CN113773287B - 一种生物活性次级代谢产物及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物和新型医药领域，具体为一种生物活性次级代谢产物及其制备和应用。生物活性次级代谢产物为下述化合物1‑7(seco‑4‑epi‑7‑epi‑brefeldin A methyl ester(1)，4‑epi‑7‑epi‑brefeldin A seco‑acid(2)，4‑epi‑6‑epi‑hydroxy‑brefeldin C(3)，peniorcinols A‑C(4‑6)和penipentenone A(7))；同时通过植物内生真菌F4a发酵培养纯化获得生物活性次级代谢产物(化合物1‑20)。本发明提供的真菌次级代谢产物具有显著的抗肿瘤、降血糖、抗氧化或己糖激酶抑制活性，它们可作为抗肿瘤、降血糖或抗氧化等的理想候选化合物。所述的化合物能通过真菌发酵生产，其制备方法简单、高效，所得产物纯度高。该发明具有良好的应用前景。
Figure DDA0003235773100000011

Description

一种生物活性次级代谢产物及其制备和应用
技术领域
本发明涉及微生物和新型医药领域，具体为一种生物活性次级代谢产物及其制备和应用。
背景技术
植物内生真菌能产生具有多种生物功能的代谢产物分子，因而在医药开发、保健品开发、生物农药等众多领域均具有重要的应用价值。因此，植物内生菌已成为在寻找结构新颖、活性显著的抗肿瘤、降血糖和抗氧化药物的重要来源。特别是，当前癌症已成为人类死亡的主要原因，2018年全球新增病例为1810万，死亡人数为960万，占死亡人数的六分之一。研究癌症机制、癌症基因、癌症信号途径和开发新型高效抗癌药物是癌症防治的关键。
布雷非德菌素及其衍生物是一种大环内酯类抗生素，具有活性高、作用广，特别对多种耐药肿瘤细胞均有良好的抑制作用，其作用机理是它们主要能诱导高尔基体的分解，抑制蛋白从内质网中转移为高尔基体的复合物，通过反竞争性抑制作用，在鸟嘌呤核苷酸释放之前选择性与ARF1-GDP:Sec7复合物结合形成ARF1-GDP:BFA:Sec7复合物，从而使GDP交换GTP的反应在早期阶段被阻断。它们可以间接抑制RAS信号通路的开关RAS-GTP过度活化，从而具有显著抑制KRAS突变的肿瘤细胞的活性，是RAS靶向抑制抗肿瘤药物的先导分子。布雷非德菌素A(BFA)首次报道从Penicillium decumbens发酵液中分离得到(Singleton等，1958)，申请人使用内生真菌F4a也能高效制备的BFA(ZL2014100726901)。BFA具有抗真菌、抗病毒、抗有丝分裂、抗肿瘤等生物学活性。同时，BFA及其衍生物是重要的抗肿瘤候选药，表1总结了专利中的BFA类化合物(8-12)的来源及其已经报道的抗肿瘤活性。
BFA类化合物(8-12)的来源及其抗肿瘤活性总结
Figure GDA0004190657490000011
Figure GDA0004190657490000021
2型糖尿病(T2DM)是以胰岛素抵抗和/或胰岛细胞功能衰竭为主要特征的一系列代谢紊乱综合征，常伴随多种急慢性并发症，已成为影响国人健康的最主要的慢性疾病之一。α葡萄糖苷酶和蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)是与T2DM相关的重要靶酶。进餐后，存在于小肠黏膜刷状缘上的α葡萄糖苷酶会将食物中的碳水化合物水解为葡萄糖，葡萄糖被吸收进入血循环进而升高血糖，因此，α葡萄糖苷酶是控制餐后血糖的主要靶酶之一。α葡萄糖苷酶抑制剂能够可逆性地抑制小肠α糖苷酶，减少碳水化合物的水解，延缓葡萄糖的生成和吸收，进而下调餐后血糖水平，是控制餐后血糖的对症治疗药物。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)是一种非跨膜蛋白酪氨酸磷酸水解酶。研究发现，PTP1B在胰岛素和瘦素信号通路中起到关键的负调控作用，是胰岛中胰岛素释放的重要生理调节剂。
近年来，随着自由基学说迅速发展，衰老和多种疾病的发生已被证实与自由基的过量产生有密切关联。机体补充外源性的抗氧化剂或给予有助于机体内源性抗氧化物质恢复的化合物对衰老和一些疾病的治疗起到辅助作用。传统的抗氧化剂一般来源于化学合成，存在稳定性差、毒副作用强等缺点，而天然抗氧化剂具有安全无毒、稳定性强、天然等优势更符合消费者要求，有些已经得到了较好的开发利用。因此，天然抗氧化剂的研发已成为食品、中医药及化妆品领域的研究热点。
O-Methylorcinol(13)于1996年首次从地衣中分离得到(1996，Siegfride H等)。2012年其微弱的抗菌活性被研究报道(Harue Nomura，2012)。其己糖激酶II抑制活性未见报道。
聚酮类化合物penialidin A(15)首次报道从藤黄叶子中分离得到的内生真菌Penicillium sp.发酵液中分离得到(Jean-Bosco Jouda等，2014)。2016年Jean-BoscoJouda等人报道了其具有很好的抗菌(霍乱弧菌和分枝杆菌)和抗肿瘤活性(HeLa)(Jean-Bosco Jouda等，2016)。2019年Liwen Hu等人报道了其具抗氧化(DPPH)和抗肿瘤活性(Balb/c3T3)(Liwen Hu，2019)。然而其ABTS自由基清除活性未见报道。
聚酮类化合物penialidin A(16)2018年首次作为天然产物报道，从海洋真菌Penicillium janthinellum DT-F29分离得到(Xiangwei Cheng等，2018)。同年，KaterinaGeorgousaki等人报道了其抗氧化活性(DPPH IC50>100μΜ；ABTS IC50＝39.3μΜ)(Katerina Georgousaki等，2018)。
聚酮类化合物myxotrichin C(17)首次报道从lichen Cetraria islandica(L.)Ach.中分离得到的内生真菌Myxotrichum sp.发酵液中分离得到(Chao Yuan等，2013)。2020年，Tran Minh Ha等人报道了其抗炎(抑制NO产生IC50＝41.5μΜ)和降血糖活性(PTP1BIC50＝19.2μΜ)。然而其抗氧化以及己糖激酶II抑制活性未见报道。
Riboflavin(18)又名维生素B2，是B族维生素的一种，为体内黄酶类辅基的组成部分(黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用)，当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。其病变多表现为口、眼和外生殖器部位的炎症，如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等，故其可用于上述疾病的防治。然而其PTP1B抑制活性未见报道。
Indole-3-acetic acid(19)是最早发现的植物激素，最初曾称为异植物生长素，亦称吲哚乙酸，缩写IAA。1928年荷兰的温特(F.W.Went)首次分离鞘尖产生的与生长有关的物质，并把这种物质命名为生长素吲哚乙酸(1973，Herbert E等)。IAA有多方面的生理效应，这与其浓度有关。低浓度时可以促进生长，高浓度时则会抑制生长，甚至使植物死亡。但其ABTS自由基清除活性和PTP1B抑制活性未见报道。
2-hydroxymethyl-3-methylcyclopent-2-enone(20)2006年首次作为天然产物报道，从内生真菌Mitosporic Dothideomycete sp.LRUB20分离得到(Porntep Chomcheon等，2006)，并报道了其中等的抗菌活性。然而其己糖激酶II抑制活性未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种生物活性次级代谢产物及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种生物活性次级代谢产物，生物活性次级代谢产物为下述化合物1-7：
Figure GDA0004190657490000041
一种生物活性次级代谢产物的制备方法：
1)将植物内生真菌F4a接种于PSA固体培养基上培养48-96h活化，活化后接种于液体培养基中于28-32℃培养48-72h所得培养物作为种子液；将所得种子液与液体培养基按体积比1:25-1:15混合，26-32℃振荡培养6-9天；
2)将发酵液离心去菌体获得发酵上清液，用大孔吸附树脂HP20固相吸附发酵液中活性成分，树脂与发酵液体积比为1:15-1:25；吸附1-3h，吸附后洗涤获得粗提物；分离所得菌体经丙酮提取获得粗提物，合并粗提物即得总提取物A；
3)将总提取物A，采用硅胶柱色谱法分离，按照二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:0-0:100梯度洗脱，收集各组分，即得生物活性次级代谢产物。
所述步骤3)经硅胶柱色谱法分离，纯二氯甲烷洗脱为流分Fa,二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:1-100:3洗脱为流份Fb,二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:4-100:6洗脱为流份Fc,二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:7-10:9洗脱为流份Fd,二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:10-100:15洗脱为流份Fe；
将流份Fa经凝胶LH20除杂，而后采用半制备HPLC纯化，经60-70％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物13(苔黑素单甲醚)；
将流分Fb经凝胶LH20分离，按照洗脱甲醇体积数分成4个亚流分，根据洗脱顺序接收40-60mL甲醇为亚流分Fb4，接收62-100mL甲醇为亚流分Fb3，接收102-120mL甲醇为亚流分Fb2，接收125-140mL甲醇为亚流分Fb1；将亚流分Fb1溶于甲醇析出沉淀，用甲醇重结晶获得化合物19吲哚-3-乙酸；将亚流分Fb2用半制备HPLC纯化，经25-35％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物20(2-hydroxymethyl-3-methylcyclopent-2-enone)；将亚流分Fb3用半制备HPLC纯化，经35-45％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物7(penipentenone A)；将亚流分Fb4经ODS反相柱层析，甲醇水梯度分离，一共获得4个亚流分(Fb4a-Fb4d)，其中30-40％甲醇水洗脱的为Fb4a，42-45％甲醇水洗脱的为Fb4b，46-50％甲醇水洗脱的为Fb4c，52-55％甲醇水洗脱的为Fb4d。将流份Fb4a溶于甲醇析出沉淀、重结晶获得化合物peniorcinol B(5)，将流份Fb4b溶于甲醇析出沉淀、重结晶获得化合物penialidin A(15)；将获得Fb4c流份用半制备HPLC纯化，45-55％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物8(7-dehydrobrefeldin A)；Fb4d用半制备HPLC纯化，35-45％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物6(peniorcinol C)；
将流份Fc经凝胶LH20分离，按照洗脱甲醇体积数收集2个亚流分，根据洗脱顺序收集50-78mL甲醇为亚流分Fc2，收集80-100mL甲醇为亚流分Fc1；将获得Fc1用半制备HPLC纯化，经50-60％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，保留时间tR 12-16min获得化合物16(penialidin F)和tR 18-20min获得化合物17(myxotrichin C)；将获得Fc2经ODS反相柱层析分离获得6个亚流分(Fc2a-Fc2f)，其中35-42％甲醇水洗脱的为Fc2a，43-46％甲醇水洗脱的为Fc2b，48-52％甲醇水洗脱的为Fc2c，53-57％甲醇水洗脱的为Fc2d，58-62％甲醇水洗脱的为Fc2e，63-66％甲醇水洗脱的为Fc2f；将亚流分Fc2a用半制备HPLC纯化，40-50％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物1(seco-4-epi-7-epi-brefeldin A methyl ester)；将亚流分Fc2b用半制备HPLC纯化，45-55％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，保留时间tR 19-22min获得化合物3(4-epi-6-epi-hydroxy-brefeldin C)和保留时间tR 22-24min获得化合物11(7-epi-brefeldin A)；将亚流分Fc2c用半制备HPLC纯化，50-60％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物9(6β-hydroxy-brefeldin C)；将亚流分Fc2d用半制备HPLC纯化，50-60％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物12(4-epi-15-epi-brefeldin A)；将亚流分Fc2e用半制备HPLC纯化，35-45％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物4(peniorcinol A)；将亚流分Fc2f用半制备HPLC纯化，30-40％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物14(2-(4-hydroxy-2-methoxy-6-methylphenyl)acetic acid)；
将流份Fd经ODS反相柱层析分离获得2个亚流分(Fd1-Fd2)，其中35-42％甲醇水洗脱的为Fd1，43-48％甲醇水洗脱的为Fd2。将亚流分Fd1经35-45％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物2(4-epi-7-epi-brefeldin A seco-acid)；将亚流分Fd2经40-50％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物10(6R-hydroxy-brefeldin A)；
将流份Fe经凝胶LH20除杂，甲醇溶解析出沉淀，沉淀再用甲醇重结晶获得化合物18(核黄素)。
所述步骤1)中液体培养基为每升水中淀粉10g，葡萄糖20g，酵母提取物1g，黄豆饼粉0.5g，大麦提取物2.5g，硫酸氨1g，硝酸钾0.8g，碳酸钙4g，七水合硫酸镁2.5g，磷酸二氢钾3g，硫酸铜0.02g，pH7.0。
所述步骤2)固相吸附后，先用蒸馏水洗涤树脂，在用体积比为1:20-1:6甲醇水洗涤，最后用甲醇解吸，回收甲醇溶剂后得的粗提物；菌体利用丙酮超声提取10-30min，反复提取2-4次，回收丙酮溶剂后得粗提物；将两者粗提物合并得总提取物A。
一种生物活性次级代谢产物的制备方法所获得生物活性次级代谢产物的应用，述化合物1-3、5-11在制备作为潜在抗肿瘤治疗剂中的应用。
一种生物活性次级代谢产物的制备方法所获得生物活性次级代谢产物的应用，所述化合物4-6、14-15、17、19作为抗氧化剂。
一种生物活性次级代谢产物的制备方法所获得生物活性次级代谢产物的应用，所述化合物1、6、18、19在制备作为潜在降血糖药剂中的应用。
一种生物活性次级代谢产物的制备方法所获得生物活性次级代谢产物的应用，所述化合物13、17和20在制备作为己糖激酶II抑制剂中的应用。
本发明所具有的优点：
本发明生物活性次级代谢产物由菌株通过特定的发酵条件和工艺产生。由于不同发酵培养基和培养条件对代谢产物的产生有显著影响，本发明中的培养基和培养条件，能显著提高真菌F4a产生次级代谢产物的多样性，能制备得到结构新颖的活性多样的化合物，如化合物4-7类似结构尚未见报道，它们表现出抗肿瘤、降血糖和抗氧化活性。化合物1-3是BFA家族新结构成员，它们在成环、羟基取代或取代基立体化学与已经报道的BFA类化合物均不相同，特别是它们结构的改变对生物活性影响极大，并不能预知其抗肿瘤活性，如化合物1和2对肿瘤细胞H358无活性，但对肿瘤细胞SW620抑制活性显著，而化合物3则对测试的多种肿瘤细胞都有活性。
本发明由真菌次级代谢产物所述的化合物能通过真菌发酵生产，其制备方法简单、高效，所得产物纯度高。
本发明所得生物活性次级代谢产物具有显著的抗肿瘤、降血糖、抗氧化或己糖激酶抑制活性，它们可作为抗肿瘤、降血糖或抗氧化等的理想候选化合物，其中新化合物3多种肿瘤细胞均有活性，抑制活性甚至强于对照药物Gemcitabine和Dasatinib；新化合物4和5抗氧化ABTS·+的活性，高于阳性对照药剂L-Ascorbic acid。
附图说明
图1为本发明实施例提供的化合物1-20的结构式。
图2为本发明实施例提供的seco-4-epi-7-epi-brefeldin A methyl ester(化合物1)的HRESIMS谱。
图3为本发明实施例提供的化合物1-7的1H-1H COSY和HMBC的重要相关。
图4为本发明实施例提供的化合物1-3的NOESY的重要相关。
图5为本发明实施例提供的化合物1-4、6和7在CH3OH中的实验ECD光谱、计算ECD光谱。
图6为本发明实施例提供的4-epi-7-epi-brefeldin A seco-acid(化合物2)的HRESIMS谱。
图7为本发明实施例提供的4-epi-6-epi-hydroxy-brefeldin C(化合物3)的HRESIMS谱。
图8为本发明实施例提供的peniorcinol A(化合物4)的HRESIMS谱。
图9为本发明实施例提供的peniorcinol B(化合物5)的HRESIMS谱。
图10为本发明实施例提供的peniorcinol C(化合物6)的HRESIMS谱。
图11为本发明实施例提供的penipentenone A(化合物7)的HRESIMS谱。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明，但本专利的保护内容不仅限于此。
实施例1植物内生真菌F4a发酵生产多种生物活性物质的制备方法
使用液体培养基为每升水中淀粉10g，葡萄糖20g，酵母提取物1g，黄豆饼粉0.5g，大麦提取物2.5g，硫酸氨1g，硝酸钾0.8g，碳酸钙4g，七水合硫酸镁2.5g，磷酸二氢钾3g，硫酸铜0.02g，pH7.0。
将植物内生真菌F4a(CCTCCM 2012531)接种于PSA固体培养基上培养48h活化，然后接种于上述液体培养基，28℃培养72h作为种子液；再将发酵获得种子液按照体积比1：18接种于相同的发酵培养基，28℃振荡培养7天。将发酵液离心去菌体获得发酵上清液，将大孔吸附树脂HP20加入发酵液中固相吸附活性成分，树脂与发酵液体积比为1:25；吸附2h完成后，先后用蒸馏水、15％甲醇水溶液洗涤树脂，再用甲醇解吸，回收甲醇溶剂后得的粗提物。菌体利用丙酮超声30min，回收丙酮溶剂后得粗提物。将两者粗提物合并得总提取物A。
将提取物A，采用快速硅胶柱色谱法分离，按照二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:0-0:100梯度洗脱，获得5个流分(Fa-Fe)，其中纯二氯甲烷洗脱为流分Fa,二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:1-100:3洗脱为流份Fb,二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:4-100:6为流份Fc,二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:7-10:9将流份Fd,二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:10-100:15为流份Fe。
将上述收集流份Fa经凝胶LH20除杂，纯甲醇洗脱收集唯一色带，采用半制备HPLC纯化，经65％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物苔黑素单甲醚(13，29.8mg，tR：17.87min)。
将上述收集流份Fb经凝胶LH20分离，甲醇洗脱，根据洗脱顺序接收40-60mL甲醇为亚流分Fb4，接收62-100mL甲醇为亚流分Fb3，接收102-120mL甲醇为亚流分Fb2，接收125-140mL甲醇为亚流分Fb1。将上述获得Fb1亚流分甲醇溶解析出沉淀，所得沉淀用甲醇重结晶获得化合物吲哚-3-乙酸(19，3.4mg)；将上述获得Fb2亚流分用半制备HPLC纯化，经30％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得2-hydroxymethyl-3-methylcyclopent-2-enone(20，68.0mg，tR：17.08min)；将上述获得Fb3亚流分用半制备HPLC纯化，经40％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得penipentenone A(7，10.0mg，tR：15.86min)；将上述获得Fb4亚流分经ODS反相柱层析分离，获得4个亚流分(Fb4a-Fb4d)，其中32-40％甲醇水洗脱的为Fb4a，42-45％甲醇水洗脱的为Fb4b，46-50％甲醇水洗脱的为Fb4c，52-55％甲醇水洗脱的为Fb4d。将上述获得流份Fb4a醇溶解析出沉淀、重结晶获得化合物peniorcinol B(5，135.1mg)；将上述获得流份Fb4b醇溶解析出沉淀、重结晶获得化合物penialidin A(15，313.2mg)。将上述获得Fb4c亚流分经50％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得7-dehydrobrefeldin A(8，74.6mg，tR：21.71min)；将上述获得Fb4d亚流分经40％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得peniorcinol C(6，16.6mg，tR：17.21min)。
将上述获得流份Fc经凝胶LH20分离，甲醇洗脱，根据洗脱顺序收集50-78mL甲醇为亚流分F c2，收集80-100mL甲醇为亚流分Fc1。，将上述获得Fc1亚流分用半制备HPLC纯化，经55％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得penialidin F(16，34.0mg，tR：14.93min)和myxotrichin C(17，3.6mg，tR：19.25min)。
将上述获得Fc2亚流分经ODS反相柱层析分离，获得6个亚流分(Fc2a-Fc2f)，其中40％甲醇水洗脱的为Fc2a，45％甲醇水洗脱的为Fc2b，50％甲醇水洗脱的为Fc2c，55％甲醇水洗脱的为Fc2d，60％甲醇水洗脱的为Fc2e，65％甲醇水洗脱的为Fc2f。将上述获得Fc2a亚流分经45％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得seco-4-epi-7-epi-brefeldin Amethyl ester(1，27.6mg，tR：20.91min)；将上述获得Fc2b亚流分经50％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得4-epi-6-epi-hydroxy-brefeldin C(3，13.7mg，tR：21.43min)和7-epi-brefeldin A(11，42.9mg，tR：23.23min)；将上述获得Fc2c亚流分经55％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得6β-hydroxy-brefeldin C(9，20.7mg，tR：24.72min)；将上述获得Fc2d亚流分经55％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得4-epi-15-epi-brefeldin A(12，24.2mg，tR：25.21min)；将上述获得Fc2e亚流分经40％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得peniorcinol A(4，6.0mg，tR：17.70min)；将上述获得Fc2f亚流分经35％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得2-(4-hydroxy-2-methoxy-6-methylphenyl)acetic acid(14，17.3mg，tR：16.59min)。
将上述获得流份Fd经ODS反相柱层析分离，获得2个亚流分(Fd1-Fd2)，其中40％甲醇水洗脱的为Fd1，45％甲醇水洗脱的为Fd2。将获得Fd1亚流分经40％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得4-epi-7-epi-brefeldin Aseco-acid(2，28.6mg，tR：17.39min)；将获得Fd2亚流分经45％的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得6R-hydroxy-brefeldin A(10，19.2mg，tR：18.86min)。
将上述获得流份Fe经凝胶LH20除杂，甲醇洗脱，收集唯一色带，析出沉淀，用甲醇重结晶获得化合物核黄素(18，10mg)。
对上述获得活性物质化合物1-20的结构解析(参见图1-11)：
化合物1为无色透明油状物，HRESIMS数据显示一个m/z311.1866[M-H]-(calcdfor C17H27O5，311.1859)(图2)，推测其分子式为C17H28O5，不饱和度为4。在1H NMR(600MHz,DMSO-d6)谱(表1)中显示存在四个烯氢质子信号δH 6.92(dd，J＝15.6，4.0Hz)、5.92(dd，J＝15.6，1.8Hz)、5.62(dd,J＝15.2，9.6Hz)和5.35(m)；三个含氧次甲基质子信号δH 4.10(m)、4.01(m)和3.54(m)；一个甲氧基质子信号δH 3.63(s)；一个甲基质子信号δH 1.00(d，J＝6.2Hz)。13C NMR(150MHz,DMSO-d6)谱(表2)中给出17个碳信号，1个酯羰基碳信号，4个不饱和碳信号，3个连氧sp3杂化的碳信号，1个甲氧基碳信号。通过与brefeldin A的1D NMR比较发现，化合物1为brefeldin A(BFA)的类似物，具体结构需要2D NMR解析。通过1H-1H COSY谱中H-2/H-3/H-4的连接和HMBC谱中H-2/C-4(δC70.1)和H-3/C-1(δC 166.4)的连接，可推断存在C-1-C-2-C-3-C-4连接的片段；通过1H-1H COSY谱中H-10/H-11/H-12/H-13/H-14/H-15/Me-16的连接和HMBC谱中H-10/C-12(δC 32.1)、H-11/C-13(δC 25.5)、H-12/C-14(δC 38.6)、H-15/C-13(δC 25.5)和H-16/C-14(δC 38.6)的连接，可推断存在从Me-16到C-10连接的片段；通过1H-1H COSY谱中H-5/H-6/H-7/H-8/H-9的连接和HMBC谱中H-7/C-5(δC 46.5)、H-7/C-9(δC 43.2)、H-8/C-5(δC 46.5)、H-8/C-6(δC 36.4)和H-9/C-6(δC 36.5)的连接，可推断存在C-5-C-6-C-7-C-8-C-9的五元环片段；以上三个片段的连接是根据1H-1H COSY谱中H-4/H-5和H-9/H-10以及HMBC谱中H-4/C-6(δC 36.4)、H-5/C-10(δC 131.9)、H-8/C-10(δC131.9)和H-9/C-11(δC 130.3)(图3)。因此，推测化合物1为BFA类似物。然而，化合物1的C-15(δC 65.7)化学位移明显低于BFA的C-15(δC70.9)化学位移，并且在HMBC中未见H-15与C-1的连接信号，却可见H-17与C-1的连接信号，推测13元内酯环开环并形成甲酯。因此，化合物1的平面结构最终确定，如图1。化合物1的相对构型根据藕合常数和NOESY谱确定(图4)。H-2/H-3(J＝15.6Hz)和H-10/H-11(J＝15.2Hz)的耦合常数提示存在两个反式双键。NOESY谱中可见H-4/H-5、H-4/H-7、H-5/H-7、H-4/H-10和H-9/H-11的连接，未见H-5/H-9连接，可推断H-4、H-5、H-7和H-9分别为α-、α-、α-和β-构型。NOESY中H-10/H-13-α(δH 1.40)和H-15/H-13-α(δH 1.40)的连接推测H-15为α-构型(图4)。化合物1的绝对构型通过对比计算ECD和实验ECD获得(图5)，可知化合物1的绝对构型为2E、4S、5R、7R、9S、10E和15S。因此，化合物1的结构被表征为一种新的BFA衍生物，命名为seco-4-epi-7-epi-brefeldin Amethyl ester。
化合物2为无色透明油状物，HRESIMS数据显示一个m/z299.1854[M+H]+(calcdfor C16H27O5，299.1859)(图6)，推测其分子式为C16H26O5，不饱和度为4。仔细对比化合物1和2的1D NMR数据，发现化合物1的甲酯在化合物2中被甲酸取代(表1，2)。在NOESY谱中H-4/H-5、H-4/H-7、H-5/H-7、H-10/H-13-α(δH 1.40)和H-15/H-13-α(δH 1.40)连接信号与化合物1一致。因此，化合物2是化合物1的去酯化物(图4)。化合物2的绝对构型通过对比计算ECD和实验ECD获得(图5)，可知化合物2的绝对构型为2E、4S、5R、7R、9S、10E和15S。因此，化合物2的结构被表征为一种新的BFA衍生物，命名为4-epi-7-epi-brefeldin Aseco-acid。
化合物3为无色透明油状物，HRESIMS数据显示一个m/z279.1601[M-H]-(calcdfor C16H23O4，279.1596)(图7)，推测其分子式为C16H24O4，不饱和度为5。通过与6β-hydroxy-brefeldin C的1DNMR和2D NMR数据比较发现，化合物3的平面结构与其一致。化合物3的相对构型根据藕合常数和NOESY谱确定(图4)。H-2/H-3(J＝15.8Hz)和H-10/H-11(J＝15.2Hz)的耦合常数提示存在两个反式双键。NOESY谱中可见H-4/H-5、H-4/H-6、H-5/H-6、H-5/H-10和H-9/H-11的连接，未见H-5/H-9连接，可推断H-4、H-5、H-6和H-9分别为α-、α-、α-和β-构型。据文献报道，当Me-16为β取向时，C-16的化学位移为δC 21；当Me-16为α取向时，C-16的化学位移为δC 18。因此，推断化合物3的Me-16(δC 20.6)为β取向。化合物3的绝对构型通过对比计算ECD和实验ECD获得(图5)，可知化合物3的绝对构型为2E、4S、5R、6R、9S、10E和15S。因此，化合物3的结构被表征为一种新的BFA衍生物，命名为4-epi-6-epi-hydroxy-brefeldin C。
化合物4为无色透明油状物，HRESIMS数据显示一个m/z319.1190[M-H]-(calcdfor C17H19O6，319.1182)(图8)，推测其分子式为C17H20O6，不饱和度为8。1D NMR显示(表3和表4)，存在1个甲氧基、1个单峰的甲基、1个双峰甲基，1个单峰的亚甲基、4个次甲基(3个烯氢)和8个季碳。13C NMR(150MHz,DMSO-d6)谱(表4)中的6个碳信号(δC 158.6、155.7、138.1、116.9、108.9和96.8)推测存在一个四元取代的苯环。具体的取代基种类和取代位置通过HMBC确认。通过HMBC谱中H-3′/C-1′、C-5′；H-5′/C-1′、C-3′、C-8′；H-9′/C-2′；H-8′/C-1′、C-5′；H-7′/C-2′、C-6′的连接，推测存在4-hydroxy-2-methoxy-6-methylbenzyl片段(图3)。13C NMR(150MHz,DMSO-d6)谱(表4)中的4个碳信号(δC 164.6、160.4、100.9和100.8)以及HMBC谱中H-4/C-3、C-5、C-10′、C-11′；H-11′/C-4、C-5；H-7′/C-3的连接，推测存在一个2，3，5-三取代呋喃酸片段(图3)。通过1H-1H COSY谱中H-11/H-12/H-13的连接，可以推测存在2-羟基丙基片段(图3)。以上三个片段的连接是根据HMBC谱中H-7′/C-3、C-2′、C-6′和H-11′/C-4、C-5的连接(图3)，因此，化合物4的平面结构可确定。化合物4的绝对构型通过对比计算ECD和实验ECD获得(图5)，可知化合物4的绝对构型为12′R。因此，化合物4的结构被表征为一种新化合物，命名为peniorcinol A。
化合物5为白色粉末，HRESIMS数据显示一个m/z 277.1068[M+H]+(calcd forC15H17O5，277.1076)(图9)，推测其分子式为C15H16O5，不饱和度为8。化合物5与化合物4的1DNMR数据相似，区别在C-5位的取代基不同(表3和表4)，结合高分辨数据以及HMBC谱中H-11′/C-4、C-5的连接(图3)，可推断C-5位为甲基取代，因此，化合物5的结构被表征为一种新化合物，命名为peniorcinol B。
化合物6为无色透明油状物，HRESIMS数据显示一个m/z297.1100[M+Na]+(calcdfor C16H18O4Na，297.1100)(图10)，推测其分子式为C16H18O4，不饱和度为8。化合物6与化合物4的1D NMR数据对比，可发现存在4-hydroxy-2-methoxy-6-methylbenzyl片段(表3和表4)。通过HMBC谱中H-2/C-4、C-5；H-3/C-1、C-5、C-10′；H-10′/C-3、C-5；H-11′/C-1、C-4、C-7′的连接，可推断存在5-(hydroxymethyl)-4-methylenecyclopentanone。通过HMBC谱中C-1/H-3、H-7′、H-11′的连接可推测羰基在C-1位上。通过HMBC谱中H-7′/C-1、C-4、C-2′、C-6′、C-11′可推断C-7′连接在C-5和C-1′之间。因此，化合物6的平面结构可确定。化合物6的绝对构型通过对比计算ECD和实验ECD获得(图5)，可知化合物6的绝对构型为5R。因此，化合物6的结构被表征为一种新化合物，命名为peniorcinol C。
化合物7为无色透明油状物，HRESIMS数据显示一个m/z221.1176[M+H]+(calcdfor C13H17O3，221.1178)(图11)，推测其分子式为C13H16O3，不饱和度为6。1D NMR显示，存在2个单峰的甲基、4个亚甲基、1个次甲基和6个季碳(表4)。通过HMBC谱中H-1′/C-5′；H-5′/C-2′、C-3′、C-6′；H-6′/C-3′、C-5′；H-7′/C-2′、C-4′的连接，可推断存在3-(hydroxymethyl)-4-methylenecyclopentanone。通过HMBC谱中H-3/C-2；H-4/C-1；H-6/C-1、C-4的连接，可推断存在5-methylenecyclopentanone。通过1H-1H COSY谱中H-1/H-1′/H-5′的连接和HMBC谱中H-1′/C-2、C-5的连接，可推断两个片段是通过C-1和C-1′连接。因此，化合物7的平面结构可确定。化合物7的绝对构型通过对比计算ECD和实验ECD获得(图5)，可知化合物7的绝对构型为1′S。因此，化合物7的结构被表征为一种新化合物，命名为penipentenone A。
表1.化合物1-3的1H NMR(600MHz，DMSO-d6)
Figure GDA0004190657490000121
Figure GDA0004190657490000131
表2.化合物1-3的13C NMR(150MHz，DMSO-d6)
position 1 2 3
1 166.4,C 167.4,C 165.9,C
2 118.7,CH 120.0,CH 117.4,CH
3 152.4,CH 151.4,CH 153.6,CH
4 70.1,CH 70.1,CH 69.1,CH
5 46.5,CH 46.7,CH 60.9,CH
6 36.4,CH2 36.5,CH2 74.0,CH
7 70.6,CH 70.6,CH 35.0,CH2
8 42.5,CH2 42.5,CH2 31.0,CH2
9 43.2,CH 43.2,CH 40.4,CH
10 131.9,CH 131.9,CH 137.7,CH
11 130.3,CH 130.3,CH 129.0,CH
12 32.1,CH2 32.2,CH2 31.5,CH2
13 25.5,CH2 25.5,CH2 26.1,CH2
14 38.6,CH2 38.6,CH2 33.9,CH2
15 65.7,CH 65.7,CH 71.0,CH
16 23.7,CH3 23.7,CH3 20.6,CH3
17 51.3,CH3
表3.化合物4-7的1H NMR(600MHz，DMSO-d6)
Figure GDA0004190657490000141
表4.化合物4-7的13C NMR(150MHz，DMSO-d6)
position 4 5 6 7
1 209.0,C 137.7,C
2 164.6,C 164.7,C 132.5,CH 207.4,C
3 100.9,C 100.5,C 158.6,CH 33.7,CH2
4 100.8,CH 100.0,CH 150.8,C 31.4,CH2
5 160.4,C 159.3,C 55.7,C 172.3,C
6 17.2,CH3
1′ 116.9,C 116.9,C 114.6,C 41.3,CH
2′ 158.6,C 158.6,C 158.8,C 206.4,C
3′ 96.8,CH 96.7,CH 96.3,CH 138.3,C
4′ 155.7,C 155.7,C 156.2,C 173.3,C
5′ 108.9,CH 108.9,CH 108.9,CH 37.5,CH2
6′ 138.1,C 138.1,C 138.4,C 17.0,CH3
7′ 19.6,CH2 19.5,CH2 28.8,CH2 52.1,CH2
8′ 19.9,CH3 19.9,CH3 20.4,CH3
9′ 55.3,OCH3 55.3,OCH3 54.4,OCH3
10′ 164.3,C 164.2,C 111.9,CH2
11′ 42.7,CH2 19.2,CH3 64.7,CH2
12′ 64.0,CH
13′ 23.4,CH3
其他的已知化合物7-dehydrobrefeldin A(8)、6β-hydroxy-brefeldin C(9)、6R-hydroxy-brefeldin A(10)、7-epi-brefeldin A(11)、4-epi-15-epi-brefeldin A(12)、O-Methylorcinol(13)、2-(4-hydroxy-2-methoxy-6-methylphenyl)acetic acid(14)、penialidin A(15)、penialidin F(16)、myxotrichin C(17)、riboflavin(18)、indole-3-acetic acid(19)和2-hydroxymethyl-3-methylcyclopent-2-enone(20)通过比较NMR数据等方法鉴定(图1)。
实施例2上述获得次级代谢产物1-20的降血糖活性
(1)α-葡萄糖苷酶抑制活性
α-葡萄糖苷酶在食物吸收过程中起着重要的作用，必须与之结合后，食物才能消化和吸收。α-葡萄糖苷酶抑制剂的降糖机制是通过抑制肠黏膜上的α-葡萄糖苷酶，使淀粉分解为葡萄糖的速度减缓，减少和延缓小肠对葡萄糖的吸收，以降低血糖，对餐后高血糖的作用比较明显。
测定方法：精密吸取供试品系列溶液各20μL，加入30μL的α-葡萄糖苷酶溶液，再加入800μL的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH 6.8)，在37℃加热5min；加入150μL pNPG溶液(10mM)，混合均匀，在37℃加热30min；加入650μL的Na2CO3终止液(1M)终止反应，使用酶标仪进行测样，在405nm下测定吸光度值。每个供试品(上述获得次级代谢产物1-20)重复测定三次，阳性对照为阿卡波糖，阴性对照为20μL的DMSO。
α-葡萄糖苷酶抑制率％＝(1-Asamp/Acont)×100％，其中Asamp代表供试品溶液的吸光度值，Acont代表阴性对照溶液的吸光度值，最终实验结果用EC50值(μM)表示。
实验结果：化合物1-20的α-葡萄糖苷酶抑制实验结果见表5。结果表明，只有化合物1和6与阳性对照阿卡波糖(EC50＝2.62μM)相比，具有中等的α-葡萄糖苷酶抑制活性(EC50＝26.89μM和38.93μM)，其余化合物均未表现出α-葡萄糖苷酶抑制活性。
(2)蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制活性
蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)广泛存在于体内各组织中，它通过催化磷酸酪氨酸(pTyr)的去磷酸化反应，与蛋白酪氨酸激酶(PTKs)共同维持蛋白酪氨酸的磷酸化水平。PTP1B在2型糖尿病和肥胖症中扮演重要角色，它不仅是胰岛素和瘦素信号转导的关键生理调节因子，而且其与ER应激以及胰岛β细胞之间也有重要关联。因此，近年来PTP1B抑制剂已成为治疗2型糖尿病和肥胖症的研究热点。
测定方法：10μL供试品溶液(上述获得次级代谢产物1-20)和81μL酶溶液充分混合，置37℃恒温箱10min。再加入4μL底物溶液，放置37℃恒温箱30min后，加入5μL终止液，在酶标仪下405nm下测定吸光度值。
实验结果：化合物1-20的PTP1B抑制活性实验结果见表5。结果表明，化合物18和19与阳性对照NaVO4(EC50＝2.38μM)相比，具有中等偏上的PTP1B抑制活性(EC50＝8.87μM和11.68μM)，其余化合物均未表现出PTP1B抑制活性。化合物18和19的PTP1B抑制活性为首次报道。
实施例3上述获得次级代谢产物的抗氧化活性
体外评价和筛选物质抗氧化活性的方法有很多，如1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH)法、2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2,2′-azinobis(3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid)ammoniumsalt，ABTS)法、氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)法、铁离子还原法(ferric reducingantioxidant power，FRAP)法等。与其他相比，DPPH法和ABTS法具有稳定性好、灵敏度高、操作简单等优点。两者已在全世界范围内被广泛用于自由基清除能力的定量分析。
(1)DPPH自由基清除活性
测定方法：精密吸取上述供试品系列溶液各100μL和DPPH乙醇溶液100μL至96孔板，混匀，室温暗处反应30min，放入酶标仪，517nm处测定吸光度，每个供试品(上述获得次级代谢产物1-20)重复测定三次，维生素C为阳性对照，100μL的无水乙醇为阴性对照。DPPH自由基清除率计算公式如下：清除率％＝(1-Asamp/Acont)×100％，其中Asamp代表供试品溶液的吸光度值，Acont代表阴性对照溶液的吸光度值，最终实验结果用EC50值(μM)表示。
实验结果：化合物1-20的DPPH自由基清除活性实验结果见表5。结果表明，只有化合物16和17与阳性对照L-Ascorbic acid(EC50＝6.12μM)相比，具有中等的DPPH自由基清除活性(EC50＝28.42和30.07μM)，其余化合物均未表现出DPPH自由基清除活性。化合物16和17的DPPH自由基清除活性为首次报道。
(2)ABTS自由基清除活性
测定方法：将配好的ABTS+溶液用0.01M磷酸盐缓冲液稀释，大概32倍，稀释后避光放置30min(使测得的吸光度值准确)，用紫外分光光度计测定吸光度值，在0.7±0.02为合格，可以使用。精密吸取上述供试品系列溶液各100μL和ABTS+溶液3mL至玻璃试管中，混匀，室温暗处反应6min，放入酶标仪，734nm处测定吸光度，每个供试品(上述获得次级代谢产物1-21)重复测定三次，阳性对照为维生素C，阴性对照为100μL的无水乙醇。ABTS+清除率计算公式同DPPH自由基清除率的计算公式，最终实验结果用EC50值(μM)表示。
实验结果：化合物1-20的ABTS自由基清除活性实验结果见表5。结果表明，化合物15-17的ABTS自由基清除活性(EC50＝14.54、7.61和14.96μM)优于阳性对照L-Ascorbicacid(EC50＝18.81μM)；化合物4-6、14和19具有中等偏上的ABTS自由基清除活性，其余化合物均未表现出ABTS自由基清除活性。其中化合物16的ABTS自由基清除活性文献已经报道，其余活性化合物的ABTS自由基清除活性均首次报道。
表5化合物1-20抗氧化和降血糖活性
Figure GDA0004190657490000171
实施例4上述获得次级代谢产物的抗肿瘤活性
选取KRAS基因突变的肿瘤细胞非小细胞肺癌H358细胞(KRASG12C)、结肠癌SW620细胞(KRASG12V)，及人肝癌细胞(HepG-2)、人胰腺癌细胞(PC-3和ASPC-1)和人淋巴瘤细胞(Romas)等肿瘤细胞株作为评价抗肿瘤活性的细胞株。
测定方法：在96孔板中放置100μL的细胞悬浮液，将培养板在培养箱预培养24小时(37℃，5％ CO2)。向培养板中加入10μL浓度为40μM、5μM、1.25μM、0.625μM和0.3125μM的化合物(上述获得次级代谢产物1-3和8-12)。将培养板在培养箱孵育12-48h时间。向每孔加入10μL的CCK8溶液。将培养板在培养箱内孵育2h。用酶标仪测定在450nm处的吸光度值，最后获得IC50值。
实验结果：化合物1-3和8-12的抗肿瘤活性实验结果见表6。结果表明，化合物1和2的抗肿瘤活性明显低于化合物3、8-11，推断与13元内酯环开环有关。化合物12与化合物3、8-11对比，没有抗肿瘤活性。除了对BFA类化合物进行了抗肿瘤活性的评价，还对新化合物5-7进行了抗肿瘤活性的筛选(测试浓度为40μM)(表7)，结果表明，化合物5具有较弱的抗人转移胰腺腺癌细胞(ASPC-1)、人原位胰腺腺癌细胞(BXPC-3)、人原髓细胞白血病细胞(HL-60)和人淋巴瘤细胞(Romas)的活性；化合物6具有较弱的抗HL-60的活性；化合物7具有较强的抗ASPC-1的活性。
表6化合物1-3和8-11的抗肿瘤活性(IC50,μM)a.
Figure GDA0004190657490000181
表7化合物5-7抗肿瘤活性(inhibition ratio,％)a.
Figure GDA0004190657490000182
实施例5上述获得次级代谢产物的己糖激酶2(HK2)抑制活性
HK2是糖酵解途径第一步的限速酶，与正常细胞相比，其在癌细胞中的表达水平较高。HK2由于其在肿瘤发生和转移过程中的关键作用，为肿瘤治疗提供了一个新的靶点。
将上述获得次级代谢产物，使用HK2酶活测定试剂盒，测定它们对HK2的抑制作用。HK2催化葡萄糖进行磷酸化转化为葡萄糖-6-磷酸，后者被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化形成NADPH。NADPH的生成速率与葡萄糖浓度有关，NADPH在340nm有特异吸收峰，在波长340nm处检测吸光度的变化，测定化合物对HK2抑制活性的IC50值，每组实验平行进行三次。
实验结果：化合物1-20的HK2抑制活性实验结果表明，化合物17(EC50＝8.01μM)表现出与阳性对照benserazide(EC50＝5.52μM)相似的HK2抑制活性，化合物13和20表现出中等活性的HK2抑制活性(EC50＝46.16μM和25.02μM)，其余化合物均未表现出HK2抑制活性。化合物13、17和20的HK2抑制活性为首次报道。

Claims (6)

1.一种生物活性次级代谢产物，其特征在于：生物活性次级代谢产物为下述化合物1-3、7：
Figure QLYQS_1
。
2.一种如权利要求1所述的生物活性次级代谢产物的制备方法，其特征在于：
1) 将植物内生真菌F4a接种于PSA固体培养基上培养48-96 h活化，活化后接种于液体培养基中于28-32℃培养48-72 h所得培养物作为种子液；将所得种子液与液体培养基按体积比1:25-1:15混合，26-32℃振荡培养6-9天；
2) 将发酵液离心去菌体获得发酵上清液，用大孔吸附树脂HP20固相吸附发酵液中活性成分，树脂与发酵液体积比为1:15-1:25；吸附1-3 h，吸附后洗涤获得粗提物；分离所得菌体经丙酮提取获得粗提物，合并粗提物即得总提取物A；
3) 将总提取物A，采用硅胶柱色谱法分离，按照二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:0-0:100梯度洗脱，收集各组分，即得生物活性次级代谢产物。
3.按权利要求2所述的生物活性次级代谢产物的制备方法，其特征在于：所述步骤3）经硅胶柱色谱法分离，纯二氯甲烷洗脱为流分Fa,二氯甲烷：甲醇的体积比为100:1-100:3洗脱为流份Fb,二氯甲烷：甲醇的体积比为100:4-100:6洗脱为流份Fc,二氯甲烷：甲醇的体积比为100:7-10:9洗脱为流份Fd,二氯甲烷：甲醇的体积比为100:10-100:15洗脱为流份Fe；
将流分Fb经凝胶LH20分离，按照洗脱甲醇体积数分成4个亚流分，根据洗脱顺序接收40-60 mL甲醇为亚流分Fb4，接收62-100 mL甲醇为亚流分Fb3，接收102-120 mL甲醇为亚流分Fb2，接收125-140 mL甲醇为亚流分Fb1；将亚流分Fb3用半制备HPLC纯化，经35-45%的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0 mL/min，获得化合物7；
将流份Fc经凝胶LH20分离，按照洗脱甲醇体积数收集2个亚流分，根据洗脱顺序收集50-78 mL甲醇为亚流分Fc2，收集80-100 mL甲醇为亚流分Fc1；将获得Fc2经ODS反相柱层析分离获得6个亚流分Fc2a-Fc2f，其中35-42%甲醇水洗脱的为Fc2a，43-46%甲醇水洗脱的为Fc2b，48-52%甲醇水洗脱的为Fc2c，53-57%甲醇水洗脱的为Fc2d，58-62%甲醇水洗脱的为Fc2e，63-66%甲醇水洗脱的为Fc2f；将亚流分Fc2a用半制备HPLC纯化，40-50%的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物1；将亚流分Fc2b用半制备HPLC纯化，45-55%的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0 mL/min，保留时间t R 19-22 min获得化合物3；
将流份Fd经ODS反相柱层析分离获得2个亚流分Fd1-Fd2，其中35-42%甲醇水洗脱的为Fd1，43-48%甲醇水洗脱的为Fd2；将亚流分Fd1经35-45%的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0 mL/min，获得化合物2。
4. 按权利要求2所述的生物活性次级代谢产物的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中液体培养基为每升水中淀粉10 g，葡萄糖20 g，酵母提取物1 g，黄豆饼粉0.5 g，大麦提取物2.5 g，硫酸氨1 g，硝酸钾0.8 g，碳酸钙4 g，七水合硫酸镁2.5 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸铜0.02 g，pH7.0。
5.按权利要求2所述的生物活性次级代谢产物的制备方法，其特征在于：所述步骤2）固相吸附后，先用蒸馏水洗涤树脂，再用体积比为1:20-1:6甲醇水洗涤，最后用甲醇解吸，回收甲醇溶剂后得的粗提物；菌体利用丙酮超声提取10-30 min，反复提取2-4次，回收丙酮溶剂后得粗提物；将两者粗提物合并得总提取物A。
6.一种权利要求1所述的生物活性次级代谢产物的应用，其特征在于：
所述化合物1在制备抗结肠癌SW620细胞KRASG12V，人肝癌细胞HepG-2、人胰腺癌细胞PC-3和ASPC-1治疗剂中的应用；
所述化合物2在制备抗非小细胞肺癌H358细胞KRASG12C治疗剂中的应用；
所述化合物3在制备抗结肠癌SW620细胞KRASG12V、人肝癌细胞HepG-2、人胰腺癌细胞PC-3和ASPC-1、非小细胞肺癌H358细胞KRASG12C治疗剂中的应用；
所述化合物7在制备抗人转移胰腺腺癌细胞ASPC-1治疗剂中的应用。
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