TWI431009B - 具細胞毒性之化合物、組合物以及其製備方法與用途 - Google Patents

Description

具細胞毒性之化合物、組合物以及其製備方法與用途

本發明係關於新穎紅麴色素及其製備方法。本發明進一步係關於包含該紅麴色素之組合物，及紅麴色素於治療癌症的用途。本發明亦關於紅麴菌發酵產物之萃取物用於治療癌症的用途。

紅麴菌(Monascus spp.)在中國發酵食品中已有數千年的使用歷史。除會產生一些色素外，經紅麴菌發酵之紅麴米還會產生具生物活性之代謝物，諸如γ-胺基丁酸(GABA)及聚酮化合物紅麴菌素K(monacolin K)，此兩種物質分別被用作抗高血壓藥(參見Tsuji,K.等人，1992,「Effects of two kinds of Koji on blood pressure in spontaneously hypertensive rats.」Nippon. Nogeikagaku Kaishi .,66: 1241-1246)及降低膽固醇之藥物(參見Endo,A.,1979,「Monacolin K,a new hypocholesterolemic agent produced by aMonascus species.」J. Antbiot .,32: 852-854：Endo,A.,1985,「Compactin(ML-236B) and related compounds as potential cholesterol-lowering agents that inhibit HMG-CoA reductase.」J. Med. Chem .,28: 401-405；及Martinokova,L.等人，1995,「Biological activity of polyketide pigments produced by the fungusMonascus. 」J. Appl. Bacteriol .,79: 609-616)。

經紅麴菌發酵之紅麴米亦發現可抑制腫瘤生成、護肝功能、抑制脂肪細胞分化、抗疲勞、增進免疫力、降血脂及降血糖之功效，是近來非常熱門之保健食品及藥品(Loret,M.-O. & Morel,S.,2010,「Isolation and structural characterization of two new metabolites from Monascus.」J Agric Food Chem .,58: 1800-1803)。多種紅麴菌產生的天然色素已被證實具有抗癌效果,如赤紅麴黃素(ankaflavin)對肝癌細胞株Hep G2及肺癌細胞株A549具細胞毒性(Su,Nan-Weiet al .,J. Agric. Food Chem.,2005,53,pp.1949-1954))。然仍須進一步研究紅麴米中的新成分及其潛在用途。

本發明之目的之一為提供一種式(I)化合物，

及其醫藥上可接受之鹽、溶劑合物或水合物，其中R¹ 、R² 及R³ 分別獨立為烷基、烯基、烷氧基、烷基羰基、烯基羰基或烷氧基羰基。

本發明之另一目的為提供一種組合物，其包含式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽、溶劑合物或水合物及視情況選用之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。

本發明之另一目的為提供一種製備式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽、溶劑合物或水合物的方法。

本發明之另一目的為提供一種紅麴米萃取物。

本發明之另一目的為提供一種組合物，其包含本發明之紅麴米萃取物及視情況選用之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。

本發明之另一目的為提供一種本發明之化合物、組合物或紅麴米萃取物於殺死腫瘤細胞以治療癌症之用途。

於以下部分中詳細描述本發明。可在以下[實施方式]及申請專利範圍中容易地發現本發明之其他特徵、目的及優點。

參考以下對本發明之各態樣、實例、及伴隨相關描述之化學圖式及表格的詳細描述，可更容易地瞭解本發明。在揭示及描述本發明之化合物、組合物及/或方法之前，應瞭解，除非由申請專利範圍另外特別地指出，否則本發明不受限於特定製備方法、載劑或調配物、或將本發明化合物調配成用於局部、經口或非經腸投予之產物或組合物的特定模式，此係由於熟習相關技術之通常知識者非常清楚此等事情是可以加以變化的。亦應瞭解，本文所用之術語僅用於描述特定態樣之目的而不意欲用於限制性本發明之範疇。

定義

除非另外指出，否則如本發明所用之以下術語應解釋為具有以下含義。

如本文所用之術語「烷基」係指在概念上可藉由自具有直鏈或分支碳鏈之非環烴化合物之結構中移除氫且該氫原子經另一原子或有機或無機取代基置換而由烷烴形成之烴基。在本發明之一些態樣中，烷基為「C₁ 至C₁₂ 烷基」，諸如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、第三戊基、己基及其類似基團。本發明之許多態樣包含「C₁ 至C₇ 烷基」，其包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、己基及庚基。

術語「烯基」在結構上類似於包含至少一個碳碳雙鍵之烷基或殘基。在一些態樣中，烯基為「C₂ 至C₁₂ 烯基」，例如乙烯基、烯丙基、丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基及6-庚烯基等，以及直鏈及分支鏈之二烯及三烯。在其他態樣中，烯基具有2至7個碳原子，較佳為具有2至3個碳原子。

術語「烷氧基」係指於上述烷基部份中含有氧基之基團。更佳烷氧基為具有1至8個，較佳為1至6個，且更佳為1至4個碳原子。較佳之烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、異-丙氧基、正-丁氧基、第二-丁氧基、第三-丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、羥甲氧基、2-羥乙氧基及2-羥丙氧基。

於本文中使用之「烷基羰基」、「烯基羰基」或「烷氧基羰基」乙詞，包括將上述的烷基部份、烯基部份或烷氧基部份並連接至-CO-基團之碳原子之基團。

如本文所用之術語「醫藥學上可接受」係指在合理醫學判斷範疇內適合於與人類及動物組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏性反應或其他問題併發症，相應具有合理之益處/風險比率的彼等化合物、材料、賦形劑、組合物或劑型。

一或多種本發明化合物可以鹽形式存在。術語「鹽」涵蓋與有機陰離子及陽離子以及無機陰離子及陽離子形成之鹽。此外，此術語包括由鹼性基團與有機酸或無機酸之標準酸鹼反應而形成之鹽。該等酸包括鹽酸、氫氟酸、三氟乙酸、硫酸、磷酸、乙酸、丁二酸、檸檬酸、乳酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、棕櫚酸、膽酸、雙羥萘酸、黏液酸、D-麩胺酸、D-樟腦酸、戊二酸、鄰苯二甲酸、酒石酸、月桂酸、硬脂酸、水楊酸、甲烷磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸及肉桂酸。

本發明之化合物亦可以溶劑合物及水合物形式存在。因此，此等化合物可與例如水合水或一個、許多或任何分率之母液溶劑分子一起結晶。該等化合物之溶劑合物及水合物包括在本發明之範疇內。

如本文所用之術語「個體」表示任何動物，較佳為哺乳動物，且更佳為人類。個體之實例包括人類、非人類靈長類動物、齧齒動物、天竺鼠、兔、綿羊、豬、山羊、母牛、馬、狗及貓。

術語如本文所提供之化合物的「有效量」意謂該化合物之量足以提供對所需功能(諸如基因表現、蛋白質功能或誘導特定類型之反應)之所需調節。如下文所指出，確實的需要量將在個體之間有變化，此視個體之疾病病況、身體狀況、年齡、性別、物種及體重、組合物之特性及配方等而定。給藥方案可經調整以誘導最佳治療反應。舉例而言，可每日投予若干分次劑量，或可依治療情形之緊急程度按比例減少劑量。因此，很難指定確實的「有效量」。然而，本發明領域中具有通常知識者使用常規實驗即可確定適當的有效量。

如本文所用之術語「治療」表示逆轉、減輕或改善此術語所適用之病症或病狀、或該病症或病狀之一或多種症狀，或抑制其進展。

如本文所用之術語「載劑」或「賦形劑」係指自身並不為治療劑，而是用作用於將治療劑傳遞至個體之載劑及/或稀釋劑及/或佐劑或媒劑，或添加至調配物中以改善調配物之處理或儲存性質或允許或有助於組合物之劑量單位形成適於經口投予之劑量單位(諸如膠囊或錠劑)的任何物質。適合之載劑或賦形劑為一般熟習製造醫藥調配物或食品之通常知識者所熟知。載劑或賦形劑可包括(舉例而言但不限於)緩衝劑、稀釋劑、崩解劑、黏合劑、黏著劑、濕潤劑、聚合物、潤滑劑、滑動劑、為遮蔽或抵消不良味道或氣味而添加之物質、調味劑、染料、芳香劑及為改善組合物之外觀而添加之物質。可接受之載劑或賦形劑包括檸檬酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑、碳酸氫鹽緩衝劑、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸及硫酸之鈉鹽及鈣鹽、碳酸鎂、滑石、明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、果膠、糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、澱粉、明膠、纖維素物質(諸如烷酸之纖維素酯及纖維素烷基酯)、低熔點蠟、可可脂、胺基酸、尿素、醇類、抗壞血酸、磷脂、蛋白質(例如血清白蛋白)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲亞碸(DMSO)、氯化鈉或其他鹽、脂質體、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油或粉末、聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇及聚乙二醇)、及其他醫藥學上可接受之物質。載劑不應破壞治療劑之藥理學活性，且在以足以傳遞治療量之藥劑的劑量投予時應無毒性。

範圍在本文中通常表述為「約」一個特定值及/或至「約」另一個特定值。當表述此類範圍時，一態樣為包括一個特定值及/或至另一個特定值之範圍。類似地，當值藉由使用字「約」表述為近似值時，應瞭解特定值可形成另一態樣。另外應瞭解，每一範圍之各端點皆有顯著性，一端點與另一端點既有相關性，亦彼此獨立。

「視情況」或「視情況地」意謂隨後所述之事件或狀況可能發生或可能不發生，且該描述包括該事件或狀況發生之情況及其未發生之情況。舉例而言，「視情況包含藥劑」意謂該藥劑可能存在或可能不存在。

必須指出，除非上下文另外清楚規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一」及「該」包括複數個所指標的物。因此，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。

本發明之化合物

本發明係關於具有下式(I)之化合物：

其中R¹ 、R² 及R³ 分別獨立為烷基、烯基、烷氧基、烷基羰基、烯基羰基或烷氧基羰基，及其醫藥上可接受之鹽、溶劑合物或水合物。

在式(I)化合物之一些態樣中，R¹ 、R² 及R³ 分別獨立為C₁ -C₁₂ 烷基、C₂ -C₇ 烯基、C₁ -C₈ 烷氧基、C₁ -C₁₂ 烷基羰基、C₂ -C₇ 烯基羰基或C₁ -C₈ 烷氧基羰基。

在一個較佳態樣中，R¹ 為C₁ -C₁₂ 烷基、C₂ -C₇ 烯基或C₁ -C₈ 烷氧基，R² 為C₁ -C₁₂ 烷基、C₂ -C₇ 烯基、C₁ -C₈ 烷氧基、C₁ -C₁₂ 烷基羰基、C₂ -C₇ 烯基羰基或C₁ -C₈ 烷氧基羰基，且R³ 為C₁ -C₁₂ 烷基、C₂ -C₇ 烯基或C₁ -C₈ 烷氧基。

在另一個較佳態樣中，R¹ 為C₂ -C₁₂ 烯基，R² 為C₁ -C₁₂ 烷基羰基，且R³ 為C₁ -C₆ 烷基。

在另一個較佳態樣中，R¹ 為C₂ -C₃ 烯基，R² 為C₁ -C₆ 烷基羰基，且R³ 為C₁ -C₄ 烷基。

在一個最佳態樣中，式(I)化合物為具有下式之(9S,9aR)-9-庚烯基-6a-甲基-3-((E)-丙-1-烯基)-9,9a-二氫-6H-呋喃并[2,3-h]異唏-6,8(6aH)-二酮：

本發明之化合物可藉由任何已知之方法進一步轉化為醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物。

本發明之組合物

本發明亦提供一種組合物，其包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物。本發明之組合物可為醫藥組合物。該組合物中的本發明之式(I)化合物可以紅麴米之萃取物或化合物形式提供。

本發明之醫藥組合物可藉由本發明領域中已知之任何方法局部或全身投予，包括(但不限於)藉由肌肉內、皮內、靜脈內、皮下、腹膜內、鼻內、經口、黏膜或外部途徑投予。適當的投藥途徑、調配方法及投藥時程可由本發明領域中具有通常知識者來決定。在本發明中，醫藥組合物可根據相應投藥途徑以多種方式調配，諸如液體溶液、懸浮液、乳液、糖漿、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物、散劑、顆粒、安瓿、注射液、輸注液、套組、軟膏、洗劑、擦劑、乳膏或其組合。在必要時，其可經滅菌或與任何醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混合，其中有許多醫藥學上可接受之載劑或賦形劑已為一般技術者所知，例如參見[實施方式]第13段。

本發明之製備方法

本發明提供製備式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物之方法：

其中R¹ 、R² 及R³ 分別獨立為烷基、烯基、烷氧基、烷基羰基、烯基羰基或烷氧基羰基。

在一個較佳態樣中，本發明之方法包含以下步驟：

(a)以紅麴菌屬分離菌株將米發酵，獲得紅麴米；

(b)以甲醇、乙醇或乙酸乙酯萃取該紅麴米；

(c)以乙酸乙酯與H₂ O萃取步驟(b)中獲得之萃取物，獲得可溶於乙酸乙酯之部分；

(d)利用溶離劑經由矽膠層析管柱溶離該可溶於乙酸乙酯之部分；及

(e)利用矽膠層析管柱及/或製備型薄層層析法(TLC)純化(d)之溶離份，以獲得該化合物。

根據本發明之方法，其中所使用的紅麴菌屬分離菌株可為高粱紅麴菌(Monascus kaoliang )、紫紅麴菌(Monascus purpureus )、紅色紅麴菌(Monascus ruber )或絨毛紅麴菌(Monascus pilosus )，較佳為高粱紅麴菌，更佳為高粱紅麴菌BCRC 31506。

根據本發明之方法，在步驟(b)之前，紅麴米可經乾燥，而步驟(b)中所使用的溶劑可為甲醇、乙醇或乙酸乙酯。

根據本發明之方法，步驟(c)中之乙酸乙酯與H₂ O之比率為約1:1。

根據本發明之方法，步驟(d)包含將該可溶於乙酸乙酯之部分裝載至矽膠層析管柱中，且利用包含12:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1正己烷/乙酸乙酯之溶離劑溶離該管柱，產生15個溶離份。步驟(e)中所用之溶離份為溶離份11。

根據本發明之另一個較佳方法，步驟(e)中之純化方法為以10:1至5:1正己烷/EA及EA進行溶離之矽膠管柱層析法，得到10種次溶離份(次溶離份11.1至11.10)，且藉由製備型TLC(SiO₂ ；5:1正己烷/EtOAc)純化次溶離份11.2。

本發明提供製備紅麴米萃取物之方法。在一個較佳態樣中，該方法包含以下步驟：

(a)用紅麴菌屬分離菌株使米發酵，獲得紅麴米；及

(b)用甲醇、乙醇或乙酸乙酯萃取該紅麴米。

根據本發明之紅麴米萃取物製備方法，其中所使用的紅麴菌屬分離菌株可為高粱紅麴菌、紫紅麴菌、紅色紅麴菌或絨毛紅麴菌，較佳為高粱紅麴菌，更佳為高粱紅麴菌BCRC 31506。

根據本發明之紅麴米萃取物製備方法，在步驟(b)之前，紅麴米可經乾燥。

效用

本發明之式(I)化合物及其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物

(R¹ 、R² 及R³ 分別獨立為烷基、烯基、烷氧基、烷基羰基、烯基羰基或烷氧基羰基)或紅麴米或紅麴米萃取物具有細胞毒性活性，因此，本發明提供適用於消除欲經殺死之病態或異常細胞(諸如腫瘤細胞，尤其實體腫瘤細胞)的藥劑。

本發明之醫藥組合物中可包含有效量之式(I)化合物或其其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物，或紅麴米或紅麴米萃取物。

由於本發明之醫藥組合物具有選擇性殺死腫瘤細胞之功效，故可用於治療癌症。在某些實施例中，癌症包括(但不限於)乳癌、皮膚癌、前列腺癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、喉癌、口腔癌、結腸及胃腸道(例如食道、胃、胰臟)癌症、腦癌、甲狀腺癌、血癌及淋巴系統癌症。

視待治療之病症、疾病或病狀、個體之狀況而定，本發明之化合物或醫藥組合物可藉由經口、非經腸(例如肌肉內、腹膜內、靜脈內、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、吸入、經鼻、經陰道、經直腸、舌下或表面(例如經皮或局部)投藥途徑投與，且可單獨或與適於各投藥途徑之醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、佐劑及媒劑一起調配成適合劑量單元。亦提供本文提供之化合物或醫藥組合物以儲槽式調配物形式之投與，其中活性成份經預定時間段釋放。

在某些實施態樣中，在投與如本發明之化合物或醫藥組合物之前、期間或之後，可向個體投與一或多個抗癌藥物、細胞毒性劑及/或療法(如外科手術及放射線療法等)。該抗癌劑或細胞毒性劑可為烷基化劑(如順鉑、卡波鉑)、抗腫瘤抗生素(如阿德力黴素及博萊黴素)、抗腫瘤植物鹼(如紫杉醇(taxol)及依託泊苷)、抗腫瘤激素(如地塞米松及他莫昔芬)或抗腫瘤免疫劑(如干擾素α、β及γ)。

提供以下實例以有助於熟習此項技術者實施本發明。

實 例 微生物

高粱紅麴菌BCRC 31506可購自財團法人食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute，FIRDI)之生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)(331台灣新竹市食品路300號)

實例1.　製備酵母材料

將高粱紅麴菌BCRC 31506接種於馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)(Difco,USA)平板上且在30℃下培養7天。用6 ml無菌水將孢子自PDA平板中洗出，且將1 ml孢子懸浮液接種於含有50 ml GSP培養基(其含有7%甘油、3%麵粉、1.2%聚蛋白腖、3%大豆粉、0.1%硫酸鎂及0.2%硝酸鈉)之250 ml錐形瓶中並震盪，且在30℃、150 rpm下培養3天，獲得種麴菌液。

實例2.　固態發酵

將75 ml 0.2%酒石酸溶液添加至10個各自含有75 g在來米(Zailai rice)之450 ml寬口玻璃瓶中。在4℃下浸泡隔夜。接著將米瀝乾並滅菌。將實例1中獲得之種麴菌液分別接種7.5 ml於各瓶中，置於25℃下培養14天(在培養第7天時，補充7.5 ml GSP培養基至培養物中)，以獲得紅麴米。

實例3.　自紅麴米中萃取及分離新穎化合物

乾燥實例2之紅麴米，且在室溫下將1 Kg經乾燥之紅麴米以95% EtOH(6 L)萃取3次。將乙醇漿萃取物分配於EtOAc與H₂ O(1:1)(10 L)之間，得到溶於EtOAc(2.5 g)之部分及溶於水(10.2 g)之部分。

將溶於EtOAc之部分經矽膠(75 g，70-230目；Merck,Germany)層析，且以12:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1正己烷/乙酸乙酯溶離，產生15個溶離份。溶離份11(1.2 g)再以矽膠(30 g，70-230目；Merck,Germany)層析，以10:1至5:1正己烷/乙酸乙酯溶離，產生10個次溶離份。將次溶離份2(28 mg)以製備型TLC(SiO₂ ；5:1正己烷/EtOAc)純化，得到新穎化合物1 (1.2 mg)。

實例4.　新穎化合物1之表徵

旋光度係在Jasco P-1020數位旋光儀上量測。紫外光譜係在Jasco UV-240分光光度計上於MeOH中獲得，且IR光譜(KBr或純)係在Perkin-Elmer系統2000 FT-IR光譜儀上獲得。使用CDCl₃ 作為溶劑之1D(¹ H、¹³ C、DEPT)及2D(COSY、NOESY、HSQC、HMBC)NMR譜係在Varian Unity Plus 400(¹ H NMR為400 MHz，¹³ C NMR為100 MHz)上記錄。化學位移內部參考CDCl₃ 中之溶劑信號(¹ H，δ 7.26；¹³ C，δ 77.0)，以TMS為內部標準品。高解析度ESI-MS譜係在Bruker Daltonics APEX II 30e光譜儀上獲得。矽膠(70-230，230-400目)(Merck)用於管柱層析法，且矽膠60 F-254(Merck)用於TLC及製備型TLC。

化合物1之特徵

化合物1 之特徵示於表1。

表1：化合物1 之¹ H及¹³ C-NMR數據(CDCl₃ ，600及150 MHz) δ單位為ppm，J單位為Hz

(9S ,9aR )-9-庚烯基-6a-甲基-3-((E)-丙-1-烯基)-9,9a-二氫-6H-呋喃并[2,3-h ]異唏-6,8(6aH)-二酮之化合物1 ，無色油狀，=+94.4(c =0.4,CHCl₃ )。UV(MeOH): 253(4.05)。IR(純)：1780(γ-內酯)，1700(連結C=O)。¹ H-及¹³ C-NMR之結果參見表1。ESI-MS：393([M +Na]⁺ )。HR-ESI-MS：393.1677([M +Na]⁺ ，；計算值393.1677)。

化合物1之結構說明

化合物1 為無色油狀，該分子式經HR-ESI-MS(m/z 393.1677，([M +Na]⁺ ，；計算值393.1677))測定為C₂₂ H₂₆ O₅ (10個不飽和度)，此結果與¹ H-及¹³ C-NMR數據一致(如上所述)。於¹ H NMR光譜中，位於δ0.87、1.58及1.91之甲基訊號係分別根據鄰位CH₂ 、四級C及CH之存在呈現三重、單重及二重之多重峰。藉由¹ H,¹ H COSY實驗，自位於δ0.87之CH₃ 訊號起始之關聯性可供確認CH₃ (CH₂ )₅ 基團。位於δ1.91之甲基也與反-(E)-二取代之碳碳雙鍵之質子一起形成個別自旋系統，並可供確認丙烯基取代基，剩餘的二個次甲基(δ3.73及3.86)則形成二自旋系統。位於δ7.35(H-1)之單重峰為該¹ H NMR光譜中相當明顯的訊號之一，共平面近位羰基之強烈去遮蔽效應可充分說明此末端之化學位移。自化合物1 之¹ H-¹ H COSY光譜可建立出從H-11至H-13之關聯性及H-9及H-9a之間的偶合，並也顯現出H-11及H-4之間的丙烯型偶合(allylic coupling)。該分子中之二個及三個鍵的質子-碳相關性係藉由HMBC所測定。化合物1 之HMBC光譜可提供其粗略的結構；其可自H-1至C-3、C-4a及C-6b；H-4至C-3、C-5、C-6b及C-11；H-5至C-4、C-6a及C-6b；10-Me質子至C-6、C-6a及C-9a；H-9至C-6b、C-8、C-9a及C-14；H-15至C-14；H-9a至C-1、C-4a、C-6、C-6a、C-6b、C-9及C-14；H-11至C-4及C-3；H-15至C-14；及H-11及H-12二者至C-3中，觀察到具有關鍵長距離之¹ H,¹³ C關聯性。化合物1 之HSQC光譜可供指定直接鍵結之C-H基團，該結果顯示H-C關聯性訊號分別為0.87/13.9、2.47及3.08/42.8、3.73/56.5、3.86/42.9、5.41/106.4、5.97/106.7、5.99/122.8、6.53/135.2及7.35/146.9。該5.41/106.7之交叉峰證明H-5次甲基係連接至4H-吡喃環之C-4a原子，且3.86/191.3之關聯性顯現出C-6酮基係連接至相同環中之C-6a。自位於δ1.58之單重峰甲基及C-6訊號之間的HMBC反應，可推斷該等質子係落在距離C-6三個鍵長之處。該Me-10質子相關於一個次甲基碳原子，而後者可被指定為C-9a。藉由位於δ3.73(H-9)之雙重峰與C-9a碳原子及內酯羰基C-8相關性，可供測定該內酯環之位置。基於H-9/C(14)=O之間的交叉峰，可明顯觀察出C₆ H₁₃ =O基團之位置。因此，化合物1之結構為(9S ,9aR )-9-庚烯基-6a-甲基-3-((E)-丙-1-烯基)-9,9a-二氫-6H-呋喃并[2,3-h ]異唏-6,8(6aH)-二酮。

實例5.化合物1對癌細胞株之細胞毒性實驗 受測癌細胞株及培養基

實驗所使用的細胞株為MRC-5(肺纖維細胞=正常細胞(對照組)，BCRC60023)、HeLa(子宮頸癌細胞，BCRC60005)、AGS(胃癌細胞，BCRC60102)及MCF-7(乳癌細胞，BCRC68003)，細胞株來自財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心。

用於培養HeLa、MRC-5及MCF-7細胞株的培養基為含10%胎牛血清之Low-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)培養基。用於培養AGS細胞株的培養基為NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM(F12K)培養基。

細胞株之前培養

將Trypan blue以1：1的比例與細胞懸浮液混合均勻，以血球計數器計算細胞數目，再以新鮮培養基將細胞稀釋至所要的濃度，例如：子宮頸癌細胞的濃度為8.33x10³ /ml；人類正常肺纖維細胞、胃癌細胞和乳癌細胞的濃度為1.67x10⁴ /ml。然後將細胞以180 μl/孔之量置入96孔平盤(HeLa為1,500細胞/孔；MRC-5、AGS及MCF-7為3,000細胞/孔)，並於37℃、5% CO₂ 培養箱中培養24小時後，加入化合物樣品進行細胞毒性測試。

細胞毒性分析

將20 μl含有不同濃度的化合物樣品(將不同量的化合物1 溶於二甲亞碸(DMSO)所配成)加入96孔平盤之各細胞培養液中。將平盤置於37℃、5% CO2培養箱中培養3天後，以MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓鹽)分析來測定細胞存活率，以評估化合物樣品對受測細胞株的細胞毒性。

MTT分析

此測試係基於活細胞可將黃色可溶性鹽MTT還原成紫藍色不溶性甲之選擇性能力。將MTT(Merck；溶於磷酸鹽緩衝鹽水中，5 mg/mL)溶液添加至平盤的各孔內(20 μl/孔)，再將平盤置於37℃、5% CO2的培養箱中培養4小時。移除各孔中的培養基，於各孔中加入DMSO(100 μg/孔)，並將96孔平盤置於振盪器上震盪5分鐘。利用ELISA reader去讀取細胞在540 nm波長的O.D.值(Ref波長690nm)，計算細胞的存活率以評估化合物樣品對受測細胞株的細胞毒性。

結果

化合物1 對受測細胞株的細胞毒性顯示於表2中。

由表2之結果可發現，化合物1 對子宮頸癌細胞株HeLa(IC50為36.2 nM)、胃癌細胞株AGS(IC50為26.6 nM)及乳癌細胞株MCF7(IC50為35.2 nM)的細胞毒性高於肺纖維細胞MRC5(正常細胞株；對照組)，此顯示化合物1 可選擇性殺死癌細胞而可用作抗癌藥物。

Claims (12)

1. 一種(9S ,9aR )-9-庚烯基-6a-甲基-3-((E)-丙-1-烯基)-9,9a-二氫-6H-呋喃并[2,3-h ]異唏-6,8(6aH)-二酮化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
2. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及視情況選用之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
3. 一種製備如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的方法，該方法包含以下步驟：(a)以高粱紅麴菌分離菌株將米發酵，獲得紅麴米；(b)以甲醇、乙醇或乙酸乙酯萃取該紅麴米；(c)以乙酸乙酯與H₂ O萃取步驟(b)中獲得之萃取物，獲得可溶於乙酸乙酯之部分；(d)利用溶離劑經由矽膠層析管柱溶離該可溶於乙酸乙酯之部分；及(e)利用矽膠層析管柱及/或製備型薄層層析法純化(d)之溶離份，獲得該化合物。
4. 如請求項3之方法，其中該分離菌株為高粱紅麴菌BCRC 31506。
5. 一種紅麴米萃取物，其係藉由包含以下之方法來獲得：(a)以高粱紅麴菌分離菌株將米發酵，獲得紅麴米；及(b)以甲醇、乙醇或乙酸乙酯萃取該紅麴米，其特徵在於該萃取物包含如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
6. 如請求項5之紅麴米萃取物，其中該分離菌株為高粱紅麴菌BCRC 31506。
7. 一種醫藥組合物，其包含如請求項5或6之紅麴米萃取物及視情況選用之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
8. 一種如請求項1之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其係用於製備用以治療癌症之醫藥品。
9. 一種如請求項5或6之紅麴菌米萃取物之用途，其係用於製備用以治療癌症之醫藥品。
10. 如請求項8或9之用途，其中該醫藥品係與一或多個抗癌藥物、細胞毒性劑及/或療法併用。
11. 如請求項10之用途，其中該抗癌劑或細胞毒性劑可為烷基化劑、抗腫瘤抗生素、抗腫瘤植物鹼、抗腫瘤激素或抗腫瘤免疫劑。
12. 如請求項10之用途，其中該療法為外科手術及/或放射線療法。