KR20040010732A

KR20040010732A - 검은콩의 폴리사카라이드

Info

Publication number: KR20040010732A
Application number: KR10-2003-7016521A
Authority: KR
Inventors: 수 메이 리우; 충 청 린; 휘 펀 리아오
Original assignee: 타이페이-베터란스 제너랄 호스피탈
Priority date: 2001-06-20
Filing date: 2002-06-13
Publication date: 2004-01-31
Also published as: CN100475231C; WO2003000178A3; CN1688325A; JP2004531574A; CA2450947A1; US6838096B2; AU2002315075B2; WO2003000178A2; TWI327066B; US20030060449A1; US20050107452A1

Abstract

본 발명은 Glycine max(L.) Merr. 콩의 추출물로부터 강화된 폴리사카라이드 0.01-99 중량%를 함유하는 영양치료 조성물에 관한 것이다. 또한,Glycine max(L.) Merr. 분쇄된 콩으로부터 폴리사카라이드를 강화하는 방법; α(1,6)-결합된 글루코스 잔기의 골격을 가지고 하나 이상의 갈락토스 또는 만노스 잔기가 (1,3)- 또는 (1,4) 결합에 의해 하나 이상의 글리코스 잔기의 C-3 또는 C-4 위치에 결합되어 있는 폴리사카라이드; 및 상기 폴리사카라이드를 혈액 세포수를 증가시키기 위해 대상에게 처리하는 방법에 관한 것이다.

Description

검은콩의 폴리사카라이드 {Black Soybean Polysaccharides}

최근의 보고에 따르면, 대두,Glycine max(L.) Merr.에서 유래된 성분은 면역 반응을 중재하고, 발암작용을 억제하고 종양의 성장을 방해할 수 있다. 예를 들면, Zhang et al., Nutr. Cancer, 1997,29 : 24-28; Zhou et al.,J. Nutr., 1999, 129:1628-635; Benjamin et al.,Brazilian J. Med. Biol. Res., 1997,30:873-881; Rao et al.,J. Nutr., 1995,125 (suppl 3): S717-S724; 및 Meydani et al.,J. Am. Colle. Nutr.,1991, 10:406-428 참조.

검은콩(Glycine max(L.) Merr.)은 검은 종자 껍질을 가지는 대두의 재배종으로, 적어도 수백년 동안, 한약재로 사용되어 왔다.

대두 및 다른 약초를 포함하는 한약 처방이 백혈병 환자의 백혈구 세포수를 증가시켰다는 것이 보고된 바 있다. Wang, Trad.Chi. Med. Res., 1992, 5:35-36 참조. 그러나, 검은콩의 어떠한 화합물 또는 화합물들이 이러한 치료 효과를 부분적으로 또는 완전히 발휘하는 지는 명확하지 않다.

본 발명은 일반적으로 대두, 특히 검은콩에서 분리한 폴리사카라이드가 유용한 생물학적 활성을 가지고 있다는 발견에 기초한 것이다.

따라서, 본 발명의 제1 양태는 소프트 음료, 우유, 스넥 바, 쥬스, 식이 보충제 또는 식물성 약제 형태를 가지는 영양치료(nutraceutical) 조성물에 관한 것이다. 이러한 영양치료 조성물은 대두 또는 검은콩의 추출물로부터 강화된 폴리사카라이드를 0.01-99 중량%(예를 들면, 소프트 음료 또는 우유에서, 0.01-1%; 또는 식이 보충물 또는 식물성 약제에서는 1-99%)를 함유한다. 이 조성물에서 폴리사카라이드의 함량(즉, 0.01-99중량%)은 본 기술 분야에 잘 알려진 방법으로 결정할 수 있다. 이러한 폴리사카라이드는 혈액 세포수를 증가시킬 수 있고, 사이토킨의 생산을 자극하며, 면역성을 향상시킬 수 있다. 즉, 폴리사카라이드-강화된 대두, 특히 검은콩은 본 발명의 영양치료 조성물에서 활성 성분으로 활용된다. 폴리사카라이드는 단백질이 없거나 단백질과 회합되어 있을 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 α-(1,6)-결합의 글루코스 잔기의 골격을 가지고 하나 이상의 (예를 들면, 4 또는 5개의) 글루코스, 갈락토스, 만노스 잔기가 하나 이상의 글루코스 잔기의 C-3 또는 C-4 자리에 (1, 3)- 또는 (1, 4)-결합에 의해 연결되어 있는 폴리사카라이드에 관한 것이다. 예를 들면, 글루코스 잔기 골격의 일부 C-4 위치에서 하나 이상의 잔기 및/또는 동일 또는 상이한 글루코스 잔기 골격의 C-3 위치에서 하나 이상의 잔기에 연결된 폴리사카라이드에 관한 것이다. 잔기의 몰%는 갈락토스 5%, 만노스 6%, 및 글루코스 89%(±20%)가 될 수 있다. 폴리사카라이드의 몰중량은 80 KDal 이상, 예를 들면 300 내지 600 KDal의 범주인 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 대두 또는 검은콩으로부터 유래된 폴리사카라이드를 강화하는 방법에 관한 것이다. 이들 폴리사카라이드는 일반적으로 고분자량, 즉, 80 KDal 이상(예를 들면, 300 내지 600 KDal)인 것이다. 본 발명은 분쇄된 콩을 물 또는 물과 유기 용매(예를 들면, 에탄올)의 혼합물에 침지하여 폴리사카라이드를 용해하는 단계(이후, 유기 용매에 분쇄된 콩을 침지하거나 또는 기계적 압압에 의해 저극성의 내용물을 제거하거나 제거하지 않음); 및 여과 또는 원심분리에 의해 불용성 내용물을 제거하고 상층물을 수집하는 단계를 포함한다. 상층액에 함유된 폴리사카라이드는 증발 또는 충분한 양의 에탄올로 침전하여 상층 용액을 농축하고, 이어서 여과 또는 원심분리하여 획득할 수 있다. 선택적으로, 충분한 양의 침전 향상제를 용액에 첨가하여 지질과 단백질 함량의 대부분을 침전시킨 후 불용성 내용물을 제거시킬 수 있다. 침전 향상제는 용해된 성분의 침전을 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물이다. 지질 또는 단백질의 침전 향산제의 예로는 산(예를 들면 아세트산 및 염산), 나트륨 염(예를 들면 염화나트륨), 칼슘염(예를 들면 황산칼슘 및 염화칼슘), 마그네슘 염(예를 들면 황화마그네슘) 및 암모늄염(예를 들면, 황산암모늄)을 포함한다. 상층액은 또한, 선택적으로 투석되고(예를 들면 가압 투석 또는 한외 여과) 동시에 폴리사카라이드보다 작은 화합물을 제거하여 농축한 후, 폴리사카라이드를 수집할 수 있다. 또한, 에탄올은 상층액에 10-80 부피%로 증가하여(예를 들면, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 또는 50-60%), 고분자량의 폴리사카라이드를 침전시켰다.

고도로 강화된 고분자량의 폴리사카라이드를 프로테아제로 처리한 후, 투석하거나 에탄올로 침전시켜 프로테아제와 펩타이드를 다시 제거할 수도 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 "고분자량 폴리사카라이드"는 80 KDal 이상(예를 들면, 300 내지 600 KDal)의 분자량을 가지는 폴리사카라이드를 의미하는 것으로, 대두 또는 검은콩으로부터 추출할 수 있다. 이러한 폴리사카라이드는 초음파 분쇄 또는 효소 분해에 의해 분자량을 줄이도록 변형시킬 수도 있다.

본 발명은 또한 대상에서 적혈구, 거대핵세포, 및 특히 백혈구(골수성 백혈구, 예를 들면 호중구, 단핵세포, 과립구, 호산구)를 포함하는 혈액 세포 수를 증가시키는 방법을 포함한다. 보다 구체적으로, 대상에게 분쇄된 대두 또는 검은콩의 추출물로부터 제조(즉, 강화 또는 정제에 의해)한 폴리사카라이드를 처리하는 것이다. 폴리사카라이드는 고분자량(즉, 80 KDal 이상, 예를 들면, 300-600 KDal) 또는 저분자량(즉, 80 KDal 미만)을 가지거나, 또는 고분자량의 폴리사카라이드와 저분자량의 폴리사카라이드의 혼합물일 수 있다. 폴리사카라이드는 대상에게 바로 투여될 수도 있다. 또는 다음과 같이, 생체외 방법을 취할 수도 있다. 말초 혈액 세포(성숙한 혈액 세포뿐 아니라 줄기 세포를 포함하는 조상 세포로 이루어짐), 골수 세포, 또는 이들의 조합이 대상으로부터 수집되고, 배지에서 폴리사카라이드와 함께 배양된 후, 그 대상에게 다시 돌려줄 수가 있다.

대두 또는 검은콩으로부터 제조된 폴리사카라이드는 TNFα와 다른 사이토킨 수준을 증가시켜 세포 면역성을 활성화시키는 데 활용할 수 있고, 암을 예방하거나 치료하는 데 대상의 면역성을 향상시킬 수 있다. 혈액 세포 수를 증가시키고 면역 체계를 부양시킴으로써, HIV와 같은 발병원에 의해 감염된 환자의 건강을 개선시키는 데 사용할 수도 있다.

본 발명은 또한 사이토킨(예를 들면 TNF α, INF γ, 인터루킨-3, 인터루킨-6, 인터루킨-17, 과립구-콜로니 자극 인자, 단핵 세포-콜로니 자극 인자 또는 과립형-단핵세포 콜로니 자극 인자)을 수득하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 대두 또는 검은콩으로부터 제조된 폴리사카라이드의 용도를 포함한다. 예를 들면, 사이토킨을 얻기 위해서는 포유류 동물로부터 수득한 사이토킨-생산 세포를 대두 또는 검은콩으로부터 제조된 폴리사카라이드를 함유하는 배지에서 배양시킬 수가 있다. 따라서 얻어진 사이토킨을 배지로부터 분리시킨다. 또는 폴리사카라이드를 사이토킨의 생산을 자극하기 위해 포유류 동물에게 투여할 수도 있다. 이후, 사이토킨을 동물의 혈액에서 분리시킬 수 있다.

본 발명은 또한 대상에서 암을 예방하고 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 Glycine max (L. ) Merr.의 콩 추출물로부터 제조된 폴리사카라이드 또는 α-(1,6)-결합된 D-글루코스 잔기의 골격 및 갈락토스, 만노스, 또는 글루코스의 하나 이상의 잔기를 가지는 측쇄를 가지는 폴리사카라이드를 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 암은 백혈구 또는 고형 암 중 하나 일 수 있다.

또한, 본 발명은 또한 폴리사카라이드 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 제약학적 조성물; 대상에게 상기 제약학적 조성물을 생체내 또는 생체 외에서 치료함으로써 대상에게 혈액 세포수를 증가시키는 방법; 및 암 또는 감염성 질병을 예방하거나 치료하기 위해 상기 제약학적 조성물로 대상의 면역성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 이 조성물에 포함된 폴리사카라이드는 분자량이 80 KDal 이상(예를 들면, 300-600 KDal) 또는 80 KDal 미만의 분자량을 가지는 대두 또는 검은콩으로 강화된 것; 또는 α-(1,6)-결합된 D-글루코스 잔기의 골격 및 갈락토스, 만노스, 또는 글루코스의 하나 이상의 잔기의 측쇄를 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 다음이 설명 및 청구범위에서 분명해 질 것이다.

(상세한 설명)

본 발명이 다양한 실시예는 대두 또는 검은콩으로부터 정제된 폴리사카라이드가 사이토킨의 생산을 자극하고, 혈액 세포 수의 증가시키고, 또한 면역성의 개선시킨다는 관찰에 준한 것이다.

폴리사카라이드는 다양한 공급원으로부터 얻은 분쇄된 검은콩으로부터 추출되어 다음의 방법에 의해 강화될 수 있다. 분쇄된 검은콩은 선택적으로 유기 용매(예를 들면 에탄올)에 침지시키거나 또는 기계적으로 가압하여 지방산과 같은 저극성의 내용물을 제거한다. 이 유기 용매에 불용성이 부분은 높은 온도로 적절한 시간 동안(예를 들면 100℃에서 10분간, 60℃에서 8시간) 물 또는 수용액에 침지시켜 폴리사카라이드를 추출한다. 이 추출물을 수집하고(예를 들면 여과에 의해), 선택적으로 황산칼슘과 같은 시약으로 처리하여 낮은 극성의 내용물 및 단백질을 침전시킨다. 이 침전물을 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 이후, 폴리사카라이드 용액을 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 폴리사카라이드 용액을 이후 강화하고 농축(예를 들면, 가압 투석 또는 한외 여과 또는 폴리사카라이드를 예를 들면 10-80 부피%의 에탄올로 침전시킴)시킨 후, 선택적으로 건조하여(또는 동결 건조) 폴리사카라이드 제제를 얻는다. 농축된 추출물을 프로테아제(예를 들면 프로테아제 K)로 처리한 후 다시 투석하거나 침전시켜 프로테아제 및 작은 펩타이드를 제거할 수 있다. 바람직할 경우, 폴리사카라이드 제제는 겔여과 또는 다른 적합한 방법에 의해 더욱 강화되거나 심지어 정제될 수도 있다. 혈액 세포 증식을 자극하고 면역 체계를 개선시킬 수 있는 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 혼합물의 평균 분자량은 겔 여과 크로마토그래피에 의해 측정하였을 때, 대략 480 KDal이다. 이들 폴리사카라이드의 한 가지는 α-(1,6)-결합된 글루코스 잔기의 골격과, 이 글루코스 잔기의 하나 이상의 C-3 또는 C-4 위치에 (1,3)- 또는 (1,4)-결합에 의해 하나 이상의 (예를 들면 4 또는 5개의) 글루코스, 갈락토스, 또는 만노스 잔기가 결합된 것으로, 예를 들면 글루코스 잔기 골격의 일부 C-4 위치에 하나 이상의 잔기가 있고, 동일하거나 다른 글루코스 잔기 골격의 C-3 위치에 하나 이상의 잔기가 결합되어 있는 것이다. 이 잔기의 몰%는 갈락토스 5%, 만노스 6%, 및 글루코스 89%(±20%)이다.

폴리사카라이드의 함량은 페놀-황산 총 탄수화물 측정 분석, 또는 임의의 유사한 방법에 의해 결정된다. 예를 들면 Fox et al.,Anal. Biochem., 1991,195:93-96 참조. 예를 들면, 폴리사카라이드와 페놀의 혼합물을 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하고 저속으로 진탕시키고 얼음으로 냉각시킨다. 농황산을 각 웰에 첨가한다. 이 플레이트를 저속으로 다시 진탕하고 고온에서 배양하고 냉각시킨다. 492 nm에서 흡광도를 측정하여 모노사카라이드(폴리사카라이드로부터 가수분해된 것)의 함량을 기준물질로 말토스 또는 D-글루코스를 이용하여 측정한다.

따라서 얻어진 폴리사카라이드 제제를 사용하여 사이토킨 함량이 낮거나 혈액 세포수(특히, 백혈구 세포수)가 낮은 것과 관련된 질병, 예를 들면 화학치료 후 암환자의 치료용(이 증상의 예방 또는 경감을 포함)영양 치료 조성물의 제조를 위해 사용할 수 있다. 영양치료 조성물은 식이 보충제(예를 들면 캡슐, 정제 또는 미니-백에 들어가는 것), 식료품(예를 들면 소프트 음료, 우유, 쥬스 또는 과자류 또는 허브티-백에 들어가는 것), 또는 식물성 약제가 될 수 있다. 식물성 약제는 정제, 경성 또는 연성 캡슐, 수성 또는 시럽과 같은 경구용에 적합한 형태이거나; 또는 수성 프로필렌 글리콜 용액 또는 완충된 수용액과 같은 비경구 용도에 적합한 형태일 수 있다. 영양치료 조성물에서 활성 성분의 함량은 대상자의 특정 필요에 따라 크게 달라진다. 함량은 또한 당업자가 인지하는 바와 같이, 투여 경로 또는 사이토킨 생산을 자극하거나 혈액 세포 수를 증가시킬 수 있는 다른 약제의 공동 사용 여부에 따라 달라질 것이다.

부분적으로 또는 고도로 정제된 폴리사카라이드의 유효량을 제약학적으로 수용가능한 캐리어와 함께 제형하여 상기의 질병을 치료하기 위한 제약학적 조성물을 제공할 수 있다. "유효량"은 치료 대상에게 치료 효과를 부여하는 데 필요한 폴리사카라이드의 함량을 의미한다. 유효량은 당업자가 인정하다 시피, 투여 경로, 부형제의 사용 및 다른 치료와 함께 사용하는 지 여부에 따라 달라진다. 제약학적으로 수용가능한 담체의 예로는 콜로이드상 실리콘 디옥사이드, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로즈, 소듐 라우릴 설페이트, 및 D & C Yellow #10을 포함한다.

폴리사카라이드는 종래의 방법을 활용한 상이한 투여 경로에 따른 투약 형태로 제형활 될 수 있다. 예를 들면, 경구 투여를 위해서는 캡슐, 겔 시일, 또는 정제로 제형화될 수 있다. 캡슐은 젤라틴 또는 셀룰로즈와 같은 임의의 표준 제약학적으로 수용가능한 물질을 함유할 수도 있다. 정제는 종래의 방법에 따라 폴리사카라이드와 고체 담체 및 윤활제의 혼합물을 압착하여 제형화할 수도 있다. 적합한 담체의 예로는 전분 또는 슈가 벤토나이트를 포함할 수 있다. 폴리사카라이드는 락토스 또는 만니톨과 같은 바인더, 종래의 충전제 및 정제화 제제를 포함하는 경질 정제 또는 캡슐의 형태로 투여될 수도 있다. 제약학적 조성물은 비경구, 예를 들면 국부, 복막내, 정맥내로 투여될 수도 있다. 비경구 투여 형태의 예로는 수용액, 등장성 식염수 또는 활성제로 5% 글루코스, 또는 기타 공지된 제약학적으로 수용가능한 부형제를 포함한다. 사이클로덱스트린 또는 본 기술분야에 공지된 기타 용해제는 제약학적 화합물의 전달을 위한 제약학적 부형제로 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 특징은 검은콩으로 제조된 폴리사카라이드를 상기 언급한 질병에 사용하는 치료 용도 및 상기 질병을 치료하는 약제를 제조하는 데 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명의 영양치료 또는 제약학적 조성물이 사이토킨의 생산을 자극하는 데에 대한 효능(예를 들면, 효소 면역 측정법(ELISA)) 또는 혈구 선행세포 개수의 증가에 대한 효능(예를 들면, 과립상-단핵 세포 콜로니 형성 단위(CFU-GM) 분석)를 평가하기 위해 실험실 내 분석을 실시할 수도 있다. 예를 들면 사이토킨 생성 세포(예를 들면, 비장세포 또는 단핵 세포)를 본 발명의 조성물이 존재하는 배지에서 배양시켜 사이토킨 생성을 증가시킬 수 있다. 이 배지에서 생산된 사이토킨의 함량을 측정할 수 있다(예를 들면 ELISA 키트에 의해). 사이토킨을 함유한 비장 세포배지를 골수 세포와 함께 배양하여 혈액 세포수를 증가시킨다. 선행 세포의 개수를 증가시키는 것은 CFU 분석에서 총 콜로니 개수를 세어서 측정할 수 있다.

미리 스크린된(실험실 내) 본 발명의 조성물의 효능을 생체 내에서 확인할 수 있다. 예를 들면 마우스에게 폴리사카라이드-함유한 조성물을 먹이고 주기적으로 사이토킨 수준 또는 혈액 세포 수를 측정할 수 있다. 다양한 함량과 투여 방식으로 테스트할 수 있다. 결과에 따라 적합한 투여 범위와 투여 경로가 결정될 수 있다. 동물 실험에서 얻어진 정보는 임상 실험을 설계하는 데 기준이 될 수도 있다.

추가의 노고 없이도, 당업자들은 본 명세서에 기재된 설명을 바탕으로 하여, 본 발명을 온전하게 실시할 수 있을 것이다. 다음의 특정 실시예는 검은콩에서 얻은 폴리사카라이드의 제조법 및 테스트하는 방법을 설명할 것이다. 이것은 단순히 본 발명을 설명하고자 하는 것이지, 어떠한 의미로도 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다. 따라서, 이하의 실시예가 검은콩 균주로부터 제조된 폴리사카라이드의 분리 및 용도에 대해 설명하고 있지만, 다른 검은콩 또는 대두 균주로부터 제조된 폴리사카라이드(이하의 실시예 1에 기대된 바와 일부 차이가 있는 구조를 가질 수도 있음)와 이들의 용도는 본 발명의 범주 내에 있는 것이다. 본 명세서에 기재된 모든 공보는 전문이 참조로 인용되고 있는 것이다.

실시예 1:

검은콩으로부터 폴리사카라이드의 분리 및 구조 특성

Glycine max(L.) Merr.(짙은 검은색 껍데기와 녹색의 떡잎, 대만의 Tainan District Agricultural Improvement Station으로부터 공급됨)을 잘게 절단하여 유기 용매에 침지시켜 저극성의 내용물을 제거하였다. 이후, 절단된 콩을 물에 담그었다. 원심분리 후, 수추출물, 즉 상층액을 액상 크로마토그래피에 의해 정제한 후, Sephadex LH-20 컬럼 (Amersham Pharmacia Biotech., Little Chalfont, 영국 버킹햄셔 소재) 및 Fractogel TSK HW-55F 컬럼(Merck, Darmstad, FRG)로 정제하였다. 정제된 수추출물을 37℃에서 1시간 동안 프로테아제 K(50 mg/ml; Sigma Co., 미국 미주리 주 세인트 루이스 소재)로 처리하였다. 최종적으로, 프로테아제 처리된 수추출물을 Sephacryl S-400 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech)으로 겔 여과하여 추가 정제하고, 동결건조로 건조하여 폴리사카라이드를 제공하였다. S-400 컬럼으로부터 얻은 결과물은 주된 폴리사카라이드가 480 KDal 정도의 분자량을 가진다는 것을 시사하였다.

폴리사카라이드의 분자량은 표준 덱스트란(Amersham Pharmacia Biotech. )을 이용하여 측정하였다. 예를 들면, Liao et al.,Anticancer Drugs, 2001,12(10):841-846; Hara et al.,Carbohydr. Res., 1982, 110:77- 87; 및 Ukai et al.,Carbohydr. Res., 1982, 101:109-116 참조. 총 탄수화물의 측정은 표준 물질로 글루코스를 이용하여 페놀-황산 열량 분석에 의해 실시하였다. Fox et al.,Anal. Biochem., 1991, 195:93-96 참조. 이것을 100℃에서 6시간 2.0N 트리플루오로아세트산으로 가수분해하고 carboPac™ MA-1 컬럼을 가진 Dionex DX-500 크로마토그래피 시스템에서 이온 교환에 의해 정제한 후 한 후, 모노사카라이드 조성을측정하였다. 예를 들면, Hardy et al.,Anal. Biochem., 1988, 170 : 54-62 참조. 주요한 폴리사카라이드 조성 및 모노사카라이드 사이의 결합을¹H-및¹³C-NMR 분광기 또는 HP 6890 시리즈 GC 시스템(HP company, 미국 델라웨어주 윌밍톤 소재)으로 HP 5973 상에서 가스 액상 크로마토그래피 매스를 사용하여 측정하였다. 폴리사카라이드의 비선광도는 589nm에서 나트륨 램프로 24℃의 물에서 JASCO DIP-370 디지털 극성분석기(JASCO Corp., 일본 소재)를 이용하여 측정할 수 있다.

주요 폴리사카라이드는 물에서 [α]_D+122.2°, c=0.45의 비선광도를 가졌다. 스펙트럼의 결과는 폴리사카라이드가 α-(1,6)-결합된 D-글루코스 잔기로 이루어진 골격과 (1,3)- 또는 (1,4)-결합의 분지에 의해 C-3 또는 C-4 위치에 치환되어 있는 갈락토스, 만노스, 또는 글루코스 잔기를 필수 성분으로 가지고 있다는 것을 시사한다. 잔기의 몰%는 갈락토스 5%, 만노스 6%, 및 글루코스 89%(±20%)이다.

얻어진 폴리사카라이드(주요 성분으로 상기 폴리사카라이드를 함께 가지는) 또는 유사한 방법으로 얻어진 폴리사카라이드를 저장하며 다음의 실시예에 기재된 실험에 사용하였다.

실시예 2:

사이토킨 생산에 대한 폴리사카라이드의 효과

특정 무균 상태에서 자란 ICR 마우스(8-10 주령, 20-25 g)에서 적출한 비장을 단일 세포로 균질화하고, 1mm 금속망을 이용하여 현탁액으로 분산시켰다. 이후, 비장 세포(1x10⁷세포/mL)를 37℃에서, 완전히 가습된 5% CO₂대기하에서 10% 송아지 태아의 혈청(FCS)을 함유하고, 프로테아제 처리하고, Sephacry S-400 컬럼으로 정제된 폴리사카라이드를 다양한 농도(예를 들면, 0, 12.5, 25, 50 및 100 pg/ml)로 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 72시간 후에 비장세포-조절된 배지(SCMs)를 수집하고, 멸균한 후, -70℃에서 1㎖ 분획으로 나누어 사용시까지 저장하였다.

SCMs(즉, 인터류킨-3, 인터류킨-6, 인터류킨-17, 과립구-콜로니 자극 인자, 단핵세포-콜로니 자극 인자, 및 과립상-단핵 세포 콜로니 자극 인자)에서 생산된 사이토킨의 측정을 ELISA 키트(R & D Systems, 미국 미네소타주 미니아폴리스 소재)를 가지고 실시하고, 대조군으로 비처리된 비장세포를 함유하는 SCM을 이용하여 실시하였다. 예를 들면, Liao et al.,Anticancer Drugs, 2001, 12(10):841-846; 및Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 11, Academic Press, John, Wiley and Sons, Inc., 1998 참조.

자극 3일 후, PSBS-SCM에서 IL-17, GM-CSF, G-CSF 및 IL-6의 함량이 획기적으로 증가하였다.

실시예 3:

콜로니 형성 단위에 대한 폴리사카라이드의 효과

a) 과립구-마크로파지 콜로니 형성 단위(CFU-GM)에 대한 효과

Wang et al., Exp. Hematol., 1996, 24:437에 기재된 바대로 소프트-아가 배양 방법을 이용하여 CFU-GM 분석을 실시하였다. ICR 마우스에서 수집한 골수 세포를 10% FCS로 보충시킨 RPMI 1640 배지에서 재현탁시키고, 37℃에서 90분간 가습화된 5% CO₂인큐베이터 내에서 배양하였다. 이후 비부착 골수 세포(1x10⁵cells/mL)를 15% FCS, 필수 및 비필수 아미노산, 비타민 C, 및 소듐 피루베이트로 보충된 McCoys' 5A 배지에서 0.3 % 아가(Sigma)의 1㎖층에 넣었다. 최종 세포 농도를 동일하게 하면서, 다양한 20 부피%의 SCMs 또는 폴리사카라이드 단독을 첨가하였다. 배양 7일 후, 도립현미경(inverted microscope)(Olympus, 미국 뉴욕주 멜빌 소재)을 이용하여 각 플레이트 상의 콜로니의 개수를 세었다. 5% 글루타르알데히드를 이용하여 고정하고 메탄올로 탈수하고 Harris' 헤마톡실린으로 염색시킨 후, 콜로니의 모폴로지를 그 자리에서 측정하였다. 예를 들면, Wang et al.,Exp. Hemato, 1992, 20:552 참조.

결과에서는 폴리사카라이드 처리가 처리된 SCM에서 배양된 골수 세포의 콜로니 형성을 현저하게 증가시켰다는 것을 나타낸다. 모폴로지 분석에서는 4가지 형태의 콜로니, 즉, 과립구, 단핵 세포/마크로파지, 과립상-단핵 세포 및 호산구가 폴리사카라이드 처리에 의해 유도되었다는 것을 나타내었다.

b) 다가능성(CFU-GEMM) 및 적혈구(BFU-E) 콜로니 형성 단위에 대한 효과

CFU-GEMM 및 BFU-E의 콜로니 분석을 1990년 Science, Engineering and Technology지에서 Wang et al.이 기재한 방법으로 실시하였다. Houston: AACP, Hsieh ed., 1990,(Sl):10; 및 Wang et al., Blood, 1985, 65:1181. 특히, 5x10⁴골수 세포를 Iscove의 변형된 Dulbecco 배지(StemCell Technologies, 캐나다 벤쿠버 소재)에서 1% 메틸 셀룰로즈의 1㎖ 혼합물, 30% FCS, 1% 소혈청 알부민, 10^-4M 2-머캅토에탄올, 2mM L-글루타민, 1 단위의 에리스로포이에틴(EPO; Connaught Laboratories Ltd, 캐나다 온타리오 윌로우달 소재) 및 20%이 다양한 SCMs을 함유한 35mm의 배양 접시에 놓았다. 접시를 37℃에서 7일 동안 공기중에서 5%의 CO₂로 플러싱된 가습화된 분위기에서 배양하였다. 배양후, 코로니를 동정하고 도립현미경으로 수를 세었다. CFU-GEMM는 과립구(G), 적혈구(E), 단핵 세포/마크로파지(M) 및 거대핵세포(M)를 포함하는 혼합된 콜로니를 보여주었으나, BFU-E는 적색 또는 분홍색의 다발성(Burst) 적혈구 콜로니를 나타내었다.

결과에서는 폴리사카라이드 처치군이 함량에 비례하는 방식으로 SCMs에서 CFU-GEMM 및 BFU-E 콜로니 형성을 뚜렷하게 증가시킨다는 것을 시사한다.

실시예 4:

마우스에서 골수혈구 형성에 대한 폴리사카라이드의 효과

방사선 조사 마우스에 대한 폴리사카라이드의 효과를 실험하기 위해서, 20마리의 ICR 마우스를 다음과 같이 4개의 군으로 나누었다(1군 당 5마리의 마우스): 대조군, 폴리사카라이드로만 처리군, 전신에 방사선 조사만 처리군(TBI), 및 TBI와 폴리사카라이드 투여군. 각 마우스의 전신을 선형 악셀러레이터(Clinac 1800, Varian Associates, Inc. , 미국 캘리포니아주, 투여율 2.4 Gy/min)를 이용하여 0일에 8 Gy(6MV 광자 빔)으로 단일 구획으로 조사하였다. 폴리사카라이드(400mg/kg)의 경구 투여는 0 내지 4일 동안 TBI 6시간 후부터 시작하였다. 대조군에서는 마우스는 통상의 식염수를 경구로 투여받았다. 말단의 혈액을 눈확굴(orbital sinus)에서 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16일에 수집하였다. 또한, 마우스의 체중을 실험기간 동안 이틀에 한번 측정하였다. 17일에, 마우스를 희생시켜, 골무기질 내용물(BMCs)을 콜로니-형성 분석을 위해 제거하였다. 골수 콜로니 형성(CFU-GM)을 상기의 방법으로 분석하였다.

ICR 마우스에서 5-플루오로우라실(5-FU)을 150 mg/kg으로 복강내 주사하였다. 6시간 후, 폴리사카라이드의 400 mg/kg을 5일 연속하여 경구로 투여하였다. 마우스를 11일 째에 희생시키고 BMC를 수집하여 콜로니-형성 분석하였다. 2가지의 생체내 실험에서, 결과는 비처리 대조군과 폴리사카라이드-처리군의 ICR 마우스의 기저 백혈구 개수는 비숫하다는 것을 보여주었다. 광조사와 5-FU 처리 모두는 분명하게 골수 억제를 유발하였다. 백혈구의 개수는 TBI와 5 FU 처리후, 현저하게 감소하였다. 폴리사카라이드를 5일 연속(0일부터 4일까지)하여 투여한 경우, TBI 및 5-FU으로 유도된 백혈구 감소증의 정도가 감소되었을 뿐 아니라, 백혈구 개수의 회복 속도가 단축되었다. TBI 및 5-FU 처리후, CFU-GM 콜로니 개수를 크게 감소하였다(각각 33±6 및 41±5 콜로니). 폴리사카라이드의 투여는 방사선 조사하고 5-FU-처리된 마우스에서 골수혈구 형성을 재구성하고, CFU-GM 개수는 TBI 와 5-FU 만을 투여한 군에 비교하여 약 2.0배(TBI) 및 1.8배(5-FU) 증가하였다.

실시예 5:

백혈구 세포주 U937에 대한 폴리사카라이드의 효과

인간의 골수 백혈구 세포주인 U937을 American Type Culture Collection(미국 메릴랜드주 록크빌 소재)로부터 얻어, 폴리사카라이드의 항암 특성을 알아보기 위한 본 연구에 사용하였다. U937 세포는 10% FCS로 보충한 RPMI 1640 배지에서 배양하고 가습화된 5% CO₂배양기에서 37℃로 유지시켰다. 1x10⁵세포/ml를 30 부피%의 정상 MNC-CM (N-MNC-CM), PSBS (25-400 ㎍/ml)-MNC-CMs 또는 PSBS (25400 ㎍/ml) 단독이 존재하거나 부재하는 조건하에서 배양시켰다. 배양 5일 후, 세포를 고무 폴리스맨(Bellco Glass, 미국 뉴저지주 빈랜드 소재)을 이용하여 디시를 부드럽게 긁어서 수집하고, 트라이판 블루 염색 배제 테스트(trypan blue dye exclusion test)를 이용하여 생세포 개수를 세었다.

이 결과로부터 U937 세포의 증식이 PSBS-MNC-CM에 의해 현저하게 억제된다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 통상 MNC-CM 또는 PSBS (400 microg/ml 이하) 단독 투여군에서는 유의적이지 않은 억제가 관찰되었다.

다양한 치료 5일 후, 세포를 수집하고 Cytospin (Shandon Southern Instrument Inc.)을 이용하여 현미경 슬라이드 상으로 세포 원심분리하고, Wright의 염색을 하고 1000배율로 도립현미경(Olympus) 하에서 관찰하였다. 세포의 모폴로지를 3단계로 분류하였다. 미성숙 아구(blasts), 중간 및 성숙 단핵 세포 또는 마크로파지.

결과에서는 PSBS-MNC-CM가 미성숙 아구를 성숙한 단핵세포와 마크로파지로 분화하도록 한다는 것을 나타내었다. 아구의 백분율을 98.7±0.9 % (비처리 대조군)에서 2.3±1.5%(PSBS 400 microg/ml로 조제된 MNC-CM)로 급격하게 감소되었다. 반대로, 단핵세포와 마크로파지의 합은 0±0%(비처리 대조군)에서 83.0±4.0% (PSBS-MNC-CM)로 증가하였다.

실시예 6:

골수형성 활성의 촉진에 대한 폴리사카라이드의 효과

BALB/c 마우스(6-10 주령, 20±5g)를 얻어서, 조절된 온도 및 습도, 그리고 12시간의 낮과 밤의 사이클의 특정 무균 상태에서 양육하고, 사료와 물에 대해서 제한을 두지 않았다. 모든 실험은 NIHGuide for the Care and Use of Laboratory Animals(DHHS publication No. NIH 85-23, revised 1996)에 주어진 지침에 따라 실시하였다. CT26 쥐과의 결장 샘암종 및 BALB/c 합성물을 심장-불활성화시킨 FCS(HyClone, 미국 유타주 로건 소재)와 2mM의 L-글루타민(Sigma, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)으로 보충시킨 RPMI 1640 배지(Life technology, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)에서 유지시키고, 37℃에서 5%의 CO₂를 함유한 가습화된 분위기에서 배양하였다. 이들 세포를 BALB/c 마우스의 왼쪽 옆구리 피하에 이식시켰다.

비종양물 이식 실험에서, 5-FU(150 mg/체중의 kg)를 0일에 복강내(i.p.) BALB/c 마우스에게 주사하고, PSBS(100 또는 400 mg/체중의 kg)를 5-FU 주사 6시간 후에 5일 연속하여 하루에 한번 경구 또는 복막내 투여하였다. 대조군의 마우스에게는 동일한 시간에 통상의 식염수를 먹었다. 종양 이식된 모델에서, 마우스당PBS에서 1x10⁶CT26 종양 세포가 왼쪽 옆구리에서 피하내로 주입되었다. 10일 후, 종양은 약 0.5㎠ 정도 성장하였고, 마우스를 대조군, 5-FU (150mg/kg, 복막내) 단독 및 5-FU+폴리사카라이드(400 mg/kg, p.o.)의 3개의 군(각 군당 5마리의 마우스)으로 나누었다. 이후, 약제 처리 방법은 종양을 이식하지 않은 이전의 실험과 유사하였다.

결과에 따르면, 5-FU 처리군에서 종양의 이식이 있건 없건 간에 백혈구의 개수를 현저하게 감소시켰다. 5일간 PSBS의 혼합된 처리는 5-FU 골수억제에 의해 유발된 백혈구 개수의 최저값의 심각성을 감소시킬 뿐만 아니라, 최저점 이후의 백혈구 개수의 회복율을 증가시켰다. 폴리사카라이드 치료는 또한 종양 이식 및 5-FU 치료로 마우스에서 사이토킨의 함량을 증가시켰다.

실시예 7:

종양 성장의 감소에 대한 폴리사카라이드의 효과

마우스당 PBS에서 대략 1x10⁶CT26 종양 세포를 0일에서 BALB/c 마우스의 좌측 옆구리에서 피하로 주입하였다. 마우스를 다음의 4개 군으로 나누어 처리하였다. (1) 대조군, 1일부터 시작하여 일주일에 4일간 PBS로 처치되었다; (2) 폴리사카라이드 단독 투여군, 1일부터 시작하여 일주에 4일간 400 mg/kg, p.o. 투여; (3) 5-FU 단독 투여군, 15 mg/kg, 11일에 시작하여 일주에 4일동안 복막내 투여; (4) 폴리사카라이드 혼합 투여군, 폴리사카라이드 1일에 시작, 5-FU 11일에 시작. 말초 혈액을 헤파린 처리된 모세관과 Coulter 계수기를 사용하여 백혈구 개수를 위해눈확굴로부터 수집하였다. 마우스의 체중과 종양의 크기를 실험 기간 동안 매주 2회 측정하였고, 종양의 크기를 캘리퍼스로 측정하고 다음의 수식으로 산출하였다: (길이/2)(폭/2)_TT. 예를 들면, Wang et al.,Anti-Cancer Drug Des., 1998,13 : 779 참조.

결과에 따르면, 폴리사카라이드 치료에 의해 종양의 크기가 현저하게 감소되었다는 것이 밝혀졌다. 11일 후, (2) 군의 종양 크기를 측정한 결과, (1)군과 유사하였고, 20일 후에는 (4)군의 종양 크기는 (3) 군의 크기보다 현저하게 작았다.

기타 실시예

상기 설명으로부터 당업자는 본 발명의 필수적인 특징을 본 발명의 사상과 범주에서 이탈함 없이 쉽게 알 수 있을 것이고, 다양한 용도와 조건에 따라 적용할 수 있도록 본 발명을 변경하고 수정할 수 있을 것이다. 따라서, 다른 실시예도 또한 청구 범위 내에 있는 것이다.

Claims

Glycine max(L.) Merr. 콩의 추출물로부터 강화된 폴리사카라이드 0.01 내지 99 중량%를 포함하는 영양치료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물이 0.01 내지 1%의 폴리사카라이드를 포함하는 영양치료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물이 1 내지 99%의 폴리사카라이드를 포함하는 영양치료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 폴리사카라이드의 적어도 하나가 단백질과 회합되어 있는 영양치료 조성물.
제2항에 있어서,

상기 폴리사카라이드의 적어도 하나가 단백질과 회합되어 있는 영양치료 조성물.
제3항에 있어서,

상기 폴리사카라이드의 적어도 하나가 단백질과 회합되어 있는 영양치료 조성물.
Glycine max(L.) Merr. 분쇄된 콩으로부터 유래된 폴리사카라이드를 강화하는 방법으로,

상기 분쇄된 콩을 물 또는 유기 용매와 물의 혼합물에 침지시켜 폴리사카라이드를 용해시키는 단계;

침전 향상제를 첨가하여 지방산 및 단백질을 침전시키는 단계; 및

상층액을 수집하는 단계

를 포함하는 방법.
제7항에 있어서,

상기 수집 단계 이후, 80 KDal 미만의 분자량을 가진 화합물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제8항에 있어서,

상기 제거 단계를 가압 투석 또는 한외여과에 의해 실시하여, 동시에 상층액의 용량을 감소시키는 방법.
제7항에 있어서,

상기 상층액을 수집하는 단계 이후, 에탄올로 상기 상층액으로부터 폴리사카라이드를 선택적으로 침전시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
Glycine max(L.) Merr. 분쇄된 콩으로부터 유래된 폴리사카라이드를 강화하는 방법으로,

상기 분쇄된 콩을 물 또는 유기 용매와 물의 혼합물에 침지시켜 폴리사카라이드를 용해시키는 단계;

상층액을 수집하는 단계; 및

상기 상층액으로부터 80KDal 미만의 분자량을 가진 화합물을 제거하는 단계

를 포함하는 방법.
제11항에 있어서,

상기 제거 단계를 가압 투석 또는 한외여과에 의해 실시하여, 동시에 상층액의 용량을 감소시키는 방법.
Glycine max(L.) Merr. 콩의 추출물로부터 제조된 폴리사카라이드를 혈액 세포수의 증가가 필요한 대상에게 처리하는 단계를 포함하는

혈액 세포 증가 방법.
제13항에 있어서,

상기 혈액 세포가 골수계 세포인 방법.
제14항에 있어서,

상기 골수계 세포가 백혈구인 방법.
제15항에 있어서,

상기 백혈구가 호중구 또는 단핵세포인 방법.
제13항에 있어서,

상기 폴리사카라이드를 대상에게 투여하는 방법.
제17항에 있어서,

상기 혈액 세포가 골수계 세포인 방법.
제13항에 있어서,

상기 대상으로부터 골수(bone mellow) 세포 또는 말초 혈액 세포를 수집하고 배지에서 폴리사카라이드로 배양한 후, 대상에게 다시 복귀시키는 방법.
α-(1,6)-결합된 D 글루코스 잔기의 골격 및 갈락토스, 만노스, 또는 글루코스 중 하나 이상의 잔기를 가지는 측쇄를 포함하는 폴리사카라이드.
제20항에 있어서,

상기 측쇄가 (1,3)- 또는 (1,4)- 결합에 의해 글루코스 잔기의 골격중 하나 이상에서 C-3 또는 C-4 위치에 결합되는 폴리사카라이드.
제20항에 있어서,

상기 글루코스/갈락토스/만노스 잔기의 비율이 89/5/6인 폴리사카라이드.
제20항의 폴리사카라이드 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
제23항에 있어서,

상기 폴리사카라이드가 제21항에 따른 것인 제약학적 조성물.
제24항에 있어서,

글루코스/갈락토스/만노스 잔기의 비율이 89/5/6인 제약학적 조성물.
제20항의 폴리사카라이드를 혈액 세포수를 증가시킬 필요가 있는 대상에게 처리하는 단계를 포함하는 혈액 세포수 증가 방법.
제26항에 있어서,

상기 폴리사카라이드는 제21항에 따른 것인 방법.
제27항에 있어서,

글루코스/갈락토스/만노스 잔기의 비율이 89/5/6인 방법.
제26항에 있어서,

상기 혈액 세포가 골수계 세포인 방법.
제29항에 있어서,

상기 골수계 세포가 백혈구인 방법.
제30항에 있어서,

상기 골수계 백혈구가 호중구 또는 단핵세포인 방법.
제26항에 있어서,

상기 폴리사카라이드를 대상에게 투여하는 방법.
제32항에 있어서,

상기 혈액 세포가 골수계 세포인 방법.
제26항에 있어서,

상기 골수 세포 또는 말초 혈액 세포를 대상으로부터 수집하고, 배지에서 상기 폴리사카라이드로 처리하고 대상으로 복귀시키는 방법.
암을 예방하거나 치료할 필요가 있는 대상에게Glycine max(L.) Merr. 콩의 추출물로부터 제조된 폴리사카라이드를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제35항에 있어서,

상기 암이 백혈병인 방법.
제35항에 있어서,

상기 암이 고형암인 방법.
암의 예방이 필요한 대상에게 제20항의 폴리사카라이드를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제38항에 있어서,

상기 암이 백혈병인 방법.
제38항에 있어서,

상기 암이 고형암인 방법.