JP4932128B2 - 生理活性作用を有する新規物質、その製造方法及び用途 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、新規配糖体化合物、これを有効成分として含有する生理活性物質、その製造方法及び用途に関する。さらに詳しくは、イソマルトールをアグリコンとして含む配糖体（グルコシド）、このグルコシドを有効成分として含有する生理活性物質、その製造方法及び用途に関する。
背景技術
担子菌の培養物は免疫増強・賦活、マクロファージ活性化等のＢＲＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ；生物応答修飾物質）としての性質を有することが知られている。
本発明者らも担子菌（バシディオマイセテスに属する菌）の培養物を用いたヒト単核球細胞のインターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）等のサイトカイン産生能回復剤に関する特許出願を行っている（特願平１１−２８３２２３号）。
このような担子菌の培養物に含まれる生理活性作用については、「水溶性リグニン」（特公平６−８８９０９号）、「多糖及びゼアチン関連物質を主とするサイトカイニン系活性物質の複合体」（特公昭６２−３６００９号）、新規多糖体物質（特開平８−２５９６０２号）等による開示がある。これらの出願に示されるように、担子菌培養物は複数のタイプの生理活性物質を含むと思われるが、いずれのタイプの生理活性物質も機器分析、特に分光学的方法（核磁気共鳴等を含む。）で一義的に存否を確認できる程度には、その構造が特定されていない。
また、従来法では植物組織原料を用いていることから培養物は多種多様な有機物を含み、さらに、目的化合物の構造に関する情報が乏しいことから、カラムクロマトグラフィー等の分離手段を用いても、機器分析により目的物質を含む分画を識別することは困難であり、生理活性作用に優れた成分を効率的に分離し製造することは困難であった。
発明の目的
本発明の課題は、本出願人が永年着目してきた担子菌培養物に含まれる生理活性作用をもたらす成分の中から主要物質の構造を明らかにし、その物質を効率的に生産できる条件等を明確にすること、及びその物質の生理活性作用を利用した食品、医薬品及び飼料などの用途を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは前記課題の解決を図るべく検討を進めた結果、従来行なわれていた植物組織原料を含む培地中での担子菌培養法とは異なり、予め担子菌を培養して得た培養液と、米糠抽出液と酵素との反応液とを反応させた時、生理活性作用効果の増大した物質が得られることを発見し、またその物質を同定して本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の生理活性作用を有する新規物質、その製造方法及び用途に関する。
１．式（Ｉ）：

（式中、Ｓｕｇはグルコース残基または２個以上のグルコース単位からなる糖鎖である。）で示されるイソマルトールをアグリコンとして含む配糖体。
２．式（ＩＩ）：

（式中、ｎは０または１以上の整数である。）で示される前項１に記載の配糖体。
３．ｎが１〜２０である前項２に記載の配糖体。
４．担子菌を培養して得た培養液と、米糠抽出液と酵素との反応液とを反応させた後、カラムクロマトグラフィーによって分離される前項１乃至３のいずれかに記載の配糖体。
５．前記式（ＩＩ）においてｎが０である式（ＩＩＩ）：

で示される２−アセチル−３−ヒドロキシフラン ３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド。
６．前項１または２に記載の配糖体を有効成分として含有する生理活性物質。
７．生理活性作用が、ヒト細胞のサイトカイン誘導能を増大させる作用である前項６に記載の生理活性作用を有する物質。
８．サイトカインが腫瘍細胞壊死因子（ＴＮＦ−α）である前項７に記載の生理活性作用を有する物質。
９．サイトカインがインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）である前項７に記載の生理活性作用を有する物質。
１０．サイトカインがインターロイキン−２（ＩＬ−２）である前項７に記載の生理活性作用を有する物質。
１１．担子菌を培養して得た培養液と、米糠抽出液と酵素との反応液とを反応させた後、分離することを特徴とする式（Ｉ）：

（式中の記号の意味は前項１の記載に同じ）で示され、生理活性作用を有する配糖体の製造方法。
１２．担子菌を培養して得た培養液と、米糠抽出液と酵素との反応液とを反応させた後、（１）^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでメチルケトンのメチル水素に由来するピーク、ＡＢシステムの特徴的な２，３−ジ置換フラン環の４，５位の水素に由来するピークを示し、（２）^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルでグルコピラノースに由来する６本のピーク及びイソマルトールに由来する６本のピークを示す成分を指標に、カラムクロマトグラフィーにより分離する前項１０記載の式（Ｉ）で示され、生理活性作用を有する配糖体の製造方法。
１３．前項６乃至１０のいずれかに記載の生理活性作用を有する物質を含有する食品。
１４．前項６乃至１０のいずれかに記載の生理活性作用を有する物質を含有する医薬品。
１５．前項６乃至１０のいずれかに記載の生理活性作用を有する物質を含有する飼料。
発明の詳細な説明
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）配糖体化合物
本発明の配糖体化合物は、担子菌を培養して得た培養液と、米糠抽出液と酵素との反応液（以下、米糠抽出・酵素反応液と略記することがある。）とを反応させた後、カラムクロマトグラフィーにより分離する方法（詳細は後述する。）で得られる、式（Ｉ）：

で示されるイソマルトールをアグリコンとして含む新規配糖体である。上記式中、Ｓｕｇはグルコース残基または２個以上のグルコース単位からなる糖鎖である。
イソマルトールは式：

で示され、香料成分として用いられる物質である。
イソマルトールをアグリコンとする配糖体は、ガラクトシド（糖部分がガラクトースである配糖体）について言及した例があるが（Ｊ．Ｂａｒｔｕｌｉｎ ｅｔ．Ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅ Ｃｈｅｍ，．２９，１０１７（１９９２），”Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｏｆ ２−Ａｃｅｔｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｎ−ｐｒｏｐｙｌｐｙｒｒｏｌｅ ｆｒｏｍ Ｉｓｏｍａｌｔｏｌ ａｎｄ １−ｎ−Ａｌｋｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｙｒｉｄｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｍａｌｔｏｌ”）、イソマルトールをアグリコンとして含むグルコシド（糖部分がグルコース単位からなる配糖体）は従来報告されておらず、その機能は勿論知られていない。
Ｓｕｇが２以上のグルコース単位を含む場合、糖鎖長は特に限定されないが、本発明の方法によれば、ｎが１〜２０個のグルコース単位の混合物として反応生成固形分中に約１０％含まれている。糖鎖（Ｓｕｇ）は、α（１→６）結合やその他の結合を一部含んでもよく、部分的に分岐鎖を有しても良いが、主としてα（１→４）結合で連結した直鎖状の糖鎖である。
新規配糖体化合物の典型的な構造は、式（ＩＩ）：

（式中、ｎは０または１以上の整数）で示される。
例えば、１個のグルコース単位を含む化合物である、前記式（ＩＩ）においてｎが０である式（ＩＩＩ）：

で示される新規な２−アセチル−３−ヒドロキシフラン ３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドは、本発明の方法で分離するほか、化学的合成により調製することができる。
（Ｂ）生理活性物質
前記した本発明の新規配糖体化合物は優れた生理活性作用を有する。
生理活性作用としては、免疫増強・賦活、マクロファージ活性化等の性質が挙げられ、特に、ヒト細胞のサイトカイン誘導能の向上が含まれる。
本発明の生理活性物質により誘導されるサイトカインの例としては、腫瘍細胞壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）等が挙げられるがこれに限定されるものではない。
腫瘍細胞壊死因子（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）ＴＮＦ−αは、腫瘍細胞を殺傷する作用を有する蛋白質であり、感染、負傷または免疫的誘発に反応して、全身で及び局所的に産生されるサイトカインである。インターフェロン（ＩＦＮ）は、ウイルスや核酸などの刺激を受けて産生される、細胞外に分泌される抗ウイルス蛋白質であり、抗ウイルス作用のみでなく、抗腫瘍作用や免疫系の活性化等様々な活性を示すことが知られている。ＩＦＮ−γは、Ｔ細胞等から産生されるものである。インターロイキン−２（ＩＬ−２）は腫瘍の縮小・消失等の効果を有する。
（Ｃ）製造及び分離方法
上述の通り生理活性作用を有する、前記式（Ｉ）で示される化合物は、従来報告されていない新規な物質であるが、本発明者らは、これが担子菌培養液中、あるいは米糠抽出・酵素反応液中には存在しないこと、また、米糠を最初から培地に添加して培養しても生成せず、担子菌培養液と米糠抽出・酵素反応液とを反応させた液中にのみ生成することを確認した。
従来、植物組織原料を含む培地中での担子菌培養は行なわれているが、予め担子菌を培養して得た培養液と米糠抽出・酵素反応液とを反応させることにより高い生理活性作用を有する物質が得られるのは予想外のことである。
（Ｃ−１）担子菌培養液
本発明の生理活性物質の製造プロセスに用いる担子菌培養液は、担子菌をその生育に適した液体培地で培養した培養液である。
液体培地の炭素源の例としては、ブドウ糖、ショ類、マルトース、サッカロース、上白糖、黒糖、糖蜜、廃糖蜜、マルツエキス等が挙げられる。
窒素源の例としては、肉エキス、ペプトン、グルテンミール、大豆粉、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム塩、尿素等が挙げられる。その他、必要に応じて、ナトリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、カルシウム塩、リン酸塩等の無機塩類や、イノシトール、ビタミンＢ１塩酸塩、Ｌ−アスパラギン、ビオチン等のビタミン類を添加してもよい。
好適な液体培地の組成は培養する担子菌の菌種にもよるが、例えば、マルツエキス（１〜５％）、酵母エキス（０．１〜０．５％）、酒石酸アンモニウム（０．１〜０．４％）等を含む培地が挙げられる。
本発明に用いる担子菌の例には、椎茸菌（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ）、マッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、マイタケ（Ｇｒｉ ｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）、ナメコ（Ｐｈｏｒｉｏｔａ ｎａｍｅｋｏ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、エノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）、マンネンタケ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）、キクラゲ（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｒａ）、コフキサルノコシカケ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ａｐｐｌａｎａｌｕｍ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｌｕｃｉｄｕｍ）、チョレイマイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔｅ）、スエヒロタケ（Ｓｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）、フクロタケ（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ ｖｏｌｖａｃｅａｅ）等が挙げられるが、特に好ましいのは、椎茸菌（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ）、及びマイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）である。
培養は、通常の中温菌の通気培養に準じて、ｐＨ２〜６で、１０〜４５℃、好ましくは１５〜３０℃の温度で行う。培養時間は、菌の量や培地の種類にもよるが、通常４〜２０日間、好ましくは６〜１２日間程度である。
培養後は、固液分離し液体成分を次ぎの米糠抽出・酵素反応液との反応に使用する。
（Ｃ−２）米糠抽出液・酵素反応液
米糠抽出液は、米糠を同量以上（例えば、２〜１０倍）の熱水中で撹拌処理し抽出した水溶液である。この際、１０５〜１３０℃程度の加圧した熱水を用いることが好ましい。次いで、酵素剤を加えて反応させた後、デカンター等により固液分離して米糠抽出液・酵素反応液を得る。
酵素剤としては、α−アミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の炭水化物加水分解酵素を単独あるいは２種以上混合して使用する。プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素等を併用してもよい。また、酵素反応は、酵素活性が損なわれない条件下、すなわち４０℃以上９０℃未満、好ましくは４０〜７０℃で、１〜２４時間程度、好ましくは３〜１２時間程度行われる。
（Ｃ−３）担子菌培養液と米糠抽出液・酵素反応液との反応
担子菌培養液と米糠抽出・酵素反応液との反応は、好ましくは４０℃以上９０℃未満、より好ましくは４０〜７０℃で行なう。通常は両者を混合して８〜２４時間反応させる。次いで液全体を加圧下に例えば１２０℃以上に加熱して液中の酵素等を失活させ、必要に応じて分離精製する。
分離精製方法は特に限定されず各種の分離方法が適用できるが、経済的見地からはカラムクロマトグラフィー法が好ましい。
従来の担子菌由来生理活性物質では、カラムの構成や溶出液の選択等は、目的化合物の構造に関するデータが乏しいため、多義的な解釈が可能な呈色反応や判定に時間のかかる生物学的検査を経て試行錯誤的に決定されていたが、本発明では目的とする生理活性物質の構造が判明しているため、構造式に基づいて親水性、分子量その他の性質からカラム構成や溶出液の選択が容易に行なえる。また、以下の分光学的特徴を指標として目的画分を迅速に識別することができる。
（１）^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルがメチルケトンのメチル水素に由来するピーク、２，３−ジ置換フラン環の４，５位の水素に由来するＡＢシステムピークを示す。
（２）^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルがグルコピラノースに由来する６本のピーク及びイソマルトールに由来する６本のピークを示す。
メチルケトンのメチル水素に由来するピークはδ２．４８（３Ｈ，ｓ）近傍に見出される。２，３−ジ置換フラン環の４，５位の水素に由来するピークは、δ６．７８及び７．６７近傍のＡＢシステムとして認められる（いずれも重水素化メタノール中での値）。
この他、３０００〜３７００ｃｍ^−１（水酸基）、１６６０ｃｍ^−１（共役カルボニル基）、１５８４ｃｍ^−１（二重結合）に由来する赤外吸収等を参照してもよい。
（Ｅ）用途
本発明の生理活性物質は、従来、食用に供されている安全な原料（米糠抽出液及び食用菌の担子菌培養液）を用いており、毒性を有する副生物が混在する可能性が極めて低い。従って、それ自体を健康食品、医薬品、あるいは強化食品添加物、飼料等として幅広く利用できる。
これらの用途、例えば健康食品として用いるには、前記（Ｃ−３）の工程で得られた生理活性物質を目的に応じて濃縮、精製する。本発明の生理活性物質は比較的熱に安定であるが、濃縮や乾燥には凍結乾燥を用いることが好ましい。必要により。食品用添加剤、賦形剤を使用して製剤化する。
医薬品は、ヒト用医薬及び動物用医薬を含む。本発明物を医薬として投与する場合、前記式（Ｉ）の生理活性物質は、そのまま、または医薬的に許容される無毒性かつ不活性の担体に添加した医薬組成物とする。担体としては、固形、半固形又は液状の希釈剤、充填剤及びその他の処方用の助剤等が用いられる。
医薬品は、静脈内投与、経口投与、組織内投与、局所投与（経皮投与等）又は経直腸的に投与することができる。剤型は、これらの投与方法に適した形状とすればよい。
飼料としては、牛、豚、鶏、羊等の家畜・家禽飼料、魚類や甲殼類等の水産養殖業用の飼料、犬猫その他のペット用飼料が挙げられる。
近年、畜産業界で問題となっている抗生物質の多用による問題を軽減する効果も期待できる。前記生理活性物質は単独で経口投与してもよいが、各種糖質やタンパク質、脂質、繊維質、ビタミン類、ミネラル類等と共に、散剤もしくはペレット状の飼料として用いることが好ましい。脂質や繊維質の種類は特に限定されず、魚、肉骨粉、大豆粕、アルファルファミール、ふすま等飼料として使用可能なものであれば、いずれを用いてもよい。
発明を実施するための最良の形態
以下、製造例及び生理活性試験結果を示した本発明の生理活性物質についてより詳細に説明する。
なお、生理活性試験は、生後６週齢、雄性のＣ５７／ＢＬ６マウスに、１ｇ／ｋｇの試料を１週間に亘り強制経口投与し、その後動物を犠牲死させて脾臓及び腹腔浸潤細胞（ＰＥＣ）を採取し、それぞれ培養を行ってＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２を測定した。
ａ）脾臓細胞の培養
採取したマウス脾臓をＤＭＥＭ培地でホモジナイズし、次いで４℃で遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）して、この中に赤血球除去の目的でＡＣＫ溶解バッファーを加えて加温（３７℃、３分）した後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）した。集められた脾臓細胞に終濃度１０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡを加えてマイクロプレートで培養し、１５時間後に培養上清を採取してＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２を測定した。
ｂ）ＰＥＣ培養
生理食塩水を用いマウス腹腔より採取したＰＥＣ（腹腔浸潤細胞）を遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分）して収集した細胞をマクロファージとし、これに終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるようにＬＰＳ（リポポリサッカライド）を添加して培養し、４時間後の培養上清中のＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２を測定した。
なお、ａ）、ｂ）共に、サイトカイン測定用キット（和光純薬（株））を使用した。
実施例１：生理活性物質の確認
下記の組成のマルツエキス（２％）、酵母エキス（０．２５％）、酒石酸アンモニウム（０．２％）を含む液体培地で、椎茸菌（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ）を２４℃１０日間通気培養して担子菌培養液を調製した。
また、米糠を５倍（質量）の水に分散して液温１２０℃で２０分撹拌して抽出した後、α−アミラーゼ、ペクチナーゼからなる酵素剤を加え６０℃で１２０分反応させ、デカンターにより固液分離して液部を回収して米糠抽出・酵素反応液を調製した。
担子菌培養液及び米糠抽出・酵素反応液は、生理活性を示さなかった。
一方、上記の操作により得た担子菌培養液と米糠抽出・酵素反応液とを混合し、６０℃で２０時間撹拌して反応させ、次いで液全体を１２０℃以上に２０分間加熱して液中の酵素等を失活させ、反応液を濃縮し、得られた濃縮液８０ｍｌ（水分７５％）を、約５００ｍｌ容量のダイヤイオンＨＰ−２０カラムを通じてメタノールで溶出したところ、溶出液に生理活性が観察されたため、この操作を２度繰り返して褐色の画分（５．６ｇ）を得た。
さらに、この画分について、各種のクロマトグラフィーにより生理活性成分の探索を試み、シリカゲルクロマトグラフィー（メルク社製，キーゼル，１２５−４００メッシュ、５０ｇ）に付し、続いてＯＤＳ系逆相ゲルカラムクロマトグラフィー（約１００ｍｌ容量）に付することにより、白色粉末状の生理活性成分（４０ｍｇ）を得た。
得られた物質の物性は、次のとおりであった。
（ｉ）質量分析（二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ））
負イオン化測定においてｍ／ｚ：２８７、正イオン化測定においてｍ／ｚ：２８９に各々分子イオンピークを示し、本化合物の分子量は２８８であることが示された。更に、これら両イオンピークの高分解能質量分析結果と併せると、分子式がＣ_１２Ｈ_１６Ｏ_８（不飽和度５）であると推定される。
（ｉｉ）ＩＲスペクトル
３０００〜３７００ｃｍ^−１に水酸基、１６６０ｃｍ^−１に共役カルボニル基、１５８４ｃｍ^−１に二重結合に由来する吸収が確認された。
（ｉｉｉ）^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（重水素化メタノール中、２７０ＭＨｚ）
δ２．４８（３Ｈ，ｓ）にメチルケトン、δ３．４−５．６にα−Ｄ−グルコピラノース環に由来するスペクトル、δ６．７８及び７．６７に結合定数１．９ＨｚのＡＢシステムに由来するピークが認められた。
（ｉｖ）^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（重水素化メタノール中、６７．５ＭＨｚ、ＤＥＰＴ測定法）
１２本のシグナルが認められ、α−Ｄ−グルコピラノース環に由来する６本のシグナル群の他、δ２７．４（一級）、δ１０５．９及び１３９．３（各三級）、δ１４８．５、１５４．３、及び１８７．４（各四級）の６本のアグリコン部分に由来するシグナルが認められた。
^１Ｈ−ＮＭＲにおける低磁場のＡＢシステムはその結合定数１．９Ｈｚから２，３−ジ置換フラン環の４，５位の水素シグナルに特徴的である。分子式の不飽和度５は、ピラノース環１個、二重結合２個、カルボニル基１個、及びフラン環１個に対応する。これらの情報に基き、得られた物質は下記式

で示される、新規物質（２−アセチル−３−ヒドロキシフラン ３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド、以下、「物質Ａ」と略記する。）であることが確認された。
物質Ａの生成過程の確認：
以上と同様にして、担子菌培養液、米糠抽出・酵素反応液、両者の反応液等に存在する物質Ａの消長を追跡した結果、担子菌培養液と米糠抽出・酵素反応液との反応液中にのみ物質Ａが生成することを確認した。担子菌培養液、米糠抽出・酵素反応液中には物質Ａは全く存在せず、両者の反応によって初めて生成することが判明した。
実施例２：物質Ａの化学合成
Ｊ．Ｂａｒｔｕｌｉｎ ｅｔ．Ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅ Ｃｈｅｍ，．２９，１０１７（１９９２），”Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｏｆ ２−Ａｃｅｔｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｎ−ｐｒｏｐｙｌｐｙｒｒｏｌｅ ｆｒｏｍ Ｉｓｏｍａｌｔｏｌ ａｎｄ １−ｎ−Ａｌｋｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｙｒｉｄｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｍａｌｔｏｌ”に記載されている、ラクトース（乳糖）を出発物質としてガラクトシルイソマルトールを化学誘導している反応例にならって、ラクトースをマルトースに置き換えて誘導した。
（ａ）化学誘導反応
マルトース・１水和物３．６０ｇ（０．０１ｍｏｌ）を５０ｍｌ容量のナス型フラスコに秤り取り、無水エタノールを３．０ｍｌ加え、撹拌子を入れて激しく撹拌、分散させる。この時、マルトース・１水和物の不溶部が無水エタノール中に偏ることなく全体に撹拌・分散している状態を保つ。激しく撹拌しながら、ピペリジン１．０ｍｌを加えて均一に混和した後、メスピペットを用いて、０．４４ｍｌの酢酸を約１５分かけて徐々に滴下する。７８℃に調節したシリコンオイル浴中に、水流冷却管を付したナス型フラスコを入れて反応させる。フラスコ内に熱が行きわたり、部分的に沸騰し始めたらトリエチルアミン約０．５ｍｌを加える。設置後、熱により次第にマルトース・１水和物が溶け始めるともに、溶液が黄色から褐色へと変化してゆく。約１２時間後、同容量のトリエチルアミンを加えて塩基性を保つ。２４時間後、フラスコを環流装置から取り外して室温に戻して精製操作に移る。このとき、反応物の性状は濃褐色のタール状物質であった。
反応物を蛍光剤入りシリカゲルで調製したＴＬＣ分析（クロロホルム・メタノール・水（６５：２５：４混液））に付したところ、物質Ａと同Ｒｆ値（約０．５）に主波長２５４ｎｍの紫外線照射により吸収を有するスポットが観察された。アニスアルデヒド−硫酸発色試液を噴霧加熱すると黄色、ついで濃青色に変色した。
（ｂ）精製
（ｂ−１）ＬＨ−２０ゲルによる粗精製
あらかじめ必要容量のＬＨ−２０ゲルをメタノール・水（１：２）を通過させて平衡化しておき、反応液を最小量の同溶媒と混和してチャージした。同溶媒で展開、分画して目的化合物を含む画分を合わせた。得られた画分を留去、乾固して褐色の油状物質を得た（０．４９ｇ）。
（ｂ−２）シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製
試料の２０−３０倍重量に相当する２００メッシュ程度のシリカゲルで作製したカラムにチャージし、展開した。水飽和酢酸エチル・メタノール（３：１）、ついで、クロロホルム・メタノール・水混液（クロロホルム・メタノール４：１に飽和量の水を添加）で再クロマトを行い、精製した画分を留去、乾固して淡黄色樹脂状物質を得た（０．４９ｇ）。
（ｂ−３）結晶化
淡黄色樹脂状物質をメタノールから結晶化させ無色針状晶を得た（０．３７ｇ）。
このようにして得た物質は物質Ａと同一のクロマトグラフィーの挙動、及びＮＭＲスペクトルを示した。
実施例３
物質Ａが、担子菌培養液と米糠抽出・酵素反応液との反応液中に見出されたことから、担子菌培養物中の生理活性物質は、還元末端側にイソマルトール構造を有する種々の糖鎖長のグルコシドからなる可能性が考えられた。
そこで、実施例１と同様の手順により担子菌培養液と米糠抽出・酵素反応液とを調製し、６０℃で２０時間撹拌して反応させ、次いで液全体を１２０℃以上に２０分間加熱して液中の酵素等を失活させた後、下記の分光学的特徴を指標として、より高分子量の有効成分を探索した。
（ａ）^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルがメチルケトンのメチル水素に由来するピーク、２，３−ジ置換フラン環の４，５位の水素に由来するＡＢシステムピークを示す。
（ｂ）^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルがグルコピラノースに由来する６本のピーク及びイソマルトールに由来する６本のピークを示す。
すなわち、前記濃縮液８０ｍｌ（固形分として２０ｇ）をカラムクロマトグラフィー（ダイヤイオンＨＰ−２０、容量：約５００ｍｌ）にチャージした後、水１．５Ｌで溶出し、溶出液を真空乾燥することにより１８ｇの粉末を得た。この画分を４５ｍｌの水に溶解し、遠沈管２本に２２．５ｍｌずつ分けてそれぞれ撹拌しつつ４倍容のエタノール９０ｍｌをゆっくり滴下し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を合せて濃縮し、凍結乾燥して粉末（１２ｇ）を得た。この粉末を水５０ｍｌに溶解しカラムクロマトグラフィー（ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８（Ｈ＋型）で精製し、得られた水溶出部１０．８ｇを更にカラムクロマトグラフィー（アンバーライトＩＲＡ−４００（ＣＯ_３ ^２−型））で精製し濃縮し凍結乾燥して水溶出粉末８．６４ｇを得、これを更にカラムクロマトグラフィー（セファデックスＧ−１５）により精製して上記（ａ）及び（ｂ）を満たす成分２．１６ｇを得た。
得られた物質の特性は、以下に示すとおりであった。
（ｉ）^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（重水中、２７０ＭＨｚ）
フラン環上のＡＢシステムに由来すると思われる、微弱で幅広いプロトンシグナルがδ６．８５及び７．３５に検出された。
（ｉｉ）^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（重水中）
イソマルトールに由来すると考えられる、微弱なシグナルがδ２６（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３）、１１１（Ｃ−４）、１４１（Ｃ−３）、１４５（Ｃ−５）、１８８（−Ｃ（Ｏ）−）に認められた。
これにより、得られた物質は下記式：

を有するものと推定される。
この物質（以下、「物質Ｂ」という。）は、イソマルトールとオリゴ糖（重合度の異なるＤ−グルコース分子からなる）との化合物の混合物（前記一般式（ＩＩ）でｎ＝２〜２０）であり、予め作成した検量線から求めた平均分子量は８５０であった。オリゴ糖はα−１，４グリコシド結合のグルコース分子からなるものが主体であるが、α−１，６結合やその他の結合のものも一部含まれると考えられる。
物質Ｂについても実施例１（２）と同様に、担子菌培養液、米糠抽出・酵素反応液、両者の反応液等に存在する物質の消長を追跡した結果、担子菌培養液と米糠抽出・酵素反応液との反応液中に物質Ｂが生成することを確認した。担子菌培養液、米糠抽出・酵素反応液それぞれに物質Ｂは全く存在せず、両者の反応によって初めて生成することが確認された。また、後述の実施例３に示すように、物質Ｂについても生理活性が確認された。
実施例４
実施例１で得た物質Ａと実施例３で得た物質Ｂの生理活性作用を比較した。
物質Ａ、物質Ｂ及び粗濃縮物を投与した後の脾臓細胞培養上清中のサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２）濃度を測定した結果を図１〜図３に示し、マクロファージ培養上清中のサイトカイン（ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ）濃度を図５〜６に示す。この結果、物質Ａは、顕著なサイトカイン誘導能を示し、物質ＢはＩＦＮ−γの誘導能では粗濃縮物に優る効果を示した。
また、マクロファージについては物質Ａに強いサイトカイン誘導が認められた。
産業上の利用可能性
本発明により、担子菌培養液と米糠抽出・酵素反応液との反応液を濃縮乾燥固化して得られる粉末中に約１０％含まれる生理活性物質の強い成分はイソマルトールをアグリコンとするグルコシドの構造を有する一連の化合物であることが判明した。この化合物は分光学的特徴を指標としてカラムクロマトグラフィー等の慣用の手段によって高純度に精製することが可能である。
従って、従来の植物組織原料を用いる担子菌培養物由来生理活性物質の製造法と比較して、夾雑物を含まない生理活性物質を得ることが可能であり、食品、飼料及び医薬品として有用である。
本発明の生理活性物質である配糖体は、担子菌培養液中には含有されず、また、米糠抽出液と酵素を反応させたのみでは生成せず、担子菌培養液と米糠抽出・酵素反応液の両者の反応が不可欠である。
このことから、物質Ａは担子菌を原料とした健康食品、医薬品等の製法及び製造管理上の指標成分としても利用できる。すなわち、物質Ａが検出された場合には、その製品の製造に担子菌培養液と米糠抽出・酵素反応液との反応が用いられていることが推定できる。また、物質Ａの生成量等は、担子菌の培養方法・条件、米糠抽出・酵素反応液の調製条件（使用酵素の種類、酵素反応の条件等）、両者の反応条件等によっても変化するが、物質Ａを指標として本発明の生理活性作用を有する新規物質の製造管理を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明物質Ａ（一般式（ＩＩＩ）の化合物）、本発明物質Ｂ（一般式（Ｉ）の化合物）及び本発明による粗生成物（ＣＲ）を投与した後の脾臓細胞培養上清中のＴＮＦ−α濃度を測定した結果を示すグラフである。
図２は、本発明物質Ａ（一般式（ＩＩＩ）の化合物）、本発明物質Ｂ（一般式（Ｉ）の化合物）及び本発明による粗生成物を投与した後の脾臓細胞培養上清中のＩＦＮ−α濃度を測定した結果を示すグラフである。
図３は、本発明物質Ａ（一般式（ＩＩＩ）の化合物）、本発明物質Ｂ（一般式（Ｉ）の化合物）及び本発明による粗生成物（ＣＲ）を投与した後の脾臓細胞培養上清中のＩＬ−２濃度を測定した結果を示すグラフである。
図４は、本発明物質Ａ（一般式（ＩＩＩ）の化合物）、本発明物質Ｂ（一般式（Ｉ）の化合物）及び本発明による粗生成物（ＣＲ）を投与した後のマクロファージ培養上清中のＴＮＦ−α濃度を測定した結果を示すグラフである。
図５は、本発明物質Ａ（一般式（ＩＩＩ）の化合物）、本発明物質Ｂ（一般式（Ｉ）の化合物）及び本発明による粗生成物（ＣＲ）を投与した後のマクロファージ培養上清中のＩＦＮ−γ濃度を測定した結果を示すグラフである。

Claims (12)

1. 式（II）：
   

   

   （式中、ｎは１〜２０である。）で示されるイソマルトールをアグリコンとして含む配糖体。
2. 担子菌を培養して得た培養液と、米糠抽出液と酵素との反応液とを反応させた後、カラムクロマトグラフィーによって分離される請求項１に記載の配糖体。
3. 請求項１または２に記載の配糖体を有効成分として含有する生理活性作用を有する組成物。
4. 生理活性作用が、ヒト細胞のサイトカイン誘導能を増大させる作用である請求項３に記載の組成物。
5. サイトカインが腫瘍細胞壊死因子（ＴＮＦ−α）である請求項４に記載の生理活性作用を有する組成物。
6. サイトカインがインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）である請求項４に記載の生理活性作用を有する組成物。
7. サイトカインがインターロイキン−２（ＩＬ−２）である請求項４に記載の生理活性作用を有する組成物。
8. 担子菌を培養して得た培養液と、米糠抽出液と酵素との反応液とを反応させた後、分離することを特徴とする式（II）：
   

   

   （式中、ｎは１〜２０である。）で示されるイソマルトールをアグリコンとして含む生理活性作用を有する配糖体の製造方法。
9. 担子菌を培養して得た培養液と、米糠抽出液と酵素との反応液とを反応させた後、(1)¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルでメチルケトンのメチル水素に由来するピーク、ＡＢシステムの特徴的な２，３−ジ置換フラン環の４，５位の水素に由来するピークを示し、(2)¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルでグルコピラノースに由来する６本のピーク及びイソマルトールに由来する６本のピークを示す成分を指標に、カラムクロマトグラフィーにより分離する請求項８に記載の式（II）で示され、生理活性作用を有する配糖体の製造方法。
10. 請求項３乃至７のいずれかに記載の生理活性作用を有する組成物を含有する食品。
11. 請求項３乃至７のいずれかに記載の生理活性作用を有する組成物を含有する医薬品。
12. 請求項３乃至７のいずれかに記載の生理活性作用を有する組成物を含有する飼料。

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