CN116103206B - 鼠乳杆菌byu8其菌剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株合成β‑烟酰胺单核苷酸的鼠乳杆菌BYU8及其应用，涉及微生物及其应用技术领域。所述鼠乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24788。本发明提供的鼠乳杆菌BYU8能够合成β‑烟酰胺单核苷酸，因而BYU8菌株在制备补充NMN产品方面具有广阔的市场应用前景。

Description

鼠乳杆菌BYU8其菌剂及应用

技术领域

本发明涉及微生物及其应用技术领域，尤其是涉及一株能够产生β-烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide mononucleotide, NMN）的鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）菌株BYU8。

背景技术

鼠乳杆菌是乳杆菌属中的一株潜在益生菌。由于其从小鼠的肠道中分离而来，因此得名鼠乳杆菌，其在正常人体的肠道、口腔中都有分布。2017年11月15日，发表在Nature上的Salt-responsive gut commensal modulates TH17 axis and disease（DOI:10.1038/nature24628）一文表明，高盐饮食有可能会损害肠道菌群，鼠乳杆菌便是其中受到损伤较多的一株菌，后续研究表明补充鼠乳杆菌或可改善小鼠的高血压水平；2018年3月21日上海交通大学在Microbiome发表的Predominant gut Lactobacillus murinusstrain mediates anti-inflammaging effects in calorie-restricted mice（DOI:10.1186/s40168-018-0440-5）一文，研究表明对小鼠进行短期能量限制后，肠道中的乳杆菌能够不断进行富集，并从富集的乳杆菌中分离得到一株鼠乳杆菌，后续通过对该鼠乳杆菌进行的研究表明其能改善肠道屏障功能，改善炎症反应，发挥抗炎作用；2022年3月3日南方医科大学在Microbiome上发表Lactobacillus murinus alleviate intestinalischemia/reperfusion injury through promoting the release of interleukin-10from M2 macrophages via Toll-like receptor 2 signaling（DOI: 10.1186/s40168-022-01227-w）一文，研究表明鼠乳杆菌可以通过改善炎症反应，改善肠道缺血再灌注损伤；以上的研究结果都表明鼠乳杆菌作为一株潜在益生菌，具有非常大的应用潜力。

NMN是一种具有生物活性的核苷酸，能提高身体中NAD+的含量，修复DNA损伤。发达国家的多项研究表明补充天然活性β-构型的NMN具有延缓衰老，改善身体机能的作用，并将其作为膳食补充剂进行食用。2021年Science的一项随机双盲的人体试验表明，补充NMN可以提高绝经后糖尿病前期妇女的胰岛素敏感性，抑制糖尿病的发展，对改善老年人的身体健康有着重要意义(DOI: 10.1126/science.abe9985)。目前NMN的生产有两种方式，化学合成及生物合成方法；化学合成法的多步反应可能使得NMN中残留多种对人体有害的化学试剂，且需要对NMN进行手性分离，因此成本较高；生物合成方法的技术壁垒较高，并且产能也显著低于化学合成方法。

人体不能合成B族维生素，只能通过饮食或者吸收肠道菌群产生的B族维生素，来补充人体所需，是人体必需维生素。NMN从结构上从属于B族维生素衍生物，目前肠道菌群内源性产生NMN的研究较少，且肠道菌群作为一种安全的、“活的”生物体，能够通过定植在人体肠道中，持续不断的产生对人体有益的功效，此外其还能通过影响肠道微生物的组成，构建稳定的肠道菌群屏障，发挥大于其本身作用的功效。因此肠道菌群作为补充活性NMN及其他B族维生素等物质具有广泛的市场意义及经济价值。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一株鼠乳杆菌菌株BYU8及其应用，本发明的菌株能够合成β-烟酰胺单核苷酸（NMN）。

本发明提供的技术方案如下：

根据本发明的一个方面，提供了一株鼠乳杆菌菌株BYU8，所述鼠乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24788。

根据本发明的另一个方面，提供了一种菌剂，所述菌剂含有所述鼠乳杆菌菌株BYU8。

根据本发明的另一个方面，提供了所述的鼠乳杆菌菌株BYU8或所述的菌剂在合成β-烟酰胺单核苷酸中的应用。

根据本发明的另一个方面，提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的制造方法，包括培养鼠乳杆菌菌株BYU8，以制备含有β-烟酰胺单核苷酸的培养物。优选地，培养所述鼠乳杆菌菌株BYU8 20-28小时。更优选地，在MRS液体培养基中37℃培养所述鼠乳杆菌菌株BYU8 24小时。

根据本发明的另一个方面，提供了一种β-烟酰胺单核苷酸增强剂，所述增强剂含有：由所述的鼠乳杆菌菌株BYU8得到的含有β-烟酰胺单核苷酸的培养物、从所述培养物中分离出的菌体、所述菌体的破碎物、所述菌体破碎物的上清液和/或从所述破碎物或所述上清液中分离的β-烟酰胺单核苷酸。

根据本发明的另一个方面，提供了一种饮食品、保健品、化妆品或药品，其含所述的β-烟酰胺单核苷酸增强剂。

根据本发明的另一个方面，提供了一种抗衰老组合物，含有所述β-烟酰胺单核苷酸增强剂。

生物样品保藏信息：鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）菌株BYU8，该菌株已于2022年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCC No.24788；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。经保藏中心于2022年4月27日检测为存活菌株。

鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）菌株BYU8，其特征在于，所述鼠乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24788

有益效果：本发明通过生物合成方法制备NMN，不使用对人体有害的化学试剂，且不需要对NMN进行手性分离。鼠乳杆菌BYU8菌株能够高产烟酰胺单核苷酸，具有巨大的被开发利用的市场潜能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明鼠乳杆菌BYU8的质谱鉴定图；

图2为化学荧光法检测NMN所用标准品绘制的标准曲线；

图3为鼠乳杆菌BYU8中NMN的高效液相色谱检测图；

图4 为鼠乳杆菌BYU8产NMN含量随时间变化的柱状图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1. 鼠乳杆菌BYU8菌株鉴定和制备

本发明中的鼠乳杆菌BYU8菌株分离自北京地区健康成年人群粪便，采集对象在采集肠道菌群前半年内无益生菌服用史，无胃肠病史，未服用过抗生素类药物。

将采集来的粪便样品经稀释后涂布于MRS固体培养基（蛋白胨 10 g、牛肉膏 10g、酵母膏 5 g、柠檬酸氢二铵 2 g、葡萄糖20 g、吐温-80 1 mL、乙酸钠5 g、磷酸氢二钾 2g、硫酸镁 0.58 g、硫酸锰0.25 g、琼脂 18 g、蒸馏水1000 mL），37℃厌氧培养24至48 h，分离获得平板上不同的单菌落，然后将每个单菌落分别在新的MRS固体培养基平板上进行划线操作，37℃厌氧培养48 h后得到纯化菌落，将每个纯化单菌落涂布在质谱板上，分别加入裂解液和基质干燥后在MALDI-TOF MS 1000质谱仪（Autobio，郑州安图生物科技有限公司）上进行质谱上机鉴定，鉴定完成后将多个分类保存于于-80℃冻存，作为本公司的菌种资源库，以待后用。

其中本发明所涉及的鼠乳杆菌BYU8菌株通过以上分离培养途径所得，其质谱鉴定结果如图1所示，BYU8菌株与鼠乳杆菌具有极高的相似性，据此将其命名为鼠乳杆菌BYU8菌株。

实施例2. BYU8活菌液及菌体裂解物制备

取﹣80℃冻存菌液涂布于MRS固体平板（蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、柠檬酸氢二铵2 g、葡萄糖20 g、吐温-80 1mL、乙酸钠5 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、琼脂18 g、蒸馏水1000 mL）在37℃条件下倒置培养24-48 h后，取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃培养18-24 h，得到一代菌液；取一代菌液10 %（v/v）接种至新鲜MRS液体培养基，37℃培养18-24 h得到二代菌液；取二代菌液10 %（v/v）接种于新鲜的MRS液体培养基中，37℃培养18-24 h得到工作菌液。

为了对鼠乳杆菌BYU8进行功能研究，本发明将按以下方法制备样品：

（1）活菌液：将鼠乳杆菌BYU8的工作菌液置于13000 rpm，4℃的条件下离心15 min后，弃去上清，收集沉淀，用无菌PBS重悬后，相同条件下离心，重复两次清洗后，获得具有活菌体的活菌液。

（2）菌体裂解物：将鼠乳杆菌BYU8的工作菌液置于13000 rpm，4℃的条件下离心15min后，弃去上清，收集沉淀，无菌PBS清洗两遍后，加入2 mL超纯水，放置于冰水混合物中用超声破碎仪进行破碎，即可获得菌体裂解物，破碎完成后放置于冰盒上待用。

还可以通过本技术领域中的其他方式获得活菌液，只要能从培养液中富集菌体即可。例如可以通过离心和/或过滤的方法实现。

实施例3. 鼠乳杆菌BYU8菌株中NMN含量检测

3.1 化学荧光方法检测

取BYU8活菌液2 mL，12000 rpm离心15 min后, 收集菌体沉淀，无菌PBS清洗两遍后，将2 mL超纯水加入菌体沉淀中进行重悬，在冰水混合物中进行超声破碎，依据菌体量，选择合适的超声破碎时间，获得菌体裂解物。取干净的1.5 mL离心管于离心管架上，加入104 μL不同浓度的标准品（0.21 mg/L、1.67 mg/L、3.34 mg/L、5.01 mg/L、8.36 mg/L）或获得的菌体裂解物，42 μL 2M KOH，42 μL 20%苯乙酮，涡旋混匀之后于冰盒上静置2 min，之后加入188 μL 88%甲酸，置于37℃摇床混匀，10 min后将100 μL反应液转移到黑色96孔荧光板孔中，实验设置3个复孔，用Tecan酶标仪读取激发光382 nm，发射光445 nm处的吸光值。根据NMN标准品的浓度及吸光值绘制标准曲线（图2），据此可计算出鼠乳杆菌BYU8菌株裂解物样品中NMN的含量（平均值）为62.35 mg/L，表明BYU8菌株可以自身合成NMN。

本申请人从自有菌种库中共活化>2000株肠道菌，获得其活菌液及菌体沉淀，然后分别进行NMN的化学荧光方法检测每株菌的NMN合成量，其中本发明所述的鼠乳杆菌BYU8产生NMN的效果优异，因此特进挑选出该株菌进行下一步的高效液相色谱检测。

3.2 高效液相色谱法检测

为了进一步确认鼠乳杆菌BYU8产生NMN的能力，我们将鼠乳杆菌BYU8活菌液离心，清洗，收集沉淀后破碎裂解，进行高效液相色谱（HPLC）检测。仪器参数条件如下：仪器waters 2695+2489；色谱柱：symmetry C18 5um*4.6 mm*250 mm；检测波长：210 nm；流动相：0.02M磷酸二氢钾：甲醇=90:10；流速：1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温：30℃。

高效液相色谱检测结果记录如图3和表1所示，根据检测所用样品量进一步计算可得出鼠乳杆菌BYU8菌体裂解物中NMN的含量为206.14mg/g，表明鼠乳杆菌BYU8菌株能够高产烟酰胺单核苷酸，具有巨大的被开发利用的市场潜能。

表1. 色谱峰结果

实施例4 鼠乳杆菌BYU8菌株培养时间对NMN含量的影响

NMN是机体合成NAD⁺的前体物质，因此其含量会处于动态变化状态。在常规菌株培养中，培养时间是影响菌株生长的重要因素，不同培养时间下鼠乳杆菌BYU8的NMN产量可能存在差异，因此需要寻找利于NMN合成和稳定的培养时长，将利于获得更多的NMN。

取实施例3中所得的二代菌液10 %（v/v）接种于新鲜的MRS液体培养基中，取37℃培养，不同培养时间16 h、24 h、48 h下BYU8活菌液各2 mL，12000 rpm离心15 min后, 收集菌体沉淀，无菌PBS清洗两遍后，将2 mL超纯水加入菌体沉淀中进行重悬，在冰水混合物中进行超声破碎，获得菌体裂解物。然后按照实施例3中的方法对NMN进行化学发光法进行检测。

测试结果如图4显示，16 h 培养后菌体中NMN含量较低，约13.4 mg/L，而培养24 h后收集的菌体中NMN的含量最高，可达62.1 mg/L, 继续延长培养时间至48 h后，NMN的含量不增反骤降，表明鼠乳杆菌BYU8中NMN含量与菌株培养时间有密切关系，但并不随培养时间延长而增加，而是24h的培养时间最有利于NMN的高产，这一结果将给后续的发酵培养提供重要参考。

实施例5 鼠乳杆菌BYU8耐酸碱胆盐活性检测

5.1人工胃、肠液的制备

本发明中所使用的人工胃肠液的制备参照中国药典。

人工胃液：量取234 ml浓盐酸，加水稀释至1000 ml，得到9.5%-10.5%的稀盐酸，然后取配制好的稀盐酸16.4 ml，加水800 ml与胃蛋白酶10 g，摇匀后，加水稀释至1000 ml即可获得人工胃液。

人工小肠液：取磷酸二氢钾6.8 g，加水500 ml使其充分溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，另称量胰酶10 g，加水溶解，将两种溶液混合后，加水稀释至1000ml即可获得人工肠液。

5.2 菌株的耐受性测试

收集实施例3中获得的二代菌液，将培养24 h 后的活菌体于13000 rpm，4℃离心15 min，弃去上清液，留取菌体沉淀，用生理盐水重悬菌体，按照活菌数10⁹ CFU/mL分别接入到人工胃液中，于37℃培养箱中培养1.5 h后,离心获得菌体后，将菌体接种于人工肠液中，37℃培养箱中培养3 h后取样进行活菌涂布检测。在相同的培养条件下，按照活菌数10⁹CFU/mL接种于pH 6.8的PBS中培养4.5 h，存活率（%）=（4.5 h后的活菌数/ 4.5 h PBS中的活菌数）×100%。结果显示本发明中的鼠乳杆菌BYU8菌株经过人工胃液和肠液中孵育培养4.5h后，存活率可达到68.6%；表明BYU8菌株具有较好的酸碱耐受性，当其被摄入体内后可以耐受连续的胃肠酸碱环境，保存较多的活菌量，有利于其在肠道中充分发挥益生菌的效用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一株鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）菌株BYU8，其特征在于，所述鼠乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24788。

2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂含有权利要求1所述的鼠乳杆菌菌株BYU8。

3.权利要求1所述的鼠乳杆菌菌株BYU8或权利要求2所述的菌剂在合成β-烟酰胺单核苷酸中的应用。

4.一种β-烟酰胺单核苷酸的制造方法，包括培养权利要求1所述的鼠乳杆菌菌株BYU8，以制备含有β-烟酰胺单核苷酸的培养物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，培养所述鼠乳杆菌菌株BYU8 20至28小时。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，在MRS液体培养基中37℃培养所述鼠乳杆菌菌株BYU8 24小时。

7.一种β-烟酰胺单核苷酸增强剂，所述增强剂含有：由权利要求1所述的鼠乳杆菌菌株BYU8得到的含有β-烟酰胺单核苷酸的培养物。

8.一种化妆品或药品，其含有权利要求7所述的β-烟酰胺单核苷酸增强剂。

9.一种抗衰老组合物，含有权利要求7所述的β-烟酰胺单核苷酸增强剂。