CN111978428B - 一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖分离纯化方法及应用 - Google Patents

一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖分离纯化方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖分离纯化方法及应用，本发明涉及多糖分离纯化方法及应用领域。本发明要解决现有大豆秸秆利用率低，其多糖成分未得到有效应用的技术问题。方法：制备粗多糖；脱蛋白；脱色；采用DEAE‑52纤维素柱色谱进行分离；采用Sephadex G‑100凝胶柱色谱凝胶分离。本发明优化了大豆秸秆多糖的分离纯化方法，利用Savage法联合三氯乙酸法对大豆秸秆多糖进行脱蛋白处理，提高了脱蛋白率，并经过后续的分离提纯操作极大提高了大豆秸秆多糖的提取率。将大豆秸秆多糖应用于抑制肝癌细胞的抗肿瘤药物中，同时还能提高大豆秸秆的利用率，减少环境污染。本发明分离提纯的大豆秸秆多糖作为抑制肝癌细胞的生物活性成分应用于制备抗肿瘤药物。

Description

一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖分离纯化方法及 应用
技术领域
本发明涉及多糖分离纯化方法及应用领域。
背景技术
我国是农业大国，其中大豆产业发展迅猛，产量也逐年递增，不过带来收益的同时也会产生大量的秸秆难以处理，目前大豆秸秆利用率不到3％，由此可见我国大豆秸秆资源还是大有利用潜能的。特别是大豆秸秆中含有的多糖成分未得到深入研究，多糖的生物活性受多糖各级构型的影响，会表现出不同的活性状态，从而影响生命活动，因此深入研究多糖的结构对多糖进一步的开发利用具有十分重要的价值。大豆秸秆常被作为废料随意丢弃，从大豆秸秆中提取的多糖结构特征与药理活性也未被研究，所以研究大豆秸秆多糖具有重要意义，为探究大豆秸秆多糖结构与活性之间的关系提供理论基础其结构特征及药理活性开发利用。
发明内容
本发明要解决现有大豆秸秆利用率低，其多糖成分未得到有效应用的技术问题，而提供一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖分离纯化方法及应用。
一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖分离纯化方法，具体按以下步骤进行：
一、制备大豆秸秆粗多糖；
①将大豆秸秆晒干，采用粉碎机打碎，然后过筛，获得秸秆粗粉；
②将秸秆粗粉在水中浸泡12～14h，然后热水浴回流浸提，获得提取液；随即过滤，将获得的滤液减压浓缩，得到浓缩液，浓缩液与滤液的体积比为1：5；
③将浓缩液冷却，加入无水乙醇，沉淀12～14h，然后离心分离，获得沉淀物；
④将沉淀物冷冻干燥，获得大豆秸秆粗多糖粉末；
二、将大豆秸秆粗多糖干燥，加入蒸馏水，获得多糖溶液，然后加入Savage试剂和TCA溶液，搅拌均匀，再离心处理5～7min，取上清液，干燥，获得脱蛋白大豆秸秆粗多糖；
三、将脱蛋白大豆秸秆粗多糖加入单蒸水，获得待脱色溶液，然后加入中性H2O2溶液，进行脱色处理，然后放入透析袋中透析，获得脱色大豆秸秆粗多糖；
四、采用DEAE-52纤维素柱色谱将脱色大豆秸秆粗多糖进行分离，获得多糖初产物；
五、将步骤四获得的多糖初产物溶于蒸馏水中，离心处理，取上清液，在高于Sephadex G-100凝胶柱色谱凝胶表面1cm处贴壁上样，然后采用去离子水作为洗脱液洗脱5h，收集洗脱液，采用苯酚-硫酸法隔管检测洗脱液在紫外490nm处光密度值，绘制洗脱曲线，合并洗脱曲线中呈单一峰的多糖组分，减压浓缩后透析60h，冷冻干燥，得大豆秸秆多糖，完成所述一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖分离纯化方法。
所述大豆秸秆多糖作为抑制肝癌细胞的生物活性成分应用于制备抗肿瘤药物。
本发明的有益效果是：
本发明优化了大豆秸秆多糖的分离纯化方法，采用最佳工艺调节，尤其利用Savage法联合三氯乙酸法对大豆秸秆多糖进行脱蛋白处理，提高了脱蛋白率，并经过后续的分离提纯操作极大提高了大豆秸秆多糖的提取率，为揭示构效关系打下基础，也为功能性产品在多糖选择方面提供参考。
经分析大豆秸秆多糖中占比第一的为半乳糖醛酸，而醛酸含量高的多糖具有良好的免疫活性和抗氧化活性。结合高碘酸氧化实验结果发现，大豆秸秆多糖含有大量的1→6型糖苷键，说明主链中存在1→6型糖苷键。大豆秸秆多糖具有β-型糖苷键，说明大豆秸秆多糖是主链为β-型1→6糖苷键的多糖，而主链为β-型1→6糖苷键的多糖一般会表现出一定的抗肿瘤活性，因此大豆秸秆多糖表现出一定的抗肿瘤活性。
经验证大豆秸秆多糖对人肝癌细胞HepG2作用72h后的半数抑制浓度(IC50)为658μg·mL-1，大豆秸秆多糖作用后，细胞内的Bcl-xL和Bcl-2蛋白表达量随大豆秸秆多糖浓度增大逐渐升高，Bax的蛋白表达量逐渐降低，大豆秸秆多糖给药组Bcl/Bax的蛋白表达量比值逐渐增大。细胞内Cytochrome C和Caspase-9的蛋白表达量随大豆秸秆多糖浓度增大逐渐降低，并且随着大豆秸秆多糖浓度的增大而增强，在剂量上表现出一定的依赖性。综合以上结果说明，大豆秸秆多糖可以通过作用HepG2细胞，增大Bcl-2在细胞中的蛋白含量，降低Bax的蛋白含量，通过提高Bcl/Bax的蛋白表达量比值，来抑制MPTP孔开放，维持线粒体膜电位。稳定线粒体的内外部结构，使Cyt-C无法释放。中断Caspase级联反应，阻止细胞凋亡。由此表明，大豆秸秆多糖可以通过线粒体途径抑制HepG2细胞凋亡。因此可将大豆秸秆中的多糖进行分离提纯，并应用于抑制肝癌细胞的抗肿瘤药物中，同时还能提高大豆秸秆的利用率，减少环境污染。
本发明分离提纯的大豆秸秆多糖作为抑制肝癌细胞的生物活性成分应用于制备抗肿瘤药物。
附图说明
图1为实施例一得到的大豆秸秆多糖的紫外光谱图；
图2为实施例一得到的大豆秸秆多糖的红外光谱图；
图3为实施例一得到的大豆秸秆多糖的气相色谱图；从左至右编为1-9号峰，1号峰为PMP；2号峰为Man的衍生物；3号峰为GlcN的衍生物；4号峰为GlcA的衍生物；5号峰GalA的衍生物；6号峰Glc的衍生物；7号峰Gal的衍生物；8号峰为Xyl的衍生物；9号峰为Fuc的衍生物；
图4为实施例一得到的大豆秸秆多糖的1H-NMR谱图；
图5为实施例一得到的大豆秸秆多糖的I2-KI光谱图；
图6为实施例一得到的大豆秸秆多糖的刚果红实验数据图，a代表大豆秸秆多糖，b代表刚果红；
图7为实施例一得到的大豆秸秆多糖的刚果红XRD扫描图；
图8为实施例一得到的大豆秸秆多糖的扫描电镜图(10μm)；
图9为实施例一得到的大豆秸秆多糖的扫描电镜图(2μm)；
图10为实施例一得到的大豆秸秆多糖的扫描电镜图(1μm)；
图11为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞凋亡的信号通路示意图；
图12为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡BCL-2相关基因表达影响图，其中“■”代表BCL2、
Figure BDA0002671696400000031
代表BCL2A1、
Figure BDA0002671696400000032
代表BCL2L1、
Figure BDA0002671696400000033
代表BCL2L10、
Figure BDA0002671696400000034
代表BCL2L11、
Figure BDA0002671696400000035
代表BCL2L2；
图13为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡BAX基因表达影响图；
图14为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡CASP3基因表达影响图；
图15为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡CASP9和APAF1基因表达影响图，其中“■”代表APAF1，
Figure BDA0002671696400000036
代表CASP9；
图16为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡CYCS基因表达影响图；
图17为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡FADD基因表达影响图；
图18为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡FAS和FASLG基因表达影响图，其中“■”代表FAS，
Figure BDA0002671696400000037
代表FASLG；
图19为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡CASP8基因表达影响图；
图20为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡CD27和CD70基因表达影响图；其中“■”代表CD27、
Figure BDA0002671696400000041
代表CD70；
图21为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡TNFRSF10A基因表达影响图；
图22为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡TNFRSF10B基因表达影响图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖分离纯化方法，具体按以下步骤进行：
一、制备大豆秸秆粗多糖；
①将大豆秸秆晒干，采用粉碎机打碎，然后过筛，获得秸秆粗粉；
②将秸秆粗粉在水中浸泡12～14h，然后热水浴回流浸提，获得提取液；随即过滤，将获得的滤液减压浓缩，得到浓缩液，浓缩液与滤液的体积比为1：5；
③将浓缩液冷却，加入无水乙醇，沉淀12～14h，然后离心分离，获得沉淀物；
④将沉淀物冷冻干燥，获得大豆秸秆粗多糖粉末；
二、将大豆秸秆粗多糖粉末加入蒸馏水，获得多糖溶液，然后加入Savage试剂和TCA溶液，搅拌均匀，再离心处理5～7min，取上清液，干燥，获得脱蛋白大豆秸秆粗多糖；
三、将脱蛋白大豆秸秆粗多糖加入单蒸水，获得待脱色溶液，然后加入中性H2O2溶液，进行脱色处理，然后放入透析袋中透析，获得脱色大豆秸秆粗多糖；
四、采用DEAE-52纤维素柱色谱将脱色大豆秸秆粗多糖进行分离，获得多糖初产物；
五、将步骤四获得的多糖初产物溶于蒸馏水，离心处理，取上清液，在高于Sephadex G-100凝胶柱色谱凝胶表面1cm处贴壁上样，然后采用去离子水作为洗脱液洗脱5h，收集洗脱液，采用苯酚-硫酸法隔管检测洗脱液在紫外490nm处光密度值，绘制洗脱曲线，合并洗脱曲线中呈单一峰的多糖组分，减压浓缩后透析60h，冷冻干燥，得大豆秸秆多糖，完成所述一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖分离纯化方法。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中多糖溶液中大豆秸秆粗多糖的质量浓度为0.25mg/mL。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中大豆秸秆粗多糖与Savage试剂的质量体积比为50mg：20mL；大豆秸秆粗多糖与TCA溶液的质量体积比为50mg：10mL，TCA溶液的体积百分含量为1％。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二的操作重复1～6次。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三所述待脱色溶液中脱蛋白大豆秸秆粗多糖的浓度为0.5mg/mL。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三所述中性H2O2溶液中H2O2体积分数为9～15％，采用氨水调节pH。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三脱色处理30～50min，处理温度为60～70℃；透析时间为60h。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤四采用DEAE-52纤维素柱色谱将脱色大豆秸秆粗多糖进行分离具体操作为：将脱色大豆秸秆粗多糖加入到蒸馏水中完全溶解，离心处理后将上清液加入到DEAE-52纤维柱中，然后控制流速为1mL·4min-1，采用浓度为0.1mol/L的NaCl溶液进行洗脱，每16min收集一管洗脱液，采用苯酚-硫酸法对洗脱液检测吸光度值，收集主要吸收峰液体；冷冻干燥，获的多糖初产物。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤五控制上样流速为0.4mL/min。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖作为抑制肝癌细胞的生物活性成分应用于制备抗肿瘤药物。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：
本实施例一种大豆秸秆多糖分离纯化方法，其特征在于该方法具体按以下步骤进行：
一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖分离纯化方法，具体按以下步骤进行：
一、制备大豆秸秆粗多糖；
①将大豆秸秆晒干，采用粉碎机打碎，然后过筛，筛子孔径为40目，获得秸秆粗粉；
②将秸秆粗粉在水中浸泡12h，然后热水浴回流浸提，获得提取液；随即过滤，将获得的滤液减压浓缩，得到浓缩液，浓缩液与滤液的体积比为1：5；
③将浓缩液冷却，加入无水乙醇，沉淀12h，然后离心分离，获得沉淀物；
④将沉淀物冷冻干燥，获得大豆秸秆粗多糖粉末；
一、将50mg大豆秸秆粗多糖粉末加入200mL蒸馏水，获得浓度为多糖溶液，然后加入20mL Savage试剂和10mL体积分数为1％的TCA溶液，用磁力搅拌机搅拌均匀，再离心处理5min，取上清液，干燥，获得脱蛋白大豆秸秆粗多糖；
二、将150mg脱蛋白大豆秸秆粗多糖加入300mL单蒸水，获得待脱色溶液，然后加入中性体积分数为9％的H2O2溶液，控制温度为70℃进行脱色处理50min，然后放入透析袋中透析60h，获得脱色大豆秸秆粗多糖；
三、采用DEAE-52纤维素柱色谱将脱色大豆秸秆粗多糖进行分离，获得多糖初产物；
步骤三采用DEAE-52纤维素柱色谱将脱色大豆秸秆粗多糖进行分离具体操作为：将脱色大豆秸秆粗多糖加入到蒸馏水中完全溶解，离心处理后将上清液加入到DEAE-52纤维柱中，然后控制流速为1mL·4min-1，采用浓度为0.1mol/L的NaCl溶液进行洗脱，每16min收集一管洗脱液，采用苯酚-硫酸法对洗脱液检测吸光度值，收集主要吸收峰液体；冷冻干燥，获的多糖初产物；
四、将100g步骤三获得的多糖初产物溶于25mL蒸馏水中，离心处理，取上清液，在高于Sephadex G-100凝胶柱色谱凝胶表面1cm处贴壁上样，控制上样流速为0.4mL/min，然后采用去离子水作为洗脱液洗脱5h，收集洗脱液，每管收集2mL样品液，采用苯酚-硫酸法隔管检测洗脱液在紫外490nm处光密度值，绘制洗脱曲线，合并洗脱曲线中呈单一峰的多糖组分，减压浓缩后透析60h，冷冻干燥，得大豆秸秆多糖，完成所述一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖分离纯化方法。
本实施例步骤一脱蛋白率为85.42％，多糖剩余率为65.41％；
分离纯化得到的大豆秸秆多糖组分呈现单一的对称峰，表明其为均一多糖。
经测试分析大豆秸秆的多糖含量为65.06±1.54％，分子量为29797Da，SSPS1的粒径的主要分布于220～255nm。
将本实施例获得的大豆秸秆多糖进行高碘酸氧化测试，经计算得出：大豆秸秆多糖经高碘酸氧化后均有甲酸生成，说明多糖样品均存在1→6或1→糖苷键；每个样品的高碘酸消耗量都远大于甲酸生成量的2倍，表明多糖中均存在大量的1→2或1→2,6或1→4或1→4,6连接的糖苷键；而其他残基则以不被高碘酸氧化的1→3、1→3,6、1→2,3、1→2以及1→2,3,4等糖苷键连接(数字表示的是糖苷键中C-C相连的位置)。大豆秸秆多糖的1→6或1→糖苷键所占摩尔比为13.19％，而1→2或1→2,6或1→4或1→4,6所占摩尔比为86.81％。
图1为实施例一得到的大豆秸秆多糖的紫外光谱图；由图可以看出大豆秸秆多糖在206nm与处具有多糖特征峰，说明SSPS1为多糖类物质；在260nm和280nm处均无吸收，说明均一的大豆秸秆多糖几乎不含有核酸和蛋白质。
图2为实施例一得到的大豆秸秆多糖的红外光谱图；由图可以看出SSPS1在3420.8cm-1处强且宽的吸收峰是O-H伸缩振动引起的，表明SSPS1存在分子内氢键和分子间氢键；2934.0cm-1处的吸收峰是-CH2-次甲基的C-H伸缩振动引起的；1629.1cm-1处的吸收峰是羧基C＝O的非对称伸缩振动引起的；1463.1cm-1处的吸收峰是C-H的变角振动引起的；1132.6cm-1处的吸收峰为C-O-H中C-O的伸缩振动所引起的，SSPS1具有吡喃环。885.6cm-1处的吸收峰为β-型吡喃糖。
图3为实施例一得到的大豆秸秆多糖的气相色谱图；从左至右编为1-9号峰，1号峰为PMP；2号峰为Man的衍生物；3号峰为GlcN的衍生物；4号峰为GlcA的衍生物；5号峰GalA的衍生物；6号峰Glc的衍生物；7号峰Gal的衍生物；8号峰为Xyl的衍生物；9号峰为Fuc的衍生物；由图得到的分析结果如表1所示，
表1大豆多糖中各构型糖苷键成分摩尔比
Figure BDA0002671696400000071
图4为实施例一得到的大豆秸秆多糖的1H-NMR谱图，根据图谱能够看到SSPS1质子峰的位移值大部分小于4.95，而质子峰的化学位移值大于4.95可判定其具有α构型糖苷键，小于4.95可判定其β构型糖苷键。SSPS1具有β-型糖苷键。
图5为实施例一得到的大豆秸秆多糖的I2-KI光谱图，由图可以看出SSPS1与I2-KI溶液混合后在565nm处无吸收峰。
图6为实施例一得到的大豆秸秆多糖的刚果红实验数据图，a代表大豆秸秆多糖，b代表刚果红；由图可以看出随着的浓度升高，刚果红与SSPS1形成的络合物的最大吸收波长相应减小，但相对于刚果红本身最大吸收波长减小的缓慢，说明SSPS1可能不具有三螺旋结构。
图7为实施例一得到的大豆秸秆多糖的刚果红XRD扫描图，由图可以看出SSPS1在2θ范围内呈现出弥散宽峰，表明SSPS1基本属于无定型结构。
图8为实施例一得到的大豆秸秆多糖的扫描电镜图(10μm)，图9为实施例一得到的大豆秸秆多糖的扫描电镜图(2μm)，图10为实施例一得到的大豆秸秆多糖的扫描电镜图(1μm)，由图可以看出SSPS1成无规则形态，由不规则的块状堆积。
由以上对大豆秸秆多糖的结构分析可知大豆秸秆多糖的结构式为
Figure BDA0002671696400000081
大豆秸秆多糖对肝癌HepG2的增殖抑制作用：肝癌HepG2细胞为体外研究的对象，采用MTT法检测不同浓度大豆秸秆多糖对肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用，进而判断大豆秸秆多糖体外抗肿瘤活性。
实验对象：肝癌HepG2，由药学院(药物工程技术研究中心)提供。
具体操作如下：
将生长至对数期的肝癌HepG2细胞接种于96孔板上，以每孔8x103个的细胞密度进行接种，放入37℃、5％CO2培养箱中培养24h，弃去培养基用浓度为64、128、256、512、1024μg·mL-1的大豆秸秆多糖对人肝癌细胞HepG2作用72h后生长抑制率分别为37.17％，41.02％，44.41％，47.75％，53.08％，随着大豆秸秆多糖给药浓度增大，生长抑制率逐渐增强，呈剂量依赖关系(如表2所示)。经计算，大豆秸秆多糖对人肝癌细胞HepG2作用72h后的半数抑制浓度(IC50)为658μg·mL-1。
表2大豆秸秆多糖对HepG2细胞增殖的影响(
Figure BDA0002671696400000091
n＝5)
Figure BDA0002671696400000092
与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01
经过大豆秸秆多糖干预后的肝癌HepG2细胞，通过流式细胞仪检测后发现了明显的凋亡峰，结果表明DNA的合成受到了抑制。经过72h后，三组平行测得大豆秸秆多糖四组剂量的凋亡率分别是(8.501±0.217)％、(8.501±0.217)％、(6.296±0.178)％，(4.207±0.355)％分析得出，随着大豆多糖给药剂量的增加，测得凋亡峰越低，凋亡率也随之呈下降的趋势，且均有显著性差异(P<0.01)。测得阳性对照组的凋亡率为(2.966±0.168)％，经与空白对照组比较具有显著性差异(P<0.01)。(如表3所示)
表3大豆秸秆多糖对HepG2细胞的凋亡率(x±s,n＝3)
Figure BDA0002671696400000093
与空白对照组比较*P＜0.05,**P＜0.01
图12为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡BCL-2相关基因表达影响图，其中“■”代表BCL2、
Figure BDA0002671696400000094
代表BCL2A1、
Figure BDA0002671696400000095
代表BCL2L1、
Figure BDA0002671696400000096
代表BCL2L10、
Figure BDA0002671696400000097
代表BCL2L11、
Figure BDA0002671696400000098
代表BCL2L2；图13为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡BAX基因表达影响图；图14为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡CASP3基因表达影响图；图15为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡CASP9和APAF1基因表达影响图，其中“■”代表APAF1，
Figure BDA0002671696400000099
代表CASP9；图16为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡CYCS基因表达影响图；图17为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡FADD基因表达影响图；图18为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡FAS和FASLG基因表达影响图，其中“■”代表FAS，
Figure BDA0002671696400000101
代表FASLG；图19为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡CASP8基因表达影响图；图20为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡CD27和CD70基因表达影响图；其中“■”代表CD27、
Figure BDA0002671696400000102
代表CD70；图21为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡TNFRSF10A基因表达影响图；图22为大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡TNFRSF10B基因表达影响图；以上为大豆秸秆多糖预HepG2细胞的凋亡相关基因表达影响，用荧光实时定量PCR技术对大豆秸秆多糖干预HepG2细胞的凋亡相关基因表达进行检测显示，在细胞线粒体凋亡途径中BCL2、BCL2A1、BCL2L1、BCL2L10、BCL2L11、BCL2L2基因表达改变均随着大豆秸秆多糖给药浓度的升高而增大。BAX、CASP3、CASP9、APAF1、CYCS基因表达改变均随着大豆秸秆多糖给药浓度的升高而减小。在细胞死亡受体凋亡途径中FADD、FAS、FASLG、CASP8、CD27、CD70、TNFRSF10A、TNFRSF10B基因均随着大豆秸秆多糖给药浓度的升高减小。经大豆秸秆多糖作用后，细胞内的Bcl-xL和Bcl-2蛋白表达量随大豆秸秆多糖浓度增大逐渐升高，Bax的蛋白表达量逐渐降低，大豆秸秆多糖给药组Bcl/Bax的蛋白表达量比值逐渐增大。细胞内Cytochrome C和Caspase-9的蛋白表达量随大豆秸秆多糖浓度增大逐渐降低，并且随着大豆秸秆多糖浓度的增大而增强，在剂量上表现出一定的依赖性。综合以上结果说明，大豆秸秆多糖可以通过作用HepG2细胞，增大Bcl-2在细胞中的蛋白含量，降低Bax的蛋白含量，通过提高Bcl/Bax的蛋白表达量比值，来抑制MPTP孔开放，维持线粒体膜电位。稳定线粒体的内外部结构，使Cyt-C无法释放。中断Caspase级联反应，阻止细胞凋亡。由此表明，大豆秸秆多糖可以通过线粒体途径抑制HepG2细胞凋亡。
Caspase-3、8、FADD、CD95/FAS、DR4、DR5、TRAIL蛋白表达量逐渐降低，随着大豆秸秆多糖浓度的增加而减小。PARP、Caspase-12蛋白表达量逐渐升高。并且随着大豆秸秆多糖浓度的增加而增加。细胞内死亡受体Fas/CD95的配基是一个同源三聚体蛋白，与Fas/CD95集合后引起了无活性Fas/CD95复合物的聚集和活化，形成了死亡诱导信号复合体(DISC)。Fas-DISC包括连接器Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)和Caspases-8，这个复合体可以起始凋亡。Fas-DISC的各组分是通过同类结构域相互作用而聚集在一起的，由Fas配基引起Fas/CD95，FADD和Caspases-8聚集，通过接近诱导效应引起起始Caspases的自动水解，剪切活化的Caspases-8从DISC释放出来，继续活化下游凋亡蛋白，引发广泛的Caspases级联反应，其中活化的Caspases-3可以剪切其他的Caspases，也可以剪切与细胞生命息息相关的底物，加快了凋亡效应阶段的步伐，导致细胞凋亡。由此表明，大豆秸秆多糖还可以通过死亡受体途径抑制HepG2细胞凋亡(如图11所示)。

Claims (7)

1.一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖的应用，其特征在于该大豆秸秆多糖作为抑制肝癌细胞的生物活性成分应用于制备抗肝癌药物；
所述大豆秸秆多糖的分离纯化方法，具体按以下步骤进行：
一、制备大豆秸秆粗多糖；
①将大豆秸秆晒干，采用粉碎机打碎，然后过筛，获得秸秆粗粉；
②将秸秆粗粉在水中浸泡12~14h，然后热水浴回流浸提，获得提取液；随即过滤，将获得的滤液减压浓缩，得到浓缩液，浓缩液与滤液的体积比为1：5；
③将浓缩液冷却，加入无水乙醇，沉淀12~14h，然后离心分离，获得沉淀物；
④将沉淀物冷冻干燥，获得大豆秸秆粗多糖粉末；
二、将大豆秸秆粗多糖粉末加入蒸馏水，获得多糖溶液，然后加入Savage试剂和TCA溶液，搅拌均匀，再离心处理5~7min，取上清液，干燥，获得脱蛋白大豆秸秆粗多糖；
三、将脱蛋白大豆秸秆粗多糖加入单蒸水，获得待脱色溶液，然后加入中性H2O2溶液，进行脱色处理，然后放入透析袋中透析，获得脱色大豆秸秆粗多糖；
四、采用DEAE-52纤维素柱色谱将脱色大豆秸秆粗多糖进行分离，获得多糖初产物；
五、将步骤四获得的多糖初产物溶于蒸馏水，离心处理，取上清液，在高于Sephadex G-100凝胶柱色谱凝胶表面1 cm处贴壁上样，然后采用去离子水作为洗脱液洗脱5 h，收集洗脱液，采用苯酚-硫酸法隔管检测洗脱液在紫外490 nm处光密度值，绘制洗脱曲线，合并洗脱曲线中呈单一峰的多糖组分，减压浓缩后透析60 h，冷冻干燥，得大豆秸秆多糖；
步骤二中大豆秸秆粗多糖与Savage试剂的质量体积比为50mg：20 mL；大豆秸秆粗多糖与TCA溶液的质量体积比为50mg：10 mL，TCA溶液的体积百分含量为1%；
步骤四采用DEAE-52纤维素柱色谱将脱色大豆秸秆粗多糖进行分离具体操作为：将脱色大豆秸秆粗多糖加入到蒸馏水中完全溶解，离心处理后将上清液加入到DEAE-52纤维柱中，然后控制流速为1 mL·4min-1，采用浓度为0.1mol/L的NaCl溶液进行洗脱，每16min收集一管洗脱液，采用苯酚-硫酸法对洗脱液检测吸光度值，收集主要吸收峰液体；冷冻干燥，获得多糖初产物。
2.根据权利要求1所述的一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖的应用，其特征在于步骤二中多糖溶液中大豆秸秆粗多糖的质量浓度为0.25 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖的应用，其特征在于将步骤二的操作重复1~6次。
4.根据权利要求1所述的一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖的应用，其特征在于步骤三所述待脱色溶液中脱蛋白大豆秸秆粗多糖的浓度为0.5mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖的应用，其特征在于步骤三所述中性H2O2溶液中H2O2体积分数为9~15%，采用氨水调节pH。
6.根据权利要求1所述的一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖的应用，其特征在于步骤三脱色处理30~50min，处理温度为60~70℃；透析时间为60h。
7.根据权利要求1所述的一种用于抑制人肝癌细胞的大豆秸秆多糖的应用，其特征在于步骤五控制上样流速为0.4 mL/min。
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