JPH0638783A - ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents
ヒアルロン酸の製造方法Info
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- JPH0638783A JPH0638783A JP2866693A JP2866693A JPH0638783A JP H0638783 A JPH0638783 A JP H0638783A JP 2866693 A JP2866693 A JP 2866693A JP 2866693 A JP2866693 A JP 2866693A JP H0638783 A JPH0638783 A JP H0638783A
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- streptococcus
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- culture
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 糖成分３％以上を主炭素源とする栄養培地に
てストレプトコッカス属のヒアルロン酸を生成する能力
を有する微生物を通気攪拌培養して、好気的条件下で、
ｐＨ５．５〜９．０に調整された培養液中にヒアルロン
酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
微生物によるヒアルロン酸の製造方法。 【効果】 ヒアルロン酸を効率よく製造できる。
てストレプトコッカス属のヒアルロン酸を生成する能力
を有する微生物を通気攪拌培養して、好気的条件下で、
ｐＨ５．５〜９．０に調整された培養液中にヒアルロン
酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
微生物によるヒアルロン酸の製造方法。 【効果】 ヒアルロン酸を効率よく製造できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は微生物によるヒアルロン
酸の製造方法に関するものである。
酸の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、ヒアルロン酸はウシの眼のガラス
液、ニワトリのトサカ、このほか臍帯、関節液等より単
離され、タンパク質及び水と結合してゼリー状を保ち、
潤滑剤的な役割、バクテリアの侵入からの保護、水分の
保持等に役立っている。しかし、極めて高価であること
が問題点であった。一方ストレプトコッカス属細菌を利
用したヒアルロン酸の生成についてはストレプトコッカ
ス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプ
トコッカス・エキ（Streptococcus equi）、ストレプト
コッカス・エキシミリス（Streptococcus equismili
s）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Strep
tococcus dysgalactiae）及びストレプトコッカス・ズ
ーエピデミカス（Streptococcuszooepidemicus）等の細
菌によりヒアルロン酸を生産する事がすでに知られてい
る。その報告はホルムストレーム（B.Holmstrom Appl・M
icrobial 1967）、ジェー・ビー・ウールコック（J.B.W
oolcock 85,372〜375J.Gen.Microbial 1974）、イー・
キエム（E.Kjem Acta Pathol.Microbial.Scand 1976）
らによって既に報告されている。
液、ニワトリのトサカ、このほか臍帯、関節液等より単
離され、タンパク質及び水と結合してゼリー状を保ち、
潤滑剤的な役割、バクテリアの侵入からの保護、水分の
保持等に役立っている。しかし、極めて高価であること
が問題点であった。一方ストレプトコッカス属細菌を利
用したヒアルロン酸の生成についてはストレプトコッカ
ス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプ
トコッカス・エキ（Streptococcus equi）、ストレプト
コッカス・エキシミリス（Streptococcus equismili
s）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Strep
tococcus dysgalactiae）及びストレプトコッカス・ズ
ーエピデミカス（Streptococcuszooepidemicus）等の細
菌によりヒアルロン酸を生産する事がすでに知られてい
る。その報告はホルムストレーム（B.Holmstrom Appl・M
icrobial 1967）、ジェー・ビー・ウールコック（J.B.W
oolcock 85,372〜375J.Gen.Microbial 1974）、イー・
キエム（E.Kjem Acta Pathol.Microbial.Scand 1976）
らによって既に報告されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしいずれも大量生
産を目的としたものではなく、グルコース１％、培養時
間２４時間、ｐＨ７．０〜７．６、温度３０〜３７℃等
の条件で行うもので、収量は０．６ｇ／ｌ以下と低いも
のであった。
産を目的としたものではなく、グルコース１％、培養時
間２４時間、ｐＨ７．０〜７．６、温度３０〜３７℃等
の条件で行うもので、収量は０．６ｇ／ｌ以下と低いも
のであった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは簡単で安価
な培地でヒアルロン酸を収量良く安全に生成せしめる事
を意図して鋭意研究した結果、特定の条件で上記細菌を
培養する事により収量が増加する事を見出し、本発明を
完成するに至った。即ち、本発明は糖成分３％以上を主
炭素源とする栄養培地にてストレプトコッカス属のヒア
ルロン酸を生成する能力を有する微生物を通気攪拌培養
し、培養液中にヒアルロン酸を生成せしめ、これを採取
するものである。本発明のヒアルロン酸を生産する能力
を有する細菌としてはストレプトコッカス・ピオゲネ
ス、ストレプトコッカス・エキ、ストレプトコッカス・
エキシミリス、ストレプトコッカス・ディスガラクティ
エ、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス等があげら
れる。
な培地でヒアルロン酸を収量良く安全に生成せしめる事
を意図して鋭意研究した結果、特定の条件で上記細菌を
培養する事により収量が増加する事を見出し、本発明を
完成するに至った。即ち、本発明は糖成分３％以上を主
炭素源とする栄養培地にてストレプトコッカス属のヒア
ルロン酸を生成する能力を有する微生物を通気攪拌培養
し、培養液中にヒアルロン酸を生成せしめ、これを採取
するものである。本発明のヒアルロン酸を生産する能力
を有する細菌としてはストレプトコッカス・ピオゲネ
ス、ストレプトコッカス・エキ、ストレプトコッカス・
エキシミリス、ストレプトコッカス・ディスガラクティ
エ、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス等があげら
れる。
【０００５】本発明においてヒアルロン酸の生産は上記
ヒアルロン酸生産菌を特定の栄養培地にて培養する事に
より行なわれる。培地としては、炭素源、窒素源、無機
塩及びその他に必要ならば有機微量栄養素を含有する培
地がよい。炭素源としては、例えば有機酸、脂肪族アル
コール等いろいろあるが、本発明では澱粉加水分解物、
グルコース、蔗糖、フラクトース等の糖分が必須成分と
して必要である。次に窒素源としては硫安、硝酸ナトリ
ウム、リン酸第二アンモニウム、肉エキス、ペプトン、
各種アミノ酸混合物、酵母エキス等の一般的な原料が用
いられる。更にこの他に塩化ナトリウム、或いはマグネ
シウム、カリウム、鉄、カルシウム等の燐酸塩、硫酸塩
或いは炭酸塩等及び微量ビタミン類が必要に応じて添加
される。
ヒアルロン酸生産菌を特定の栄養培地にて培養する事に
より行なわれる。培地としては、炭素源、窒素源、無機
塩及びその他に必要ならば有機微量栄養素を含有する培
地がよい。炭素源としては、例えば有機酸、脂肪族アル
コール等いろいろあるが、本発明では澱粉加水分解物、
グルコース、蔗糖、フラクトース等の糖分が必須成分と
して必要である。次に窒素源としては硫安、硝酸ナトリ
ウム、リン酸第二アンモニウム、肉エキス、ペプトン、
各種アミノ酸混合物、酵母エキス等の一般的な原料が用
いられる。更にこの他に塩化ナトリウム、或いはマグネ
シウム、カリウム、鉄、カルシウム等の燐酸塩、硫酸塩
或いは炭酸塩等及び微量ビタミン類が必要に応じて添加
される。
【０００６】ヒアルロン酸の収量増加には、炭素源のう
ちグルコースを用いると特に良い結果が得られる。糖の
添加は一度に多量添加するよりも少量に分割して適時添
加する方が良い結果となる。糖の濃度は３％以上添加す
るとヒアルロン酸の生産量が１％の時に比べ顕著に増加
する。その濃度は６〜８％添加すれば十分で、これ以上
添加しても収量の増加はない。３％未満では本発明の効
果は発揮出来ない。表１に培地組成を示した。培地中の
グルコースの添加量を変えて培養した結果を表２に示し
た。グルコース３％以上添加の場合は１％と比較すると
かなり収量が増加する事が分かる。
ちグルコースを用いると特に良い結果が得られる。糖の
添加は一度に多量添加するよりも少量に分割して適時添
加する方が良い結果となる。糖の濃度は３％以上添加す
るとヒアルロン酸の生産量が１％の時に比べ顕著に増加
する。その濃度は６〜８％添加すれば十分で、これ以上
添加しても収量の増加はない。３％未満では本発明の効
果は発揮出来ない。表１に培地組成を示した。培地中の
グルコースの添加量を変えて培養した結果を表２に示し
た。グルコース３％以上添加の場合は１％と比較すると
かなり収量が増加する事が分かる。
【０００７】
【表１】培地組成の比較 ──────────────────────────────────── 培地組成 添加量％ ──────────────────────────────────── グルコース １ ３ ４ ８ 酵母エキス ０．５ ０．５ ０．５ ０．５ ペプトン １．５ １．５ １．５ １．５ リン酸第１水素カリウム ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ チオ硫酸ナトリウム ０．１１ ０．１１ ０．１１ ０．１１ 亜鉛酸ナトリウム ０．０２ ０．０２ ０．０２ ０．０２ ──────────────────────────────────── ｐＨ５．５〜９．０、温度３０〜４４℃、通気量１〜２
ｌ／min、培養時間（１〜４日）
ｌ／min、培養時間（１〜４日）
【表２】培養条件（通気の有無とグルコース量）とヒアルロン酸生産量（ｇ／ｌ） ──────────────────────────────────── 通気の有無 グルコース量 ％ ──────────────────────────────────── １ ３ ４ ８ ──────────────────────────────────── 有 ０．５ｇ ２．０ｇ ２．１ｇ ４．０ｇ 無 − − ０．０５ｇ − ────────────────────────────────────
【０００８】グルコース８％添加時のヒアルロン酸の収
量は、常法に従い精製した結果、４．０ｇ／ｌであっ
た。培養時においては通気攪拌が必須である。通気攪拌
の方法としては振とう培養あるいは空気吹込みによる通
常の通気攪拌培養があるが、いずれを使用してもよい。
その際、攪拌力は弱く、通気量を多くした方が良い結果
が得られる。通気の有無を表２に示す。通気する事によ
って収量が明らかに増加することが分かる。更に培養時
に、アルカリ水溶液にてｐＨ５．５〜９．０に調整する
と、ヒアルロン酸が安定に生成出来、より好ましい。ア
ルカリ水溶液としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、塩基性アミノ酸、低級アミノ等の通常用いられるア
ルカリの単独或いは混合溶液が使用出来る。培養後、培
養液中に蓄積されたヒアルロン酸を分離、採取するにあ
たっては、培地を酸性にして処理すると純度がよくなり
処理しやすい。ヒアルロン酸の分離には従来から行われ
ている多糖類の分離採取法が利用出来る。
量は、常法に従い精製した結果、４．０ｇ／ｌであっ
た。培養時においては通気攪拌が必須である。通気攪拌
の方法としては振とう培養あるいは空気吹込みによる通
常の通気攪拌培養があるが、いずれを使用してもよい。
その際、攪拌力は弱く、通気量を多くした方が良い結果
が得られる。通気の有無を表２に示す。通気する事によ
って収量が明らかに増加することが分かる。更に培養時
に、アルカリ水溶液にてｐＨ５．５〜９．０に調整する
と、ヒアルロン酸が安定に生成出来、より好ましい。ア
ルカリ水溶液としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、塩基性アミノ酸、低級アミノ等の通常用いられるア
ルカリの単独或いは混合溶液が使用出来る。培養後、培
養液中に蓄積されたヒアルロン酸を分離、採取するにあ
たっては、培地を酸性にして処理すると純度がよくなり
処理しやすい。ヒアルロン酸の分離には従来から行われ
ている多糖類の分離採取法が利用出来る。
【０００９】例えば培養液中の菌体、その他の不溶成分
はロ過又は遠心分離等により分離除去する。溶液中に混
在する蛋白質はトリクロル酢酸、又はクロロホルム、イ
ソアミルアルコール混液での除去或いは活性白土、活性
炭等の吸着剤或いはペプシン、パパイン、プロナーゼ等
の蛋白質分解酵素にて除去することが出来る。又、混在
する低分子物質は限外ロ過、透析或いは有機溶媒再沈法
等により分解除去する。その後、有機溶媒による沈殿法
又はカチオン活性剤による吸着法或いはイオン交換樹脂
による吸着法で精製後凍結乾燥、噴霧乾燥或いは溶媒沈
殿法等の方法でヒアルロン酸を単離する事が出来る。こ
のようにして得られたヒアルロン酸は水に可溶、メタノ
ール、エタノール、アセトン、クロロホルム、エーテル
等の有機溶媒には不溶の白色繊維状、無味、無臭の乾燥
物である。
はロ過又は遠心分離等により分離除去する。溶液中に混
在する蛋白質はトリクロル酢酸、又はクロロホルム、イ
ソアミルアルコール混液での除去或いは活性白土、活性
炭等の吸着剤或いはペプシン、パパイン、プロナーゼ等
の蛋白質分解酵素にて除去することが出来る。又、混在
する低分子物質は限外ロ過、透析或いは有機溶媒再沈法
等により分解除去する。その後、有機溶媒による沈殿法
又はカチオン活性剤による吸着法或いはイオン交換樹脂
による吸着法で精製後凍結乾燥、噴霧乾燥或いは溶媒沈
殿法等の方法でヒアルロン酸を単離する事が出来る。こ
のようにして得られたヒアルロン酸は水に可溶、メタノ
ール、エタノール、アセトン、クロロホルム、エーテル
等の有機溶媒には不溶の白色繊維状、無味、無臭の乾燥
物である。
【００１０】次にストレプトコッカス・ズーエピデミカ
スで培養して得られた精製ヒアルロン酸の性質を以下に
述べる。 呈色反応 アンスロン − 硫酸反応 ： 緑色 カルバゾール − 硫酸反応 ： 紅色 赤外吸収スペクトル ＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルは図１の
通りである。 ０．１％水溶液の比施光度：［ａ］20/D＝−６７．５゜ 電気泳動による分析 等速電気泳動のチャートを図２に示した。泳動条件は下
記の通りで、本多糖のボテンシアルユニットバリュー
（Potential Unit Value）は０．２３であるところか
ら、本粘質物はヒアルロン酸であることを確認した。泳動条件 リーデイング液 0.01M、HCL β-Ala、pH3.2、トリトンX-100、0.1% ターミナル液 0.01M カフ゜ロン酸 泳動電流 100μA キャピラリチューブ 20cm×0.5mmφ 恒温槽温度 20゜C チャートスピード 10mm/mnポテンシアルユニットバリュー 本粘質物 0.23 ヒアルロン酸 0.23 コンドロイチン硫酸 0.11 又、セルロースアセテート膜を用いるろ紙電気泳動で
も、０．１Ｍ酢酸亜鉛電極液で本多糖はヒアルロン酸と
一致した。その際、真菌性ヒアルロニダーゼ（Streptom
yces hyalurolyticus）で処理後電気泳動にて分析した
ものは標品と同様スポットを示さず、本酵素により分解
される事からもヒアルロン酸である事が確認出来た。
スで培養して得られた精製ヒアルロン酸の性質を以下に
述べる。 呈色反応 アンスロン − 硫酸反応 ： 緑色 カルバゾール − 硫酸反応 ： 紅色 赤外吸収スペクトル ＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルは図１の
通りである。 ０．１％水溶液の比施光度：［ａ］20/D＝−６７．５゜ 電気泳動による分析 等速電気泳動のチャートを図２に示した。泳動条件は下
記の通りで、本多糖のボテンシアルユニットバリュー
（Potential Unit Value）は０．２３であるところか
ら、本粘質物はヒアルロン酸であることを確認した。泳動条件 リーデイング液 0.01M、HCL β-Ala、pH3.2、トリトンX-100、0.1% ターミナル液 0.01M カフ゜ロン酸 泳動電流 100μA キャピラリチューブ 20cm×0.5mmφ 恒温槽温度 20゜C チャートスピード 10mm/mnポテンシアルユニットバリュー 本粘質物 0.23 ヒアルロン酸 0.23 コンドロイチン硫酸 0.11 又、セルロースアセテート膜を用いるろ紙電気泳動で
も、０．１Ｍ酢酸亜鉛電極液で本多糖はヒアルロン酸と
一致した。その際、真菌性ヒアルロニダーゼ（Streptom
yces hyalurolyticus）で処理後電気泳動にて分析した
ものは標品と同様スポットを示さず、本酵素により分解
される事からもヒアルロン酸である事が確認出来た。
【００１１】
【実施例】実施例１ グルコース８％、酵母エキス０．５％、ペプトン１．５
％、リン酸第１水素カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリ
ウム０．１１％、亜鉛酸ナトリウム０．０２％の組成の
培地を１ｌのジャーフアーメンターいわしや製ＭＡ型５
００mlミニジャーに４００ml分注し、１２０℃、１５分
間加熱殺菌後、前培養したストレプトコッカス・ズーエ
ピデミカスを接種し、ｐＨ７，３３℃で４日間通気攪拌
（通気量２ｌ／ｍ（Q）、回転数２００ｒｐｍ）培養し
た。培養終了後培養液より遠心分離により、菌体及びそ
の他の夾雑物を除去し、上澄液へ２倍量のエタノールを
攪拌しつつ加えると繊維状物質が沈殿した。これをロ別
した後、エーテル、ついでエタノールで充分洗浄後、再
び水に溶解し、セチルピリジニウムクロライドを加え、
生じた沈殿をロ取し、水及び０．１Ｍ ＮａＣｌ水溶液
にて十分洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌにてヒアルロン酸
を抽出し、その溶液を透析法により脱塩後、溶液を凍結
乾燥して培養液１ｌより４．０ｇのヒアルロン酸を得
た。本品はロ紙電気泳動にて標品のヒアルロン酸と同じ
位置に泳動され、等速電気泳動のユニットバリューも
０．２３と標品のそれと一致した。更に赤外線吸収スペ
クトルも標品のスペクトルと一致した。一方、グルコー
ス８％の代りにグルコース１％添加した培地で同様にス
トレプトコッカス・ズーエピデミカスを培養した場合に
は、培養液１ｌより０．５ｇ／ｌのヒアルロン酸が得ら
れたにすぎなかった。実施例２ 実施例１に於て使用した培地中のグルコースの量を４％
におきかえた培地を用いてストレプトコッカス・ズーエ
ピデミカスを実施例１と同様の方法で培養した。ヒアル
ロン酸の収量は２．１ｇ／ｌであった。ただし、本条件
で通気攪拌しなかった場合の収量は０．０５ｇ／ｌと低
かった。実施例３ 実施例１に於て使用した培地中のグルコースの量を３％
におきかえた培地を用いてストレプトコッカス・ズーエ
ピデミカスを実施例１と同様の方法で培養し、処理し
た。ヒアルロン酸の収量は、２．０ｇ／ｌであった。実施例４ 実施例１と同様の方法でストレプトコッカス・エキ（Ａ
ＴＣＣ９５２７）を培養し、培養液からヒアルロン酸を
単離精製し、培養液１ｌより３．８ｇのヒアルロン酸を
得た。
％、リン酸第１水素カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリ
ウム０．１１％、亜鉛酸ナトリウム０．０２％の組成の
培地を１ｌのジャーフアーメンターいわしや製ＭＡ型５
００mlミニジャーに４００ml分注し、１２０℃、１５分
間加熱殺菌後、前培養したストレプトコッカス・ズーエ
ピデミカスを接種し、ｐＨ７，３３℃で４日間通気攪拌
（通気量２ｌ／ｍ（Q）、回転数２００ｒｐｍ）培養し
た。培養終了後培養液より遠心分離により、菌体及びそ
の他の夾雑物を除去し、上澄液へ２倍量のエタノールを
攪拌しつつ加えると繊維状物質が沈殿した。これをロ別
した後、エーテル、ついでエタノールで充分洗浄後、再
び水に溶解し、セチルピリジニウムクロライドを加え、
生じた沈殿をロ取し、水及び０．１Ｍ ＮａＣｌ水溶液
にて十分洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌにてヒアルロン酸
を抽出し、その溶液を透析法により脱塩後、溶液を凍結
乾燥して培養液１ｌより４．０ｇのヒアルロン酸を得
た。本品はロ紙電気泳動にて標品のヒアルロン酸と同じ
位置に泳動され、等速電気泳動のユニットバリューも
０．２３と標品のそれと一致した。更に赤外線吸収スペ
クトルも標品のスペクトルと一致した。一方、グルコー
ス８％の代りにグルコース１％添加した培地で同様にス
トレプトコッカス・ズーエピデミカスを培養した場合に
は、培養液１ｌより０．５ｇ／ｌのヒアルロン酸が得ら
れたにすぎなかった。実施例２ 実施例１に於て使用した培地中のグルコースの量を４％
におきかえた培地を用いてストレプトコッカス・ズーエ
ピデミカスを実施例１と同様の方法で培養した。ヒアル
ロン酸の収量は２．１ｇ／ｌであった。ただし、本条件
で通気攪拌しなかった場合の収量は０．０５ｇ／ｌと低
かった。実施例３ 実施例１に於て使用した培地中のグルコースの量を３％
におきかえた培地を用いてストレプトコッカス・ズーエ
ピデミカスを実施例１と同様の方法で培養し、処理し
た。ヒアルロン酸の収量は、２．０ｇ／ｌであった。実施例４ 実施例１と同様の方法でストレプトコッカス・エキ（Ａ
ＴＣＣ９５２７）を培養し、培養液からヒアルロン酸を
単離精製し、培養液１ｌより３．８ｇのヒアルロン酸を
得た。
【図１】本培養により得たヒアルロン酸の赤外線吸収ス
ペクトルである。
ペクトルである。
【図２】本培養により得たヒアルロン酸の等速電気泳動
のチャートである。
のチャートである。
【手続補正書】
【提出日】平成５年２月２４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 ヒアルロン酸の製造方法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は微生物によるヒアルロン
酸の製造方法に関するものである。
酸の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、ヒアルロン酸はウシの眼のガラス
液、ニワトリのトサカ、このほか臍帯、関節液等より単
離され、タンパク質及び水と結合してゼリー状を保ち、
潤滑剤的な役割、バクテリアの侵入からの保護、水分の
保持等に役立っている。しかし、極めて高価であること
が問題点であった。一方ストレプトコッカス属細菌を利
用したヒアルロン酸の生成についてはストレプトコッカ
ス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏ
ｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・エキ（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・
エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ
ｓｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクテ
ィエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｃｌａ
ｃｔｉａｅ）及びストレプトコッカス・ズーエピデミカ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍ
ｉｃｕｓ）等の細菌によりヒアルロン酸を生産する事が
すでに知られている。その報告はホルムストレーム
（Ｂ．Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ Ａｐｐｌ・Ｍｉｃｒｏｂｉ
ａｌ １９６７）、ジェー・ビー・ウールコック（Ｊ．
Ｂ．Ｗｏｏｌｃｏｃｋ ８５，３７２〜３７５Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ １９７４）、イー・キエム
（Ｅ．Ｋｊｅｍ Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ．Ｓｃａｎｄ １９７６）らによって既に報告
されている。
液、ニワトリのトサカ、このほか臍帯、関節液等より単
離され、タンパク質及び水と結合してゼリー状を保ち、
潤滑剤的な役割、バクテリアの侵入からの保護、水分の
保持等に役立っている。しかし、極めて高価であること
が問題点であった。一方ストレプトコッカス属細菌を利
用したヒアルロン酸の生成についてはストレプトコッカ
ス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏ
ｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・エキ（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・
エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ
ｓｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクテ
ィエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｃｌａ
ｃｔｉａｅ）及びストレプトコッカス・ズーエピデミカ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍ
ｉｃｕｓ）等の細菌によりヒアルロン酸を生産する事が
すでに知られている。その報告はホルムストレーム
（Ｂ．Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ Ａｐｐｌ・Ｍｉｃｒｏｂｉ
ａｌ １９６７）、ジェー・ビー・ウールコック（Ｊ．
Ｂ．Ｗｏｏｌｃｏｃｋ ８５，３７２〜３７５Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ １９７４）、イー・キエム
（Ｅ．Ｋｊｅｍ Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ．Ｓｃａｎｄ １９７６）らによって既に報告
されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしいずれも大量生
産を目的としたものではなく、グルコース１％、培養時
間２４時間、ｐＨ７．０〜７．６、温度３０〜３７℃等
の条件で行うもので、収量は０．６ｇ／ｌ以下と低いも
のであった。
産を目的としたものではなく、グルコース１％、培養時
間２４時間、ｐＨ７．０〜７．６、温度３０〜３７℃等
の条件で行うもので、収量は０．６ｇ／ｌ以下と低いも
のであった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは簡単で安価
な培地でヒアルロン酸を収量良く安全に生成せしめる事
を意図して鋭意研究した結果、特定の条件で上記細菌を
培養する事により収量が増加する事を見出し、本発明を
完成するに至った。即ち、本発明は糖成分３％以上を主
炭素源とする栄養培地にてストレプトコッカス属のヒア
ルロン酸を生成する能力を有する微生物を通気攪拌培養
し、培養液中にヒアルロン酸を生成せしめ、これを採取
するものである。本発明のヒアルロン酸を生産する能力
を有する細菌としてはストレプトコッカス・ピオゲネ
ス、ストレプトコッカス・エキ、ストレプトコッカス・
エキシミリス、ストレプトコッカス・ディスガラクティ
エ、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス等があげら
れる。
な培地でヒアルロン酸を収量良く安全に生成せしめる事
を意図して鋭意研究した結果、特定の条件で上記細菌を
培養する事により収量が増加する事を見出し、本発明を
完成するに至った。即ち、本発明は糖成分３％以上を主
炭素源とする栄養培地にてストレプトコッカス属のヒア
ルロン酸を生成する能力を有する微生物を通気攪拌培養
し、培養液中にヒアルロン酸を生成せしめ、これを採取
するものである。本発明のヒアルロン酸を生産する能力
を有する細菌としてはストレプトコッカス・ピオゲネ
ス、ストレプトコッカス・エキ、ストレプトコッカス・
エキシミリス、ストレプトコッカス・ディスガラクティ
エ、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス等があげら
れる。
【０００５】本発明においてヒアルロン酸の生産は上記
ヒアルロン酸生産菌を特定の栄養培地にて培養する事に
より行なわれる。培地としては、炭素源、窒素源、無機
塩及びその他に必要ならば有機微量栄養素を含有する培
地がよい。炭素源としては、例えば有機酸、脂肪族アル
コール等いろいろあるが、本発明では澱粉加水分解物、
グルコース、蔗糖、フラクトース等の糖分が必須成分と
して必要である。次に窒素源としては硫安、硝酸ナトリ
ウム、リン酸第二アンモニウム、肉エキス、ペプトン、
各種アミノ酸混合物、酵母エキス等の一般的な原料が用
いられる。更にこの他に塩化ナトリウム、或いはマグネ
シウム、カリウム、鉄、カルシウム等の燐酸塩、硫酸塩
或いは炭酸塩等及び微量ビタミン類が必要に応じて添加
される。
ヒアルロン酸生産菌を特定の栄養培地にて培養する事に
より行なわれる。培地としては、炭素源、窒素源、無機
塩及びその他に必要ならば有機微量栄養素を含有する培
地がよい。炭素源としては、例えば有機酸、脂肪族アル
コール等いろいろあるが、本発明では澱粉加水分解物、
グルコース、蔗糖、フラクトース等の糖分が必須成分と
して必要である。次に窒素源としては硫安、硝酸ナトリ
ウム、リン酸第二アンモニウム、肉エキス、ペプトン、
各種アミノ酸混合物、酵母エキス等の一般的な原料が用
いられる。更にこの他に塩化ナトリウム、或いはマグネ
シウム、カリウム、鉄、カルシウム等の燐酸塩、硫酸塩
或いは炭酸塩等及び微量ビタミン類が必要に応じて添加
される。
【０００６】次に、炭素源の種類とヒアルロン酸の生産
効率について検討した結果を示す。なお、各炭素源の添
加量は３％とし、他の培地組成は後述する表２に準じ
た。結果を次の表１に示す。
効率について検討した結果を示す。なお、各炭素源の添
加量は３％とし、他の培地組成は後述する表２に準じ
た。結果を次の表１に示す。
【表１】 このように、ヒアルロン酸の収量増加には、炭素源のう
ちグルコースを用いると特に良い結果が得られる。糖の
添加は一度に多量添加するよりも少量に分割して適時添
加する方が良い結果となる。糖の濃度は３％以上添加す
るとヒアルロン酸の生産量が１％の時に比べ顕著に増加
する。その濃度は６〜８％添加すれば十分で、これ以上
添加しても収量の増加はない。３％未満では本発明の効
果は発揮出来ない。表２に培地組成を示した。培地中の
グルコースの添加量を変えて培養した結果を表３に示し
た。グルコース３％以上添加の場合は１％と比較すると
かなり収量が増加する事が分かる。
ちグルコースを用いると特に良い結果が得られる。糖の
添加は一度に多量添加するよりも少量に分割して適時添
加する方が良い結果となる。糖の濃度は３％以上添加す
るとヒアルロン酸の生産量が１％の時に比べ顕著に増加
する。その濃度は６〜８％添加すれば十分で、これ以上
添加しても収量の増加はない。３％未満では本発明の効
果は発揮出来ない。表２に培地組成を示した。培地中の
グルコースの添加量を変えて培養した結果を表３に示し
た。グルコース３％以上添加の場合は１％と比較すると
かなり収量が増加する事が分かる。
【０００７】
【表２】 ｐＨ５．５〜９．０、温度３０〜４４℃、通気量１〜２
Ｌ／ｍｉｎ、培養時間（１〜４日）
Ｌ／ｍｉｎ、培養時間（１〜４日）
【表３】
【０００８】グルコース８％添加時のヒアルロン酸の収
量は、常法に従い精製した結果、４．０ｇ／ｌであっ
た。培養時においては通気攪拌が必須である。通気攪拌
の方法としては振とう培養あるいは空気吹込みによる通
常の通気攪拌培養があるが、いすれを使用してもよい。
その際、攪拌力は弱く、通気量を多くした方が良い結果
が得られる。通気の有無を表３に示す。通気する事によ
って収量が明らかに増加することが分かる。更に培養時
に、アルカリ水溶液にてｐＨ５．５〜９．０に調整する
と、ヒアルロン酸が安定に生成出来、より好ましい。ア
ルカリ水溶液としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、塩基性アミノ酸、低級アミノ等の通常用いられるア
ルカリの単独或いは混合溶液が使用出来る。次の表４に
水酸化ナトリウムにより培養時のｐＨを調整した結果を
示す。なお、基本培養条件は前記表２に示した通りであ
り、炭素源としてグルコース３％を用いた。
量は、常法に従い精製した結果、４．０ｇ／ｌであっ
た。培養時においては通気攪拌が必須である。通気攪拌
の方法としては振とう培養あるいは空気吹込みによる通
常の通気攪拌培養があるが、いすれを使用してもよい。
その際、攪拌力は弱く、通気量を多くした方が良い結果
が得られる。通気の有無を表３に示す。通気する事によ
って収量が明らかに増加することが分かる。更に培養時
に、アルカリ水溶液にてｐＨ５．５〜９．０に調整する
と、ヒアルロン酸が安定に生成出来、より好ましい。ア
ルカリ水溶液としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、塩基性アミノ酸、低級アミノ等の通常用いられるア
ルカリの単独或いは混合溶液が使用出来る。次の表４に
水酸化ナトリウムにより培養時のｐＨを調整した結果を
示す。なお、基本培養条件は前記表２に示した通りであ
り、炭素源としてグルコース３％を用いた。
【表４】 なお、培養後、培養液中に蓄積されたヒアルロン酸を分
離、採取するにあたっては、培地を酸性にして処理する
と純度がよくなり処理しやすい。ヒアルロン酸の分離に
は従来から行われている多糖類の分離採取法が利用出来
る。
離、採取するにあたっては、培地を酸性にして処理する
と純度がよくなり処理しやすい。ヒアルロン酸の分離に
は従来から行われている多糖類の分離採取法が利用出来
る。
【０００９】例えば培養液中の菌体、その他の不溶成分
はロ過又は遠心分離等により分離除去する。溶液中に混
在する蛋白質はトリクロル酢酸、又はクロロホルム、イ
ソアミルアルコール混液での除去或いは活性白土、活性
炭等の吸着剤或いはペプシン、パパイン、プロナーゼ等
の蛋白質分解酵素にて除去することが出来る。又、混在
する低分子物質は限外ロ過、透析或いは有機溶媒再沈法
等により分解除去する。その後、有機溶媒による沈殿法
又はカチオン活性剤による吸着法或いはイオン交換樹脂
による吸着法で精製後凍結乾燥、噴霧乾燥或いは溶媒沈
殿法等の方法でヒアルロン酸を単離する事が出来る。こ
のようにして得られたヒアルロン酸は水に可溶、メタノ
ール、エタノール、アセトン、クロロホルム、エーテル
等の有機溶媒には不溶の白色繊維状、無味、無臭の乾燥
物である。
はロ過又は遠心分離等により分離除去する。溶液中に混
在する蛋白質はトリクロル酢酸、又はクロロホルム、イ
ソアミルアルコール混液での除去或いは活性白土、活性
炭等の吸着剤或いはペプシン、パパイン、プロナーゼ等
の蛋白質分解酵素にて除去することが出来る。又、混在
する低分子物質は限外ロ過、透析或いは有機溶媒再沈法
等により分解除去する。その後、有機溶媒による沈殿法
又はカチオン活性剤による吸着法或いはイオン交換樹脂
による吸着法で精製後凍結乾燥、噴霧乾燥或いは溶媒沈
殿法等の方法でヒアルロン酸を単離する事が出来る。こ
のようにして得られたヒアルロン酸は水に可溶、メタノ
ール、エタノール、アセトン、クロロホルム、エーテル
等の有機溶媒には不溶の白色繊維状、無味、無臭の乾燥
物である。
【００１０】次にストレプトコッカス・ズーエピデミカ
スで培養して得られた精製ヒアルロン酸の性質を以下に
述べる。 呈色反応 アンスロン − 硫酸反応 ： 緑色 カルバゾール − 硫酸反応 ： 紅色 赤外吸収スペクトル ＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルは図１の
通りである。 ０．１％水溶液の比施光度：［ａ］２０／Ｄ＝−６７．
５° 電気泳動による分析 等速電気泳動のチャートを図２に示した。泳動条件は下
記の通りで、本多糖のボテンシアルユニットバリュー
（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｕｎｉｔ Ｖａｌｕｅ）は０．
２３であるところから、本粘質物はヒアルロン酸である
ことを確認した。泳動条件 リーデイング液 ０．０１Ｍ、ＨＣＬ β−Ａｌａ、ｐＨ３．２、トリトンＸ−１００ 、０．１％ ターミナル液 ０．０１Ｍ カプロン酸 泳動電流 １００μＡ キャピラリチューブ ２０ｃｍ×０．５ｍｍφ 恒温槽温度 ２０゜Ｃ チャートスピード １０ｍｍ／ｍｎポテンシアルユニットバリュー 本粘質物 ０．２３ ヒアルロン酸 ０．２３ コンドロイチン硫酸 ０．１１ 又、セルロースアセテート膜を用いるろ紙電気泳動で
も、０．１Ｍ酢酸亜鉛電極液で本多糖はヒアルロン酸と
一致した。その際、真菌性ヒアルロニダーゼ（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）で
処理後電気泳動にて分析したものは標品と同様スポット
を示さず、本酵素により分解される事からもヒアルロン
酸である事が確認出来た。
スで培養して得られた精製ヒアルロン酸の性質を以下に
述べる。 呈色反応 アンスロン − 硫酸反応 ： 緑色 カルバゾール − 硫酸反応 ： 紅色 赤外吸収スペクトル ＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルは図１の
通りである。 ０．１％水溶液の比施光度：［ａ］２０／Ｄ＝−６７．
５° 電気泳動による分析 等速電気泳動のチャートを図２に示した。泳動条件は下
記の通りで、本多糖のボテンシアルユニットバリュー
（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｕｎｉｔ Ｖａｌｕｅ）は０．
２３であるところから、本粘質物はヒアルロン酸である
ことを確認した。泳動条件 リーデイング液 ０．０１Ｍ、ＨＣＬ β−Ａｌａ、ｐＨ３．２、トリトンＸ−１００ 、０．１％ ターミナル液 ０．０１Ｍ カプロン酸 泳動電流 １００μＡ キャピラリチューブ ２０ｃｍ×０．５ｍｍφ 恒温槽温度 ２０゜Ｃ チャートスピード １０ｍｍ／ｍｎポテンシアルユニットバリュー 本粘質物 ０．２３ ヒアルロン酸 ０．２３ コンドロイチン硫酸 ０．１１ 又、セルロースアセテート膜を用いるろ紙電気泳動で
も、０．１Ｍ酢酸亜鉛電極液で本多糖はヒアルロン酸と
一致した。その際、真菌性ヒアルロニダーゼ（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）で
処理後電気泳動にて分析したものは標品と同様スポット
を示さず、本酵素により分解される事からもヒアルロン
酸である事が確認出来た。
【００１１】
【実施例】実施例１ グルコース８％、酵母エキス０．５％、ペプトン１．５
％、リン酸第１水素カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリ
ウム０．１１％、亜鉛酸ナトリウム０．０２％の組成の
培地を１１のジャーフアーメンターいわしや製ＭＡ型５
００ｍｌミニジャーに４００ｍｌ分注し、１２０℃、１
５分間加熱殺菌後、前培養したストレプトコッカス・ズ
ーエピデミカスを接種し、ｐＨ７，３３℃で４日間通気
攪拌（通気量２ｌ／ｍ （Ｑ）、回転数２００ｒｐｍ）
培養した。培養終了後培養液より遠心分離により、菌体
及びその他の夾雑物を除去し、上澄液へ２倍量のエタノ
ールを攪拌しつつ加えると繊維状物質が沈殿した。これ
をロ別した後、エーテル、ついでエタノールで充分洗浄
後、再び水に溶解し、セチルピリジニウムクロライドを
加え、生じた沈殿をロ取し、水及び０．１Ｍ ＮａＣｌ
水溶液にて十分洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌにてヒアル
ロン酸を抽出し、その溶液を透析法により脱塩後、溶液
を凍結乾燥して培養液１１より４．０ｇのヒアルロン酸
を得た。本品はロ紙電気泳動にて標品のヒアルロン酸と
同じ位置に泳動され、等速電気泳動のユニットバリュー
も０．２３と標品のそれと一致した。更に赤外線吸収ス
ペクトルも標品のスペクトルと一致した。一方、グルコ
ース８％の代りにグルコース１％添加した培地で同様に
ストレプトコッカス・ズーエピデミカスを培養した場合
には、培養液１１より０．５ｇ／ｌのヒアルロン酸が得
られたにすぎなかった。実施例２ 実施例１に於て使用した培地中のグルコースの量を４％
におきかえた培地を用いてストレプトコッカス・ズーエ
ピデミカスを実施例１と同様の方法で培養した。ヒアル
ロン酸の収量は２．１ｇ／ｌであった。ただし、本条件
で通気攪拌しなかった場合の収量は０．０５ｇ／ｌと低
かった。実施例３ 実施例１に於て使用した培地中のグルコースの量を３％
におきかえた培地を用いてストレプトコッカス・ズーエ
ピデミカスを実施例１と同様の方法で培養し、処理し
た。ヒアルロン酸の収量は、２．０ｇ／ｌであった。実施例４ 実施例１と同様の方法でストレプトコッカス・エキ（Ａ
ＴＣＣ９５２７）を培養し、培養液からヒアルロン酸を
単離精製し、培養液１ｌより３．８ｇのヒアルロン酸を
得た。
％、リン酸第１水素カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリ
ウム０．１１％、亜鉛酸ナトリウム０．０２％の組成の
培地を１１のジャーフアーメンターいわしや製ＭＡ型５
００ｍｌミニジャーに４００ｍｌ分注し、１２０℃、１
５分間加熱殺菌後、前培養したストレプトコッカス・ズ
ーエピデミカスを接種し、ｐＨ７，３３℃で４日間通気
攪拌（通気量２ｌ／ｍ （Ｑ）、回転数２００ｒｐｍ）
培養した。培養終了後培養液より遠心分離により、菌体
及びその他の夾雑物を除去し、上澄液へ２倍量のエタノ
ールを攪拌しつつ加えると繊維状物質が沈殿した。これ
をロ別した後、エーテル、ついでエタノールで充分洗浄
後、再び水に溶解し、セチルピリジニウムクロライドを
加え、生じた沈殿をロ取し、水及び０．１Ｍ ＮａＣｌ
水溶液にて十分洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌにてヒアル
ロン酸を抽出し、その溶液を透析法により脱塩後、溶液
を凍結乾燥して培養液１１より４．０ｇのヒアルロン酸
を得た。本品はロ紙電気泳動にて標品のヒアルロン酸と
同じ位置に泳動され、等速電気泳動のユニットバリュー
も０．２３と標品のそれと一致した。更に赤外線吸収ス
ペクトルも標品のスペクトルと一致した。一方、グルコ
ース８％の代りにグルコース１％添加した培地で同様に
ストレプトコッカス・ズーエピデミカスを培養した場合
には、培養液１１より０．５ｇ／ｌのヒアルロン酸が得
られたにすぎなかった。実施例２ 実施例１に於て使用した培地中のグルコースの量を４％
におきかえた培地を用いてストレプトコッカス・ズーエ
ピデミカスを実施例１と同様の方法で培養した。ヒアル
ロン酸の収量は２．１ｇ／ｌであった。ただし、本条件
で通気攪拌しなかった場合の収量は０．０５ｇ／ｌと低
かった。実施例３ 実施例１に於て使用した培地中のグルコースの量を３％
におきかえた培地を用いてストレプトコッカス・ズーエ
ピデミカスを実施例１と同様の方法で培養し、処理し
た。ヒアルロン酸の収量は、２．０ｇ／ｌであった。実施例４ 実施例１と同様の方法でストレプトコッカス・エキ（Ａ
ＴＣＣ９５２７）を培養し、培養液からヒアルロン酸を
単離精製し、培養液１ｌより３．８ｇのヒアルロン酸を
得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】本培養により得たヒアルロン酸の赤外線吸収ス
ペクトルである。
ペクトルである。
【図２】本培養により得たヒアルロン酸の等速電気泳動
のチャートである。
のチャートである。
Claims (1)
- 【請求項１】 糖成分３％以上を主炭素源とする栄養培
地にてストレプトコッカス属のヒアルロン酸を生成する
能力を有する微生物を通気攪拌培養して、好気的条件下
で、ｐＨ５．５〜９．０に調整された培養液中にヒアル
ロン酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する微生物によるヒアルロン酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2866693A JPH0638783A (ja) | 1993-01-25 | 1993-01-25 | ヒアルロン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2866693A JPH0638783A (ja) | 1993-01-25 | 1993-01-25 | ヒアルロン酸の製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15235581A Division JPS5856692A (ja) | 1981-09-26 | 1981-09-26 | ヒアルロン酸の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0638783A true JPH0638783A (ja) | 1994-02-15 |
Family
ID=12254843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2866693A Pending JPH0638783A (ja) | 1993-01-25 | 1993-01-25 | ヒアルロン酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0638783A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100836733B1 (ko) * | 2002-11-15 | 2008-06-10 | 코오롱생명과학 주식회사 | 히알우론산 나트륨의 회수방법 및 그를 위한 장치 |
-
1993
- 1993-01-25 JP JP2866693A patent/JPH0638783A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY=1956 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100836733B1 (ko) * | 2002-11-15 | 2008-06-10 | 코오롱생명과학 주식회사 | 히알우론산 나트륨의 회수방법 및 그를 위한 장치 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 19960130 |