JPS62220198A

JPS62220198A - デイメイン修正培地

Info

Publication number: JPS62220198A
Application number: JP6545786A
Authority: JP
Inventors: Kanji Suzuki; 鈴木　寛二
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1986-03-24
Filing date: 1986-03-24
Publication date: 1987-09-28
Also published as: JPH0586193B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はディメイン修正培地、更に詳しくはガスソー法
に用いる改良されたディメイン修正培地に関するもので
ある。

〔従来の技術〕

現在、臨床症状を呈する種々の先天性代謝異常症が知ら
れている。特に脳障害を起し、精神薄弱を伴う先天性ア
ミノ酸代謝異常症としてフェニールケトン尿症、メイグ
ルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、ヒスチジン血症等
が知られている。

これらの疾患の罹患愚兄の血液中には、疾患に対応した
アミノ酸が増加することから、最近ではこのアミノ酸量
を指標とするスクリーニング法が該疾患の早期発見の為
に広〈実施されている。

１９６１年、ガスジー（Ｇｕｔｈｒｉｅ　）は枯草菌を
利用し、新生児から採った微量の血液をｐ紙にしみこま
せたＦ紙片を用い、血中の７エニールアラニン量を測定
するバクチリアル・インヒビ？／　ｗ　７　・７　ｙ　
セイ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　Ａ
ｓ５ａｙ　：以下ＢＩＡ　と略称する）法を考案した〔
アール・ガスジー、ジャーナル　オプ　アメリカン　メ
ディカル　ソサエティ、第１７８巻、８６３頁。

１９６１年　　（几、Ｇｕｔｈｒｉｅ　、　　Ｊ、Ａｍ
ｅｒ、Ｍｅｄ。

Ａｓ５ｏｃ、、１７８，８６３．１９６１））。

その後、フェニールアラニンの他にロイシン、メチオニ
ン、ヒスチジン等のアミノ酸についてもＢＩＡでの測定
が可能となった〔アール、ガスジー、パース　ディテク
ト、オリジナル　アーティクル　シリーズ、ＩＩＸＷ巻
、第６９２号。

１９６８年（Ｒ，Ｇｕｔｈｒｉｅ　、　Ｂｉｒｔｈ　Ｄ
ｅｔｅｃｔ　。

Ｏｒｉｇｉｎａｌ　Ａｒｔｉｃｌｅ　５ｅｒｉｅｓ　、
　Ｖｏｌ、　ｐｉ　、　ＪＥ　６９２゜１９６Ｂ））。

ガスジーの開発した上記ＢＩＡ法は、一般にガスソー法
として知られており、その方法は枯草菌の発育に必要な
アミノ酸に対する代謝阻害剤を含む寒天平板培地上に１
血液を浸みこませたＦ紙片（ディスク）を置いて培養す
ると、血液中に存在するアミノ酸によって菌が阻害剤の
作用に打ち勝って発育し、この菌の発育の程度は血液中
に含まれるアミノ酸量に比例することから、アミノ酸に
対応する阻害剤を選択することによって、数種のアミノ
酸代謝異常症の検出、即ちマススクリーニングを可能と
するものである。

該ガスソー法によるマススクリーニングは、世界各国で
広く採用されており、我国でも１９７７年　の厚生省よ
りの各都道府県への通達によシ、全国的に実施されてい
る（厚生省通知。

「先天性アミノ酸代謝真常検査の実施について」児童家
庭局発第４４１号、７月１４日、１９７７年）。

との検査法に使用される培地が、ガスジー法用ディメイ
ン修正培地である。本培地は通常使用濃度の１０倍濃度
に調整された液体培地であり、一般的な組成例としては
、培地１００　（１ｗｊあ九シリン酸二カリウム１５０
ｙ、　　リン酸−カリウム５０１％塩化アンモニウム２
５＃、硝酸アンモニウム５１１硫酸す）　ＩＪウム５ｙ
、Ｌ−グルタミン酸５１％Ｌ−アスパラギン５＃、Ｌ−
アラニン２．５　ｐ、硫酸マグネシウム（ＬＳＩ、塩化
マンガン（ＬＯ５＃、塩化第二鉄（ＬＯ５＃、塩化カル
シウムα０５Ｉおよびブドウ糖（グルコース）５０ｇで
構成されており、ｐＨは＆　８４７．０に調整されてい
る。

検査の実施に際して、精製寒天を精製水に溶解した寒天
液に、ディメイン修正培地を必要量加え混和し、規定量
の各種の阻害剤液と枯草菌芽胞液を必要に応じて希釈し
たのち、その適量を加え寒天プレート（寒天平板培地）
として使用する。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、従来の液体培地であるディメイン修正培
地は、保存状態によっては本来の無色澄明の色調が黄色
から褐色、遂には黒色へと経時的に変化してしまうとい
う大きな欠点を有していた。

即ち、このような経時変化による褐色化が起ると、外観
上の商品価値を低下させるだけでなく、褐色化の進行に
つれ菌の発育が愚くなり、培地としての性能をも低下さ
せ、スクリーニングの正しい結果が得られなくなる。

本発明は上記従来技術における問題点を解決するための
ものであり、その目的とするところは長期保存しても着
色せず、安定性の向上したディメイン修正培地を提供す
ることにある。

〔問題点を解決するための手段〕

すなわち本発明のディメイン修正培地は、マンニット、
サッカロース、トレハロース及ヒソルビットからなる群
から選ばれる少なくとも１種の糖を含有することを特徴
とする。

本発明者は、上述の従来のディメイン修正培地の経時変
化による褐色化は、培地組成中に含まれる糖の性質に起
因するのではと考え、鋭意検討の結果、本発明を完成し
た。

糖の種類としては加熱したときにカラメル化を起し難く
、且つガスソー法で用いる枯草菌が利用可能であるもの
がよい。又、実用上充分な純ｆのものが安晶に入手し得
ると都合がよい。

これらの点よシマンニット、サッカロース、トレハロー
ス及びソルビットが好ましい。

これらの糖は単独又は２種以上を組合せて用いることが
できる。糖の含有量は、使用濃度の１０倍濃度の液体培
地１０００７あた＃）２０〜１００Ｉが適量である。

糖以外の成分は通常ディメイン修正培地に使用されるも
のを用いることができる。

本発明のディメイン修正培地は、現在一般に広く用いら
れている使用濃度の１０倍濃度の液体培地としては勿論
、乾燥粉末培地の形態でも供給することができる。又、
ペースト状などの他の形態でもよく、これらの形態のう
ちで使用目的や保管状態等に応じて最も適するものを週
明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるもので
はない。チは重量−を示す。

１）糖の種類とカラメル化種々の糖について、カラメル化の検討を行なった。実験
に使用した糖は、還元糖としてキシロース、マルトース
、アラビノース、フルクトース、マンノース、メリビオ
ース、ラクトース、ラムノース、グルコースの９種類を
用いた。又、非還元糖としてマンニット、アトニット、
サッカロース、ズルシット、トレハロース、イノフット
、ソルビットの７種類を用いた。前述した１０倍濃度の
ディメイン修正培地の成分中からグルコースを除いたも
のを調製し、これに各種の糖をそれぞれ培地１０１００
ＯあたＪ、５０ｓ加え九培地を調製した。これらを１０
０℃の沸とう水中で１５分間加熱したときのカラメル化
による着色を観察した。結果を表−１に示す。

表−１表−１の結果より９種類の還元糖は全て、カラメル化を
起むし、培地が黄色〜褐色に着色した。一方７種類の非
還元糖は、全てカラメル化を起こさず、培地を着色しな
かった。これらのことから当培地に使用する糖は非還元
糖がよいことが確認された。

ｌ）枯草菌ＡＴＣＣ−６６５５とＡＴＣＣ−６０５Ｉ　
Ｏ糖利用能次に、７種類の非還元糖の各々について。

Ｂｌλに用いる、枯草菌ＯＡ’Ｉ’ＣＣ−６６５５およ
びＡＴＣＣ−６０５１の糖利用能について検討を加えた
、糖分解用培地は、フエーレイ７ノｙ　（Ｈｕｇｈ−Ｌ
ｅｉｆｉｏｎ　）　　の基礎培地を用いて調製し丸。す
なわち、培地１０００ｄあたシカゼインペプトン２＃、
塩化ナトリウム５１．　　リン＠２カリクムＩＩＬ５　
＃、カンテン２Ｉ、およびａ２−プ四ムチモールブルー
溶液４０−を加え、ｐＨｔ−７，０にｇａしたものを基
礎培地として、これに上記非還元糖を各々１１に加えた
培地を調製した。これに枯草菌ＡＴＣＣ−６６５５お−
よび人ＴＣＣ−６０５１を接種し、５７℃で４８時間培
養して糖の利用能を調べた。

対照としてグルコースを１％に加えた培地についても併
せて実施した。結果を表−２に示すＯ表−２表−２の結果から枯草［ＡＴＣＣ−６６５５とＡＴＣＣ
−６０５１の両者が利用できる非還元糖ハマンニット、
サッカロース、トレハロース、ソルビットであり、イノ
ジットはＡＴＣＣ−６０５１は利用できるがＡＴＣＣ６
６３３は利用できない。アトニットとズルシットはいず
れの菌も利用できないことが確認された。これらのこと
からガスソー法のＢＩＡＫ匣用できる非還元糖としては
、マンニット、サッカロース、トレハロース、およびソ
ルビノトカ予想された。

Ｉ）ガスソー法に使用できる糖の最適置火に、上記ｉｔ
）で求めたマンニット、？ツカａ−ス、トレハロース、
ソルビットニついて培地中の最適量を求めるために、そ
れぞれの糖を１０倍濃度の培地１００Ｏｄあたシ２０１
１５０Ｉ、１００ｙ加えた各々の培地をｍａｒ。

た。これらの培地でガスソー法に使用する寒天平板を作
成し、これに各アミノ酸の凛準血液Ｆ紙〔富士レビオ株
製〕をのせて、発育帯・を観察した。対照としてグルコ
ースについても同様に加えた培地を調製して併せて実施
した。結果を表−３−Ａから表−５−Ｄに示す。

表−ｓ　−Ａ測定アミノ酸：フェニルアラニン（ＰＫＶ）使用菌株：
枯草菌ＡＴＣＣ−６６ｓｓ表中の数値は発育帯の直径（％）を示す。

表−５−Ｂ測定アミノ酸（メチオニン（ＨＣＵ）使用菌株：枯草菌ＡＴＣＣ−６６ｓｓ表中の数値は発育帯の直径（））を示す。

表−Ｓ　−Ｃ測定アミノ酸：ヒスチジン（ＨＥ）使用菌株：枯草菌ＡＴＣＣ−６６３３表中の数値は発育帯の直径（％）を示す。

表−５−Ｄ測定アミノ酸：ロイシン（Ｍ８ＵＤ）使用菌株：枯草菌ＡＴＣＣ−６０５１表中の数値は発育帯の直径（ｔ）を示す。

表−３の結果からいずれの糖も２０〜１００１で使用で
きることが確認された。

ＩＶ）　　培地の熱安定性および経時安定性上記Ｖで調
製した各培地のうち、各々の糖を５０１／ｌ　含むもの
を用いて次のような種々の条件での安定性について検討
した。すなわち、それぞれの培地を１００℃の沸とう水
中で３０分間、加熱したもの、３７℃で１週間、２５℃
で２年間、１５℃で５年間及び４〜１０°０で３年間各
々保存したものの色調の変化を観察した。その結果、グ
ルコース以外の全ての楯についてはこれらの全ての条件
下での色調の変化がないことが確認された。一方、グル
コースを加えた培地については、下記表−４−Ａに示す
ように保存温度が高いほど経時的に着色しやすいことが
確認された。

培地の着色の強さは、分光光−置針を用いて、波長４０
０ａ＋での吸光度から求めた。図に各保存温度における
吸光度と保存期間との関係を示す。

表−４−Ａなお、吸光度と肉眼での色調との関係を表−４−ＢＫ示
す。

表−４−Ｂ図から明らかなように本発明の培地は長い間保存しても
全く着色しないが、従来の培地は著しく着色するのが判
るＧ ■）各温度条件における培地の保存期間とガスジー法で
の効力試験上記ｔｖ）で用いた５０１／ｌ　の糖を含む各々の培地
について４〜１０℃に長期間保存して、上記幻と同様の
方法でガスジー法を実施した。

対照として各糖ごとに調製直後の培地についても併せて
実施した。結果を表−５−Ａないし表−５−Ｈに示す。

表−５の結果からマンニット、サッカロース、トレハロ
ース、ソルビット、については４〜１０℃で３年間保存
したものでも調５１！直後の培地と効力的にほとんど差
が認められないため、長期間安定なことが確認された。

一方、グルコースについては経時的にカラメル化の進行
と共に各アミノ酸において発育帯の径が小さくなり、定
量性が悪くなることが確認された。

以上のように本発明者は、従来のガスジー法用ディメイ
ン修正培地に含まれる還元糖であるグルコースが培地の
カラメル化の原因であることをつきとめ、さらに非還元
糖のうち枯草苫ＡＴＣＣ−６６５５およびＡＴＣＣ−６
０５１のいずれにも利用される糟であればどのようなも
のでも長期間にわたって培地の安定化をはかることが可
能であることをつきとめ、改良されたガスジー法用ディ
メイン修正培地を完成した。

〔発明の効果〕

上述のように本発明のディメイン修正培地は。

マンニット、サッカロース、トレハロース及ヒソルビッ
トからな１廊から選ばれる少なくとも１種の糖を含有す
るため、長期保存しても着色せず、従来のディメイン修
正培地に比べて安定性が非常に向上した。又、このため
その管理も容易となった。

【図面の簡単な説明】

図は本発明及び従来のディメイン修正培地の各保存！［
における吸光度と保存期間との関係を表わすグラフであ
る。特許出願人　　栄研化学株式会社（ほか１名）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）マンニット、サッカロース、トレハロース及びソ
ルビットからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖を
含有することを特徴とするディメイン修正培地。
（２）糖の含有量が培地１０００ｍｌあたり２〜１０ｇ
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のデ
ィメイン修正培地。
（３）液体状の形態であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載のディメイン修正培地。
（４）使用濃度の１０倍濃度の液体状の形態であること
を特徴とする特許請求の範囲第３項記載のディメイン修
正培地。
（５）粉末状の形態であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載のディメイン修正培地。