換等であれば、変異後のアミノ酸配列からなるタンパク質の酵素活性に影響しないであろう。また、(b)のタンパク質のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号15に記載のアミノ酸配列に各種のアミノ酸残基が付加したアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がヒアルロン酸合成活性を有するアミノ酸配列も挙げられる。そのようなアミノ酸配列としては、例えば、配列番号15に記載のアミノ酸配列に、タグを付加した融合タンパク質等が挙げられる。一態様において、上記(b)のタンパク質は、配列番号15に記載のアミノ酸配列と、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質である。
上記(c)のDNAは、上記配列番号15に記載のアミノ酸配列ラクトコッカス ラクティスに属する乳酸菌(より特定すれば、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティス K3041株(FERM P−21970))由来のヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列)をコードするDNAである。
上記(d)のDNAは、上記(c)のDNAをもとに、当業者に公知の手法を用いて得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロット・ハイブリダイゼーション法等(Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience,1989))を行った際、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、この条件は使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列および長さによって異なる。このような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度および塩濃度を変えることにより決定可能である。このようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、DNAの塩基配列と一定以上の相同性を有するDNAであるため、一態様において、上記(d)のDNAは、配列番号14に記載の塩基配列からなるDNAと、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAである。
上記(e)のDNAは、上記(c)のDNAをもとに、当業者に公知の手法を用いて得ることができる。例えば、配列番号14に記載の塩基配列と同一のアミノ酸をコードする塩基配列、上記(b)のタンパク質をコードする塩基配列等が挙げられる。また、ヒアルロン酸合成酵素活性に関与しないアミノ酸に対応する一部の塩基を変異(欠失、置換または付加)させた塩基配列も挙げられる。変異の導入は、天然型のヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子(例えば上記(c)のDNAからなる遺伝子)をもとに当業者に公知の遺伝子工学的技術や変異処理などを用いて行うことができる。
〔果糖含有培地においてヒアルロン酸生産能を有する乳酸菌の探索〕
探索には、各種乳製品、漬物、野菜、果物サンプル等から分離した乳酸菌保存株、および微生物保存機関から分与された乳酸菌保存株、合計約1,500株を用いた。各菌をMRS寒天培地またはM17寒天培地で、30℃、1日間、アネロパック・ケンキ(三菱ガス化学社製)を用いた嫌気条件にて静置培養した。試験管に入った果糖含有滅菌培地[水道水に、果糖(D−フルクトース、和光純薬工業社製)1.0%(w/v)、トリプトンN1(オルガノテクニー社製)1.0%(w/v)、酵母エキス(べクトン・ディッキンソン社製)0.5%(w/v)、リン酸水素二カリウム0.2%(w/v)を添加。pH7.0]3mLに寒天培地上に生育した各菌のコロニーをつまようじで接種し、30℃、1日間、アネロパック・ケンキ(三菱ガス化学社製)を用いた嫌気条件にて静置培養した。ヒアルロン酸生産能については、全ての実施例等において、得られた培養液を採取し、ヒアルロン酸測定キット(生化学バイオビジネス社製)を用いてヒアルロン酸含有量を調べることで評価した。その結果、K3041株およびK1780株の2株がヒアルロン酸をそれぞれ6.2mg/L,0.7mg/L生産することがわかった。
〔菌の同定〕
実施例1で見出された2株について、Randomly Amplified Polymorphic DNA(RAPD)解析で分類した。本発明菌から、Genereleaser(Bio Ventures社製)を用いて、染色体DNAを抽出した。これを鋳型とし、プライマーとして、配列3’−GGT GCG GGA A−5’(配列番号4)および3’−AAC GCG CAA C−5’(配列番号5)(GE Healthcare社製)を用いて、Mighty AMP DNA Polymerase(タカラバイオ社製)でPCRを行った。PCRの温度プロファイルは、まず、98℃,2分間処理し、次いで98℃,10秒−47℃,15秒−68℃,2分のサイクルを30回行った後、68℃,7分間処理して、4℃で冷却した。得られたPCR増幅についてアガロースゲル電気泳動を行った(図1)。マーカーとして、Loading Quick DNA Mass Ladder DNA−134(東洋紡社製)を用いた。RAPD解析の結果、実施例1で見出された2つの菌株は異なる菌であると考えられた。
〔糖の種類によるヒアルロン酸の生産性への影響〕
試験管に入った各種糖含有滅菌培地[トリプトンN1(オルガノテクニー社製)1.0%(w/v)、酵母エキス(べクトン・ディッキンソン社製)1.0%(w/v)、リン酸水素二カリウム0.2%(w/v)、pH7.3に、炭素源として果糖(D−フルクトース、和光純薬工業社製)、ブドウ糖(D−グルコース、和光純薬工業社製)、ショ糖(スクロース、和光純薬工業社製)、乳糖(ラクトース、和光純薬工業社製)、麦芽糖(マルトース、和光純薬工業社製)、D−ガラクトース(和光純薬工業社製)、D−マンノース(和光純薬工業社製)、またはN−アセチル−D−グルコサミン(シグマ社製)をそれぞれ1.0%(w/v)含む培地]3mLずつ入れ、寒天培地上に生育した各菌のコロニーをつまようじで接種した。30℃、1日間、アネロパック・ケンキ(三菱ガス化学社製)を用いた嫌気条件にて静置培養し、ヒアルロン酸生産量を調べた(表4)。
微生物保存機関から分与された乳酸菌保存株ラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティス NBRC100933を実施例3と同様に培養し、培養液中のヒアルロン酸量を調べたが、ヒアルロン酸は検出されなかった。
乳製品から独自に見出した、ショ糖を含有する培地で微量のヒアルロン酸生産能を有するストレプトコッカス サーモフィルス K1296株をM17寒天培地上に生育させて、コロニーをつまようじで採取し、実施例3に記載の培地に接種した。本菌株のヒアルロン酸生産の最適条件である、50min-1にて往復振とう下、好気条件で、37℃にて1日間培養した。培養液中のヒアルロン酸量を調べた結果(表4)、本菌株は乳酸菌が資化する最も一般的な糖である乳糖、ショ糖、ブドウ糖およびガラクトースでしかヒアルロン酸を生産せず、生産量もK3041株よりも低かった。
〔培養最適温度〕
試験管に入った滅菌培地[水道水に、乳糖(ラクトース、和光純薬工業社製)1.0%(w/v)、トリプトンN1(オルガノテクニー社製)1.0%(w/v)、酵母エキス(べクトン・ディッキンソン社製)0.5%(w/v)、リン酸水素二カリウム0.2%(w/v)を添加。pH7.0]3mLにMRS寒天培地に生育させたK3041株のコロニーをつまようじで接種し、図2に示す各温度にて、実施例1と同様に培養し、ヒアルロン酸生産量を調べた(図2)。本菌株によるヒアルロン酸生産には、20〜30℃での培養が好適であることがわかった。
〔K3041株のトマトジュース培地におけるヒアルロン酸の生産〕
無塩トマトジュース(日本デルモンテ社製,pH4.5)を、無菌条件下で滅菌した8N NaOHでpH7.4に調整し、滅菌した試験管に分注した。MRS寒天培地上に生育させたK3041株のコロニーをつまようじで接種してシリコン栓をし、これを30℃で18時間、アネロパック・ケンキ(三菱ガス化学社製)を用いた嫌気条件にて静置培養した。得られた培養液を十分に混合した後に採取し、ヒアルロン酸含有量を調べた。なお、ヒアルロン酸の生産量については、K3041株非接種のブランクのヒアルロン酸含量も同時に測定し、これを差し引くことで求めた。本菌株はトマトジュース培地において、ヒアルロン酸を21.6mg/L生産していることがわかった。
比較例2で用いたストレプトコッカス サーモフィルス K1296株をM17寒天培地上に生育させて、コロニーをつまようじで採取し、実施例5に記載のトマトジュース培地(pH7.4)に接種した。本菌株のヒアルロン酸生産の最適条件である、50min-1にて往復振とう下、好気条件で、37℃にて間培養した。培養液中のヒアルロン酸量を調べた結果、K1296株はトマトジュース培地にて、ヒアルロン酸を0.8mg/Lしか生産していなかった。
〔K3041株のスキムミルク培地におけるヒアルロン酸の生産〕
スキムミルク(べクトン・ディッキンソン社製、糖として主に乳糖を含有)10%(w/v)の培地3mLを試験管に分注して滅菌し、MRS寒天培地上に生育させたK3041株のコロニーをつまようじで接種した。アネロパック・ケンキ(三菱ガス化学社製)を用いて嫌気条件とし、30℃で1日間培養した。得られた各培養液を採取し、ヒアルロン酸含有量を調べた。なお、ヒアルロン酸の生産量については、K3041株非接種のブランクのヒアルロン酸含量も同時に測定し、これを差し引くことで求めた。本菌株はスキムミルク培地にて、ヒアルロン酸を8.3mg/L生産していることがわかった。培養物はチーズらしい香味を呈していた。
比較例2で用いたK1296株をM17寒天培地上に生育させて、コロニーをつまようじで採取し、実施例6に記載の培地に接種した。本菌株のヒアルロン酸生産の最適条件である、50min-1にて往復振とう下、好気条件で、37℃にて1日間培養した。培養液中のヒアルロン酸量を調べた結果、K1296株はスキムミルク培地にて、ヒアルロン酸を2.9mg/L生産しており、K3041株よりも生産量が低かった。本培養物はK3041株の培養物と比較するとチーズらしい香味が弱く感じられた。
〔K3041株のミニジャーによるヒアルロン酸の生産と精製1〕
乳糖(ラクトース、和光純薬工業社製)1.0%(w/v)、トリプトンN1(オルガノテクニー社製)1.0%(w/v)、酵母エキス(べクトン・ディッキンソン社製)1.0%(w/v)、リン酸水素二カリウム0.2%(w/v)の培地(pH7.0)2Lを121℃にて15分間滅菌し、K3041株の前培養液を0.1%接種した。回転数50rpmにて攪拌し、窒素ガスを通気して嫌気条件として、27℃で1日間培養した。pHは1Nの水酸化ナトリウム水溶液で、下限6.5となるように調整しつづけた。得られた各培養液を採取し、ヒアルロン酸含有量を調べた結果、ヒアルロン酸を40mg/L生産していることがわかった。
カラム:SuperQ−5PW(東ソー社製)
溶離液:水 〜 水−0.5M 塩化ナトリウム 6:4(80分間のグラデーション)
検出:210nm
カラム槽温度:40℃
流量:1mL/min
注入量:0.1mL
分析時間:80min
〔K3041株のミニジャーによるヒアルロン酸の生産と精製2〕
実施例7と同様の手法でK3041株を培養してヒアルロン酸含有培養液を得た。K3041株を培養して得られた培養液を遠心処理して上清を回収後、デオキシリボヌクレアーゼI(ウシ脾臓由来、和光純薬工業社製)およびリボヌクレアーゼ(ウシ膵臓由来、和光純薬工業社製)をそれぞれ2mgずつ添加した以外は実施例7と同様に処理し、無色の結晶を350mg得た。
IR νmax(cm-1)=1607,1407,1376,1148,1032,945
〔K3041株が生産するヒアルロン酸の平均分子量測定〕
実施例8で得られたヒアルロン酸の無色結晶および下記に示す平均分子量の異なる市販のヒアルロン酸標品を、SEC/MALS(サイズ排除クロマトグラフィー/多角度光散乱検出法)により分析した。装置および分析条件を下記に記す。
<装置>
HPLC:GPC−101(ポンプ、デガッサ、オーブン、示差屈折計一体型,昭和電工社製)
カラム:Shodex OHpak SB−806M HQ(昭和電工社製)
MALS
光散乱検出器:DAWN HELEOS 8(Wyatt technology社製)
解析ソフト:ASTRA Ver 5.3.4(Wyatt technology社製)
HA水溶液の屈折率増分dn/dc:0.152
第2ビリアル定数A2:0.000cm3・mol/g
(文献値は0.002cm3・mol/gであるが、高分子域で数万程度の分子量差しか与えないので、今回は無視した。)
カラム槽温度:40℃
溶離液:0.2M 硝酸ナトリウム
流量:0.5mL/min
試料濃度:0.01g/dL
注入量:0.1mL
分析時間:30min
実施例7で調製したサンプル
標品(キッコーマンバイオケミファ社製)
標品A(極限粘度より換算した平均分子量 2,040,000)
標品B(極限粘度より換算した平均分子量 1,040,000)
標品C(極限粘度より換算した平均分子量 100,000)
〔K3041株のヒアルロン酸合成酵素のクローニング〕
(1)K3041株 染色体DNAの調製
K3041株をMRS寒天培地に接種し、30℃、1日間、アネロパック・ケンキ(三菱ガス化学社製)を用いた嫌気条件にて静置培養した。培地表面に生育した菌体を集菌し、抽出液(10mM Tris−HCl、pH8.0、100mM EDTA、0.5%SDS)2mlに懸濁させた。RNase(Sigma社製)を1mg添加し、1時間室温で放置した。次いでプロテイナーゼK(Roche社製)を1mg添加し、55 ℃にて4時間処理した。TE飽和フェノール(和光純薬工業社製)0.5mlで2回処理し、上清をクロロホルム0.5mlで処理して上清を回収した。これに等量のイソプロピルアルコールを添加し、遠心処理して沈殿を得た。これを滅菌水に溶かして、染色体DNA溶液を得た。
ストレプトコッカス ズーエピデミカス ATCC35246株のヒアルロン酸合成酵素(hasA)のアミノ酸配列(日本DNAデータバンク アクセッションナンバー AF347022)の配列情報を利用して、日本DNAデータバンクの国際塩基配列データベースを用いて、アミノ酸相同性検索(BLAST検索)を行った結果、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティスの中では、IL1403株のタンパク質(Q9CH63、Glycosyltransferase protein(糖転位酵素))のアミノ酸配列と21%同一性、44%類似性であることがわかった。
[センスプライマー1:5’−GTNATHWSNGCNTAYAAYGARGA’(配列番号10、23mer,Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミン、Nはアデニン、シトシン、グアニンまたはチミン、Hはアデニン、シトシンまたはチミン、Wはアデニンまたはチミン、Sはシトシンまたはグアニン、Yはチミンまたはシトシン、Rはアデニンまたはグアニンを示す。);
センスプライマー2:5’−GARATHTTYATHGTNGAYGA−3’(配列番号11、20mer);
アンチセンスプライマー1:5’−CCANCKNCKNCKYTGYTTNA−3’(配列番号12、20mer,Kはグアニンまたはチミンを示す。);
アンチセンスプライマー2:5’−CKRTTNCKNACDATNGGNCKNCCNGT−3’(配列番号13、26mer,Dはアデニン、グアニンまたはチミンを示す。)]
ヒアルロン酸非生産株である、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティス NBRC100933株について、実施例10中(1)に記載の方法で染色体DNAを取得し、実施例10中(2)に記載の方法で同プライマーを用いてNested PCRを行った結果、0.3kbp程度に相当する遺伝子断片が増幅した。得られた遺伝子断片についてダイレクトシーケンスで塩基配列を解読した結果、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティス IL1403株のタンパク質(Q9CH63)の塩基配列の一部と高い相同性(95%類似性)が確認された。ラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティス IL1403株の配列情報を利用して、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティス NBRC100933株のQ9CH63に対応する部分をコードする遺伝子の全長を取得した(配列番号16)。配列番号16の塩基配列でコードされる推定アミノ酸配列は配列番号17に示す。配列番号17のアミノ酸配列は、実施例8で得られたラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティス K3041株由来の配列番号15のアミノ酸配列とは9アミノ酸異なり、さらにC末端側に52アミノ酸が挿入されていることがわかった。配列番号17のアミノ酸配列についてBLAST検索した結果、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ クレモリスの細胞内接着タンパク質様タンパク質(intercellular adhesion protein−like protein(3308223AFH))のアミノ酸配列と最も高い相同性を示すことがわかった(81%同一性、87%類似性)。
以上、ヒアルロン酸非生産株であるラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティス属する菌においても、Q9CH63の塩基配列の一部と高い類似性(相同性)を有する遺伝子が存在すること、該遺伝子と類似し、異なる機能を有する遺伝子が確認されたことから、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティスに属する菌において、ヒアルロン酸合成能の有無の違いは、ヒアルロン酸合成酵素ホモログのアミノ酸配列のわずかな違いに基づく可能性が示唆され、配列の類似性からその機能を推定することは難しいと考えられた。
ストレプトコッカス ズーエピデミカス ATCC35246株のヒアルロン酸合成酵素(hasA)のアミノ酸配列について、日本DNAデータバンクの国際塩基配列データベースを用いて、ラクトバチルス属とのアミノ酸相同性検索(BLAST検索)を行った。その結果、K3041株のヒアルロン酸合成酵素と推定されるタンパク質のアミノ酸配列(配列番号15、hasAと21%同一性、44%類似性)よりも高い相同性(類似性)を示すタンパク質(Q88WUO、Glucosyltransferase(糖転位酵素)、hasAと24%同一性、45%類似性)を有する乳酸菌 ラクトバチルス プランタラム NCIMB8826株が見つかった。そこで、ラクトバチルス プランタラム NCIMB8826株を実施例1と同様に炭素源の異なる複数種の培地で培養したが、いずれの培地中でもヒアルロン酸の生産は確認できなかった。ストレプトコッカス ズーエピデミカス ATCC35246株のヒアルロン酸合成酵素(hasA)との相同性(類似性)のみを指標とするだけでは、ヒアルロン酸生産菌を見出すことができないことがわかった。
Claims (8)
- (i)乳酸菌を、果糖を添加した培地で培養し、果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する乳酸菌を選択する工程;および
(ii)前記工程(i)で選択された、果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する乳酸菌を、培地で培養する工程;
を含む、ヒアルロン酸の製造方法であって、
乳酸菌がラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)に属する乳酸菌である、方法。 - 乳酸菌が、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ガラクトース、マンノースおよびN−アセチルグルコサミンからなる群から選択される1以上の糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する、請求項1に記載のヒアルロン酸の製造方法。
- 前記工程(ii)における培地が、果実、野菜、穀物、いも、海藻、豆、キノコおよびこれらの処理物からなる群から選択される1以上の食品原料を炭素源として含有する、請求項1または2に記載のヒアルロン酸の製造方法。
- 培養が、20〜30℃の温度下、嫌気的条件で行われる、請求項1〜3のいずれか1項に記載のヒアルロン酸の製造方法。
- 前記乳酸菌が、以下の(a)または(b)に記載のタンパク質をコードする遺伝子:
(a)配列番号15に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;または
(b)配列番号15に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質;
あるいは、以下の(c)〜(e)のいずれかに記載のDNAからなる遺伝子:
(c)配列番号14に記載の塩基配列からなるDNA;
(d)配列番号14に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;および
(e)配列番号14に記載の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;
を有する、請求項1または2に記載のヒアルロン酸の製造方法。 - 乳酸菌が、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)K3041株(FERM P−21970)である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のヒアルロン酸の製造方法。
- 前記工程(ii)における培地が果糖を含有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載のヒアルロン酸の製造方法。
- 果糖を資化してヒアルロン酸を生産する能力を有する、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシズ ラクティス(Lactococcus lactis subsp. lactis)K3041株(FERM P−21970)。
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