JP5222562B2 - エクオル濃度調節剤 - Google Patents
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Description
エクオル濃度調節活性(%)=(対象とする糖類を含む培養液中のエクオル濃度)/(糖類を含まない培養液中のエクオル濃度)×100
エクオルプロデューサーの新鮮排泄便について、ガラスビーズ(φ3mm)を用いて10倍容の嫌気状態の希釈液(KH2PO4 0.00255%、K2HPO4 0.00255%、NaCl 0.006%、(NH4)2SO4 0.00255%、CaCl2 0.000255%、MgSO4 0.000255%、0.1%レサズリン溶液 0.1%、8%Na2CO3溶液 2.2%、L−システイン塩酸塩 0.05%)に懸濁し、滅菌ガーゼを用いて固形分を除去した。8,000rpm、10分の遠心分離を行い、沈殿を同量の同希釈液にて懸濁した。この状態で−30℃にて凍結保存した。
解凍した糞便希釈液について再度遠心分離し、沈殿を100倍容のPY培地(ペプトン 0.5%、トリプチケースペプトン 0.5%、イーストエキス 1%、ヘミン 0.00005%、ビタミンK1 0.0001%、L−システイン塩酸塩 0.05%、KH2PO4 0.0006%、K2HPO4 0.0006%、NaCl 0.0012%、(NH4)2SO4 0.0006%、CaCl2 0.00006%、MgSO4 0.00006%)に再懸濁した。その際に最終濃度1%となるように、アドニトール、アラビノース、セロビオース、エリスリトール、フラクトオリゴ糖、フルクトース、ガラクトース、グルコース、グリコーゲン、イノシトール、イヌリン、ラクチトール、ラクトース、ラクチュロース、マルトース、マンニトール、マンノース、メレチトース、メリビオース、ラフィノース、ラムノース、リボース、ソルビトール、ソルボース、シュクロース、トレハロース、キシロース、ガラクトオリゴ糖を加えた。同時に糖を添加しない系列も作製した。それらに最終濃度100μMとなるようにダイゼインを添加し、37℃で、16時間完全嫌気培養を行った。なお、培養はすべて独立した4系列で行った。得られた培養液から、ダイゼインとエクオルの抽出及びHPLC分析を行った。なお、ここで用いたイノシトールは、SIGMA社製のmyo−イノシトールである。グリコーゲンは、SIGMA社製のグリコーゲンであり、その由来は、牡蠣である。トレハロースは、SIGMA社製のD(+)トレハロースであり、α,α体である。ガラクトオリゴ糖は、ヤクルト薬品工業社製のTOS−Sであり、4’ガラクトシルラクトースと6’ガラクトシルラクトースとの混合物である。フラクトオリゴ糖は、和光純薬社製であり、1−ケストース、ニストース、1−フラクトシル−D−ニストースとの混合物である。
ダイゼイン及びエクオルの抽出は以下のように行った。培養液500μLに250μLのジエチルエーテルを添加し十分に攪拌した。この混合液を2,000rpmにて10分間遠心分離し、ジエチルエーテル層を得た。残った水層に対して同様のジエチルエーテル抽出を再び行い、2度の抽出で得られたエーテル層を併せて窒素ガス噴射下40℃にて濃縮乾固した。これを250μLの80%メタノールにて溶解し、フィルター濾過した通過物を測定検体とした。
また、HPLC条件は次の条件で行った。
装置:LCモジュール1(Waters)
カラム:YMC−Pack CN(Y.M.C製)
検出:紫外吸光光度計(測定波長 280nm)
カラム温度:40℃
移動相:0.1%蟻酸溶液/アセトニトリル/メタノール(87:3:10)混液
流量:2.5mL/min
サンプル注入量:10μL
上記条件にて、ダイゼイン、エクオルの標準品をそれぞれ注入し、検量線を作成して、試料中のダイゼイン、エクオル濃度を測定した。得られた濃度より段落〔0020〕に記載した数式を用いてエクオル濃度調節活性を算出した。
その結果を表1及び図1に示した。糖無添加を100%とした場合、フラクトオリゴ糖、グルコース、イヌリン、ラクトース、ラクチュロース、メリビオース、ラフィノース、シュクロース、ガラクトオリゴ糖では、エクオル変換が50%以下に抑制されていたことから、負のエクオル濃度調節活性があることがわかった。特に、フラクトオリゴ糖、グルコース、イヌリン、ラクトース、ラフィノース、シュクロース、ガラクトオリゴ糖では、生成したエクオルは全く見られず培地に添加した100μMのダイゼインが殆ど残存していた。なお、イヌリンにはラットの血清中のエクオル濃度を低下させる作用が知られているが(非特許文献5)、今回の試験系でもイヌリンにダイゼインからのエクオル変換能を著しく低下させる作用が見出された。また、フラクトオリゴ糖にはエクオル産生を促進させるとの報告(非特許文献5)、及びヒト糞便培養物のエクオル産生活性を低下させるとの報告(非特許文献6)があるが、今回の試験系ではフラクトオリゴ糖にダイゼインからのエクオル変換能を著しく低下させる作用が見出された。
一方、アドニトール、アラビノース、エリスリトール、ガラクトース、ラクチトール、メレチトース、トレハロース、リボース、ソルボース、キシロース、イノシトール、ソルビトールでは、エクオル変換が200%以上に促進されていたことから、正のエクオル濃度調節活性があることがわかった。特に、ラクチトール、メレチトース、トレハロース、ソルボース、キシロース、イノシトールでは、培地に添加した100μMのダイゼインの70%以上がエクオルに変換されており、エクオル濃度調節活性も400%以上であった。
試験例1に記載の方法にて保存した糞便懸濁液を500μLのPY培地(PY培地に最終1%となるようにアドニトール又はソルボースを添加、アドニトール又はソルボースの代わりに滅菌蒸留水を添加したものを対照とした)に1/10となるように懸濁し、最終濃度100μMとなるようにダイゼインを添加した。それを16時間、37℃にて完全嫌気培養した。培養後液50μLを新しい500μLの同培地に植え継ぎ、残りはダイゼイン及びエクオルの抽出に用いた。植え継ぎ以降の操作を順次繰り返し、継代を重ねた。その際に、適宜菌液をグラム染色し、顕微鏡観察した。ダイゼイン及びエクオルの抽出及びHPLCによる定量は、試験例1に記載の方法で行った。得られたダイゼイン及びエクオル濃度を次式に当てはめることによりダイゼイン−エクオル変換率を求めた。なお、培養はすべて独立した3系列で行い、平均値と標準偏差を求めた。
ダイゼイン−エクオル変換率(%)=100×(培養液中のエクオル濃度)/(培養液中のエクオル濃度+ダイゼイン濃度)
その結果、図2に示すように、アドニトール、ソルボースを糖源とした場合、それぞれ8代目、及び11代目までダイゼイン−エクオル変換能が維持できた。また、11代目の培養液内には元来の糞便由来物は1012分の1しか含まれていないことから、ソルボースを糖源としたPY培地のみでエクオル変換能を維持できることが推察された。また、ソルボースを糖源としたPY培地で11代培養した際のグラム染色像を観察すると、3〜5種類の細菌が観察された。このことから、11代の継代培養によりエクオル変換菌が選択的に増殖していることがわかった。
下記の処方で各種成分を混合して造粒・乾燥・整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
(処方) (mg)
微結晶セルロース 100
トレハロース 80
ステアリン酸マグネシウム 0.5
メチルセルロース 12
下記処方により、常法に従って各成分を配合し、均質化して清涼飲料を得た。得られた清涼飲料は褐色瓶に充填後、アルミキャップにて封印し、加熱処理を施した。
(処方) (g)
香料 0.8
クエン酸 0.2
果糖 4
ガラクトオリゴ糖 1.5
水 93.5
下記の組成で各種成分を混合し、水を用いて1Lに調整した後、滅菌してエクオル変換能を有する微生物の選択培地を製造した。
(組成) (g)
ペプトン 5
トリプチケースペプトン 5
イーストエキス 10
アドニトール 10
ソルボース 10
ヘミン 0.0005
ビタミンK1 0.001
L−システイン塩酸塩 0.5
KH2PO4 0.006
K2HPO4 0.006
NaCl 0.012
(NH4)2SO4 0.006
CaCl2 0.0006
MgSO4 0.0006
10mMダイゼイン溶液 10
Claims (5)
- アドニトールを有効成分とする、微生物によるダイゼインからのエクオル変換の促進剤。
- 体内におけるエクオル濃度を上昇させるものである請求項1記載の促進剤。
- さらにダイゼインを含有する請求項1又は2に記載の促進剤。
- アドニトール及びダイゼインを含有することを特徴とするエクオル変換能を有する微生物の選択培地。
- 請求項4記載の選択培地を用いて、検体に含まれるエクオル変換能を有する微生物を培養することを特徴とする検体中のエクオル変換能を有する微生物の検出方法。
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