CN1252079C

CN1252079C - 具有生理活性作用的新物质、其制备方法及其用途

Info

Publication number: CN1252079C
Application number: CNB018078001A
Authority: CN
Inventors: 藤井创; 中川乔; 孙步祥
Original assignee: Amino UP Chemical Co Ltd
Current assignee: Amino Corp
Priority date: 2001-02-08
Filing date: 2001-08-09
Publication date: 2006-04-19
Anticipated expiration: 2021-08-09
Also published as: MXPA02010057A; WO2002062813A1; KR20020093893A; KR100838939B1; US20050143341A1; ES2360765T3; JPWO2002062813A1; US6831067B2; JP4932128B2; ATE502042T1; CN1422277A; US7169762B2; US20030045483A1; CA2404514A1; CA2404514C; NZ521796A; EP1298137A1; AU2001277737B2; EP1298137A4; EP1298137B1

Abstract

本发明涉及式(I)表示的含有异麦芽酚作为苷元的新的糖苷，(I)包含该糖苷的具有提高人细胞的细胞因子诱导能力作用的生理活性物质，其制备方法，以及包含该物质的食品、药品和饲料；式中，Sug是葡萄糖残基或由两个或更多个葡萄糖单元组成的糖链。

Description

具有生理活性作用的新物质、其制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及新的糖苷化合物，含有其作为有效成分的生理活性物质，它们的制备方法和用途。更具体地说，本发明涉及含有异麦芽酚作为苷元的糖苷(葡糖苷)，含有该葡糖苷作为有效成分的生理活性物质，其制备方法和用途。

背景技术

已知担子菌的培养物具有作为免疫增强、免疫活化和巨噬细胞活化等的BRM(生物学反应修饰物质)的性质。

本发明人已提交了关于用担子菌(属于担子菌纲的菌)培养物作为人单核细胞干扰素-γ(IFN-γ)、白介素12(IL-12)等细胞因子产生能力恢复剂的专利申请(特愿平11-283223号)。

这种担子菌的培养物中包含的生理活性已在下列文献中描述：“水溶性木质素”(特公平6-88909号)、“主要包含多糖和玉米素相关物质的细胞因子类活性物质的复合物”(特公昭62-36009号)、“新的多糖物质”(特开平8-259602号)等。如这些申请所示，担子菌培养物包含多种类型的生理活性物质，但是，没有一种生理活性物质的结构能够被确定到通过仪器分析，尤其是光谱法(包括核磁共振等)而清楚地确认它的存在。

而且，在常规方法中，用植物组织材料使培养物包含多种不同类型的有机物，由于缺乏目的化合物的结构信息，通过仪器分析，即使使用柱色谱法等分离手段也难以识别含有目的物质的部分，因此，难以有效分离和制备具有优良生理活性作用的成分。

发明目的

本发明的目的在于阐明本申请人长期关注的担子菌培养物中所含的生理活性成分中的主要物质的结构，明确有效制备该物质的条件，提供利用该物质的生理活性作用的食品、药品和饲料的用途。

发明内容

本发明人为了解决上述问题，进行了广泛的研究，结果是，发现与在含有植物组织材料的培养基中的担子菌的常规培养方法不同，通过使培养担子菌得到的培养液与米糠提取液和酶的反应液反应时，得到生理活性作用增大的物质，而且已鉴定了这些物质，从而完成本发明。

也就是说，本发明涉及以下具有生理活性作用的新物质，它们的制备方法和用途。

1.式(I)表示的包含异麦芽酚作为苷元的糖苷：

式中，Sug是葡萄糖残基或由两个或更多个葡萄糖单元组成的糖链。

2.前述1所述的糖苷，其由式(II)表示：

式中，n为0或1或更大的整数。

3.前述2所述的糖苷，其中，n为1-20。

4.前述1-3之任一项所述的糖苷，其中，所述的糖苷通过以下方法得到：使通过培养担子菌得到的培养液与米糠提取液和酶的反应液反应，然后通过柱色谱分离所述的糖苷。

5.前述式(II)中n为0的式(III)表示的2-乙酰基-3-羟基呋喃-3-O-α-D-吡喃糖苷：

6.包含前述1或2所述的糖苷作为有效成分的生理活性物质。

7.前述6所述的具有生理活性作用的物质，其中，所述的生理活性作用是提高人细胞的细胞因子诱导能力的作用。

8.前述7所述的具有生理活性作用的物质，其中，所述的细胞因子为肿瘤坏死因子(TNF-α)。

9.前述7所述的具有生理活性作用的物质，其中，所述的细胞因子为干扰素-γ(IFN-γ)。

10.前述7所述的具有生理活性作用的物质，其中，所述的细胞因子为白介素-2(IL-2)。

11.式(I)表示的具有生理活性作用的糖苷的制备方法：

式中的符号的意义与前述1中所述相同，所述方法包括以下步骤：使通过培养担子菌得到的培养液与米糠提取液和酶的反应液反应，然后进行分离。

12.前述10中所述的式(I)表示的具有生理活性作用的糖苷的制备方法，所述方法包括以下步骤：使通过培养担子菌得到的培养液与米糠提取液和酶的反应液反应；然后通过柱色谱，用表现出以下特征的成分作为指标，分离所述的糖苷：(1)¹H-NMR谱显示的由甲基酮的甲基氢导致的峰和AB系统特征的由2，3-二取代呋喃环的4，5-位氢导致的峰，(2)¹³C-NMR谱显示的由吡喃葡萄糖导致的6个峰和由异麦芽酚导致的6个峰。

13.含有前述6-10之任一项所述的具有生理活性作用的物质的食品。

14.含有前述6-10之任一项所述的具有生理活性作用的物质的药品。

15.含有前述6-10之任一项所述的具有生理活性作用的物质的饲料。

附图说明

图1显示给予本发明的物质A(通式(III)的化合物)、本发明的物质B(通式(I)的化合物)和本发明的粗产物(CR)后，脾细胞培养上清中的TNF-α浓度的测定结果。

图2显示给予本发明的物质A(通式(III)的化合物)、本发明的物质B(通式(I)的化合物)和本发明的粗产物(CR)后，脾细胞培养上清中的IFN-α浓度的测定结果。

图3显示给予本发明的物质A(通式(III)的化合物)、本发明的物质B(通式(I)的化合物)和本发明的粗产物(CR)后，脾细胞培养上清中的IL-2浓度测定结果。

图4显示给予本发明的物质A(通式(III)的化合物)、本发明的物质B(通式(I)的化合物)和本发明的粗产物(CR)后，巨噬细胞培养上清中的TNF-α浓度的测定结果。

图5显示给予本发明的物质A(通式(III)的化合物)、本发明的物质B(通式(I)的化合物)和本发明的粗产物(CR)后，巨噬细胞培养上清中的IFN-γ浓度的测定结果。

发明详述

以下详细说明本发明。

(A)糖苷化合物

本发明的糖苷化合物是式(I)表示的含有异麦芽酚作为苷元的新的糖苷：

所述糖苷化合物通过以下方法得到：使通过培养担子菌得到的培养液与米糠提取液和酶的反应液(下文简称为米糠提取液·酶反应液)反应，然后通过柱色谱法进行分离(后文将详细描述)。上式中，Sug是葡萄糖残基或由两个或更多个葡萄糖单元组成的糖链。

异麦芽酚是下式表示的用作香料成分的物质：

已有以异麦芽酚作为苷元的糖苷，其例子是半乳糖苷(糖部分为半乳糖的糖苷)(J.Bartulin等，J.Heterocycle Chem.，29，1017(1992)，“Syntheses of 2-Acetyl-3-hydroxy-1-n-propylpyrrole from isomaltoland 1-n-alkyl-3-hydroxy-2-methyl-4-pyridones from maltol”(由异麦芽酚合成2-乙酰基-3-羟基-1-正丙基吡咯和由麦芽酚合成1-正烷基-3-羟基-2-甲基-4-吡啶酮))，但是，还没有含有异麦芽酚葡糖苷(糖部分由葡萄糖单元组成的糖苷)的报道，也不知道其功能。

在Sug包含两个或更多个葡萄糖单元的情况下，对糖链的长度没有特别的限制。根据本发明的方法，n为1-20的葡萄糖单元的混合物占反应生成的固体成分的约10％。糖链(Sug)含α(1→6)键或含一部分其它键，其可以包含部分支链，但是，它是主要通过α(1→4)键连接的直链的糖链。

新的糖苷化合物的典型的结构如式(II)所示：

式中，n为0或1或更大的整数。

例如，前述式(II)中n为0的式(III)表示的含有一个葡萄糖单元的化合物，新的2-乙酰基-3-羟基呋喃-3-O-α-D-吡喃葡糖苷可以由本发明的方法分离或通过化学合成制备：

(B)生理活性物质

上述本发明的新的糖苷化合物具有优良的生理活性作用。

这些生理活性作用例如免疫增强/活化、巨噬细胞活化等性质，特别是提高人细胞的细胞因子诱导能力。

由本发明的生理活性物质诱导的细胞因子的实例是肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)等，但是，其并不限于这些。

肿瘤坏死因子TNF-α是具有杀伤肿瘤细胞作用的蛋白质，其是对感染、创伤或免疫诱导反应而全身或局部产生的细胞因子。干扰素(IFN)是在受到病毒或核酸刺激时产生并分泌到细胞外的抗病毒蛋白质，已知其不仅显示抗病毒作用，还显示抗肿瘤作用和活化免疫系统等多种活性。IFN-γ是由T细胞等产生的。白介素-2(IL-2)具有使肿瘤缩小或消失的效果。

(C)制备和分离方法

上述的式(I)表示的具有生理活性作用的化合物是从来未报道过的新物质，本发明人已确认，它们不存在于担子菌培养液或米糠提取液·酶反应液中，且在最初将米糠加到培养基中进行培养也没有生成，它们仅在担子菌培养液与米糠提取液·酶反应液反应液中生成。

以前，在含有植物组织材料的培养基中进行担子菌的培养，但是意外的是，通过使培养担子菌得到的培养液和米糠提取液·酶反应液反应，得到了具有高生理活性作用的物质。

(C-1)担子菌培养液

在本发明的生理活性物质的制备方法中使用的担子菌培养液是通过在适于担子菌生长的液体培养基中培养担子菌得到的培养液。

液体培养基的碳源的实例包括葡萄糖、蔗糖(sucrose)、麦芽糖、蔗糖(saccharose)、高级白糖、黑糖、糖蜜、废糖蜜、麦芽提取液等。

氮源的实例包括肉提取液、蛋白胨、面筋粉、大豆粉、干酵母、酵母提取液、硫酸铵、酒石酸铵、尿素等。此外，如果需要，可以添加钠盐、镁盐、锰盐、铁盐、钙盐和磷酸酸等无机盐类，肌醇、维生素B1盐酸盐、L-天冬酰胺和生物素等维生素类。

优选的液体培养基的组成可以根据担子菌的菌株而变，例如是含有麦芽提取液(1-5％)、酵母提取液(0.1-0.5％)和酒石酸铵(0.1-0.4％)。

用于本发明的担子菌的实例包括埃杜香菇(Lentinum edodes)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、多叶奇果菌(Grifola frondosa)、 Phoriota nameko、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、冬菇(Flammulina velutipes)、透明灵芝(Ganoderma lucidum)、木耳(Auricularia auricura)、平盖灵芝(Ganoderma applanalum)、透明革盖菌(Coriolus lucidum)、 Grifola umbellate、 Shizophyllum commune、草菇小包脚菇 (Volvariella volvaceae)等，特别优选埃杜香菇(Lentinum edodes)和多叶奇果菌(Grifola frondosa)。

根据通常的中温菌的通气培养，在pH 2-6和10-45℃，优选15-30℃的温度下进行培养。培养时间取决于菌的量和培养基的种类，通常进行4-20天，优选6-12天。

培养后，进行固液分离并将液体成分用于接着与米糠提取液·酶反应液的反应。

(C-2)米糠提取液·酶反应液

米糠提取液是通过在等量或更多(例如2-10倍)的热水中搅拌处理米糠而提出的水溶液。此时，优选使用105-130℃的加压热水。然后，加入酶试剂使米糠反应后，通过滗析器等进行固液分离，得到米糠提取液·酶反应液。

作为酶试剂，可以单独或组合其中两种或多种使用α-淀粉酶、纤维酶、果胶酶等碳水化合物水解酶。可以并用蛋白酶等蛋白水解酶。另外，酶反应在不损失酶活性的条件下进行，即在40℃-90℃，优选在40-70℃下进行1-24小时，优选进行3-12小时。

(C-3)担子菌培养液和米糠提取液·酶反应液的反应

担子菌培养液和米糠提取液·酶反应液的反应优选在40-90℃，更优选40-70℃的温度下进行。通常，将二者混合，反应8-24小时。然后，在加压下，在例如120℃或更高温度下，通过加热全部液体使液体中的酶等失活，如需要，进行分离纯化。

对分离纯化的方法没有特别的限制，可以使用各种分离方法，但从经济的角度考虑，柱色谱是优选的。

在来自担子菌的常规生理活性物质中，由于缺乏有关目的化合物的结构的数据，柱的构成和洗脱剂的选择以试验-和-误差(trial-and-error)的方式，通过可能有多种解释的呈色反应或需要很长时间进行判断的生物学检查确定，然而，在本发明中，由于目的生理活性物质的结构已被阐明，可以在其结构式的基础上根据亲水性、分子量和其它性质而容易地选择柱的构成和洗脱剂。而且，可以通过使用以下光谱特征作为指标而快速识别目的部分。

(1)¹H-NMR光谱显示由甲基酮的甲基氢导致的峰和由2，3-二取代呋喃环的4，5-位的氢导致的AB系统的峰。

(2)¹³C-NMR显示的由吡喃葡萄糖导致的6个峰和由异麦芽酚导致的6个峰。

甲基酮的甲基氢导致的峰出现在δ2.48(3H，s)附近。确认2，3-二取代呋喃环的4，5-位的氢导致的峰为δ6.78和7.67附近的AB系统(两者的值均为在氘代甲醇中的值)。

此外，可以参照3000-3700cm^-1(羟基)、1660cm^-1(共轭羰基)和1584cm^-1(双键)的红外吸收等。

(E)用途

本发明的生理活性物质使用过去提供作为食用的安全原料(米糠提取液和食用菌的担子菌培养液)，其混有有毒性的副产品的可能性及低。因此，其本身可以广泛地用作保健品、药品或强化食品添加剂、饲料等。

为了这些用途，例如用作保健品，根据目的浓缩、纯化前述(C-3)的过程得到的生理活性物质。本发明的生理活性物质对热相对稳定，但是，优选使用冷冻干燥进行浓缩和干燥。如果必要，可以使用食品添加剂、赋形剂进行配方。

药品包括人用和动物用的药物。在将本发明的产品作为药物给予的情况下，可以使用上式(I)的生理活性物质本身或者添加有药学可接受的无毒、惰性载体而得到的药物组合物。作为载体，可以使用固体、半固体或液体稀释剂、填充剂和其它配方的助剂。

这些药品可以静脉内给药、口服给药、组织内给药、局部给药(经皮给药等)或经直肠给药。剂型是适于其给药方法的形状。

作为饲料，可以列举牛、猪、鸡、羊等家畜和家禽的饲料，鱼或甲壳类等的水产养殖业用的饲料，狗、猫和其它宠物用的饲料。

可以预期在减轻近年来在畜产业中成为问题的使用大量抗生素的问题的效果。以上生理活性物质可以单独口服给予，但优选与各种糖苷、蛋白质、脂质、纤维、维生素类、矿物质等一起用作散剂或丸状的饲料。对脂质和纤维的种类没有特别的限制，可以使用任何可以用作鱼、肉骨粉、大豆粉、苜蓿粉和糠等饲料的物质。

具体实施方式

以下通过制备例和生理活性试验结果详细说明本发明的生理活性物质。

通过强制口服给予6周龄雄性C57/BL6小鼠1周的1g/kg样品进行生理活性试验，之后处死动物，收集脾细胞和腹膜渗出细胞(PEC)，分别进行培养并测定TNF-α、IFN-γ和IL-2。

a)脾细胞的培养

在DMEM培养基中均化所收集的小鼠的脾，接着在4℃离心分离(1000rpm，5分钟)，向其中加入ACK溶解缓冲液并保温(37℃，3分钟)以除去红细胞，然后离心分离(1000rpm，5分钟)。向这样收集的脾细胞中加入终浓度为10μg/ml的ConA并在微量培养板中培养，15小时后，收集培养上清，测定TNF-α、IFN-γ和IL-2。

b)PEC培养

用生理盐水从小鼠腹腔收集PEC(腹膜渗出细胞)，通过离心分离(1000rpm，10分钟)收集细胞，此细胞作为巨噬细胞，向其中加入终浓度为100ng/ml的LPS(脂多糖)并进行培养，4小时后，测定培养上清中的TNF-α、IFN-γ和IL-2。

对于以上a)和b)，使用用于测定细胞因子的试剂盒(和光纯药(株))。

实施例1：生理活性物质的确认

在24℃下，在含有麦芽提取液(2％)、酵母提取液(0.25％)和酒石酸铵(0.2％)的液体培养基中培养埃杜香菇 (Lentinum edodes)10天以制备担子菌培养液。

另外，将米糠分散在5倍(质量)的水中，并在120℃的液体温度下搅拌20分钟以进行提取，然后加入由α-淀粉酶和果胶酶组成的酶试剂，并在60℃下反应120分钟，然后用滗析器进行固液分离，回收液体部分以制备米糠提取液·酶反应液。

担子菌培养液和米糠提取液·酶反应液都不显示任何生理活性。

另一方面，将由上述操作得到的担子菌培养液和米糠提取液·酶反应液混合，在60℃下搅拌20小时，进行反应，然后，在120℃或更高温度下将全部液体加热20分钟以使液体中的酶失活，浓缩反应液，将得到的浓缩液80ml(水分：75％)通过500ml容量的DIAIONHP-20柱，用甲醇洗脱，为了在洗脱液中观察生理活性，重复该操作两次以得到棕色部分(5.6g)。

接着，通过各种色谱法检测该部分中的生理活性成分，进行硅胶色谱(Kiesel，由Merck&Co.，Inc.生产，125-400目，50g)，然后进行ODS反相凝胶柱色谱(约100ml容量)，获得白色粉末状生理活性组分(40mg)。

所得的物质具有以下物理性质：

(i)质谱(二级离子质谱(SIMS))

负离子化测定显示m/z：287的分子离子峰，正离子化测定显示m/z：289的分子离子峰，显示本化合物的分子量为288。而且，结合这些离子峰的高分辨质谱的结果，推定分子式为C₁₂H₁₆O₈(不饱和度5)。

(ii)IR光谱

确认了3000-3700cm^-1处羟基导致的吸收、1660cm^-1处共轭羰基导致的吸收和1584cm^-1处双键导致的吸收。

(iii)¹H-NMR谱(在氘代甲醇中，270MHz)

观察到由甲基酮导致的δ2.48(3H，s)的信号和由α-D-吡喃葡萄糖环导致的δ3.4-5.6的信号，以及偶合常数为1.9Hz的由AB系统导致的δ6.78和δ7.67处的峰。

(iv)¹³C-NMR谱(在氘代甲醇中，67.5MHz，DEPT测定法)

观察到12个信号，除了由α-D-吡喃葡萄糖环导致的6个信号之外，还观察到δ27.4(伯)、δ105.9和139.3(均为叔)、δ148.5、154.3和187.4(均为季)的由醇部分导致的6个信号。

¹H-NMR中低磁场AB系统的特征在于偶合常数为1.9Hz下的2，3-二取代呋喃环的4，5-位氢的信号。分子式的不饱和度为5，对应于一个吡喃糖环、两个双键、一个羰基和一个呋喃环。根据以上信息，证明所得物质是由下式表示的新物质(2-乙酰基-3-羟基呋喃-3-O-α-D-吡喃葡糖苷，下文简称为“物质A”)：

物质A的制备过程的确认：

以上述相同的方式，追踪担子菌培养液、米糠提取液·酶反应液、二者的反应液等中存在的物质A的增多和减少，结果是，证明物质A仅在担子菌培养液和米糠提取液·酶反应液的反应液中生成。在担子菌培养液、米糠提取液·酶反应液中均不存在物质A，这表明物质A仅通过二者的反应开始生成。

实施例2：物质A的化学合成

根据J.Bartulin等，J.Heterocycle Chem.，29，1017(1992)，Syntheses of 2-acetyl-3-hydroxy-1-n-propylpyrrole from isomaltol and 1-n-alkyl-3-hydroxy-2-methyl-4-pyridones from maltol(由异麦芽酚合成2-乙酰基-3-羟基-1-正丙基吡咯和由麦芽酚合成1-正烷基-3-羟基-2-甲基-4-吡啶酮)中记载的以乳糖作为原料化学衍生半乳糖基异麦芽酚的反应例，用麦牙糖代替乳糖进行衍生。

(a)化学衍生反应

在50ml容量的茄型瓶中称取3.60g(0.01mol)麦芽糖一水合物，并加入3.0ml无水乙醇，用放入其中的搅拌子剧烈搅拌进行分散。此时，保持以下状态：搅拌麦芽糖一水合物的不溶部分使其无局部化地均匀分散在整个无水乙醇中。在剧烈搅拌时，加入1.0ml哌啶并均匀混合，然后，在约15分钟内用移液管缓慢滴加0.44ml乙酸。将装有水冷凝管的茄型瓶置于调节至78℃的硅油浴中进行反应。当热分布在瓶内并开始部分沸腾时，加入约0.5ml三乙胺。在放置烧瓶以后，麦芽糖一水合物由于热而开始溶解，溶液由黄色变成棕色。约12小时后，加入相同体积的三乙胺以保持碱性。24小时后，从回流装置中取出烧瓶，并在继续进行纯化操作前使烧瓶的温度恢复到室温。此时，反应物的性状是深棕色焦油状物质。

用掺有荧光剂的硅胶制得的板对反应物进行TLC分析(氯仿/甲醇/水(65∶25∶4混合液))，结果是在与物质A相同的Rf值(约0.5)处观察到用主波长254nm的紫外线照射时有吸收的点。当喷以茴香醛-硫酸显色剂并加热时，斑点变黄并进一步变成深蓝色。

(b)纯化

(b-1)LH-20凝胶初步纯化

使必要体积的LH-20凝胶预先通过甲醇/水(1∶2)以使其平衡，并负载与最少量的相同溶剂混合的反应液。用相同的溶剂展开，合并含有目的化合物的部分。蒸发所得的部分并浓缩至干，得到棕色油状物(0.49g)。

(b-2)硅胶柱色谱法纯化

在用重量为样品的20-30倍的200目硅胶制备的柱上加样，并进行展开。再次用水饱和的乙酸乙酯/甲醇(3∶1)，然后用氯仿/甲醇/水混合液(饱和量的水加到4∶1氯仿/甲醇中)再次进行色谱，蒸发纯化的部分并浓缩至干，得到淡黄色树脂状物质(0.49g)。

(b-3)结晶

用甲醇结晶该淡黄色树脂状物质，得到无色针状结晶(0.37g)。

这样得到的物质显示与物质A相同的色谱行为和NMR谱。

实施例3

担子菌培养液和米糠提取液·酶反应液的反应液中物质A的存在表明担子菌培养液中的生理活性物质可能是在还原末端具有异麦芽酚结构的各种糖链长度的葡糖苷。

因此，通过与实施例1相同的方法制备担子菌培养液和米糠提取液·酶反应液，在60℃下搅拌20小时进行反应，接着将整个反应液加热至120℃或更高，持续20分钟，使反应液中的酶等失活，然后，用以下光谱特征作为指标，寻找具有更高分子量的有效成分。

(a)¹H-NMR谱显示由甲基酮的甲基氢导致的峰和由2，3-二取代呋喃环的4，5-位的氢导致的AB系统峰。

(2)¹³C-NMR谱显示由吡喃葡萄糖导致的6个峰和由异麦芽酚导致的6个峰。

更具体地说，在色谱柱(DIAION HP-20，容量：约500ml)上负载80ml(20g固体)上述浓缩液，然后用1.5升水洗脱，将洗脱液真空干燥，得到18g粉末。将该部分溶于45ml水中，并分散在两个离心管中，每管的量为22.5ml，在搅拌各溶液时，将4倍体积即90ml乙醇滴加，在3000rpm下离心10分钟，合并所得的上清液，浓缩并冷冻干燥，得到粉末(12g)。将该粉末溶于50ml水中，通过柱色谱(DOWEX 50W-X8(H⁺型))纯化，进一步通过柱色谱(AMBERLITE IRA-400(CO₃ ²-型))纯化所得的10.8g水洗脱部分，浓缩并冷冻干燥，得到8.64g水洗脱粉末，进一步通过柱色谱(SEPHADEX G-15)进行纯化，得到2.16g符合上述(a)和(b)的成分。

所得的物质具有以下物理性质。

(i)¹H-NMR谱(在氘代水中，270MHz)

在δ6.85和7.35处检测到推测由呋喃环上的AB系统导致的微弱、宽质子信号。

(ii)¹³C-NMR谱(氘代水中)

在δ26(-C(O)CH₃)、111(C-4)、141(C-3)、145(C-5)和188(-C(O)-)处观察到推测由异麦芽酚导致的微弱信号。

根据上述，推测所得的物质具有下式表示的结构：

该物质(下文称为“物质B”)是在异麦芽酚和寡糖(由不同聚合度的D-葡萄糖分子组成)间的化合物的混合物(在以上通式(II)中，n＝2-20)，从事先制作的标准曲线得出的平均分子量为850。寡糖主要包括具有α-1，4糖苷键的葡萄糖分子，和包括部分具有α-1，6键或其它键的葡萄糖分子。

以与实施例1(2)相同的方式，追踪担子菌培养液、米糠提取液·酶反应液、二者的反应液等中物质B的增多和减少，结果证明物质B仅在担子菌培养液和米糠提取液·酶反应液的反应液中生成。在担子菌培养液、米糠提取液·酶反应液中均不存在物质B，表明物质B通过二者的反应开始生成。另外，如后述的实施例4所示，确认了物质B也具有生理活性。

实施例4

比较了在实施例1中得到的物质A和在实施例3中得到的物质B的生理活性作用

图1-3显示了给予物质A、物质B和粗浓缩物后，在脾细胞培养上清中细胞因子(TNF-α、IFN-γ和IL-2)浓度的测定结果，图5和图6显示了在巨噬细胞培养上清中细胞因子(TNF-α和IFN-γ)的浓度。结果显示，物质A表现出显著的细胞因子诱导能力，物质B表现的IFN-γ诱导能力优于粗浓缩物的。

另外，对于巨噬细胞，发现物质A具有强的细胞因子诱导。

工业实用性

根据本发明，发现通过将担子菌培养液和米糠提取液·酶反应液的反应液浓缩至干而得到的粉末中，含有约10％生理活性强的成分，包括一系列具有含异麦芽酚作为苷元的葡糖苷结构的化合物。可以采用常规方法如柱色谱法，用光谱特征作为指标，将这些化合物纯化至高纯度。

因此，与使用植物组织材料从担子菌培养物生产生理活性物质的常规方法相比，可以获得不含杂物质的生理活性物质，它们可用作食品、饲料和药品。

本发明的生理活性物质的糖苷并不包含在担子菌培养液中，它们不是仅仅通过米糠提取液与酶反应而制备的，担子菌培养液和米糠提取液·酶反应液二者的反应是不可欠缺的。

根据上述，物质A可以用作以担子菌为原料的保健品、药品等的生产方法和生产管理中的指标成分。也就是说，当检测到物质A时，可以推定在生产这种产品中使用了担子菌培养液与米糠提取液·酶反应液的反应。另外，物质A的生成量随担子菌的培养方法和条件、米糠提取液·酶反应液的制备条件(所用酶的种类、酶反应的条件等)、两者的反应条件等而变化，因此，可以将物质A用作指标，对本发明的具有生理活性作用的新物质的生产进行管理。

Claims

1.式(I)表示的包含异麦芽酚作为苷元的糖苷：

2.根据权利要求1的糖苷，其由式(II)表示：

式中，n为0或1或更大的整数。

3.根据权利要求2的糖苷，其中，n为1-20。

4.根据权利要求1-3之任一项的糖苷，其中，所述的糖苷通过以下方法得到：使通过培养担子菌得到的培养液与米糠提取液和酶的反应液反应，然后通过柱色谱分离所述的糖苷。

6.包含权利要求1或2的糖苷作为有效成分的生理活性物质。

7.根据权利要求6的具有生理活性作用的物质，其中，所述的糖苷是提高人细胞的细胞因子诱导能力的糖苷。

8.根据权利要求7的具有生理活性作用的物质，其中，所述的细胞因子为肿瘤坏死因子。

9.根据权利要求7的具有生理活性作用的物质，其中，所述的细胞因子为干扰素-γ。

10.根据权利要求7的具有生理活性作用的物质，其中，所述的细胞因子为白介素-2。

11.式(I)表示的具有生理活性作用的糖苷的制备方法：

式中的符号的意义与权利要求1中所述相同，所述方法包括以下步骤：使通过培养担子菌得到的培养液与米糠提取液和酶的反应液反应，然后进行分离。

12.权利要求10中的式(I)表示的具有生理活性作用的糖苷的制备方法，所述方法包括以下步骤：使通过培养担子菌得到的培养液与米糠提取液和酶的反应液反应；然后通过柱色谱，用表现出以下特征的成分作为指标，分离所述的糖苷：(1)¹H-NMR谱显示的由甲基酮的甲基氢导致的峰和AB系统特征的由2，3-二取代呋喃环的4，5-位氢导致的峰，(2)¹³C-NMR谱显示的由吡喃葡萄糖导致的6个峰和由异麦芽酚导致的6个峰。

13.含有权利要求6-10之任一项的具有生理活性作用的物质的食品。

14.含有权利要求6-10之任一项的具有生理活性作用的物质的药品。

15.含有权利要求6-10之任一项的具有生理活性作用的物质的饲料。