KR101603173B1

KR101603173B1 - 베타글루칸을 함유하는 가축사료 첨가제 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101603173B1
Application number: KR1020090002372A
Authority: KR
Inventors: 한만덕; 김선기; 김종덕; 김용현; 백종윤
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단; 선 바이오 (주)
Priority date: 2009-01-12
Filing date: 2009-01-12
Publication date: 2016-03-15
Also published as: KR20100083020A

Abstract

영지버섯(Ganoderma lucidum) 균사체로부터 추출된 베타글루칸을 유효성분으로 포함하며, 상기 베타글루칸은 수용성 베타글루칸으로 10 내지 40 kD 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 가축사료 첨가제 및 그 제조방법이 개시된다. 상기 가축사료 첨가제는, 가축들의 자가 면역력을 증진시키고 사료효율을 향상시킬 수 있다. 특히, 이유자돈에서 높은 발생률을 선보이는 질병을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있는 효과가 있으며, 축산업 및 사료산업상 매우 유용하게 활용될 수 있다.

영지버섯, 균사체, 베타글루칸, 이유자돈, 가축사료, 면역력, 사료효율

Description

베타글루칸을 함유하는 가축사료 첨가제 및 그 제조방법{Feed Additives containing Betaglucan and Preparation Method of the Same}

본 발명은 영지버섯(Ganoderma lucidum) 균사체로부터 추출된 베타글루칸을 유효성분으로 포함하는 가축사료 첨가제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

축산업은 동물의 유전적인 개량, 우수한 사료개발 등의 개선으로 생산효율은 현저히 개선되었지만, 동물들의 각종 대사성 질병이 오히려 증가하고 있어 축산업 경쟁력에 큰 장애 요인이 되고 있다. 가축의 생산이, 협소한 공간에서 대량 사육생산 시스템으로 기업화함으로써, 동물들은 스트레스 증가 및 면역결핍과 연관된 질병이 증가하고 있다. 또한, 합성사료의 사용량이 증가하는 것도, 동물의 면역저하와 함께 다양한 질병을 발생시키는 원인으로 작용하고 있다.

이러한 질병을 예방하고 치료하기 위하여, 축산농가에서는 항생제 남용을 하게 되었고, 이에 따라 항생제 내성균주의 출현 및 항생제 잔류 등의 문제가 사회적 이슈로 대두되고 있다. 이에 유럽연합(EU)은 성장목적으로 동물사료에 항생제 첨가를 금지시켰고, 치료목적에서도 엄격한 통제 절차를 거치도록 하고 있다. 국내에서도 항생제 사용을 대체할 수 있는 다양한 방안이 시도되고 있으나, 그 중에서 가 장 주목받는 방법은 면역증강을 통한 방안이다. 국내에서 시급한 대처가 요구되는 가축질병은, 돼지의 이유 후 전신소모성증후군(PMWS)과 양계의 조류 인플루엔자(AI) 등이 있다. 이러한 질병에 대해서, 백신처방이 불가능한 시점에서 고려할 수 있는 대응방법으로는, 동물의 면역능력을 증가시켜 질병 저항성을 자발적으로 축적시키고, 최종적으로는 생산성을 증가 시킬 수 있는 천연물소재의 대체물질을 개발하는 것이다. 이러한 천연물소재 대체물질은, 기존의 항생제 투여 대신 자연 면역력을 증강시켜 질병 방어력을 향상시키고, 사료와 함께 흡수시켜 신진대사가 원활하게 작용하도록 함으로써, 가축의 폐사율을 줄이고 사료 섭취율을 향상시킬 수 있을 것이다.

상기 천연물소재 대체물질로는 주변에 널리 분포하고 있는 버섯을 고려할 수 있다. 버섯에는, 트레할로즈(trehalose), 만니톨(mannitol), 아라비니톨(arabinitrol) 등과 같은 사람의 장에서 흡수·이용되기 어려운 저분자당과, 베타글루칸, 헤테로글루칸, 키틴질 등 불소화성 식물섬유소가 주체를 이룬다. 따라서, 식품분석에 의한 식품 계산치보다 저칼로리 소재라고 할 수 있다. 특히, 버섯에 함유되어 있는 베타글루칸은, 버섯 균사체에서 세포 외 다당류로 합성되는 생리활성 다당류이다. 베타글루칸은 면역증강 효과, 간 기능 향상, 항암효과, 항산화 효과 및 비만억제 효과 등 많은 약리적 활성을 나타낸다. 특히 반응조절물질(biological response modifier, BRM) 역할을 하는 베타글루칸은 항바이러스 작용, 세포증식 억제 작용, 대식세포(macrophage)의 활성, 자연살해 세포(natural killer cell)의 활성화, 항체생성의 촉진 및 암세포 유전자 발현에 조절적 역할을 한다.

이와 같은 베타글루칸은, 화학요법제와는 다른 기전에 의해 생리활성을 나타내므로 면역작용 상승을 기대할 수 있고, 항생제와 같은 화학요법제가 나타내는 약제 내성이 없는 것이 장점이다. 따라서, 버섯에 함유된 베타글루칸을 이용한 동물용 사료의 개발은, 동물 질병을 예방하고 치료하기 위한 획기적인 방법으로 활용될 수 있다.

본 발명의 일실시예의 목적은 영지버섯(Ganoderma lucidum) 균사체로부터 추출된 베타글루칸을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은 영지버섯(Ganoderma lucidum) 균사체로부터 추출된 베타글루칸을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물 및 급여방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은 영지버섯(Ganoderma lucidum) 균사체로부터 추출된 베타글루칸을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 사료 첨가제 및 그 제조방법에 관한 것으로, 영지버섯(Ganoderma lucidum) 균사체로부터 열수추출된 베타글루칸을 유효성분으로 포함하며, 상기 베타글루칸은 수용성 베타글루칸으로 10 내지 40 kD 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 가축사료 첨가제는, 가축들의 신진대사를 향상시키고 면역력 및 항스트레스 효과를 증진시킴으로써, 이유자돈의 사료효율을 높이고 각종 질병에 대해 자가 면역력을 극대화하여 생산성을 높일 수 있다. 또한, 이유자돈의 일당증체량과 사료효율을 증대시켜 혈액중의 헤모글로빈, 적혈구 및 백혈구의 수치가 증 가하고 이유자돈에서 높은 발생률을 선보이는 질병을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있는 효과가 있으므로, 축산업 및 사료산업상 매우 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 베타글루칸 함유 사료 첨가제는, 영지버섯(Ganoderma lucidum) 균사체로부터 열수추출된 베타글루칸을 유효성분으로 포함하며, 상기 베타글루칸은 수용성 베타글루칸으로 10 내지 40 kD 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 베타글루칸의 분자량이 10 kD 미만인 경우에는 면역증강효과가 감소하는 단점이 있고, 40 kD 초과시에는 용해성 및 생체 이용률이 저하된다는 문제점이 있다. 상기 베타글루칸 함유 사료 첨가제는, 영지버섯에서 추출한 불용성 베타글루칸에 대한 수용화를 매우 높은 수율로 전환하였으며, 이러한 수용성 베타글루칸을 유효성분으로 하여 면역활성 실험에서 항암, 항보체 및 대식세포활성이 우수함을 확인하였다. 또한, 수용성 베타글루칸이 이유자돈을 대상으로 한 실험에서 면역증강 효과가 있는 것으로 확인하였다.　

일실시예에서, 상기 베타글루칸은 영지버섯 균사체에 대한 열수추출을 통해 추출된 것일 수 있다. 구체적으로는, 영지버섯 균사체에 물을 첨가하고, 고압 조건(121℃, 1 시간)에서 열을 가하여 추출액을 얻을 수 있다. 본 발명의 일실시예에 의하면, 열수추출법을 통해 얻은 추출액은 한외여과(ultrafiltration)를 통해 농축한다.

원심분리된 상층액은 한외여과 시스템(막 통과 분자량 크기 10,000)을 이용하여 추출액의 1/10까지 농축한 후 2배의 물을 첨가하면서 재농축 과정을 반복, 1,000 배 정도　희석하면서 분자량 10,000 이하의 저분자와 10,000 이상의 고분자로 구분하였다.　 농축액은 동결건조기에서 건조하여 다당류를 분리하였다. 이 같은 방법은 다당류의 수율이 높이고, 특히 베타글루칸의 함량이 높은 것으로 나타났다.

또한 상기 영지버섯 균사체는 반복적인 연구와 실험을 통해 최적화된 배지에서 배양된 것을 특징으로 한다. 일실시예에서, 상기 배지는, 배지 전체 중량을 기준으로, 글루코스 0.1 내지 5.0 중량% 및 효모 추출물(yeast extract) 0.05 내지 3.0 중량%를 포함할 수 있다.

일실시예에서, 상기 배지는, 영지버섯으로부터 베타글루칸을 생산하기 위한 최적화된 배지로서, 배지 전체 중량을 기준으로, 글루코스　1.0~3.0 중량%, 효모 추출물 0.2~0.6 중량%, K₂HPO₄ 0.05~0.2 중량%, KH₂PO₄ 0.01~0.1 중량%, MgSO₄·7H₂O 0.05~0.2 중량% 및 옥수수 오일 0.1~0.5 중량%를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 배지는, 배지 전체 중량을 기준으로, 글루코스　2.0 중량%, 효모 추출물 0.4 중량%, K₂HPO₄ 0.1 중량%, KH₂PO₄ 0.046 중량%, MgSO₄·7H₂O 0.1 중량% 및 옥수수 오일 0.25 중량%를 포함할 수 있다.

또 다른 일실시예에서, 상기 배지는, 영지버섯으로부터 베타글루칸을 대량생산하기 위한 산업용 배지로서, 배지 전체 중량을 기준으로, 글루코스 0.1~1.0 중량%,　콩 분말(Soybean flour) 0.1~1.0 중량%, 효모 추출물 0.05~0.2 중량%, KH₂PO₄0.1~0.5 중량%, MgSO₄0.05~0.5 중량% 및 가용성 전분 1.0~2.0 중량%를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 산업용 배지는, 배지 전체 중량을 기준으로, 글루 코스 0.5 중량%,　콩 분말(Soybean flour) 0.5 중량%, 효모 추출물 0.1 중량%, KH₂PO₄0.2 중량%, MgSO₄0.1 중량% 및 가용성 전분 1.5　중량%를 포함할 수 있다.

일실시예에서, 상기 배지는, 배지 전체 중량을 기준으로, 오일 성분을 0.01 내지 0.5 중량%를 더 포함할 수 있다. 상기 오일 성분으로는, 예를 들어, 콩유(soybean oil), 포도씨유(grape seed oil), 옥수수유(corn oil), 캐놀라유(canola oil), 올리브유(olive oil) 및 참기름(sesame oil)등으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 영지버섯 균사체에 대한 배지에 상기 오일 성분을 첨가하게 되면, 다양한 실험을 통해, 균사체 생장을 현저하게 촉진시키는 것으로 확인되었다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는, 베타글루칸 이외에 다양한 영양 성분들을 혼합할 수 있다. 일실시예에서, 상기 베타글루칸 함유 사료 첨가제는, 사료 첨가제 전체 중량을 기준으로, 베타글루칸 25 내지 40 중량%, 대두박 50 내지 70 중량% 및 건조효모 6 내지 15 중량%를 포함할 수 있다.

또한, 상기 베타글루칸 함유 사료 첨가제를, 일반적인 기초사료에 다양한 비율로 첨가하여, 사료 조성물을 제조할 수 있다. 일실시예에서, 상기 사료 첨가제는, 전체 사료 중량을 기준으로, 0.1 내지 100 mg/kg의 비율로 첨가될 수 있다. 상기 비율은, 베타글루칸 함유 사료 첨가제의 가격이 상대적으로 고가인 점과 사료 효율 및 항암 효과를 고려하여 최적 범위를 선정한 것으로, 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 상기 사료 조성물을 동물에게 급여하는 방법을 제공한다. 동물에게 상기 사료 조성물을 공급하는 시기는 특별히 제한되는 것은 아니나, 일실시예에서, 상기 사료 조성물은 동물의 이유전기에 공급될 수 있다. 또 다른 일실시예에서, 상기 사료 조성물은, 이유자돈의 이유전기, 즉 생후 3 내지 5 주 사이에 공급될 수 있다. 이는, 사료의 경제성, 사육 동물의 증체량 및 영양소 소화율을 비교 분석한 결과, 이유후기 보다는, 이유전기에 공급함으로써, 베타글루칸의 효능을 극대화시킬 수 있기 때문이다. 또한, 상기 이유자돈이란, 생후 3 주 내지 6 주 사이의 새끼돼지를 총칭하는 의미이다.

본 발명은 또한, 영지버섯 균사체로부터 추출한 베타글루칸을 함유하는 사료 첨가제를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 사료 첨가제는,

(a) 영지버섯 균사체를 고온 및 고압의 조건에서 열수 추출하는 공정;

(b) 상기 (a) 공정의 추출액으로부터 상층액을 분리하여, 한외여과를 거쳐 분자량 10,000 달톤 이상의 베타글루칸을 수득하는 공정; 및

(c) 수득된 베타글루칸을 혼합하여 사료 첨가제를 제조하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 (a) 공정은, 영지버섯 균사체를 열수추출하는 과정이다. 구체적으로는, 영지버섯 배양액에 물을 첨가하고, 121℃, 1시간의 고압 조건에서 열을 가하여 추출액을 얻게 된다. 본 발명의 일실시예에 의하면, 열수추출법을 통해 추출된 농축액은 다당류의 수율이 높고, 특히 베타글루칸의 함량이 높은 것으로 나타났다.

일실시예에서, 상기 (a) 공정의 이전에, 베타글루칸을 생산하기 위해 최적화된 배지에서 영지버섯 균사체를 배양하는 공정을 더 거칠 수 있으며, 상기 배지는, 배지 전체 중량을 기준으로, 글루코스 0.1 내지 5.0 중량% 및 효모 추출물(yeast extract) 0.05 내지 3.0 중량%를 포함할 수 있다.

또 다른 일실시예에서, 상기 배지는, 영지버섯으로부터 베타글루칸을 대량생산하기 위한 산업용 배지로서, 배지 전체 중량을 기준으로, 글루코스 0.1~1.0 중량%,　콩 분말(Soybean flour) 0.1~1.0 중량%, 효모 추출물 0.05~0.2 중량%, KH₂PO₄0.1~0.5 중량%, MgSO₄0.05~0.5 중량% 및 가용성 전분 1.0~2.0 중량%를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 산업용 배지는, 배지 전체 중량을 기준으로, 글루코스 0.5 중량%,　콩 분말(Soybean flour) 0.5 중량%, 효모 추출물 0.1 중량%, KH₂PO₄0.2 중량%, MgSO₄0.1 중량% 및 가용성 전분 1.5　중량%를 포함할 수 있다.

일실시예에서, 상기 배지는, 배지 중량을 기준으로, 오일 성분을 0.01 내지 0.5 중량%를 더 포함할 수 있다. 상기 오일 성분으로는, 예를 들어, 콩유(soybean oil), 포도씨유(grape seed oil), 옥수수유(corn oil), 캐놀라유(canola oil), 올리브유(olive oil) 및 참기름(sesame oil)등으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 영지버섯 균사체에 대한 배지에 상기 오일 성분을 첨가하게 되면, 다양한 실험을 통해, 균사체 생장을 현저하게 촉진시키는 것으로 확인되었다.

일실시예에서, 상기 (c) 공정 이후에, 제조된 사료 첨가제를 동결건조, 분말, 액상 또는 베타글루칸이 함유된 발효산물의 형태로 가공하는 공정을 더 거칠 수 있다. 상기 방법에 의해 제조된 사료 첨가제를 여러 형태로 가공하는 과정에서, 다양한 영성 성분들이 혼합될 수 있다. 일실시예에서, 상기 사료 첨가제는, 사료 첨가제 전체 중량을 기준으로, 베타글루칸 25 내지 40 중량%, 대두박 50 내지 70 중량% 및 건조효모 6 내지 15 중량%를 포함할 수 있다.

또한, 상기 베타글루칸 함유 사료 첨가제는, 일반적인 기초사료에 다양한 비율로 첨가될 수 있다. 일실시예에서, 상기 베타글루칸 함유 사료 첨가제는, 전체 사료 중량을 기준으로, 0.1 내지 100 mg/kg의 비율로 첨가될 수 있다. 상기 비율은, 베타글루칸 함유 사료 첨가제의 가격이 상대적으로 고가인 점과 사료 효율 및 항암 효과를 고려하여 최적 범위를 선정한 것으로, 특별히 제한되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 하기 위한 실시예에 의해 상세히 설명하고자 하나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1] 베타글루칸 생성이 우수한 버섯 균주 선별

다양한 버섯 균주를 배양하여 베타글루칸의 생성이 우수한 버섯 균주를 선별하였다. 구체적으로는, 영지버섯(Ganoderma lucidum SCH-1), 잔나비걸상버섯(Ganoderma applanatum), 목질진흙버섯-상황버섯(Phellinus linteus), 덕다리버섯(Laetiporus sulphureus), 쓰가불로초(Ganoderma tsugae), 아까시재목버섯(Fomitella fraxinea), 흰들버섯(Agaricus blazei) 및 큰 느타리 버섯(Pleurotus eryngii)을 사용하였다. 상기 버섯들의 균주들은, 채집을 통한 조직 분리 방법을 통해 확보하였으며, 이를 이용해 생리활성시험과 균사체를 통한 베타글루칸 생산이 우수한 균주를 선발하였다.

상기 버섯 균주들을 버섯 완전배지(Glucose 2.0%, Peptone 0.2%, Yeast extract 0.2%, K₂HPO₄ 0.1%, KH₂PO₄ 0.46% 및 MgSO₄·7H₂O 0.05%)에 배양하였다. 배양조건은 28℃, 160 rpm의 진탕기(shaking incubator)에서 7 일간 배양하였다. 배양된 버섯 균주들에 대하여, 균사체 및 균사체성 베타글루칸의 생성 수율을 측정하여, 하기 표 1에 나타내었다.

학명	국명	균사체 건중량(g/100ml)	균체 외 다당류 건중량(g/100ml)	최종 pH
Ganoderma lucidum SCH-1	영지버섯	0.852	0.449	4.36
Ganoderma　　　　oregonece	-	0.617	0.344	5.73
Ganoderma　　　applanatum	잔나비걸상버섯	0.500	0.236	5.02
Phellinus linteus	목질진흙버섯 (상황)	0.479	0.042	6.79
Laetiporus sulphureus	덕다리버섯	0.731	0.135	5.25
Ganoderma tsugae	쓰가불로초	0.386	0.043	6.13
Fomitella fraxinea	아까시재목버섯	0.763	0.145	5.58
Agaricus blazei	흰들버섯	0.739	0.040	5.54
Pleurotus eryngii	큰느타리 버섯	0.839	0.440	4.54

표 1을 참조하면, 영지버섯 균사체가 100 ml당 0.852 g의 균사체량를 나타내어 가장 우수한 균사체 생장을 보였으며, 큰느타리버섯 균사체는 0.839 g/100ml의 균사체량을 나타내었다. 균체외 다당류의 수율 역시 영지버섯 0.449 g/100ml, 큰 느타리 버섯 0.440/100 ml의 순으로 나타났다.

[실시예 2] 영지버섯 SCH-1 균사체 추출물의 항암효과

영지버섯 G. lucidum SCH-1에서 추출한 고분자 및 저분자 물질의 인간 암세포주의 증식 억제률을 측정하였다. SNU-1, SNU C4, SNU 387 세포들(2 x 10⁴ cells/㎖) 그리고 A549(1 x 10⁴ cells/㎖)을 영지버섯 추출물을 200 ㎍/㎖로 함유하는 배지에서 48 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상층액을 제거하고, MTT 방법에 의해 세포독성(cytotoxicity)을 분석하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1을 참조하면, G. lucidum SCH-1에서 추출된 고분자 분획물(분자량 10000 이상; HM)과 저분자 분획물(분자량 10,000 미만; LM)은 인체 암세포주에 대하여 모두 증식억제 효과가 있었다. 고분자 분획물의 세포증식억제효과는 SNU-C4(34.5%), SNU 387(31.3%), A549(22.2%), SNU-1(6.0%)의 순으로 나타내었으며, 저분자 분획의 경우, SNU 387(67.8%), SNU-C4(63.5%), A549(24.3%), SNU-1(20.6%)의 순으로 증식이 억제되었다.

폐선암 세포주(A549)나 위암세포주(SNU-1)에는 24.3%, 20.6%의 증식억제를 나타내어 간암세포나 결장암세포보다 낮은 억제효과를 보였다.

실험에 사용된 암세포들의 활성을 알아보기 위해 항암제 마이토마이신을 1㎍/㎖의 농도로 처리한 양성 대조군에서는 SNU C4(100%), A549(89.2%), SNU-1(57.4%), SNU 387(27.8%)의 순으로 세포증식 억제율을 나타내어, 저분자(LM) 및 고분자(HM)의 억제순서와는 차이가 있었다. 따라서 버섯 추출물은 항암제 마이토마이신보다 200 배 높은 농도에서 유사한 암세포 증식효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

[실시예 3] 영지 SCH-1 균사체 발효의 최적 조건

3-1. 탄소원이 영지버섯의 균사생장 및 균체외 다당체 생산에 미치는 영향

각종 탄소원이 영지버섯의 균사생장 및 균체외 다당체 생산에 미치는 영향을 조사한 결과하였다. 영지 SCH-균사체는, 0.2% 효모추출물(yeast extract), 0.2% 펩톤(peptone), 0.1% K₂HPO₄, 0.046% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂O 및 2% 탄소원(carbon sources)을 함유한 배지에서 배양하였다. 조사결과는 하기 표 2와 같고, 괄호는 표준편차를 나타낸다. 표 2를 참조하면, 당류 가운데 균사생장이 우수한 것은 글루코우즈(glucose)이고, 다당류에서는 흑설탕(brown sugar)에서 가장 양호하였으며, 균체외 다당체는 프락토우즈(fructose)에서 가장 양호하였다.　

탄소원	균사체 건중량(g/100ml)	균체 외 다당류 건중량(g/100ml)	최종 pH
Brown sugar	0.748 (±0.065)	0.039 (±0.007)	5.16
Fructose	0.617 (±0.329)	0.044 (±0.008)	5.73
Lactose	0.500 (±0.086)	0.036 (±0.004)	6.02
Galactose	0.479 (±0.034)	0.042 (±0.001)	5.79
Sucrose	0.731 (±0.074)	0.035 (±0.002)	6.25
Maltose	0.386 (±0.043)	0.043 (±0.009)	7.13
Starch(Corn)	0.763 (±0.069)	0.645 (±0.280)	5.58
Glucose	0.839 (±0.005)	0.040 (±0.000)	5.54

3-2. 질소원이 영지버섯의 균사생장 및 균체외 다당체 생산에 미치는 영향

각종 질소원이 영지버섯의 균사생장 및 균체외 다당체 생산에 미치는 영향을 알아보았다. 영지버섯 균사체는, 2% 글루코스(glucose), 1% 프락토스(fructose), 0.1% K₂HPO₄, 0.046% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂O 및 0.4% 질소원(nitrogen sources)을 함유한 배지에서 배양하였다. 조사결과는 하기 표 3과 같고, 괄호는 표준편차를 나타낸다. 표 3을 참조하면, 효모추출물(yeast extract)에서 균사생장 및 균체외 다당체 생산에 가장 좋았다. 그리고, 콘 스팁 리커(corn steep liquor)에서는, 균사생장은 매우 낮게 나왔으나, 균체외 다당체량은 높게 나왔다.

질소원	균사체 건중량(g/100ml)	균체 외 다당류 건중량(g/100ml)	최종 pH
Yeast extract	0.896 (±0.040)	0.046 (±0.007)	4.27
Beef extract	0.420 (±0.049)	0.034 (±0.005)	5.73
Skim milk	0.648 (±0.091)	0.044 (±0.007)	5.58
Corn steep liquor	0.079 (±0.024)	0.106 (±0.003)	6.36
Monosodium glutamate	0.067 (±0.008)	0.030 (±0.002)	6.12
Peptone	0.229 (±0.014)	0.023 (±0.006)	5.43

3-3. 오일이 영지버섯의 균사생장 및 균체외 다당체 생산에 미치는 영향

　균사생장과 균체외 다당체 생산에 가장 좋은 탄소원과 질소원을 고정시키고 오일(oil)이 균사생장 및 균체외 다당체 생산에 미치는 영향을 알아보았다. 영지버섯 균사체는, 2% 글루코스(glucose), 1% 프락토스(fructose), 0.4% 효모추출물(yeast extract), 0.1% K₂HPO₄, 0.046% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂O 및 0.25% 오일(oil)을 함유한 배지에서 배양하였다. 조사결과는 하기 표 4와 같고, 괄호는 표준편차를 나타낸다. 표 4를 참조하면, 균사생장은 대조군보다 최대 1.5 배까지 증가시키는 경향을 보였으나, 균체외 다당체 생산은 모든 오일에서 대조군보다 낮거나 비슷한 수준으로 생산되는 결과를 보였다.

오일(oil)	균사체 건중량(g/100ml)	균체 외 다당류 건중량(g/100ml)	최종 pH
대조군	0.78 (±0.046)	0.065 (±0.006)	5.63
Soybean oil	1.09 (±0.122)	0.048 (±0.009)	5.60
Grape seed oil	1.04 (±0.193)	0.041 (±0.011)	5.73
Corn oil	1.12 (±0.193)	0.041 (±0.012)	5.47
Canola oil	1.15 (±0.145)	0.049 (±0.009)	5.68
Olive oil	1.00 (±0.164)	0.050 (±0.015)	5.84
Sesame oil	0.83 (±0.081)	0.049 (±0.005)	4.51

3-4. 초기 pH가 영지버섯의 균사생장 및 균체외 다당체 생산에 미치는 영향

영지버섯 SCH-1의 최적 pH를 알아보기 위해 최적배지에서 초기 pH를 각각 3~7로 조정하여 7 일간 배양하였다. 배양은, 2% 글루코스(glucose), 1% 프락토스(fructose), 0.4% 효모추출물(yeast extract), 0.1% K₂HPO₄, 0.046% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂O 및 0.25% 옥수수 오일(corn oil)을 함유한 배지에서, 28℃ 160 rpm 조건에서 이루어졌다. 배양하기 전 초기 pH를 3~7까지 각각 조정하여 배양 7 일차의 최종 균사체량(mycelium) 및 균체외 다당체양 (EPS)을 측정하였다. 측정결과는 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 각각의 초기 pH에 따른 총 균사체량과 균체외 다당체량을 함께 비교하였을 때, 초기 pH가 6으로 조정된 경우에 균사체량과 균체외 다당체량이 가장 많이 생산되었다.

[실시예 4]　 균사체 생성 및 베타글루칸 생성 최적 배지 결정

실시예 3의 배지 조성에 관한 연구결과 영지버서 균사체 및 베타글루칸 생성을 위한 최적 배지를 제조하였다. 배지의 구성성분 및 함량은 하기 표 5와 같다.

구성성분	함량(%)
글루코스	2.0
효모 추출물	0.4
K₂HPO₄	0.1
KH₂PO₄	0.046
MgSO₄·7H₂O	0.1
Corn oil	0.25

[실시예 5] 대두피를 이용한 베타글루칸 생성용 산업용 배지 개발

　우수한 베타글루칸을 생성능을 보인 대두피를 이용하여 보다 우수한 베타글루칸 생성용 배지를 얻기 위하여 다음과 같이 실험하였다. 먼저, 선발된 영지버섯 SCH-1(G. lucidum SCH-1)을 시험균주로, 탄수화물과 단백질의 조성을 달리한 6 개의 배합비를 설정한 배지에서 배양하였다. 배지의 조성은 하기 표 6과 같으며, 28℃, 170 rpm에서 7 일간 진탕기(shaking incubator; HK-SC25C, Korea)에서 배양하였다. 그런 다음 원심분리기(MEGA 21R, Hanil Science, Korea)를 이용하여 8,000 g에서 균사체를 회수하여 적외선 수분분석기(IR moisture determination balance, Kett FD-610, Japan)로 균사체량을 측정하였으며, 측정된 결과는 도 3과 같다.

(단위: g/100ml)	배합비 A	배합비 B	배합비 C	배합비 D	배합비 E	PDB
포도당	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	2
옥수수 전분	1.5		1.5		1.5
Soybean flour	0.5	0.5			0.5
Yeast extract	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
KH₂PO₄	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
MgSO₄	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
가용성 전분		1.5		1.5		0.4
Skim milk powder			0.5	0.5
Corn steep liquor					0.4
Dry matter of media	2.9	2.9	2.9	2.9	3.3	2.4

최대의 균사체 생산(dry matter base)을 나타낸 배합비는 B처리구로서, 배양액 100 ml 당 2.51 g의 수율을 보여 대조구(일반 연구실에서 액상버섯 배지로 흔히 사용하는 potato dextrose broth)의 균사체 0.43 g보다 약 5.8 배의 수율 차이를 보였다.

또한, 각각의 배지에서 pH의 변화를 조사한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4를 참조하면, 배양과정을 거치면서 대부분 pH가 약간 감소하는 비슷한 경향을 보였다.

이러한 결과들을 바탕으로 베타글루칸 생성 최적배지를 제조하여 대량 생산에 이용하였으며, 구체적인 조성비는 표 7과 같다.

구성성분	함량(%)
Glucose	0.5
Soybean flour	0.5
Yeast extract	0.1
KH₂PO₄	0.2
MgSO₄	0.1
Starch, soluble	1.5
Dry matter of media	2.9

결과적으로, 배합비 B를 산업용 배지로 확정하였으며, 발효조(KF-7L, Kobiotech, Korea, capacity 7L)를 사용하여 온도, 교반속도, 공기주입량, 배양시간 등 산업용 대량배양에 따른 최적조건을 사전 점검하였다. 또한, 자돈 사양실험에 필요한 베타글루칸을 얻기 위해 산업용 발효조(KF-500L, Kobiotech, korea, capacity 500L)를 사용하여 액상버섯을 대량 배양하였다.

최적의 배양조건은, 배양 볼륨 500 L, 온도 28℃, 교반속도 160 rpm, 공기 주입량은 0.5 vvm, 배양기간은 5 일간으로 하였다. 배양이 완료된 후 연속원심분리기(A-Q2375, Tomoe Co., Japan)를 이용하여 x 12,000 g로 원심 분리하여 균사체를 회수하였으며, -75℃의 deep freezer에서 냉동시킨 다음 동결건조기 (OPERON DFC-400CE, Operon co., Korea)를 사용하여 균사체를 건조하였다. 배양결과 동결 건조 된 균사체 5.0 kg을 얻어 총 균사체의 수율은 2.5% 이었으며, 이를 분석한 결과 베타글루칸의 함량은 약 34.1%로서 자돈 사양실험의 재료로 사용하였다.

[실시예 6] 열수 추출법에 의한 베타글루칸 추출

영지 배양액을 스테인레스 비이커에 넣고 열수추출 하였다. 물 10 L을 가하여 121℃에서 1 시간 동안 고압 고온 멸균하여 추출액을 여과시켜 원심 분리하였다. 그런 다음, 분자량 10,000의 투석 튜브를 사용하여 농축시킨 후 동결 건조하였다. 도 5에는 이러한 영지버섯 배양액에 대한 열수추출 과정을 간략적으로 나타내었다.

또한, 열수추출하는 조건을 변화시켜, 그에 따른 총 다당류의 수율과 베타글루칸의 함량을 측정하였다. 열수추출 조건 및 측정결과는 하기 표 8에 나타내었다. 표 8을 참조하면, 121℃에서 30 분간 고압 가온 하였을 때, 총 다당류의 수율이 가장 높은 2.56%를 얻었다. 이때 베타글루칸의 함량은 34.1%로 다른 추출 조건보다 순도는 낮았지만 수율적인 면에서 우수한 추출 조건이었다.

구분	Batch-1	Batch-2	Batch-3	Batch-4	평균
배양액(ml)	2,000	2,000	2,000	2,000	2,000
온 도(℃)	121	121	100	100	110.50
반응시간(min)	20	30	20	30	25.00
총 다당류 량(g)	46.3	51.2	30.1	34.2	40.45
수 율(%)	2.3	2.56	1.51	1.71	2.02
베타글루칸 함량	37	34.1	40.2	37.5	37.20

[실시예 7] 열수 추출법에 의한 베타글루칸의 물성 특성

배양된 영지 균사체에 열수추출을 통해 분리된 베타글루칸은 하기 표 9에서와 같이 탄수화물, 단백질 및 헥소사민(Hexosamine)의 함량은 차이가 있었다. 즉, 총 탄수화물은 75.8%, 단백질은 8.4% 그리고 헥소사민(Hexosamine)은 0.69%로 포함되어 있는 것을 알 수 있다.

성분분석	탄수화물(%)	단백질(%)	헥소사민(%)
베타 글루칸	75.85	8.4	0.69

영지 균사체를 세포분획별로 수획하여 얻은 베타글루칸의 구성당을 분석하기 위하여 가스크로마토그래피를 이용하여 구성당의 함량을 조사하였다. 조사결과는 하기 도 6과 같다.

분석 결과, 베타글루칸의 주요 구성 성분은 주로 포도당으로 구성된 글루칸임을 알 수 있다.　 글루칸의 함량은 90% 이상의 포도당으로 구성되어 있다.

또한, 베타글루칸을 적외선 스펙트럼으로 측정하여, 베이커(Baker) 등의 분석방법을 통하여 구조를 추정하였다. 일반적으로 알파-아노머 탄수화물은 811~855 ㎝^-1에서 흡수파장이 나타나며, 베타-아노머 등은 895±9 ㎝^-1의 부근에서 나타난다.　 적외선 스펙트럼 측정결과는 도 7에 나타내었다.

GLP(영지버섯 균사체 다당류, G. lucidum polysaccharide)는 적외선 스펙트럼 상에서는 가시적으로 구별할 수 있는 890 ㎝^-1전후의 부근에서 흡수되어 베타글루칸임이 확인되었다. 탄수화물 가운데 카르보닐기(carbonyl group; C=O)는 1725~49 ㎝^-1, 아세트아미도기(acetamido group, 예: -NH, CO, CH₃)은 1648 ㎝^-1 부근에서 흡수파장을 보였다. 고리 형태의 단당은, 1 번 탄소와 5 번 탄소 사이에 에테르 결합(C-O-C)을 이룬다. 이러한 구조는 적외선 스펙트럼의 1150~1080 ㎝^-1(ring form), 1150~1060 ㎝^-1(alkyl ether)에서 흡수파장을 나타내는데, 도 7에서 이와 같은 범위의 흡수피크를 확인할 수 있다.

또한, 영지 균사체로부터 얻은 베타글루칸을 겔 크로마토그래피를 통하여 분자량 분포를 측정하였다. 측정결과는 하기 표 10과 도 8에 나타내었다.

조 베타글루칸	분자량(평균, kD)
열수 추출된 베타글루칸의 평균 분자량	10 - 40

표 10과 도 8을 참조하면, 수용성(Ws)의 경우 10~40 kD 범위의 평균 분자량 분포를 단일피크로 나타냈다.

[실시예 8] 베타글루칸과 관련 다당류의 항암활성 비교

영지버섯의 균사체를 배양하고, 배양된 균사체를 열수추출하여 얻은 베타글루칸에 대한 항암활성을 비교하였으며, 실험결과는 도 9에 나타내었다. 도 9에서, GLP는 본 실시예에 따른 영지버섯로부터 추출된 베타글루칸을, PSK는 양성대조군(Krestin^®)을 의미한다. 도 9를 참조하면, 베타글루칸의 항암활성이 52.5% 로써, 대조물질인 PS-K(Krestin^® 60.3%의 암 억제률 보다 20% 이상 우수한 암 저지 효과가 있음을 확인할 수 있다.

[실시예 9] 항보체 활성시험

면역계는 매우 복잡하게 연관되어 일어나는 일련의 반응계로써, 그 중 보체계는 생체내에서 면역기능의 하나인 감염방어등과 같은 방어반응과 종양면역에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 보체계는 면역 활성 다당류에 의해 활성화되므로, 베타글루칸을 이용하여 항보체 활성을 측정하였다. 측정결과는 도 10에 나타내었다.

도 10을 참조하면, 보체계의 활성도는 영지 균사체 다당류(GLP)를 50 μg/ml로 투여하였을 때 28%의 항보체 활성을 보였다. 상대적으로, 양성 대조군으로서 케레스틴(Krestin^®)에 대해서는 20.9%를 나타내었다.

[실시예 10] 베타글루칸에 의한 마우스에서의 면역활성 시험

10-1. S-180이 이식된 마우스에 베타글루칸을 복강 투여시 혈청 종양괴사인자(TNF-α) 농도

S(사코마)-180이 이식된 마우스에 베타글루칸을 복강투여 후, 혈중 종양괴사인자 농도증가를 확인하고자, 육종암이 이식된 마우스에 베타글루칸 (GLP)을 증류수에 녹여 복강 투여한 후 (5 mg/0.2 ml/kg), 마우스의 혈청을 채취하여 TNF-α의 양을 효소면역흡착방법(ELISA)로 측정하였다. 측정결과는 도 11과 같다.

도 11을 참조하면, 베타글루칸은 52.98 ρg/ml의 종양괴사인자 생성능을 보였다. 이에 대해, 양성 대조군으로 사용한 면역항암제 레티난(Lentinan^®) 주사제는 12.73 ρg/ml의 종양괴사인자의 농도를 나타냈다.

10-2. 마우스 혈중 단핵구 배양액에 베타글루칸 투여시 종양괴사인자(TNF-α) 농도

　　　　　마우스의 혈중에서 단핵구를 분리하고, 이를 초대 배양하여 베타글루칸을 투여 후, 배지내 종양괴사인자 농도 증가를 확인하였다. 실험결과는 도 12에 나타내었다. 도 12를 참조하면, 베타글루칸(GLP)은 1,462 ρg/ml 종양괴사인자 생성능을 보였다. 상대적으로, 양성 대조군으로 사용한 LPS는 2,441 pg/ml이었으며, 면역항암제 레티난(Lentinan^®) 주사제는 262.75 ρg/ml의 종양괴사인자의 농도를 나타내었다.

10-3. 랫(Rat) 골수의 단핵구에 대한 베타글루칸에 의한 일산화질소(NO) 생성능

랫(Rat)의 대퇴부로부터 골수를 채취하여 골수내의 단핵구를 수집하였다. 수집된 단구세포는 RPMI 1640에서 배양한 후, 세포수가 ml당 2 x 10⁶ 되도록 한 후, 시료를 처리하여 48 시간이 지난 후 일산화질소(nitric oxide)를 측정하였다. 측정결과는 도 13과 같다.

도 13을 참조하면, 베타글루칸(GLP)은 농도에 따른 산화질소의 생성을 촉진하였다. 1 ㎍/㎖ 의 투여 농도에서는 15.94±1.10μM, 20 ㎍/㎖ 투여 농도에서는 82.26± 2.78 μM의 일산화 질소를 생성하였다.

[실시예 11] 면역증강제 사료첨가제 조성

상기 실시예들을 통해 생산된 베타글루칸을 하기 표 11의 조성으로 면역 증강용 사료 첨가제를 제조하였다.

구성성분	함량(%)
베타 글루칸	34
대두박	60
건조효모	10
수분	10 이하

[실시예 12] 가축 사양시험

상기 실시예 11을 통해 제조된 베타글루칸 제품을 이용하여, 이유자돈에서의 효과를 확인하기 위하여 가축 사양시험을 실시하였다

가축사양시험은 28 일간 양돈실습농장에서 실시하였으며, 자료분석 및 사료분석은 축산기술지원센터에서 실시하였다. 삼원교잡종(Landrace×Large White×Duroc) 이유자돈(8.6 kg) 144 두를 선발하여 공시하였고, 체중의 편차와 암수구분에 의한 오차를 줄이기 위하여 전체 시험돈을 체중과 성별로 4 개 군(암컷 2 반복, 거세 수컷 2 반복)으로 구분하였다.

이유자돈은 평균 생후 20 일에 이유한 자돈 144 두를 선발하여 3 일간의 예비사양 후 13 일간(생후 23 일 - 1 일령) 이유자돈 시험을 실시하였다. 사양시험 설계에서, 시험구 배치 및 처리방법은 표 12에서 보는 바와 같이 4처리 4반복의 난괴법 배치로 하였다. 시험구의 처리는 T1 처리구(+control)는 항생제를 0.255% 첨가한 처리구이며, T2 처리구(-control)는 무항생제 처리구, T3 처리구는 항생제와 베타글루칸 0.2%를 첨가한 처리구, T4 처리구는 무항생제에 베타글루칸 0.2%를 첨가한 처리구로 하였다. 항생제는 테라마이신(OTC 0.055%), 네오마이신(0.1%) 및 티아물린(0.1%)을 혼합 제조한 것을 사용하였다.　

처리구	T1	T2	T3	T4	계
반복	4	4	4	4
마리/반복	9	9	9	9
반복당 마리수	36	36	36	36	144
처리내용
항생제	0.255%	×	0.255%	×
베타글루칸	×	×	0.2%	0.2%

[실시예 13] 시험사료 조성

급여한 기초사료의 배합비 및 성분함량은 표 13과 같다.

원료사료	성분함량(%)	영양소	성분함량
Corn, EP 　Wheat 　Dehulled soybean meal 　Full fat soybean meal 　Whey 　White fish meal 　Soy oil 　Pop gold 　Brewers yeast 　White sugar 　Limestone 　DCP 　Salt 　ZnO 　Vitamin Mix 　Mineral Mix 　Lysine 78% 　Methionine 99% 　OTC 200 　Tiamulin 38g 　Anti-oxidant 　Flavor 및 sweetener 　Organic acid 　Probiotic	25.07 　12.00 　12.00 　　7.00 　23.85 　　5.58 　　3.02 　　3.50 　　1.50 　　3.00 　　0.32 　　0.68 　　0.20 　　0.30 　　0.20 　　0.30 　　0.32 　　0.08 　　0.05 　　0.10 　　0.03 　　0.10 　　0.50 　　0.30	Crude protein 　Crude fat 　Crude fiber 　Crude ash 　Ca 　P 　Lysine 　DE(kcal/kg)	21.00 　　6.20 　　2.00 　　5.80 　　0.80 　　0.73 　　1.50 3,600
합 계	100.00

[실시예 14] 가축생산성

시험돈은, 사료섭취량, 증체량 및 사료효율을 시험개시와 종료시에 각각 측정하였다. 또한, 1 일 1 두당 섭취량은 매 조사 시기에 사료잔량을 측정하여 계산하였으며, 일당증체량은 매 잔량 측정시 이동식 전자저울로 측정하였다. 사료효율은 시험기간 중의 증체량을 사료섭취량으로 나누어 계산하였다. 이유자돈의 분변 상태 조사는, 1 점에서 5 점의 지수로 1=된똥, 2=약간 된똥, 3=정상, 4=약간설사, 5=설사로 기록하였다. 분내 수분함량 측정은, 시험 중에 각 처리구에 동일한 시간동안 배설된 분을 10 g 채취한 후, 105℃에서 건조전후 무게를 측정하여 조사하였다. 이유자돈의 폐사율은 전체 공시한 가축에 대한 시험기간 중 폐사한 마리수로 측정하였다.

20 일령에 이유한 자돈을 144 두를 선발하여 3 일간의 예비 사양 후(23 일령)에 시험을 개시하였다. 항생제와 베타글루칸을 달리하여 급여한 이유자돈의 시험에서 개시일의 평균체중은 표 14에서 보는 바와 같이 8.6 kg이며, 14 일 후 평균 체중은 13.4 kg이다.

처　　 리	T1	T2	T3	T4	Mean	SEM
0~14 일
개시체중(㎏)	8.6	8.6	8.6	8.6	8.6	0.9
종료체중(㎏)	13.6	13.0	13.8	13.1	13.4	1.3
일당증체량(g)	352.3	317.3	371.1	320.3	340.2	39.8
일일사료섭취량(g)	491.7	475.9	509.3	474.2	487.8	41.7
사료효율	0.72	0.67	0.73	0.68	0.70	0.08
15~28 일
개시체중(㎏)	13.6	13.0	13.8	13.1	13.4	1.3
종료체중(㎏)	20.2	18.4	20.4	18.8	19.4	1.9
일당증체량(g)	470.8^a	382.6^b	471.6^a	408.9^ab	433.5	59.9
일일사료섭취량(g)	731.2	631.8	765.4	662.7	693.3	82.3
사료효율	0.63	0.61	0.62	0.63	0.62	0.07
0~28일
개시체중(㎏)	8.6	8.6	8.6	8.6	8.6	0.9
종료체중(㎏)	20.2	18.4	20.4	18.8	19.4	1.9
일당증체량(g)	411.6	349.9	421.4	364.6	386.9	46.6
일일사료섭취량(g)	616.4	553.5	637.4	558.5	591.5	64.0
사료효율	0.67	0.63	0.66	0.65	0.65	0.06
설사지수	2	2	3	3	3
분 수분함량(%)	65.8	64.9	71.9	72.1	68.7	5.0
폐사율	0.0	2.8	0.0	0.0	0.7

이유자돈 전기(0 일-14 일: 8.7 - 13.4 kg)에서는 일당 증체량과 1 일 두당 사료섭취량은 처리간에 유의적인 차이가 없었다. 그러나, 사료요구율은 T1, T2, T3 및 T4 처리구가 각각 1.40, 1.50, 1.37 및 1.48로 무항생제 처리구인 T2가 가장 높았으며, 항생제와 베타글루칸을 첨가한 처리구(T3처리구)가 가장 낮아 사료효율이 가장 좋았다(p<0.05). 이유자돈 후기(0일~14일: 13.4 kg~19.4 kg)에서는 1 일 두당 사료섭취량과 사료요구율은 처리간에 유의적인 차이가 없었다. 그러나, 일당증체량은 T1, T2, T3 및 T4 처리구가 470.8 g, 382.6 g, 471.6 g 및 408.9 g으로 항생제와 베타글루칸을 첨가한 처리구가 가장 높았으며, 무항생제 처리구가 가장 낮았다(p<0.05). 시험 전기간(0~28 일)의 종료체중은 T1, T2, T3 및 T4처리구가 각각 20.2 kg, 18.4 kg, 20.4 kg 및 18.8 kg로 항생제 처리구인 T1 및 T4처리구가 다른 처리구보다 무거웠다(p>0.05). 이유자돈의 일당증체량도 T1, T2, T3 및 T4처리구가 각각 411.6 g, 349.9 g, 421.4 g 및 364.6 g으로 T1 및 T3처리구가 다른 처리구보다 많이 증체하였으며 처리간에 유의성도 있었다. 즉, 항생제 처리구가 무항생제 처리구들보다 많이 증체하였으며, 베타 글루칸의 효과는 항생제의 효과보다 적었다.

일일 두당 사료섭취량은 T1, T2, T3 및 T4 처리구가 각각 616.4 g, 553.4 g, 637.4 g 및 558.5 g로 항생제 처리구인 T1 및 T3처리구가 다른 처리구보다 많이 섭취하였으나 처리간에 유의성은 없었다. 그리고, 사료요구율은 T1, T2, T3 및 T4 처리구가 각각 1.50, 1.58, 1.51 및 1.54로 처리간에 유의성은 없었다.

또한, 도 14에는 28 일간의 이유자돈의 일당증체량을 나타내었다. 이유자돈의 증체량은 항생제를 첨가한 구가 첨가하지 않은 구보다 약 17% 많이 증체하여 이는 다른 시험에서와 유사한 경향을 보였다. 한편 베타 글루칸의 효과는 무항생제에서는 4%의 효과가 있었으며, 항생제 처리구에서는 2%의 증체효과가 있었다. 따라서 베타 글루칸은 항생제 사료보다 무항생제 사료에서 자돈의 일당증체량 향상에 효과가 좋을 것으로 판단되었다.

한편, 이유자돈 분변의 설사지수는, 베타 글루칸을 첨가한 처리구(T3 및 T4처리구)가 첨가하지 않은 처리구보다 낮았으며, 분의 수분함량도 설사지수와 마찬가지로 베타글루칸을 첨가한 T3와 T4처리구가 다른 처리구보다 많아 베타 글루칸을 첨가함에 따라 이유자돈의 분변이 약간 묽은 경향을 보였다. 이유자돈의 폐사율은 무항생제 처리구의 2.8%인 것을 제외하고는 다른 처리구는 폐사한 가축이 없었다.

이상의 이유자돈의 생산성을 볼 때, 무항생제 처리구보다 항생제 처리구의 생산성이 우수하였으며, 베타 글루칸은 항생제의 효과보다 적었다. 그리고, 베타글루칸은 항생제 사료에서의 효과보다 무항생제 사료에서 효과가 높아 무항생제 사료에서 사료첨가제로 효과가 높을 것으로 판단된다.

[실시예 15] 사료첨가제의 경제성 분석

이유자돈에 항생제와 베타 글루칸을 달리하여 급여한 시험의 경제성 분석은 표 15에서 보는 바와 같다. 시험에 사용한 사료 1 kg 당 가격은 이유전기는 1,370원, 이유후기는 452원이었으며, 첨가한 항생제는 kg당 OTC는 4,700원, 네오마이신 2,500원, 티아물린 2,500원이었으며, 베타글루칸 kg당 5,000원으로 가정하여 경제성을 분석하였다.

이를 기준으로, 이유전기(0-14일)의 자돈 사료비는 T1, T2, T3 및 T4 처리구가 각각 1,374.1원, 1,370.0원, 1,381.4원 및 1,382.3원으로 처리간의 차이가 1% 이내로 거의 차이가 없었으나 베타 글루칸을 첨가한 T3 및 T4처리구의 사료비가 높았다.

한편, 시험기간 동안 이유자돈의 두당 섭취량을 고려한 1 일 두당 섭취량의 사료비는 T1, T2, T3 및 T4 처리구가 각각 675.6원, 652.0원, 703.5원 및 655.5원으로 T3 처리구(항생제+베타 글루칸)의 사료비가 가장 높았다. 그리고 이유자돈의 증체량을 고려한 증체 1 kg당 사료비는 T1, T2, T3 및 T4 처리구가 각각 1,917.8원, 2,054.8원, 1,895.8원 및 2,046.4원으로 T2(무항생제) 및 T4 처리구(무항생제+베타글루칸)의 사료비가 다른 처리구보다 높았다.

처　　 리	T1	T2	T3	T4
0-14일
사료가격(원)	1,366.5	1,370.0	1,363.8	1,372.3
항생제가격(원)	7.6		7.6
베타글루칸가격(원)			10.0	10.0
전체 사료비(원)	1,374.1	1,370.0	1,381.4	1,382.3
사료비(지수)	100.0	99.7	100.5	100.6
1일두당섭취량의 사료비(원)	675.6	652.0	703.5	655.5
증체 1kg당 사료비(원)	1,917.8	2,054.8	1,895.8	2,046.4
증체 1kg당 사료비(지수)	100.0	107.1	98.9	106.7
15-28일
사료가격(원)	450.8	452.0	449.9	451.1
항생제가격(원)	7.6	-	7.6	-
베타글루칸가격(원)	-	-	10.0	10.0
전체 사료비(원)	458.4	452.0	467.5	461.1
사료비(지수)	100.0	98.6	102.0	100.6
1일두당섭취량의 사료비(원)	335.2	285.6	357.8	305.6
증체 1kg당 사료비(원)	712.0	746.4	758.8	747.3
증체 1kg당 사료비(지수)	100.0	104.8	106.6	105.0

이유후기(15~28 일)의 자돈 사료비는 T1, T2, T3 및 T4 처리구가 각각 458.4원, 452.0원, 467.5원 및 461.1원으로 항생제와 베타 글루칸을 첨가한 T3 처리구의 사료비가 가장 높았다. 시험기간 동안 이유자돈의 두당 섭취량을 고려한 1 일 두당 섭취량의 사료비는 T1, T2, T3 및 T4 처리구가 각각 335.2원, 285.6원, 357.8원 및 305.6원으로 T3 처리구(항생제+베타 글루칸)의 사료비가 가장 높았다. 그리고, 이유자돈의 증체량을 고려한 증체 1 kg당 사료비는 T1, T2, T3 및 T4 처리구가 각각 712.0원, 746.4원, 758.8원 및 747.3원으로 T2(무항생제) 및 T4 처리구(무항생제+베타글루칸)의 사료비가 다른 처리구보다 많았다.

이상의 이유자돈 시험의 경제성분석 결과를 종합해 볼 때, 이유전기에서는 항생제와 베타글루칸을 첨가함에 따라 사료비는 증가하여 많았으나, 섭취량과 증체량을 고려한 사료비에서는 베타글루칸을 첨가한 처리구(T3 및 T4)가 첨가하지 않은 처리구(T1 및 T2)보다 감소하여 베타글루칸의 효과가 있다. 그러나, 이유후기에서는 베타글루칸의 효과가 이유전기보다 적은 것은 결과를 보였다. 따라서, 베타글루칸의 효과는 이유후기보다 이유전기(생후 3~5 주)에 효과가 좋을 것으로 판단된다.　　

[실시예 16] 혈액분석

혈청의 생화학검사는 각 처리당 8 마리를 임의 선발하여 시험 4 주차에 경정맥(Jugular)에서 진공튜브를 사용하여 혈액 5 ㎖를 채취하여 4℃, 2,000 rpm 30 분간 원심분리하여 혈청분석에 이용하였다. 분리된 혈청은 enzymatic colorimeter method에 의하여 총 콜레스테롤 농도는 총 콜레스테롤 검사시약으로, HDL 콜레스테롤 농도는 HDL-C 검사시약을 사용하였다. TG(triglyceride)농도는 자동생화학분석기를 이용하여 측정하였다.　　 이유자돈에 항생제와 베타 글루칸을 달리하여 급여한 시험의 혈액성상은 하기 표 16에서 보는 바와 같다.

혈액성분	T1	T2	T3	T4	평균	SEM
Albumin (g/㎗)	3.3	3.8	3.5	3.4	3.5	0.1
Alkaline Phosphatase (u/ℓ)	230^a	205^a	217^a	154^b	202	17
Alanine amino Transferase (u/ℓ)	91^b	109^a	96^ab	84^b	95	1
Aspartate amino Transferase (u/ℓ)	193	290	186	215	221	37
Blood Urea Nitrogen (㎎/㎗)	12	11	13	11	12	1
Cholesterol (㎎/㎗)	93	109	101	97	100	8
Creatinine (㎎/㎗)	0.9	1.1	1.0	0.9	1.0	0.0
Gamma Glutamyl Transferase (u/ℓ)	30^ab	46^a	45^a	27^b	37	4
Globulin (g/㎗)	3.9	4.0	4.5	4.1	4.1	0.2
Glucose (㎎/㎗)	89	67	77	75	77	8
Total Bilubin (㎎/㎗)	2.3	2.1	2.4	2.7	2.4	0.5
Total Protein (g/㎗)	7.1	7.6	7.1	7.4	7.3	0.2
Triglyceride (㎎/㎗)	50	51	45	44	47	5

혈액성상은 시험종료시에 처리당 8 두의 혈액 채취하여 분석하였으며, 표 16에서 보는 바와 같이 조사한 알부민 등 13 개의 성분 중에서 알카라인 포스타파아제, 알라닌아미노 트랜스퍼라아제 및 감마 글루타밀 트랜스퍼라아제에서 처리간에 유의적인 차이가 있었다(p<0.05). 유의적인 차이가 있는 3 성분 모두 무항생제 처리구인 T2 처리구가 처리구중에서 가장 높았고, 베타글루칸 처리구(T4)가 가장 낮은 성분함량을 나타내었다.　

　또한, 이유자돈의 혈액 내 잔류항생물질 분석결과는 표 17에서 보는 바와 같다. 혈액내 잔류 항생제 분석은, 항생제 처리구와 무항생제 처리구에서 각각 4 두씩 분석하였다. 항생제는 표 17과 같이, 아모실린, 겐타마이신 등 20 개 항목을 분석하였으며, 2 개의 처리구 모두에서 항생제가 검출되지 않았다.

검사항목	항생제	무항생제	민감도 (ppm)	검사항목	항생제	무항생제	민감도 (ppm)
아모실린 (Amoxicillin)	불검출	불검출	0.005	겐타마이신 (Gentamycin)	불검출	불검출	0.1
암피실린 (Ampicillin)	불검출	불검출	0.005	네오마이신 (Neomycin)	불검출	불검출	0.3
세프티오퍼 (Ceftiofur)	불검출	불검출	0.1	스트렙토마이신 (Streptomycin)	불검출	불검출	1.5
에리스토마이신 (Erythromycin)	불검출	불검출	0.1	스펙티노마이신 (Spectinomycin)	불검출	불검출	0.1
타이로신 (Tylosin)	불검출	불검출	0.05	바시트라신 (Bacitracin)	불검출	불검출	0.5
스피라마이신 (Spiramycin)	불검출	불검출	1	버지니아마이신 (Virginiamycin)	불검출	불검출	0.5
옥시테트라사이클린 (Oxytetracycline)	불검출	불검출	0.1	엔로플록사신 (Enrofloxacin)	불검출	불검출	0.6
클로르테트라사이클린 (Chlortetracycline)	불검출	불검출	0.1	클로람페니콜 (Chloramphenicol)	불검출	불검출	2.5
테크라사이클린 (Tetracycline)	불검출	불검출	0.2	살리노마이신 (Salinomycin)	불검출	불검출	1.25
셀파메타진 (Sulfamethazine)	불검출	불검출	0.075	모넨신 (Monensin)	불검출	불검출	1.25

[실시예 17] 영양소 이용율

시험사료의 소화율은 크롬(Cr₂O₃, Chromic oxide)을 이용한 간접측정법으로 사양시험 마지막 주에 3 일 동안 오전과 오후에 각각 분을 모은 후 분석에 이용하였다. 분석을 위해 샘플은 순환식 건조 오븐에 넣어 60℃에서 72 시간 건조시킨 후 Wiley mill을 이용하여 1 mm 입자로 분쇄한 후 분석시료로 사용하였다.

시험사료와 분의 일반성분은 AOAC(1990)에 준하여 실시하고, 사료와 분 중의 Cr 농도를 측정하기 위해 HNO₃와 HCl로 전처리를 하여 ICP(inductively coupled plasma)를 이용하여 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 18에 나타내었다.

시료와 분의 일반성분의 소화율은 간접방법으로 다음의 수학식 1에 의하여 구하였다.

영양소 이용율 = 100 × {1-(사료중의 Cr함량% × 분중의 영양소 함량%)/(분중의 Cr함량% × 사료중의 영양소 함량%)}

베타글루칸이 이유자돈의 항생제 및 무항생제 사료의 영양소 소화율은 표 18에서 보는 바와 같다. 모든 자료는 SAS(1999)의 GLM 공정을 이용하여 분산분석을 실시하였고, 유의성 검정은 Duncan's multiple range test(Duncan, 1955)로 처리하였다.

영양소 이용율	T1	T2	T3	T4	평균	SEM
건물	75.0	70.5	73.9	71.7	72.8	2.1
조단백질	67.1	63.0	70.7	65.7	66.6	3.4
조지방	68.2	64.7	71.6	67.7	68.1	3.0
조회분	31.6	20.5	34.2	28.7	28.7	5.6

표 18을 참조하면, 건물소화율은 T1, T2, T3 및 T4 처리구가 각각 75.0%, 70.5%, 73.9% 및 71.7%로 항생제 처리구(T1) 처리구가 다른 처리구보다 높았다. 반면 조단백질, 조지방 및 조회분의 소화율은 무항생제 사료에 베타글루칸을 첨가한 처리구(T3)가 다른 처리구보다 높았다.

도 1은 영지버섯에서 추출한 고분자 및 저분자 물질의 인간 암세포주에서의 증식억제률을 나타낸 그래프이다;

도 2는 영지버섯 배양시 초기 pH가 균사체와 균체외 다당류 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다;

도 3은 다양한 영지버섯 SCH-1 배양배지에 따른 균체량을 나타낸 그래프이다;

도 4는 다양한 영지버섯 배양배지에 따른 pH 변화량을 나타낸 그래프이다;

도 5는 버섯에서 베타글루칸을 열수추출하는 방법을 나타낸 모식도이다;

도 6은 균체외성 베타글루칸의 G.L.C 형태 및 단당 구성 분석을 나타낸 그래프이다;

도 7은 베타글루칸의 적외선 스펙트럼 분석을 나타낸 그래프이다;

도 8은 영지버섯에서 열수추출한 베타글루칸의 겔 크로마토그래피 분석 그래프이다;

도 9는 영지균사체의 베타글루칸 및 항암제 PSK간의 항암활성 비교를 나타낸 그래프이다;

도 10은 베타글루칸의 보체계 활성효과를 나타낸 그래프이다;

도 11은 사코마 180을 이식한 마우스에서의 혈청내 종양괴사인자의 농도를 나타낸 그래프이다;

도 12는 마우스 혈액내 단핵구 배양액에 베타글루칸 투여시 TNF-α 농도를 나타낸 그래프이다;

도 13은 베타글루칸 농도에 따른 랫(rat)의 골수 단핵구에서의 일산화질소 농도를 나타낸 그래프이다;

도 14는 베타글루칸이 이유자돈의 일당증체량에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
영지버섯(Ganoderma lucidum) 균사체로부터 추출된 베타글루칸을 함유하는 사료 첨가제를 제조하는 방법으로서,

(a) 영지버섯 균사체를 고온 및 고압의 조건에서 열수추출하는 공정;

(b) 상기 (a) 공정의 추출액으로부터 상층액을 분리하여, 한외여과를 거쳐 분자량 10,000 달톤 이상의 베타글루칸을 수득하는 공정; 및

(c) 수득된 베타글루칸을 포함하는 사료 첨가제를 제조하는 공정을 포함하며,

상기 (a) 공정 이전에, 영지버섯 균사체를 배지에서 배양하는 공정을 더 포함하며,

상기 배지는, 배지 전체 중량을 기준으로, 글루코스　1.0~3.0 중량%, 효모 추출물 0.2~0.6 중량%, K₂HPO₄ 0.05~0.2 중량%, KH₂PO₄ 0.01~0.1 중량%, MgSO₄·7H₂O 0.05~0.2 중량% 및 옥수수 오일 0.1~0.5 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 함유 사료 첨가제의 제조방법.
영지버섯(Ganoderma lucidum) 균사체로부터 추출된 베타글루칸을 함유하는 사료 첨가제를 제조하는 방법으로서,

(a) 영지버섯 균사체를 고온 및 고압의 조건에서 열수추출하는 공정;

(b) 상기 (a) 공정의 추출액으로부터 상층액을 분리하여, 한외여과를 거쳐 분자량 10,000 달톤 이상의 베타글루칸을 수득하는 공정; 및

(c) 수득된 베타글루칸을 포함하는 사료 첨가제를 제조하는 공정을 포함하며,

상기 (a) 공정 이전에, 영지버섯 균사체를 배지에서 배양하는 공정을 더 포함하며,

상기 배지는, 영지버섯으로부터 베타글루칸을 대량생산하기 위한 산업용 배지로서, 배지 전체 중량을 기준으로, 글루코스 0.1~1.0 중량%,　콩 분말(soybean flour) 0.1~1.0 중량%, 효모 추출물 0.05~0.2 중량%, KH₂PO₄0.1~0.5 중량%, MgSO₄0.05~0.5 중량% 및 가용성 전분 1.0~2.0　중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 함유 사료 첨가제의 제조방법.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,

상기 배지는, 배지 전체 중량을 기준으로, 오일 성분 0.01 내지 0.5 중량%를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 함유 사료 첨가제의 제조방법.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,

상기 (c) 공정 이후에, 제조된 사료 첨가제를, 동결건조, 분말, 액상 또는 베타글루칸이 함유된 발효산물의 형태로 가공하는 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 함유 사료 첨가제의 제조방법.