JP2020010703A - １，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸誘導体 - Google Patents
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Abstract
【課題】ビフィズス菌増殖作用を有する安定な新規化合物を提供すること。【解決手段】 式（Ｉ）：［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は生体内で酵素により加水分解し得る基であり；Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が水素原子ではない。］で表される化合物又はその塩。【選択図】図２
Description
本発明は、腸内フローラの改善に有効なビフィズス菌の増殖作用を有する１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸誘導体に関する。詳しくは、本発明は安定化された１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）誘導体に関し、さらに詳しくは、１）ＤＨＮＡ水酸基の硫酸エステル、ＤＨＮＡ水酸基のグルクロン酸化化合物及びグルコシル化化合物、２）これらの化合物を含有する医薬や食品に関する。
１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid：DHNA)は、従来から染料、顔料及び感光材料等、工業材料として用いられてきた。近年、ＤＨＮＡがプロピオン酸菌培養液から発見され、ビフィズス菌増殖因子やビタミンＫ前駆体であることが報告され（特許文献１、２、非特許文献１）、プロピオン酸菌培養液から精製、濃縮されたＤＨＮＡ分画は腸内フローラの改善、代謝性骨疾患の予防等に有効であり（特許文献３）、他にもＩＢＳ（炎症性腸疾患）、ヘリコバクター・ピロリ菌除菌、アレルギー、骨粗鬆症に有効であると考えられ、健康食品や医薬の分野で注目されている。
しかしＤＨＮＡは酸化により容易に分解され不安定であるため、その分解を防ぐため、（１）ＤＨＮＡ分画を添加する飲食品（乳製品を含む飲料、乳酸菌飲料、野菜汁、果汁、栄養飲料等）、ゲル状食品（ヨーグルト等））等から窒素置換等により溶存酸素を完全に除去する、または（２）抗酸化剤を共存させる等の工程が必要とされていた（特許文献４）。
また従来のＤＨＮＡは、特にｐＨ７以上で分解されやすいため、十二指腸から小腸、小腸から大腸へ消化管の移動中に分解されやすく、ビフィズス菌増殖効果等を発現させるためには多くの用量が必要であった。
このようにＤＨＮＡを安定化させるために飲食品等の加工時に酸素を除去するという煩雑な操作を必要とすることなく、また飲食品の風味を損ねる抗酸化剤の添加を伴わず、さらに消化管まで分解されることなく到達することのできるＤＨＮＡは知られていない。
しかしＤＨＮＡは酸化により容易に分解され不安定であるため、その分解を防ぐため、（１）ＤＨＮＡ分画を添加する飲食品（乳製品を含む飲料、乳酸菌飲料、野菜汁、果汁、栄養飲料等）、ゲル状食品（ヨーグルト等））等から窒素置換等により溶存酸素を完全に除去する、または（２）抗酸化剤を共存させる等の工程が必要とされていた（特許文献４）。
また従来のＤＨＮＡは、特にｐＨ７以上で分解されやすいため、十二指腸から小腸、小腸から大腸へ消化管の移動中に分解されやすく、ビフィズス菌増殖効果等を発現させるためには多くの用量が必要であった。
このようにＤＨＮＡを安定化させるために飲食品等の加工時に酸素を除去するという煩雑な操作を必要とすることなく、また飲食品の風味を損ねる抗酸化剤の添加を伴わず、さらに消化管まで分解されることなく到達することのできるＤＨＮＡは知られていない。
Isawa K, et al, Isolation and identification of a new bifidogenic growth stimulator produced by propionibacterium freudenreichiiET-3, Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 679-681 (2002)
本発明の目的は、腸内フローラの改善に有用であり、ビフィズス菌増殖作用を有する安定な化合物及び、それらを含有する医薬及び食品を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、
式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は生体内で酵素により加水分解し得る基であり；Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が水素原子ではない。］
で表される化合物又はその塩が、優れたビフィズス菌増殖作用を有し、腸内フローラの改善に有用であり、かつ安定であることを見出し、本発明を完成するに至った。
で表される化合物又はその塩が、優れたビフィズス菌増殖作用を有し、腸内フローラの改善に有用であり、かつ安定であることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである。
［１］式（Ｉ）：
［１］式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は生体内で酵素により加水分解し得る基であり；Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が水素原子ではない。］
で表される化合物又はその塩。
［２］生体内で酵素により加水分解し得る基が、グリコシル基又はオキソ酸基である［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］生体内で酵素により加水分解し得る基が、
で表される化合物又はその塩。
［２］生体内で酵素により加水分解し得る基が、グリコシル基又はオキソ酸基である［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］生体内で酵素により加水分解し得る基が、
［式中、＊は結合部位を示す。］
からなる群より選ばれる基である［１］に記載の化合物又はその塩。
［４］生体内で酵素により加水分解し得る基が、
からなる群より選ばれる基である［１］に記載の化合物又はその塩。
［４］生体内で酵素により加水分解し得る基が、
［式中、＊は結合部位を示す。］
からなる群より選ばれる基である［１］に記載の化合物又はその塩。
［５］［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含有してなる医薬。
［６］ビフィズス菌増殖剤である［５］に記載の医薬。
［７］腸内フローラ改善剤である［５］に記載の医薬。
［８］［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含有してなる食品。
［９］植物の組織培養培地に1,4-ジヒドロキシ-2-ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）を添加し培養
することを特徴とする
式（Ｉ）：
からなる群より選ばれる基である［１］に記載の化合物又はその塩。
［５］［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含有してなる医薬。
［６］ビフィズス菌増殖剤である［５］に記載の医薬。
［７］腸内フローラ改善剤である［５］に記載の医薬。
［８］［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含有してなる食品。
［９］植物の組織培養培地に1,4-ジヒドロキシ-2-ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）を添加し培養
することを特徴とする
式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は生体内で酵素により加水分解し得る基であり；Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が水素原子ではない。］
で表される化合物またはその塩の製造方法。
［１０］植物がグリコシルトランスフェラーゼを発現している植物である［９］に記載の製造方法。
［１１］ＤＨＮＡがＤＨＮＡを産生する微生物を培養して得られた培養液由来のものである［９］又は［１０］に記載の製造方法。
で表される化合物またはその塩の製造方法。
［１０］植物がグリコシルトランスフェラーゼを発現している植物である［９］に記載の製造方法。
［１１］ＤＨＮＡがＤＨＮＡを産生する微生物を培養して得られた培養液由来のものである［９］又は［１０］に記載の製造方法。
本発明によれば、式（I）の化合物は、優れたビフィズス菌増殖作用を有するので、腸
内フローラを改善し、便秘や下痢の予防や改善、大腸がんの予防に有効である。
また本願の化合物は、ビフィズス菌を増やし免疫を活性化・調整する効果があるため、花粉症の予防や改善、アトピー性皮膚炎の改善、ガン予防、コレステロールの低下、高血圧の改善に有効である。
さらに本発明によれば、骨粗鬆症等の予防または改善に有効である。
また本発明によれば、飲食品等を製造する際には、煩雑な工程を経ることなく簡便に添加することができ、また飲食品の風味や味に影響を与える抗酸化剤等を添加することなく製造することができる。
本発明によれば、分解せずに大腸に到達するので、少ない用量でのDHNAの投与が可能になり、小児や老人等にも服用しやすく安全に投与することができる。
内フローラを改善し、便秘や下痢の予防や改善、大腸がんの予防に有効である。
また本願の化合物は、ビフィズス菌を増やし免疫を活性化・調整する効果があるため、花粉症の予防や改善、アトピー性皮膚炎の改善、ガン予防、コレステロールの低下、高血圧の改善に有効である。
さらに本発明によれば、骨粗鬆症等の予防または改善に有効である。
また本発明によれば、飲食品等を製造する際には、煩雑な工程を経ることなく簡便に添加することができ、また飲食品の風味や味に影響を与える抗酸化剤等を添加することなく製造することができる。
本発明によれば、分解せずに大腸に到達するので、少ない用量でのDHNAの投与が可能になり、小児や老人等にも服用しやすく安全に投与することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本願発明は、式（Ｉ）：
本願発明は、式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は生体内で酵素により加水分解し得る基であり；Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が水素原子ではない。］
で表される化合物又はその塩（以下本発明の化合物又は化合物（Ｉ）ともいう）に関する。
で表される化合物又はその塩（以下本発明の化合物又は化合物（Ｉ）ともいう）に関する。
本明細書中のＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は生体内で酵素により加水分解し得る基（以下特定の基と略す時もある）を示し、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が水素原子ではない。
生体内で酵素により加水分解し得る基とは、化合物（Ｉ）を投与した場合に生体内の酵素により加水分解されれば特に限定されないが、通常は、
生体内で酵素により加水分解し得る基とは、化合物（Ｉ）を投与した場合に生体内の酵素により加水分解されれば特に限定されないが、通常は、
［式中、＊は結合部位を示す。］
等のグリコシル基（単糖配糖体、二糖配糖体、オリゴ糖配糖体）、又は
等のグリコシル基（単糖配糖体、二糖配糖体、オリゴ糖配糖体）、又は
［式中、＊は結合部位を示す。］
等のオキソ酸基等であり、
等のオキソ酸基等であり、
［式中、＊は結合部位を示す。］
が好ましく、
が好ましく、
［式中、＊は結合部位を示す。］
がより好ましい。
がより好ましい。
生体内の酵素としては、腸内に存在する酵素が挙げられる。例えば硫酸エステル化された化合物（ＤＨＮＡＳ）を加水分解するスルファターゼ、β−グルクロン酸化された化合物（ＤＨＮＡＧ）を加水分解するβ−グルクロニダーゼ、同様にリン酸エステル化された化合物（ＤＨＮＡＰ）を加水分解するホスファターゼ、β−グルコシル化されたＤＨＮＡを加水分解するβ−グルコシダーゼ、β−ガラクトシル化されたＤＨＮＡを加水分解するβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。なかでもスルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、ホスファターゼが好ましく、スルファターゼおよびβ−グルクロニダーゼがより好ましい。
また上記酵素は、細菌、真菌、植物、動物由来のものであってもよいが、ヒトなど動物の体内にある酵素が好ましい。
化合物（Ｉ）においては、Ｒ１及びＲ２がどちらも特定の基であってもよく、Ｒ１及びＲ２が同じであっても異なっていてもよい。
またＲ１及びＲ２のいずれかが特定の基であってもよい。この場合には、特に限定されないが、１位の−ＯＨは２位の−ＣＯＯＨとの水素結合により不活性となっているため、合成の容易さの観点から、Ｒ２が特定の基であることが好ましい。
またＲ１及びＲ２のいずれかが特定の基であってもよい。この場合には、特に限定されないが、１位の−ＯＨは２位の−ＣＯＯＨとの水素結合により不活性となっているため、合成の容易さの観点から、Ｒ２が特定の基であることが好ましい。
式（Ｉ）で表される化合物の好適な具体例としては、
で表される化合物等が挙げられ、
より好ましくは、
より好ましくは、
であり、さらに好ましくは、
である。
式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、薬理学的に許容しうる塩等が挙げられ、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等との金属塩；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン等の有機塩基との塩；トリフルオロ酢酸、酢酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ケイ皮酸、フマル酸、ホスホン酸、塩酸、硝酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、スルファミン酸、硫酸等の酸との酸付加塩等が挙げられる。
式（Ｉ）で表される化合物は、結晶であってもよい。
式（Ｉ）で表される化合物の結晶は、式（Ｉ）で表される化合物に自体公知の結晶化法を適用して結晶化することによって製造することができる。式（Ｉ）で表される化合物が結晶である場合、結晶形が単一であっても結晶形混合物であっても式（Ｉ）で表される化合物に包含される。
式（Ｉ）で表される化合物の結晶は、式（Ｉ）で表される化合物に自体公知の結晶化法を適用して結晶化することによって製造することができる。式（Ｉ）で表される化合物が結晶である場合、結晶形が単一であっても結晶形混合物であっても式（Ｉ）で表される化合物に包含される。
式（Ｉ）で表される化合物は、同位元素（例、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ等）等で標識されていてもよい。
さらに式（Ｉ）で表される化合物は、水和物であっても、非水和物であっても、無溶媒和物であっても、溶媒和物であってもよい。
さらに、１Ｈを２Ｈ（Ｄ）に変換した重水素変換体も、式（Ｉ）で表される化合物に包含される。
さらに式（Ｉ）で表される化合物は、水和物であっても、非水和物であっても、無溶媒和物であっても、溶媒和物であってもよい。
さらに、１Ｈを２Ｈ（Ｄ）に変換した重水素変換体も、式（Ｉ）で表される化合物に包含される。
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、化学合成法、動物や植物に由来する天然のもの、発酵法又は遺伝子組換法によって得られるもののいずれを使用してもよい。
化合物（Ｉ）は、公知の化学合成法を用いて製造することができる。
例えば、Ｒ１および／またはＲ２がオキソ酸基である化合物（Ｉ）は、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を、硫酸化剤やリン酸化剤等の公知のオキソ酸エステル化剤と反応させることにより得ることができる。
硫酸化剤としては、例えば、トリメチルアミン三酸化硫黄錯体、トリエチルアミン三酸化硫黄錯体、ジメチルホルムアミド三酸化硫黄錯体、ピリジン三酸化硫黄錯体、クロロスルホン酸などが用いられる。
リン酸化剤としては、例えば、無水リン酸、オルトリン酸、ポリリン酸、五酸化リンなどが用いられる。
硫酸化剤やリン酸化剤等の公知のオキソ酸エステル化剤の使用量は、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に対して、通常１モル当量から１０モル当量である。
上記反応は、通常、溶媒中で行う。溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが用いられ、反応温度は、通常、０℃〜１００℃であり、反応時間は、通常、０．１〜２４時間である。
硫酸化剤としては、例えば、トリメチルアミン三酸化硫黄錯体、トリエチルアミン三酸化硫黄錯体、ジメチルホルムアミド三酸化硫黄錯体、ピリジン三酸化硫黄錯体、クロロスルホン酸などが用いられる。
リン酸化剤としては、例えば、無水リン酸、オルトリン酸、ポリリン酸、五酸化リンなどが用いられる。
硫酸化剤やリン酸化剤等の公知のオキソ酸エステル化剤の使用量は、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に対して、通常１モル当量から１０モル当量である。
上記反応は、通常、溶媒中で行う。溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが用いられ、反応温度は、通常、０℃〜１００℃であり、反応時間は、通常、０．１〜２４時間である。
一方、例えば、Ｒ１および／またはＲ２がβ−グリコシル基である化合物（Ｉ）は、公知の糖分子に対して、１位のヒドロキシ基を脱離基とし、その他の活性基（ヒドロキシ基、カルボキシ基）に保護基を導入した保護糖フラグメントを、ルイス酸や金属塩等の活性化剤の存在下、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸のカルボン酸保護体と反応させることによりグリコシル化反応に付し、得られた生成物を公知の方法で脱保護することにより得ることができる。
脱離基としては、例えば、ハロゲン原子、アセチルオキシ基、イミデート基、アルコキシ基、アルキルスルファニル基、フェニルスルファニル基、ピリジルスルファニル基等が挙げられる。
ヒドロキシ基の保護基としては、例えば、アセチル基やベンゾイル基のようなアシル基等が挙げられる。カルボキシ基の保護基としては、例えば、ｔｅｒｔ−ブチル基やメチル基のようなアルキル基が挙げられる。
保護糖フラグメントは、市販のものを用いてもよいし、公知の方法により得ることもできる。
保護糖フラグメントの使用量は、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸のカルボン酸保護体に対して、通常０．１モル当量から１０モル当量である。
１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸のカルボン酸保護体としては、例えば、上記で示したカルボキシ基の保護基で保護されたものが挙げられ、具体的には、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸ｔｅｒｔ−ブチル、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸メチル等が挙げられる。また、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸のカルボン酸保護体は、必要に応じて、さらに一方のヒドロキシ基を保護しているものを用いてもよい。
活性化剤としては、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸銀、酸化銀、炭酸銀、過塩素酸銀、塩化第一銀、臭化第一銀、ヨウ化第一銀、ケイ酸銀、四フッ化ホウ素酸銀、銀ゼオライト、塩化第一スズ、臭化第一スズ、ヨウ化第一スズ、塩化第二スズ、臭化第二スズ、ヨウ化第二スズ、臭化テトラエチルアンモニウムや塩化テトラエチルアンモニウム、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート、エーテル性三フッ化ホウ素、四フッ化ケイ素等が挙げられる。
活性化剤の使用量は、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸のカルボン酸保護体に対して、通常０．０１モル当量から１００モル当量である。
上記グリコシル化反応は、通常、溶媒中で行う。溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、ジエチルエーテル、ベンゼン、トルエン、アセトニトリルなどが用いられ、反応温度は、通常、０℃〜１００℃であり、反応時間は、通常、０．１〜２４時間である。
上記グリコシル化で得られる生成物のα体とβ体の比は使用する試薬や反応条件により異なる。
上記グリコシル化で得られた生成物の脱保護反応は、上記で例示したような保護基を用いた場合、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムやナトリウムメトキシドのような塩基で処理することにより容易に行うことができる。塩基の使用量は、グリコシル化で得られた生成物に対して、通常０．０１モル当量から過剰量である。
脱保護反応は、通常、溶媒中で行う。溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどが用いられ、反応温度は、通常、０℃〜１００℃であり、反応時間は、通常、０．１〜２４時間である。
脱離基としては、例えば、ハロゲン原子、アセチルオキシ基、イミデート基、アルコキシ基、アルキルスルファニル基、フェニルスルファニル基、ピリジルスルファニル基等が挙げられる。
ヒドロキシ基の保護基としては、例えば、アセチル基やベンゾイル基のようなアシル基等が挙げられる。カルボキシ基の保護基としては、例えば、ｔｅｒｔ−ブチル基やメチル基のようなアルキル基が挙げられる。
保護糖フラグメントは、市販のものを用いてもよいし、公知の方法により得ることもできる。
保護糖フラグメントの使用量は、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸のカルボン酸保護体に対して、通常０．１モル当量から１０モル当量である。
１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸のカルボン酸保護体としては、例えば、上記で示したカルボキシ基の保護基で保護されたものが挙げられ、具体的には、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸ｔｅｒｔ−ブチル、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸メチル等が挙げられる。また、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸のカルボン酸保護体は、必要に応じて、さらに一方のヒドロキシ基を保護しているものを用いてもよい。
活性化剤としては、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸銀、酸化銀、炭酸銀、過塩素酸銀、塩化第一銀、臭化第一銀、ヨウ化第一銀、ケイ酸銀、四フッ化ホウ素酸銀、銀ゼオライト、塩化第一スズ、臭化第一スズ、ヨウ化第一スズ、塩化第二スズ、臭化第二スズ、ヨウ化第二スズ、臭化テトラエチルアンモニウムや塩化テトラエチルアンモニウム、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート、エーテル性三フッ化ホウ素、四フッ化ケイ素等が挙げられる。
活性化剤の使用量は、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸のカルボン酸保護体に対して、通常０．０１モル当量から１００モル当量である。
上記グリコシル化反応は、通常、溶媒中で行う。溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、ジエチルエーテル、ベンゼン、トルエン、アセトニトリルなどが用いられ、反応温度は、通常、０℃〜１００℃であり、反応時間は、通常、０．１〜２４時間である。
上記グリコシル化で得られる生成物のα体とβ体の比は使用する試薬や反応条件により異なる。
上記グリコシル化で得られた生成物の脱保護反応は、上記で例示したような保護基を用いた場合、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムやナトリウムメトキシドのような塩基で処理することにより容易に行うことができる。塩基の使用量は、グリコシル化で得られた生成物に対して、通常０．０１モル当量から過剰量である。
脱保護反応は、通常、溶媒中で行う。溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどが用いられ、反応温度は、通常、０℃〜１００℃であり、反応時間は、通常、０．１〜２４時間である。
上記の方法により得られた化合物は、公知の分離精製手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、溶媒抽出、晶出、再結晶、転溶、クロマトグラフィーなどにより、反応液から単離精製して次の反応に用いてもよい。
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の製造のための出発物質である１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸やその保護体は、市販のものを用いてもよいし、公知の方法により得ることもできる
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、微生物や植物組織を培養して得られる培養液由来のものも本発明に含まれる。硫酸転移酵素（sulfotransferase, ST）やＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（UDP-glucuronosyltransferase,UGT）等を発現している培養微生物の
培地からＤＨＮＡＳ、ＤＨＮＡＧ等は単離可能である。またＤＨＮＡを培地に添加することによりＤＨＮＡＳやＤＨＮＡＧ等を高収量で得ることが可能である。更にグリコシルトランスフェラーゼ（グルコシル化、ガラクトシル化、グルクロニル化等に関わる酵素）を発現している植物の組織培養培地にＤＨＮＡを添加するとグリコシル−ＤＨＮＡが得られる。
ＤＨＮＡを産生する菌としては、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属菌
、エンテロバクター（Enterobacter）属菌、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）属菌、バチルス（Bacillus）属菌等が挙げられるが、これらにSTあるいはUGT発現ベク
ターを導入することによりＤＨＮＡＳやＤＨＮＡＧ等は高収量で得られる。なかでもプロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属菌を用いることが好ましい。更にＤＨＮＡ
産生株とＳＴ、ＵＧＴ発現株あるいはグリコシルトランスフェラーゼ発現細胞株との混合培養によっても上記化合物は得られる。
培地からＤＨＮＡＳ、ＤＨＮＡＧ等は単離可能である。またＤＨＮＡを培地に添加することによりＤＨＮＡＳやＤＨＮＡＧ等を高収量で得ることが可能である。更にグリコシルトランスフェラーゼ（グルコシル化、ガラクトシル化、グルクロニル化等に関わる酵素）を発現している植物の組織培養培地にＤＨＮＡを添加するとグリコシル−ＤＨＮＡが得られる。
ＤＨＮＡを産生する菌としては、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属菌
、エンテロバクター（Enterobacter）属菌、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）属菌、バチルス（Bacillus）属菌等が挙げられるが、これらにSTあるいはUGT発現ベク
ターを導入することによりＤＨＮＡＳやＤＨＮＡＧ等は高収量で得られる。なかでもプロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属菌を用いることが好ましい。更にＤＨＮＡ
産生株とＳＴ、ＵＧＴ発現株あるいはグリコシルトランスフェラーゼ発現細胞株との混合培養によっても上記化合物は得られる。
植物の組織培養は常法に準じて実施される。
植物の組織としては、グリコシルトランスフェラーゼを発現している植物であれば限定されず、例えばタバコ、シロイヌナズナ、ユーカリ、ヨウシュヤマゴボウ、ニチニチソウ等の組織が挙げられる。
植物の組織培養に用いられる培地は、通常この分野で既知の培地が使用される。
培地に含有される成分としては、炭素源としては通常植物組織の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等が用いられ、窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム 硝酸塩等が使用される。
燐酸、カリウム源としては燐酸カリウム、燐酸アンモニウム、塩化カリウム等が用いられる。その他微量金属としては、Ｍｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｚｎ等の無機塩が有効である。さらに必要に応じて、コーンスチープリカー、カゼイン、酵母エキス、ペプトン等の有機物を添加しても良い。
例えば、培地としては、ＭＳ培地、Ｋａｎｏ培地、Ｂ５培地などが挙げられる。
また上記培地を改変した培地であってもよい。
植物の組織としては、グリコシルトランスフェラーゼを発現している植物であれば限定されず、例えばタバコ、シロイヌナズナ、ユーカリ、ヨウシュヤマゴボウ、ニチニチソウ等の組織が挙げられる。
植物の組織培養に用いられる培地は、通常この分野で既知の培地が使用される。
培地に含有される成分としては、炭素源としては通常植物組織の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等が用いられ、窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム 硝酸塩等が使用される。
燐酸、カリウム源としては燐酸カリウム、燐酸アンモニウム、塩化カリウム等が用いられる。その他微量金属としては、Ｍｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｚｎ等の無機塩が有効である。さらに必要に応じて、コーンスチープリカー、カゼイン、酵母エキス、ペプトン等の有機物を添加しても良い。
例えば、培地としては、ＭＳ培地、Ｋａｎｏ培地、Ｂ５培地などが挙げられる。
また上記培地を改変した培地であってもよい。
植物の組織培養培地に添加するDHNAの量は、例えば培地に対して、最終濃度が100〜400μＭとなるように添加する。
また添加するDHNAは、上記DHNAを産生する菌を慣用の方法で培養し、当該菌にDHNAを産生させ、その培養液をそのまま植物の組織培養培地に添加してもよい。培養条件等はFuruichi K, et al., Enhancement of 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid production by Propionibacterium freudenreichii ET-3 fed-batch culture, Appl Environ Microbiol,73, 3137-3143 (2007)に記載に準じる。
また添加するDHNAは、上記DHNAを産生する菌を慣用の方法で培養し、当該菌にDHNAを産生させ、その培養液をそのまま植物の組織培養培地に添加してもよい。培養条件等はFuruichi K, et al., Enhancement of 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid production by Propionibacterium freudenreichii ET-3 fed-batch culture, Appl Environ Microbiol,73, 3137-3143 (2007)に記載に準じる。
培地のｐＨは中性または弱塩基性、弱酸性でよい。通常、ｐＨ４．５〜６．５である。
培養温度は、通常６〜３５℃、好ましくは２０〜３５℃、より好ましくは２５〜３２℃である。６〜３５℃の温度条件下においては、植物の組織培養に望ましい。
当該培養に先立って前培養を行うことが好ましい。
本培養の培養時間は、前培養液の細胞濃度や本培養の培地の量に対する前培養液の液量により変わりうるが、対数増殖期に入った後新しい培地およびDHNAを加え１５〜２４時間程度である。培養は静置または振盪、攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続培養法により実施される。
培養終了後、植物組織や培養液から、慣用の方法により抽出・精製し、上記化合物（I
）又はその塩を得る。
またＤＨＮＡ投与動物の尿からＤＨＮＡＳやＤＨＮＡＧ等を得る方法が可能である。
）又はその塩を得る。
またＤＨＮＡ投与動物の尿からＤＨＮＡＳやＤＨＮＡＧ等を得る方法が可能である。
本発明の化合物（I）又はその塩を含有してなる医薬も本発明に包含される（以下本発
明の医薬ともいう）。
本発明の医薬は、本発明の化合物（I）又はその塩をそのままあるいは薬理学的に許容
される担体を配合し、経口的又は非経口的に投与することができる。
明の医薬ともいう）。
本発明の医薬は、本発明の化合物（I）又はその塩をそのままあるいは薬理学的に許容
される担体を配合し、経口的又は非経口的に投与することができる。
本発明の医薬は、経口投与する場合の剤形としては、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、マイクロカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられ、また、非経口投与する場合の剤形としては、例えば注射剤、注入剤、点滴剤、坐剤等が挙げられる。また、適当な基剤と組み合わせ、徐放性製剤とすることも有効である。
本発明の医薬を上記の剤形に製造する方法としては、当該分野で一般的に用いられている公知の製造方法を適用することができる。また、上記の剤形に製造する場合には、必要に応じて、その剤形に製する際に製剤分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤等を適宜、適量を含有させて製造することができる。
例えば、本発明の医薬を錠剤に製する場合には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を含有させて製造することができ、丸剤及び顆粒剤に製する場合には、賦形剤、結合剤、崩壊剤等を含有させて製造することができる。また、散剤及びカプセル剤に製する場合には賦形剤等を、シロップ剤に製する場合には甘味剤等を、乳剤又は懸濁剤に製する場合には懸濁化剤、界面活性剤、乳化剤等を含有させて製造することができる。
賦形剤の例としては、乳糖、白糖、ブドウ糖、でんぷん、蔗糖、微結晶セルロース、カンゾウ末、マンニトール、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム等が挙げられる。
結合剤の例としては、５ないし１０重量％デンプンのり液、１０ないし２０重量％アラビアゴム液又はゼラチン液、１ないし５重量％トラガント液、カルボキシメチルセルロース液、アルギン酸ナトリウム液、グリセリン等が挙げられる。
崩壊剤の例としては、でんぷん、炭酸カルシウム等が挙げられる。
滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、精製タルク等が挙げられる。
甘味剤の例としては、ブドウ糖、果糖、転化糖、ソルビトール、キシリトール、グリセリン、単シロップ等が挙げられる。
界面活性剤の例としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ソルビタンモノ脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル４０等が挙げられる。
懸濁化剤の例としては、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ベントナイト等が挙げられる。
乳化剤の例としては、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ポリソルベート８０等が挙げられる。
更に、本発明の医薬を上記の剤形に製造する場合には、所望により、製剤分野において通常用いられる着色剤、保存剤、芳香剤、矯味剤、安定剤、粘稠剤等を適量、添加することができる。
本発明の医薬を経口投与する場合の投与量は、投与する患者の性別、症状、年齢、投与方法によって異なるが、通常、成人体重１ｋｇあたりの本発明の化合物の１日の投与量は、０．００３μｇ〜３μｇであり、好ましくは０．０３μｇ〜３μｇ、より好ましくは０．１μｇ〜１μｇである。上記１日あたりの量を一度にもしくは数回に分けて投与することができる。食前、食後、食間を問わないが食前が好ましい。また投与期間は特に限定されない。
本発明の医薬を非経口的に投与する場合は、通常、液剤（例えば注射剤）の形で投与する。その１回投与量は投与対象、症状、投与方法等によっても異なるが、例えば注射剤の形にして、上記経口投与量を勘案して適量を静脈注射により投与することができる。
注射剤としては、静脈注射剤のほか、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等が含まれ、また持続性製剤としては、イオントフォレシス経皮剤等が含まれる。かかる注射剤は自体公知の方法、すなわち、本発明の化合物を無菌の水性液もしくは油性液に溶解、懸濁又は乳化することによって調製される。
注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（例えばエタノール）、ポリアルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。
油性液としては、ゴマ油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）等と配合してもよい。
注射剤としては、静脈注射剤のほか、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等が含まれ、また持続性製剤としては、イオントフォレシス経皮剤等が含まれる。かかる注射剤は自体公知の方法、すなわち、本発明の化合物を無菌の水性液もしくは油性液に溶解、懸濁又は乳化することによって調製される。
注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（例えばエタノール）、ポリアルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。
油性液としては、ゴマ油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）等と配合してもよい。
本発明の医薬を経皮吸収型外用剤として投与（適用）する場合には、必要に応じて公知の添加剤等を混合して常法により、クリーム剤、液剤、ローション剤、乳剤、チンキ剤、軟膏剤、水性ゲル剤、油性ゲル剤、エアゾール剤、パウダー剤、シャンプー、石鹸等の外用製剤等とすることができる。
本発明の化合物は、そのままであるいは適当な添加剤を加えて医薬部外品等とすることができる。
本発明の化合物は、そのままであるいは適当な添加剤を加えて医薬部外品等とすることができる。
上記外用剤には、上記成分の他に水溶性成分、油性成分、粉末成分、界面活性剤、高分子成分、増粘剤、粘着性改良剤、被膜形成剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、賦形剤、保湿剤、皮膚保護剤、清涼化剤、香料、着色剤、キレート剤、潤沢剤、鎮痒剤、血行促進剤、収斂剤、組織修復促進剤、制汗剤、植物抽出成分、動物抽出成分、化粧品や医薬部外品等に必要な添加剤等を必要に応じて配合することができる。
本発明の医薬はビフィズス菌増殖剤又は腸内フローラ改善剤として、哺乳動物（例、ヒト、サル、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギ等）に対し有用である。
本発明のビフィズス菌増殖剤は、腸内ビフィズス菌量を増加させることができ、それにより、便秘や下痢の予防や改善、大腸がんの予防に有効であり、便秘の予防や改善に好ましく適用される。
また本発明の腸内フローラ改善剤は、腸内フローラを改善し、免疫を活性化・調整し、花粉症の予防や改善、アトピー性皮膚炎の改善、ガン予防、コレステロールの低下、高血圧の改善に有効である。
腸内フローラとは、ヒトなどの哺乳動物の腸管内において絶えず増殖を続けている多種・多様な細菌が集まって複雑な微生物生態系を構築している、この微生物群集を意味し、「腸内フローラ改善」とは、ヒトに有害な働きをする菌（悪玉菌）を劣勢に保ち、ヒトに有用な働きをする菌（善玉菌）を優勢にすることを意味する。
また本発明の腸内フローラ改善剤は、腸内フローラを改善し、免疫を活性化・調整し、花粉症の予防や改善、アトピー性皮膚炎の改善、ガン予防、コレステロールの低下、高血圧の改善に有効である。
腸内フローラとは、ヒトなどの哺乳動物の腸管内において絶えず増殖を続けている多種・多様な細菌が集まって複雑な微生物生態系を構築している、この微生物群集を意味し、「腸内フローラ改善」とは、ヒトに有害な働きをする菌（悪玉菌）を劣勢に保ち、ヒトに有用な働きをする菌（善玉菌）を優勢にすることを意味する。
本発明の化合物は、該化合物の作用の増強又は該化合物の投与量の低減等を目的として、整腸剤、消化薬、止瀉薬、抗アレルギー剤、抗炎症剤、抗ヒスタミン薬等の薬剤と組み合わせて用いることができる。この際、本発明の化合物と併用薬剤の投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。さらに、本発明の化合物と併用薬剤とは、それぞれの活性成分を含む２種類の製剤として投与されてもよいし、両方の活性成分を含む単一の製剤として投与されてもよい。
本発明の化合物又はその塩を含む食品も本発明に包含される（以下本発明の食品ともいう）。本発明の食品においては、ＤＨＮＡＳ、ＤＨＮＡＧ、グルコシル−ＤＨＮＡ（ＤＨＮＡｇ）等を産生する菌または細胞を培養して得られる培養液のみからなる食品であってよい。
本発明の食品は、本発明の化合物を含む一般的な食品形態であれば如何なるものでも良い。例えば、それ自体、又はそれに適当な風味を加えてドリンク剤、例えば清涼飲料、粉末飲料とすることもできる。具体的には、ジュース、牛乳、菓子、ゼリー等に混ぜて飲食することができる。また、このような食品を保健機能食品として提供することも可能である。この保健機能食品には、ビフィズス菌増殖や腸内フローラ改善等の本発明の用途に用いるものであるという表示を付した飲食品、特に、特定保健用食品、栄養機能食品等も含まれる。
さらに、本発明の食品を食品補助剤として利用することも可能である。食品補助剤として使用する場合、例えば錠剤、カプセル、散剤、顆粒、懸濁剤、チュアブル剤、シロップ剤等の形態に調製することができる。本発明における食品補助剤とは、食品として摂取されるもの以外に栄養を補助する目的で摂取されるものをいい、栄養補助剤、ダイエタリーサプリメント等もこれに含まれる。
本発明の化合物を食品として摂取する場合、成人体重１ｋｇあたりの本発明の化合物の１日の摂取量は、０．００３μｇ〜３μｇであり、好ましくは０．０３μｇ〜３μｇ、より好ましくは０．１μｇ〜１μｇである。
上記の量を１日１回から数回に分けて食前に摂取することが好ましい。この場合、１日あたり摂取量、又は１回あたりの摂取量を１単位包装とすることができる。
上記の量を１日１回から数回に分けて食前に摂取することが好ましい。この場合、１日あたり摂取量、又は１回あたりの摂取量を１単位包装とすることができる。
植物の組織培養培地にDHNAを添加し培養することを特徴とする上記式（Ｉ）で表される化合物の製造方法も本発明に包含される。植物の組織は、グリコシルトランスフェラーゼを発現しているものが好ましい。各種定義は既述に準じる。
植物の組織培養培地に１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）を添加し培養することにより得られる上記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩も本発明に包含される。各種定義は既述に準じる。
以下、製造例及び試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、試験例等は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を限定するものではない。
（製造例１）ＤＨＮＡＳ・Ｎａ（上記式（ａ１）で表される化合物のＮａ塩）の合成方法
２００ｍＬの四つ口コルベンを用いてアルゴン雰囲気下、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（東京化成）（１０．３５ｇ、５０．６９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５０ｍＬ）に、ピリジン−三酸化硫黄コンプレックス（和光純薬）（１０．７２ｇ、６７．３５ｍｍｏｌ）を添加し、内温２５〜２８℃で４時間撹拌した。この反応液をそのまま、バス温４５℃で減圧濃縮し、得られた残渣にＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ（５／１ｖ／ｖ）（１００ｍＬ）を加え、均一な溶液にした。溶液を氷冷し、析出した固体をろ取、冷ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ（５／１ｖ／ｖ）（２０ｍＬ，ｘ２）で洗浄後、減圧乾燥し、ＤＨＮＡＳの粗体を得た。この粗体を精製水（５０ｍＬ）に懸濁し、撹拌下、均一溶液になるまで飽和重曹水を添加した。活性炭（２ｇ）を添加し、３０分間撹拌後、ろ別した。ろ液を予め調製した強酸性陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０Ｗｘ８（Ｎａ）（５００ｍＬ）を用いて、水で溶出した。目的物を含むフラクションを集め、バス温４５℃にて減圧濃縮した。得られた残渣にＥｔＯＨ−トルエンを添加後、減圧濃縮する操作を２回実施した。残渣にアセトン（５０ｍＬ）を添加し、４０℃にて３０分間加温懸濁後、氷冷した。析出した個体をろ取、アセトン（１０ｍＬ，ｘ２）で洗浄後、５０℃にて減圧乾燥し、ＤＨＮＡＳ・Ｎａのアセトン１：１付加体を白色個体として１３．５４ｇ（収率７３％）単離した。アセトン付加体（１３．５３ｇ）を水（３００ｍＬ）に溶解後、減圧濃縮した。得られた水溶液を凍結乾燥し、ＤＨＮＡＳ・Ｎａを淡褐色固体として１１．６１ｇ（収率７３％）得た（ＨＰＬＣによる検定、純度＞９９．９％）。
得られたＤＨＮＡＳ・ＮａのUVスペクトルを図1に示す。UVスペクトルはメタノール(12%）、アセトニトリル(20%)、およびギ酸アンモニウム（8mM）を含む水溶液を溶媒として
使用して測定した。
得られたＤＨＮＡＳ・ＮａのNMRデータを表１及び表２に示す。シグナルの帰属はcorrelation spectroscopy (COSY)、heteronuclear multiple bond correlation (HMBC)等の二次元NMR法により行った。硫酸エステルの結合位置（C-1 またはC-4）については、シュミレーションソフトでC-4の13C化学シフトを計算したところC-4位に付いた値（136.5ppm）
の方がC-1に付いた値（149.7ppm）より実測値（137.8ppm）に近いことからC-4に結合していると判断した。
得られたDHNAS・Naのマススペクトル；FAB Mass（ネガティブモード）によりM-Hのピークが305 [DHNAS・Na(MW=306)-1=305] に観察された。
２００ｍＬの四つ口コルベンを用いてアルゴン雰囲気下、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（東京化成）（１０．３５ｇ、５０．６９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５０ｍＬ）に、ピリジン−三酸化硫黄コンプレックス（和光純薬）（１０．７２ｇ、６７．３５ｍｍｏｌ）を添加し、内温２５〜２８℃で４時間撹拌した。この反応液をそのまま、バス温４５℃で減圧濃縮し、得られた残渣にＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ（５／１ｖ／ｖ）（１００ｍＬ）を加え、均一な溶液にした。溶液を氷冷し、析出した固体をろ取、冷ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ（５／１ｖ／ｖ）（２０ｍＬ，ｘ２）で洗浄後、減圧乾燥し、ＤＨＮＡＳの粗体を得た。この粗体を精製水（５０ｍＬ）に懸濁し、撹拌下、均一溶液になるまで飽和重曹水を添加した。活性炭（２ｇ）を添加し、３０分間撹拌後、ろ別した。ろ液を予め調製した強酸性陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０Ｗｘ８（Ｎａ）（５００ｍＬ）を用いて、水で溶出した。目的物を含むフラクションを集め、バス温４５℃にて減圧濃縮した。得られた残渣にＥｔＯＨ−トルエンを添加後、減圧濃縮する操作を２回実施した。残渣にアセトン（５０ｍＬ）を添加し、４０℃にて３０分間加温懸濁後、氷冷した。析出した個体をろ取、アセトン（１０ｍＬ，ｘ２）で洗浄後、５０℃にて減圧乾燥し、ＤＨＮＡＳ・Ｎａのアセトン１：１付加体を白色個体として１３．５４ｇ（収率７３％）単離した。アセトン付加体（１３．５３ｇ）を水（３００ｍＬ）に溶解後、減圧濃縮した。得られた水溶液を凍結乾燥し、ＤＨＮＡＳ・Ｎａを淡褐色固体として１１．６１ｇ（収率７３％）得た（ＨＰＬＣによる検定、純度＞９９．９％）。
得られたＤＨＮＡＳ・ＮａのUVスペクトルを図1に示す。UVスペクトルはメタノール(12%）、アセトニトリル(20%)、およびギ酸アンモニウム（8mM）を含む水溶液を溶媒として
使用して測定した。
得られたＤＨＮＡＳ・ＮａのNMRデータを表１及び表２に示す。シグナルの帰属はcorrelation spectroscopy (COSY)、heteronuclear multiple bond correlation (HMBC)等の二次元NMR法により行った。硫酸エステルの結合位置（C-1 またはC-4）については、シュミレーションソフトでC-4の13C化学シフトを計算したところC-4位に付いた値（136.5ppm）
の方がC-1に付いた値（149.7ppm）より実測値（137.8ppm）に近いことからC-4に結合していると判断した。
得られたDHNAS・Naのマススペクトル；FAB Mass（ネガティブモード）によりM-Hのピークが305 [DHNAS・Na(MW=306)-1=305] に観察された。
（製造例２）ＤＨＮＡＧ（上記式（ｃ１）で表される化合物）の製造方法
ＩＣＲ系統の雌マウス（７週齢）１匹に、６０ｍｇ／２００μＬ（２３３５ｍｇ／Ｋｇ（１％ｔｗｅｅｎ８０水溶液））のＤＨＮＡを経口単回投与した後、代謝ケージに移し投与後２４時間ごとに３日目まで尿、糞を採取し代謝排泄物を得た。代謝排泄物を分析し、図３に示すように、Ｍ１を分取しＤＨＮＡＧを得た。
得られたＤＨＮＡＧのＵＶスペクトルを図１に示す。ＵＶスペクトルはメタノール（１２％）、アセトニトリル（２０％）、およびギ酸アンモニウム（８ｍＭ）を含む水溶液を溶媒として使用して測定した。
得られたＤＨＮＡＧのＮＭＲデータを表１及び表２に示す。
なおシグナルの帰属はｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ （ＣＯＳＹ）、ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂｏｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ（ＨＭＢＣ）等の二次元ＮＭＲ法により行った。ＨＭＢＣにおいてＨ−１’はＣ−４と相関が現れているのでグルクロニル基の結合位置はＣ−４と決定した。
ＩＣＲ系統の雌マウス（７週齢）１匹に、６０ｍｇ／２００μＬ（２３３５ｍｇ／Ｋｇ（１％ｔｗｅｅｎ８０水溶液））のＤＨＮＡを経口単回投与した後、代謝ケージに移し投与後２４時間ごとに３日目まで尿、糞を採取し代謝排泄物を得た。代謝排泄物を分析し、図３に示すように、Ｍ１を分取しＤＨＮＡＧを得た。
得られたＤＨＮＡＧのＵＶスペクトルを図１に示す。ＵＶスペクトルはメタノール（１２％）、アセトニトリル（２０％）、およびギ酸アンモニウム（８ｍＭ）を含む水溶液を溶媒として使用して測定した。
得られたＤＨＮＡＧのＮＭＲデータを表１及び表２に示す。
なおシグナルの帰属はｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ （ＣＯＳＹ）、ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂｏｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ（ＨＭＢＣ）等の二次元ＮＭＲ法により行った。ＨＭＢＣにおいてＨ−１’はＣ−４と相関が現れているのでグルクロニル基の結合位置はＣ−４と決定した。
（製造例３）ＤＨＮＡｇ（上記式（ｄ１）で表される化合物）の製造方法
タバコＢＹ−２細胞（理研バイオリソースセンターから入手；培養はpH5.5以外は同セ
ンター指定のBY-2培養法に従った）懸濁液１ｍｌを３００ｍｌの三角フラスコを用いてＭＳ培地＊９５ｍｌに接種し２６．５℃で暗黒下、好気的に３日間振とう培養（１分間に１００回振とう）を行った。順調な増殖が確認されたところで更にＭＳ培地で２倍に希釈し１８時間培養した後、２５ｍｌを新たな２００ｍｌフラスコへ移し、ＭＳ培地を２５ｍl加え、同様の条件で６時間培養後、ＤＨＮＡ（東京化成）を２．０４ｍｇ添加した（ＤＨＮＡのＤＭＳＯ溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ添加、最終濃度２００μＭ）。１８時間培養後、培養液の一部を採取し遠心分離（１５万回転／分）後上清の２０μｌをＨＰＬＣ＊＊に注入しグルコシル−ＤＨＮＡ（保持時間１６．５分）を分析した（図５）。その結果、ＤＨＮＡから１０−１７％の収率でβ−グルコシル−ＤＨＮＡ（ＤＨＮＡｇ）が生成することが判明した（分子量はＦＡＢマスにより分子量３６６であることを確認；β−グルコシダーゼにより加水分解を受けることを確認）。ＤＨＮＡｇのＵＶスペクトルおよびＮＭＲデータを図１、表３及び４に示す。ＮＭＲのＨＭＢＣにおいてＨ−１’はＣ−４と相関が現れているのでグルコシル基の結合位置はＣ−４と決定した。
＊ＭＳ培地：Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ用混合塩類（ＷＡＫＯ）にショ糖（３０ｇ／ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（２００μｇ／ｍｌ）、ビタミン［Ｍｙｏ−イノシトール（１００μｇ／ｍｌ）、Ｔｈｉａｍｉｎ−ＨＣｌ（１μｇ／ｍｌ）］及び２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２００μｇ／ｌ）を加え、ｐＨ５．５に調整。
＊＊ＨＰＬＣ条件：カラム、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８，４．６ｘ２５０ｍｍ，５μｍ）；溶離、Ａ：１５％ＭｅＯＨ，１０ｍＭギ酸アンモニウム、Ｂ：アセトニトリル、Ａ→３０％Ｂ（２０ｍｉｎ）グラジエント；流速、１ｍｌ／ｍｉｎ；温度、４０℃
タバコＢＹ−２細胞（理研バイオリソースセンターから入手；培養はpH5.5以外は同セ
ンター指定のBY-2培養法に従った）懸濁液１ｍｌを３００ｍｌの三角フラスコを用いてＭＳ培地＊９５ｍｌに接種し２６．５℃で暗黒下、好気的に３日間振とう培養（１分間に１００回振とう）を行った。順調な増殖が確認されたところで更にＭＳ培地で２倍に希釈し１８時間培養した後、２５ｍｌを新たな２００ｍｌフラスコへ移し、ＭＳ培地を２５ｍl加え、同様の条件で６時間培養後、ＤＨＮＡ（東京化成）を２．０４ｍｇ添加した（ＤＨＮＡのＤＭＳＯ溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ添加、最終濃度２００μＭ）。１８時間培養後、培養液の一部を採取し遠心分離（１５万回転／分）後上清の２０μｌをＨＰＬＣ＊＊に注入しグルコシル−ＤＨＮＡ（保持時間１６．５分）を分析した（図５）。その結果、ＤＨＮＡから１０−１７％の収率でβ−グルコシル−ＤＨＮＡ（ＤＨＮＡｇ）が生成することが判明した（分子量はＦＡＢマスにより分子量３６６であることを確認；β−グルコシダーゼにより加水分解を受けることを確認）。ＤＨＮＡｇのＵＶスペクトルおよびＮＭＲデータを図１、表３及び４に示す。ＮＭＲのＨＭＢＣにおいてＨ−１’はＣ−４と相関が現れているのでグルコシル基の結合位置はＣ−４と決定した。
＊ＭＳ培地：Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ用混合塩類（ＷＡＫＯ）にショ糖（３０ｇ／ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（２００μｇ／ｍｌ）、ビタミン［Ｍｙｏ−イノシトール（１００μｇ／ｍｌ）、Ｔｈｉａｍｉｎ−ＨＣｌ（１μｇ／ｍｌ）］及び２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２００μｇ／ｌ）を加え、ｐＨ５．５に調整。
＊＊ＨＰＬＣ条件：カラム、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８，４．６ｘ２５０ｍｍ，５μｍ）；溶離、Ａ：１５％ＭｅＯＨ，１０ｍＭギ酸アンモニウム、Ｂ：アセトニトリル、Ａ→３０％Ｂ（２０ｍｉｎ）グラジエント；流速、１ｍｌ／ｍｉｎ；温度、４０℃
（製造例４）グリコシル化ＤＨＮＡの培養による製造方法
Furuichi K, et al., Enhancement of 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid production by Propionibacterium freudenreichii ET-3 fed-batch culture, Appl Environ Microbiol,73, 3137-3143 (2007)の方法に従い得られた、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属菌、エンテロバクター（Enterobacter）属菌、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）属菌、バチルス（Bacillus）属菌等の培養液をAmberlite XAD-2（Aldrich Chemical Company, Inc, USA）カラムへ導入し培養液中の低分子化合物を吸着させる。カラムを十分に脱イオン水で洗浄後、エタノールで低分子化合物を溶出する。得られたエタノール溶液を濃縮乾固し残渣をＤＭＳＯに溶解しその一定量を、タバコ、シロイヌナズナ、ユーカリ、ヨウシュヤマゴボウ、ニチニチソウ等の植物培養細胞の培地に添加する。１５〜２４時間の培養後、培養液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２カラムへ導入し生成したグリコシル化ＤＨＮＡを吸着させる。カラムを脱イオン水で十分洗浄後グリコシル化ＤＨＮＡを１０→６０％エタノールを含む水溶液でグラジエントにより（又は段階的にエタノール濃度を上げて）溶出する。β−グルコシル−ＤＨＮＡ化合物は４０〜６０％エタノール濃度で溶出される。
Furuichi K, et al., Enhancement of 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid production by Propionibacterium freudenreichii ET-3 fed-batch culture, Appl Environ Microbiol,73, 3137-3143 (2007)の方法に従い得られた、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属菌、エンテロバクター（Enterobacter）属菌、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）属菌、バチルス（Bacillus）属菌等の培養液をAmberlite XAD-2（Aldrich Chemical Company, Inc, USA）カラムへ導入し培養液中の低分子化合物を吸着させる。カラムを十分に脱イオン水で洗浄後、エタノールで低分子化合物を溶出する。得られたエタノール溶液を濃縮乾固し残渣をＤＭＳＯに溶解しその一定量を、タバコ、シロイヌナズナ、ユーカリ、ヨウシュヤマゴボウ、ニチニチソウ等の植物培養細胞の培地に添加する。１５〜２４時間の培養後、培養液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２カラムへ導入し生成したグリコシル化ＤＨＮＡを吸着させる。カラムを脱イオン水で十分洗浄後グリコシル化ＤＨＮＡを１０→６０％エタノールを含む水溶液でグラジエントにより（又は段階的にエタノール濃度を上げて）溶出する。β−グルコシル−ＤＨＮＡ化合物は４０〜６０％エタノール濃度で溶出される。
（試験例１）
ＤＨＮＡ、ＤＨＮＡＳ、ＤＨＮＡＧ及びＤＨＮＡｇの安定性の比較
ＤＨＮＡ、製造例１で得られたＤＨＮＡＳ、製造例２で得られたＤＨＮＡＧ及び製造例３で得られたＤＨＮＡｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）溶液および水に、最終濃度が２５μｇ／ｍｌとなるように添加して各溶液を調製した。各溶液を室温（２３℃）で放置し、時間を追ってＨＰＬＣによりＤＨＮＡ濃度を測定し、各化合物の分解を調べた。
ＤＨＮＡは各条件で２４時間以内に急速な分解が見られた（図２）。特にｐＨ７．４における分解は著しかった。
ＤＨＮＡＳ、ＤＨＮＡＧ及びＤＨＮＡｇについてはいずれの条件でも６日間の観察で分解はほとんど見られなかった。ＤＨＮＡの急速な分解とＤＨＮＡＳ、ＤＨＮＡＧ及びＤＨＮＡｇの安定性はTLCによっても確認された。
ＤＨＮＡ、ＤＨＮＡＳ、ＤＨＮＡＧ及びＤＨＮＡｇの安定性の比較
ＤＨＮＡ、製造例１で得られたＤＨＮＡＳ、製造例２で得られたＤＨＮＡＧ及び製造例３で得られたＤＨＮＡｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）溶液および水に、最終濃度が２５μｇ／ｍｌとなるように添加して各溶液を調製した。各溶液を室温（２３℃）で放置し、時間を追ってＨＰＬＣによりＤＨＮＡ濃度を測定し、各化合物の分解を調べた。
ＤＨＮＡは各条件で２４時間以内に急速な分解が見られた（図２）。特にｐＨ７．４における分解は著しかった。
ＤＨＮＡＳ、ＤＨＮＡＧ及びＤＨＮＡｇについてはいずれの条件でも６日間の観察で分解はほとんど見られなかった。ＤＨＮＡの急速な分解とＤＨＮＡＳ、ＤＨＮＡＧ及びＤＨＮＡｇの安定性はTLCによっても確認された。
ＨＰＬＣの分離条件
・カラム；ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ（登録商標）Ｃ１８（４．６ｘ２５０ｍｍ，３μ）、ジーエルサイエンス株式会社製
・温度；４０℃
・溶離液；１２％メタノール、２０％アセトニトリル、８ｍＭギ酸アンモニウム
・流速；０．６５ｍｌ／ｍｉｎ
・ＨＰＬＣ装置；Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ １１００
ＴＬＣの分離条件
・プレート；Ｍｅｒｃｋ シリカゲルＴＬＣプレート（５ｘ１０ｃｍ）
・展開溶媒；１−ブタノール：酢酸：水（４：１：２）
・Ｒｆ値；ＤＨＮＡ（０．８７）、ＤＨＮＡＳ（０．５６）、ＤＨＮＡＧ（０．４３）、ＤＨＮＡｇ（０．７１）
・検出；ＵＶランプ照射により青色蛍光スポットとして検出
・カラム；ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ（登録商標）Ｃ１８（４．６ｘ２５０ｍｍ，３μ）、ジーエルサイエンス株式会社製
・温度；４０℃
・溶離液；１２％メタノール、２０％アセトニトリル、８ｍＭギ酸アンモニウム
・流速；０．６５ｍｌ／ｍｉｎ
・ＨＰＬＣ装置；Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ １１００
ＴＬＣの分離条件
・プレート；Ｍｅｒｃｋ シリカゲルＴＬＣプレート（５ｘ１０ｃｍ）
・展開溶媒；１−ブタノール：酢酸：水（４：１：２）
・Ｒｆ値；ＤＨＮＡ（０．８７）、ＤＨＮＡＳ（０．５６）、ＤＨＮＡＧ（０．４３）、ＤＨＮＡｇ（０．７１）
・検出；ＵＶランプ照射により青色蛍光スポットとして検出
（試験例２）
ＤＨＮＡＳの毒性試験
ＩＣＲ系統の雌マウス（７週齢、ｎ＝６）に、１匹あたり６０ｍｇ／２００μＬ水のＤＨＮＡＳを経口単回投与した（２１４３ｍｇ／ｋｇ）。コントロール群のマウス６匹には、水２００μＬを経口単回投与した。ＤＨＮＡＳを投与したマウスとコントロールマウス各１匹を、代謝ケージに移し投与後２４時間ごとに３日目まで尿、糞を採取し代謝排泄物の分析に供した。その他のマウスは、体重と状態の所見観察を投与後２８日目まで行った。観察期間中において毒性は見られなかった。またＤＨＮＡＳ投与群では糞の軟化が見られた。
ＤＨＮＡＳの毒性試験
ＩＣＲ系統の雌マウス（７週齢、ｎ＝６）に、１匹あたり６０ｍｇ／２００μＬ水のＤＨＮＡＳを経口単回投与した（２１４３ｍｇ／ｋｇ）。コントロール群のマウス６匹には、水２００μＬを経口単回投与した。ＤＨＮＡＳを投与したマウスとコントロールマウス各１匹を、代謝ケージに移し投与後２４時間ごとに３日目まで尿、糞を採取し代謝排泄物の分析に供した。その他のマウスは、体重と状態の所見観察を投与後２８日目まで行った。観察期間中において毒性は見られなかった。またＤＨＮＡＳ投与群では糞の軟化が見られた。
ＤＨＮＡの毒性に関する知見
ＤＨＮＡ急性毒性に関してはＤＨＮＡ含有抽出物を用い７８ｍｇ／Ｋｇ（ＤＨＮＡとして１ｍｇ／Ｋｇ）の量を５週齢ＩＣＲマウス５匹に５日間投与後、１４日間観察した研究により、体重、行動、臓器解剖所見に異常がなかったと報告されている［北里研究所 毒性試験報告書（１９９４）］。
ＤＨＮＡ急性毒性に関してはＤＨＮＡ含有抽出物を用い７８ｍｇ／Ｋｇ（ＤＨＮＡとして１ｍｇ／Ｋｇ）の量を５週齢ＩＣＲマウス５匹に５日間投与後、１４日間観察した研究により、体重、行動、臓器解剖所見に異常がなかったと報告されている［北里研究所 毒性試験報告書（１９９４）］。
（試験例３）
ＤＨＮＡ投与実験
ＩＣＲ系統の雌マウス（７週齢）１匹に、６０ｍｇ／２００μＬ（2335ｍｇ／Ｋｇ（１％ｔｗｅｅｎ８０水溶液））のＤＨＮＡを経口単回投与した後、代謝ケージに移し投与後２４時間ごとに３日目まで尿、糞を採取し代謝排泄物の分析を行った。
ＤＨＮＡ投与実験
ＩＣＲ系統の雌マウス（７週齢）１匹に、６０ｍｇ／２００μＬ（2335ｍｇ／Ｋｇ（１％ｔｗｅｅｎ８０水溶液））のＤＨＮＡを経口単回投与した後、代謝ケージに移し投与後２４時間ごとに３日目まで尿、糞を採取し代謝排泄物の分析を行った。
（ＤＨＮＡおよびＤＨＮＡＳの代謝産物の同定）
マウスにＤＨＮＡを投与後２４時間に尿を採取しＨＰＬＣにより分析したところ二つの代謝物Ｍ１およびＭ２が検出された（図３）。
マウスにＤＨＮＡを投与後２４時間に尿を採取しＨＰＬＣにより分析したところ二つの代謝物Ｍ１およびＭ２が検出された（図３）。
ＨＰＬＣの分離条件
・カラム；ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ（登録商標）Ｃ１８（４．６ｘ２５０ｍｍ，３μ）、ジーエルサイエンス株式会社製
・溶離液；直線グラジエント（０−１５分）、Ａ液（１２．５ｍＭクエン酸、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ酢酸、３０ｍＭ水酸化ナトリウム）→２０％アセトニトリルを含むＡ液；（１５−３５分）２０％アセトニトリルを含むＡ液
・流速；０．６５ｍｌ／ｍｉｎ
・カラム；ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ（登録商標）Ｃ１８（４．６ｘ２５０ｍｍ，３μ）、ジーエルサイエンス株式会社製
・溶離液；直線グラジエント（０−１５分）、Ａ液（１２．５ｍＭクエン酸、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ酢酸、３０ｍＭ水酸化ナトリウム）→２０％アセトニトリルを含むＡ液；（１５−３５分）２０％アセトニトリルを含むＡ液
・流速；０．６５ｍｌ／ｍｉｎ
分取したＭ１についてはＦＡＢ Ｍａｓｓ（ネガティブモード）（ＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＳＸ１０２）による質量分析からＭ−Ｈのピークが３７９に観察され分子量は３８０でありグルクロン酸化ＤＨＮＡと推定され、またＭ１はβ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（Ｔｙｐｅ Ｈ−１，ＳＩＧＭＡ））処理により加水分解されＤＨＮＡを生じることからβ-グルクロン酸化ＤＨＮＡ（ＤＨＮＡＧ）と同定された。構造はＮ
ＭＲから確定した。
Ｍ２はＦＡＢ Ｍａｓｓ（ネガティブモード）によりＭ−Ｈのピークが２８３に観察されたことから分子量は２８４でありＤＨＮＡ硫酸エステル（ＤＨＮＡＳ）と推定され、合成品とＨＰＬＣにおける保持時間およびＵＶスペクトルが一致したことから構造は確定した。
一方ＤＨＮＡＳ投与マウス２４時間尿からもＭ１（ＤＨＮＡＧ）が検出され（図４）、この結果からマウスにおいて、ＤＨＮＡＳ→ＤＨＮＡ→ＤＨＮＡＧ経路が存在し生体内でＤＨＮＡＳ→ＤＨＮＡ変換が起こっていることが証明された。
ＭＲから確定した。
Ｍ２はＦＡＢ Ｍａｓｓ（ネガティブモード）によりＭ−Ｈのピークが２８３に観察されたことから分子量は２８４でありＤＨＮＡ硫酸エステル（ＤＨＮＡＳ）と推定され、合成品とＨＰＬＣにおける保持時間およびＵＶスペクトルが一致したことから構造は確定した。
一方ＤＨＮＡＳ投与マウス２４時間尿からもＭ１（ＤＨＮＡＧ）が検出され（図４）、この結果からマウスにおいて、ＤＨＮＡＳ→ＤＨＮＡ→ＤＨＮＡＧ経路が存在し生体内でＤＨＮＡＳ→ＤＨＮＡ変換が起こっていることが証明された。
Claims (2)
- 式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は
［式中、＊は結合部位を示す。］からなる群より選ばれる生体内で酵素により加水分解し得る基であり；Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が水素原子ではない。］
で表される化合物又はその塩を有効成分として含有してなるビフィズス菌増殖に用いられる食品。 - 式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は
［式中、＊は結合部位を示す。］からなる群より選ばれる生体内で酵素により加水分解し得る基であり；Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が水素原子ではない。］
で表される化合物又はその塩を有効成分として含有してなる腸内フローラ改善に用いられる食品。
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