TWI327066B - Black soybean polysaccharides - Google Patents

Description

1327066 /、、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 根據最近的研究報告，大豆67/c/;?e zffaz (L. ) Merr. 可以調節免疫反應，預防癌之生成（carcin0genesi s)，以 及抑制腫瘤生長。請參考：Zhang et a 1.，Nutr. Cancer, 1997， 29:24-28; Zhou et al.， J. Nutr., 1999， 129: 1628-635; Benjamin et al., Brazilianh J. Med. Biol. Res., 1997,30： 873-881； Rao et al., 1995,125 (suppl 3):S717-s724; and Meydani et al. , J. Am. Colle. Nutr., 1991, 19:406-428 。 黑大豆(L· ) Merr.)是一種具有黑色種 皮的大丑變種培育植物。在傳統中醫藥學中已經被使用至 少百年。 亦有報告指出，草藥藥方中含有黑大豆和其他草藥成 分會使白血球減少症患者的白血球數量增加。請參考：

Wang， Trad. Chi. Med· Res·， 1992， 5: 35-36。然而， 對於是在黑大豆中所含有的何種化合物、以完全或部分之 形式、而達到治療效果，都還不清楚。 【先前技術】 本發明係基於由—4"· 士 5 ί* 般大旦’特別疋黑大豆’純化出的 多醣體，可以維持有益的生物活性之發現。 因此本發明之—^態係有關力一種營養食品组合 物，其可以是—種無酒精軟性飲料、牛奶、一種零食、果 4 σ°、或者是—種植物性的藥物。該營養食品 組合物包括〇 〇l_qQ舌旦 .99重I百分比（例如，在無酒精軟性飲料 或者是牛奶中Α ί) Π1 10/ ^ 马0.01—1%，在飲食補給品或者是植物性的 樂物中為l-qc)9n，& _ 9 }攸丑類或者是黑大豆之萃取物富集的多 醣體。該組合物中’多醣體的成分(即0.0卜99重量百分比) 可以使用本領域孰立Μ 、 1域熟知的方法確認。這種多醣體可以增加血 東、田胞數目’刺激細胞激素的產生，以及增強免疫能力。 換句話說，含豐富多醣體的豆類萃取物，特別是由黑大豆 —者係用於作為本發明之營養食品組合物的活性成 分。多醣體可以是與蛋白質分離，或是與蛋白質結合者。 本發明的另-型態係有關於-種多醣體，具有α (1’6)_鍵結葡萄糖殘基，以及一或多個（如：4或5個）葡 萄糖’半乳糖或甘露糖殘基的骨架，其經由（1，3)_或（1，4) 鍵結連結至一或多個葡萄糖殘基之C-3或C-4位置，例如 經由一或多個於一骨架之葡萄糖殘基的某些C-4位置以及 /或經由一或多個於同樣或另一骨架之葡萄糖殘基的C_3 位置。這些殘基的莫耳百分比可以為5%半乳糖，6%甘露糖 和89%的葡萄糖（±2G%)。多糖體的分子量高於8_al，例 如.介於300到600KDal的範圍中。 本發明之更一型態係有關於一種由豆類和黑大豆富集 多糖體的方法。it些多糖體通常具有冑分子量，也就是高 於80KDal(例如：300到60〇KDal)。本方法包括下列步驟门 浸泡研磨的大豆於水中或水與有機溶劑的混合液中(例如. 乙醇），以溶解多醣體(有或無事先將研磨的大豆浸· 1327066 機溶劑或經機械懕六w ^ 飛械壓力以移除低極性成分）；以及以過濾或離 心移除不溶解的成分I必隹 ，、收市上々液。包含於上清液的多醣 體可藉由辰縮上清液，以蒸館法或以足量的乙醇沈殿接著 過濾或離心而取得。選擇性的，在不溶解的成分被移除之 前，可加入足量的沈澱增強劑至該溶液中，以沈澱大多數 的脂質和蛋白質成份。沉澱物增強劑是一種可以引起不溶 解成份沉殿的化a你# &人& ° 或、，· 5物。脂質或蛋白質的沉殺增強 劑之例子包括酸(例如:醋酸和氯化氫），鈉鹽(例如：氯化 鈉）’約鹽（例如：硫酸㈣氯化約），鎮鹽（例如：氯化幻， 以及氨鹽（例如：硫酸氨）。上清液也可適當地透析（例如： 以壓力透析或超過濾）’並且同時濃縮，以在收集多糖體前 移除小於多糖體的化合物。替代性地，將乙醇加入上清液 以增加ίο,%的體積（例如：增加1〇_2〇%，2〇_3〇%， 30-40% ’ 40-50%或者50_6〇%的體積），以沉澱高分子量 多醣體。 南度富集的高分子量多醣體也可以-蛋白酶處理，接 著再度透析或以乙醇沉澱，以除去蛋白酶和胜狀。 本發明之「高分子量多醣體」’係指由大豆或黑大豆 中抽取出’具有高於80KDal(例如:3〇〇-6〇〇〇al)的分子量 的多糖體。這樣的多醣體可以經過修飾，例如：可以藉 音波裂解或酵素消化，以減少其分子量。 。 本發明’亦包含一種於一個體增加血球細胞數目的方 法’血球細胞包含紅血球，巨核細胞，特別是白血球(例如. 類骨㈣白血球’如嗜中性球’單核球’顆粒球以及唾伊 6 1327066 ’’工性球）。更具體地，上述個體係以由磨碎的大豆或黑大豆 之萃取物所製備的多糖體治療。多醣體可具有一高分子量 (即，向於80KDal ’如，300-600KDal)，或一低分子量（即， 低於80KDal)，或者可以為那些高分子量或低分子量的組 合物。多糖體可以直接施予上述個體。或者，可採用下述 之活體外方式：由個體收集週邊血液細胞（包括成熟血球細 胞ス及包括幹細胞的原始細胞），骨髓細胞，或其紐^合物， 於一培養基中培養多醣體，以及接著將之送回上述個體。 從大豆或黑大豆中所製備的多醣體也可以被用於活化 細胞免疫力’其係藉由增加腫瘤壞死因子α (TNF “）和其 他細胞激素的量，並且可以增強一個體預防或治療癌症的 免疫力。多糖體亦可以藉由增加血球細胞數目和補強 (boost ing)免疫系統能力’改善病毒感染病患的健康，如 HIV感染病患。 本發明之範圍亦包含一種獲得一細胞激素（cytokine) 的方法，（細胞激素為如腫瘤壞死因子α，干擾素r，白介 素-3’白介素-6，白介素- I?’顆粒球群刺激因子，單核球 群刺激因子，或顆粒-單核球群刺激因子）。該方法包括使 用從大豆或黑大豆中製備的多醣體。舉例來說，從哺乳類 動物中收集而來的細胞激素生成細胞 (cytokine-producing cells)，可以在含有由大豆或黑大 豆中製備的多黯體之培養基培養’以生產細胞激素。由此 獲得的細胞激素再由培養基中分離出來。或者，多醣體可 以施予一哺乳類動物’以刺激細胞激素的產生。細胞激素 1/066 可以再由動物血液中分離出來。 本發明更關於一種协—Jm m ju 、一個體中預防和治療癌症的方 法’該方法包括施予一所费·袖脚丄丨_ 厅需個體由大豆（?V_7c//7e啦/ (L.)

Merr.萃取物製備的多醣错 夕聰體或者該多糖體具有一 α-(1，6) 鍵結D-fj苟糖殘基之骨举w β目士 月木以及具有一或多個半乳糖，甘露 糖或葡萄糖殘基的支鍤。μ、+、# — 述癌症可以是白血病（1 eukem i a 或者是一固態腫瘤β 3 一種樂學組合物，其包含 ’以及一種於一個體增加血 内或是活體外以該藥學組合

並且’本發明之範圍亦包 多醣體以及藥學上可接受載體 球細胞數目的方法，係於活體 物治療該個體；以及-種以上述藥學組合物，增加一個體 之免疫能力’以預防或治療癌症或傳染病的方法。包含於 上述組合物之多糖體’可以為由大豆和黑大豆富集者，其 具有高於SGKDal(例如：議__KDal)或低於隱Dai的分 子量；或為具冑α-(1，6)鍵結D-葡萄*殘基之骨架以及具 有一或多個半乳糖，甘露糖或葡萄糖殘基之支鏈者。 本發明之其他特徵，目的，和優點，將會揭露在以下 敘述和申請專利範圍中。 【發明内容】 本發明之多種實施例係基於對於由大豆或黑大豆純化 的夕醣體’刺激細胞激素生產’增加血球細胞數目以及增 強免疫力的觀察。 多醣體可以自多種來源之磨碎的黑大豆中萃取得，並 8 1327066 可以下列方法富集。磨碎的黑大豆適當地浸泡於一有機溶 劑（例如：乙醇）中，或以機械屢力，去除低極性的成分，例 如：脂肪酸。有機溶劑無法溶解的部分再浸泡於水中或水 溶液中’並且於高溫培育適當時間(例如：於1〇ot：j0分鐘 或者於啊8小時），以萃取多聽體。收集萃取物（例如： 以過滤法）’並適當地以如疏㈣（⑻_如…⑷之試 劑處理，以沉殿出低極性成分和蛋白質。沉殺物再以離心 或過滤方法除去。多醣體溶液適#地以或濃縮（❹：以 壓力透析或超過濾’或以乙醇沉澱多醣體，例如以議 體積的量），然後，適當地乾燥（或者冷康乾燥），以獲得多 醣體製備物。該濃縮萃取物可以蛋白酶處理（例如：蛋白酶 K)’然後再—次透析或·以移除蛋白酶和小胜肽。依所 需’多醣體製備物可進-步以膠體㈣（gei fntrati〇n) 3 '、、適。的方法來虽集或甚至純化。對刺激血球細胞增 殖和增強伯主免疫能力具有強度的多醣體或多醣體混合物 的平均分子量大約A 48GKDa卜且可以膠體過濾層析法確 認。廷些多醣體中一種成分是一種多糖體，其具有α 6)-鍵結葡萄糖殘基之骨架以及一或多個（如4或5個） 葡萄糖’半乳糖或者甘露糖殘基之支鏈，上述骨架與支鏈 系^1，或（1，4)鍵結連結至一或多個葡萄糖殘基之 ^或C 4位置，上述鍵結係如一或多個殘基在一骨架葡 \ ’殘基之某個C-4位置以及/或一或多個殘基在同樣 或^骨架葡萄糖殘基之C-3位置。這些殘基的莫耳百分 D 、為5/6半乳糖，6%甘露糖和89%的葡萄糖（土2〇%)。 1,327066

_· 多醣體的量係決定於酚-硫酸（phen〇l-suifuric aci(O • 總碳水化合物確認試驗，或者任何類似的方法。請參考例 如：Fox et al· Anal Biochem.，1991，195:93-96。例如， .一多醣體與酚的混合物加入微滴定盤上的孔洞中，並以低 速搖動，然後使用冰塊冷卻。接著’在每-孔洞中加入濃 縮硫酸，然後再以低速搖動滴定盤，並在高溫下培養後冷 卻。以492mn的吸光值測量決定單醣體 (IH〇n〇CSacharide)(由多醣體水解而來）的量，使用麥芽糖 拳和D-葡萄糖作為標準。 夕醣體的製備 一 从低用木配製马一種 營養食品組合物，以治瘁（魚括 席I匕括預防或者改善症狀）與低量 的細胞激素或低血球細胞數目「胜 肥歎目C特別是白血球數目）相關的 生理失調’例如：化學治療後的莸 煻傻的癌症病人。該營養組合物可 以是一種飲食的補充物（例如.膠壸 膠曩或樂錠或者置於微型的 囊狀物中），一種食品（例如·一 . 種“，、酒精軟性飲料，牛奶， 果汁，一種點心糕點或者被放在— ^ 檀樂草的茶包中），或者 一種植物性的藥物。該植物性藥 罘物可以是一適合口服的形 式，例如：藥錠，硬式或者是軟式 式的膠囊，水狀液體或是糠 浆，或者疋—適合非口服的投與形式，例如-種水狀丙埽 溶液，或—種緩衝水溶液。該營養組合物之活性成 份的置大部分範圍係取決於個 成 夕说L 锻之特殊需要。其量也將會 多樣化，如熟於此技藝人士所 了解，係依據投與路禋， 以及可此共同投與的藥劑，上 + 4# 4 i I 扎樂劑亦可以刺激細胞激素 生產或增加血球細胞數目。 ^ 10 1327066 部分或者高度純化的多醣體，以一有效劑量可與一藥 學上可接文載體配製成一種藥學組合物，以治療上述生理 失調。「一有效劑量」是指多醣體的劑量足以給予被治療 個體療效。有效劑量係多樣的，如熟於此技藝人士所能了 解’係依據投與路徑’賦形劑的使用，以及選擇性加上其 他治療方法的共同使用。藥學上可接受載體的例子包括膠 狀的二氧化矽，硬脂酸鎂，纖維素，月桂基硫酸鈉，以及 D&C Ye 11 ow .# 1 〇。 夕醣體可以利用常見的方法配製成不同投與路徑之齊 型。例如：可被配製成膠囊，密閉的膠狀物，藥錠以用於口 服投與。膠囊可包含任何標準藥學上可接受的原料，如： 明膝或纖維素。藥錠m缩多_體和㈣載體與潤滑劑 之混合物，以傳統的程序配製成。適當的固體載體包括例 如澱粉和糖膠。多醣體也可以硬殼藥錠或含黏結劑，如 乳糖或甘露糖’傳統填絲，以及製_謂囊形式投盘。 藥學組合物可以是經由非口服的方法投與，例如：局部「 腔内，以及靜脈内投與。非口服劑型的例子包括活性率劑 之！溶液，等渗透壓的食鹽水韻的葡萄糖，或其= :樂學上…的賦形劑。環葡聚糖，或其他 劑，可以被用作藥學職形劑，以運送治療化合物。 在本發明的範圍中，也包含使用由 多醣體’以治療上述生理失 斤製備的 之藥劑的製法。 治療此類生理失調 一試管内 貫驗可以被用來評估本發 明之營養或藥學組 1327066

σ物對刺激細胞激素生產（例如：以—酵素連結免疫吸收試 驗（ELISA))或者增加原始血球細胞數目（例如：藉由顆粒— 早核球群形成單位（CFU-GM)試驗）的效力。例如，細胞激素 生成細胞（例如：脾臟細胞或單核細胞），可以被培養在存在 本發明之組合物的培養基中，以提高細胞激素的°生成。如 此可以測量在培養基中生產的細胞激素量（例如，以EUSA 套組）。包含細胞激素的脾臟細胞培養基，可以與骨髓細胞 培養以增加血球細胞數。原始細胞數目的增加可以試 驗測量細胞群總數。 初步篩檢（試管内）本發明組合物的效力，可以活體内 試驗確認。例如’將小鼠飼以含多糖體之組合物，測量其 時間間隔的血球細胞數或細胞激素量。可測試不同劑量與 才又與方法。根據結果，可決定適當的劑量範圍和投與路徑。 從模式動物所得來的資訊，可作為設計臨床研究的依據。 不需更進-步闡述，熟於此技藝人士當可根據文中敛 述’利用本發明至最大的範圍。以下特定的實施例，係描 述黑大豆多酿體的製備與試驗’僅作為說明，而並非用以 限制本發明。因此’即使以下實施例描述分離與使用由黑 大旦株製備之多聽體，以並侦堃士 __ ^以具他黑大且或大豆株系製備的多 餹體（與以下實施例！ f中所描述可能會有—些構造上的 不同)以及其使用亦包括在本發明的範圍中。所有本文中所 列的出版品係以其整體作為本發明之參考資料。 【實施方式】 12 1327066 實施例一： 來自黑大豆之多糖體的分離舆構造特性 來自則义（L. ) Merr.株的豆子（深紫黑色的 種皮和綠色的子葉，來自台灣台南區農業改良站），被切碎 然後浸泡在一有機溶液中，以去除低極性的成分。然後將 切碎的豆子浸泡在水中。經過離心分離後所得到的水萃取 物’即上清液’以液相色層分析法，接著’以交聯葡聚糖 LH-20 管柱（Amersham Pharmacia Biotech.，Little Chalfont，Buckinghamshire，England)，以及 Fractogel TSK HW-55F 管柱純化。將純化過的水萃取物以蛋白酶 -K(protease-K) (50mg/ml;Sigma Co., Saint Louis,MO) > 於37 °C下處理一小時。最後，蛋白酶-K處理過的水萃取物 進一步採用 Sephacryl S-400 管柱（Amersham Pharmacia

Biotech.)進行膠體過濾而純化，並使用低壓凍乾法 (lyophy 1 izat ion)乾燥以得到多醣體。由S-400管柱的結 果推知主要多醣體具有約480KDa】的分子量。

多醣體的分子量取決於使用標準的葡聚糖（Amersham Pharmacia Biotech.)來分等級。請參考例如：Liao et al.， Anticancer Drug, 2001,12(10)： 841-846; Hara et al., Carbohydr. Res., 1982, 110: 77-87;and Ukai et al., Carbohydr. Res. , 1982，110 : 109-116。總碳水化合物之 瑞認係以紛-硫酸（phenol sulfuric acid)比色測試法，並 使用葡萄糖作為標準而進行。請參考：Fox et a 1.，Anal. Biochem.，1991, 195: 93-96。其單醣體組合物係以 2.〇N 13 1327066 的三氟乙酸（trifluoroacetic acid)在100T：下水解6小 時確認’再以Dionex DX-500色層分析系統，採用 carb〇PaCTM MA-1管柱進行離子交換而純化。請參考例如

Hardy etal.’ Anal. Biochem·, 1988，170: 54-62。組合 物中主要多醣體和單醣體之間的連結係使用1H_和j 3H — 光譜（spectroscopy)，或者氣相液相色層分析_質量，於 HP 5973 MSD’ 以 HP 6870 系列系統（HP company，Wilmingt〇n DE)確認。特定多醣體旋光係使用JASC〇DIp_37〇數位偏極 計（digital P〇larimeter)(JASC〇 c〇rp.， Japan)，於 24 °C水中，使用589mn波長的鈉離子燈而測量。 主要多醣體在水中具有特定的旋光【61：】1)+122.2<>，。 = 0.45。光譜結果顯示多醣體必須以α-(1，6)_鍵結d—葡 甸糖殘基之骨架，以及半乳糖、甘露糖或葡萄糖殘基在c—3 或C 4位置以（1，3)-或（1，4)-鍵結知支鏈取代》這些殘 基的莫耳百分比為5%半乳糖，6%甘露糖和89%的葡萄糖（土 20%) 〇 多醣體由此獲得（以上述多醣體作為主要成分），或者 使用相似的方法獲得，儲存及使用在下述的實施例中。 實施例二： 多醣想對細胞激素之生產的效力 將脾臟從無特定病原情況下飼養的⑽小鼠週 大，2〇為重）中移除，均質化使成單一細胞並使用卜㈣ 的金屬師子過濾懸浮液。帛著’將該脾臟細胞(1 X ls/mL)於包含1〇%胎牛血清（Fcs)的肝μ 培養 14 1327066 液，上述培養液係包含以蛋白酶處理過並以Sephacry S_400管柱純化過，多種濃度（如：〇, 12.5, 25, 5〇和ι〇〇 gg/ml)的多醣體，於3rc下，含有5%二氧化碳，完全濕 潤的空氣中培養。72小時後，收集含有脾臟細胞的培養基 (SCMs)，消毒，以卜mL之包裝存放於_7〇。〇下以備使用。

SCMs中生產之細胞激素（即：白介素_3，白介素_6，白 介素-17,顆粒球群刺激因子，單核球群刺激因子，以及顆 粒-單核球群刺激因子）的測量係以EUSA套組（R&D

Systems，Minneeapolis，MN)，使用一含 SCM 未處理之脾臟 細胞作為對照組，而進行。請參考例如：Lia〇 et al.，

AntiCancer Drug，2001,12(10): 84卜846;以及 Current

Protocols in olecular Biology, Chapter 11, Academic

Press’ John, Wiley 和 Sons, Inc.,1998。 刺激二天後，I.L-17, GM-CSF, G-CSF 以及 il-6 在 PSBS-SCMs中的量顯著地增加。 實施例三： 多醣體對群落形成單位的效力 a)對顆粒球-巨噬細胞群落形成單位（CFU_GM)的效力 CFU-GM試驗使用軟瓊酯培養方法進行，如同：Wang et a1.’ Exp. Hematol·，1 996，24: 437 所述。自 ICR 小鼠 收集的骨髓細胞於添加有10% FCS的RPMI l64〇培養基再 懸浮’並培養在3 7 X：下，具有濕潤5 %二氧化碳的培養箱中 9〇分鐘。非附著的骨髓細胞（lxl05 cells/mL)接著被分裝 l~mL的〇. 3%瓊酯（Sigma)層，於添加有15%FCS、必須或非 15 1327066 必須胺基酸、維他命C以及丙酮酸鈉（sodium pyruvate) 的McCoys’ 5A培養基中培養。多種20%(v/v)SCMs或單獨 的多聽體亦加入分裝有相同最終細胞濃度的培養盤中。7 天的培養後，在每一個培養盤中的群數，採用倒立顯微鏡 (Olympus, Melville，NY)計數。群落的型態學係以5%的 戊二酿（glutaraldehyde)固定，以甲醇脫水，以及Harris， 踩木素染色而原位嫁認。請參考：Wang et a 1.， Exp.

Hematol. ， 1992， 20:552 〇 結果顯示，以多醣體處理明顯地增加處理過SCMs中 培養骨髓細胞菌落的形成。型態學分析指出4種群落，即， 顆粒球’單核球/巨嗟細胞，顆粒_單核球，以及嗜伊紅球， 經由多糖體的處理而被引發。 b)對多潛能（CFU-GEMM)及類紅血球（BFU-E)群落形成單位 的效力 CFU-GEMM和BFU-E的群落試驗根據Wang et al.所述 的步驟完成（in the Proceeding of the 1 990 Science, Engineering and Technology. Houston :AACP, Hsieh ed., 1 990, (SI) :10； AND IN Wang et al., Blood, 1 985, 65 :1181 )。特別地是，5x 1 04的骨髓細胞被分裝於3 5mm培 養盤中’其中包含有 lmL的1%甲基纖維素 (methylcellulose)於 Iscove’ s 改良的 Dulbecco’ s 培養 基（StemCell Technologies，Vanconver，Canada)，30% FCS，1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin)，1 0-4M 2-疏基乙醇（2-mercapt〇e1:hanol)，2Mm L-榖胺酿胺酶 16 1327066 (L-glutamine)， 一單位的促紅血球生成素 (erythropoietinKEPO; Connaught Laboratories Ltd. Willowdale，Ontario，Canada)’ 以及 2〇% 多種的 SCMs 的混合物。該培養盤被培養在3的濕潤空氣中，暴露在 含有5 % 一氧化碳的空氣中7天。培養後，以倒立顯微鏡 鏗定並分級群落。CFU-GEMM顯示混合的群落，包含顆粒球 (G)’紅血球（E)，單核球/巨噬細胞（M)，以及巨核細胞（M)， 同時BFU-E顯示多中心（擠滿的）紅色的或粉紅色的類紅血 球群落。 結果指出’多糖體處理明顯地增加cfu_gemm和bFU_e 群落在SCMs的形成，並且顯示劑量依存性。 實施例四： 多醣體對小鼠骨题系細胞生成的效力 為檢驗多醣體對受過輻射線照射小小鼠的效力，20 隻ICR小鼠被分為下列4組（每組5隻小鼠）：對照組，單 以多醣體處理，單以全身輻射（TBI)處理，以及以TBI與多 糖體處理。每隻小鼠於第〇曰全身施照以單一級數8Gy(6MV 光子束）’使用線性加速器（Clinac^ l8〇〇 Varian

Associates，Inc.’CA’ USA,劑量級 2.4Gy/min)之輻射 線。於第0至4日’ TBI後6小時施以口服多醣體 (400mg/kg)。在對照組當中，小鼠接受正常口服食鹽水。 於第0’ 2’ 4’ 6’ 8’ 1〇’ 12, 14和第16天由眼框靜脈竇 收集週邊血液’並以庫爾特計數器（(：〇ιι1_^Γ c〇un1：er)計數 白血球。此外，在實驗期間，每隔一天測量小鼠體重。在 17 1327066 第17天，犧牲小鼠並取屮a 卫取出骨礦成分（BMCs)以 試驗。類骨髓群落形成（rpTi 丁砰洛瓜成 战（CFU-GM)以上述方法評估。 以150mg/kg單一兩丨吾6^ P；产《= 的5-氟尿嘧啶（5_FC)， 射至ICR小鼠。6小時狳， 腹腔注 時後連續5天給予口服多醣體 400mg/kg。小鼠在第u天鱔 ^ 天犧牲，並收集BMCs進行群落形 成試驗。在這兩個活體内實驗 _ 貫驗的結果顯不’ ICR小鼠的基 底白血球數，在沒有處理的對照組中以及多醣體處理的實 驗組中是相似的。輻射線和5_FU處理皆引起明顯的骨髓抑 制。在TBI和5-FU處理後，白血球數明顯地減少。接著連 續5天的投與多醣體(從第0日到第4日），不但減低τβι 和5-FC處理造成的白血球數減少的程度，而且縮短了白血 球數恢復的時間。TBI和5-FC處理後，CFU —GM群落數大為 減少（分別是33±6以及41±5個群落）。多醣體的服用可以 重新修復輻射線照射和5一FU處理小鼠的骨髓系細胞，與單 獨處理以TBI和5-FC的組別比較，CFU_GM數增加大約2. 〇_ 倍（TBI)以及 1 _ 8 倍（5-FU)。 實施例五： 多磨體在白血病細胞株U937的效力 人體類骨髓白血病細胞株U937，自美國菌種中心 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) 取得’用於本試驗以證實多醣體的抗癌特性。U937細胞被 培養於添加有l〇%FCS的RPMI 1640培養基中，維持在37 C以及潮溼的、含5%的二氧化碳之培養箱。lxl 〇5cel 1 s/ml 的細胞被培養在存在或不存在 30 % (v/v)正常 18 1327066 MNC-CM(N-MNC-CM)，PSBS(25-400 /i g/m】）-MNC-CMs，或者 是單獨PSBS(25-400 # g/ml )之中。5天的培養後，使用橡 膝刮子（rubber p〇licman)(Bellco Glass, Vineland, NJ) 輕刮培養盤收集細胞，並以錐藍（trypan bl ue)染色排除試 驗計數存活細胞數。 結果指出，U937細胞的增殖很明顯地受到 PSBS-MNC-CM的抑制。然而，在正常MNC-CM或單獨PSBS(•高 達40 0microg/ml)中沒有觀察到明顯的抑制情形。 5天的多種處理後，收集該細胞並使用細胞抹片離心 機（Cytospin)(Shandon Southern Instrument Inc.)將細 胞離心至顯微破片上’.以Wr i ghl; ’ s染劑著色，然後使用 1 000X倍率於倒立顯微鏡（〇lympus)下觀察。細胞形態學被 分為下列三階段：不成熟芽細胞（immature blasts)，中間 期（intermediates)，以及成熟單核球或巨噬細胞。 結果顯示’ PSBS-MNC-CM引發不成熟細胞分化成為成 熟早核球或巨嗟細胞。芽細胞百分比明顯的減少，從9 8. 7 ±0.9% (未處理的對照組），減至2.3±1.5%(MNC_CM備自 400microg/ml的PSBS)。相比之下，單核球加上巨噬細胞 的百分比增加’從〇±〇% (未處理的對照組）至83. 〇±4. 〇% (PSBS-MNC-CM)。 實施例六： 多醣體對促進骨髓活性的效力 取得BALB/c小鼠（6-10週大，20±5g)，並且保持於無 特定病原環境下，控制溫度以及溼度，在12小時的光照/ 19 I(327〇66 '•黑暗循環週期下’並且可自由攝取食物和水。所有的實驗 • 操作皆依照 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(DHHS 出版品 No· NIH 85-23，修定 1996)。CT26 鼠科結腸癌和先天的BALB/c保持在RPMI 1 640培養基（Lif e technology, Grand Island，NY)，添加 10%熱不活化的 a FCS(HyClone, Logan, Utah)以及 2Mm L_ 榖胺巯胺 (L-glutamine)(Sigma，St. Louis, MO)，並培養在 37〇c 且含有5%二氧化碳的濕潤空氣中，這些細胞被移植入 41 bala/c小鼠左腰皮下。 在無腫瘤的移植實驗當中，5-FU(150ing/kg體重），在 第〇日，以腹腔（i.p)注射至BALB/C小鼠，並且在5_FU注 射6小時後，每天一次給予口服或腹腔注射psBS(丨或 4〇〇mg/kg體重），連續5天。對照組的小鼠同時接受一般 生理食鹽水。在腫瘤移植組中，每隻小鼠左腰皮下注射在 PBS中的1 X1 〇 CT26腫瘤細胞。丨〇天後，腫瘤長至约 • 〇. 5Cm2，然後將小鼠分為3組（每組5隻小鼠），包括對照 組，單獨5-FU(150mg/kg，腹腔注射），以及5_FC加上多醣 體（400mg/kg，口服接著，藥物治療流程與前述無腫瘤實 驗的方法相同。 ° ’員示$ F U處理法明顯地使小鼠的白血球數減 少’不_有或無腫瘤植入。結合5天的sbs治療，不僅減 低因為5~Fut髓抑制所弓I起的白血球數嚴重過低，而且增 加了白血球數的恢復比率。在腫瘤植入以及吓處理的小 鼠中’多黯體的處理也增加了該小鼠的細胞激素量。 20 1327066 實施例七： 多醣體對抑制腫瘤生長的效力 在第0日’每隻BALB/c小鼠左腰皮下注射於pBS中 約1X1 06 CT2 6 Μ瘤細胞。接著，小鼠被分為以下4組：（1) 對照組，每星期4天以PBS處理，從第一天開始；單獨 施以多醣體組，口服400mg/kg，每星期4天，從第一天開 始’（3)單獨施以5-FU組，腹腔注射][5mg/kg，每星期1 次，從第11天開始；（4)結合多醣體開始於第一天，以及 5-FU開始於第11天。自眼框靜脈竇收集週邊血液，並使 用肝燐脂以抑制血球凝固的毛細管和庫爾特計數器 (Coulter counter)，來計算白血球。小鼠體重以及腫瘤大 小’在實驗期間每星期測量兩次’並使用卡尺以及使用下 列公式計算測量腫瘤大小，（Length/2)(Width/2) 7Γ。請參 考，Wang et a 1.，Anti-Cancer Drug Des., 1988，1 3: 779。 該結果顯示’多醣體的治療明顯縮小了腫瘤。第n 天後’第（2)組腫瘤被測量出明顯小於第（1)組，且經過2〇 天後’第（4 )組腫瘤被測量出明顯小於第（3 )組。 其他實施例 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以 限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神 和範圍内，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護 範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 【圖式簡單說明】 21 1327066

Claims (1)

1327066 第91113056號争文申請專利$圍_______ 七、申請專利範圍：i.: · ：''; c, ：' ^ 丄.—種營養食品的組合物，包括：〇. 〇1_^9重量$分比 的田3夕聽體之卒取物，係由大豆以此聊义（L. ) Merr. 製備，其中該萃取物包括具有α_(16)_鍵結卜葡萄糖殘基 之月架及一或多個半乳糖、甘露醣、或葡萄糖殘基之支鏈， 該支鏈係以一（1，3)_或（1，4)一鍵結，結合至一或多個骨架葡 萄糖殘基的C-3或C-4位置。 2. 如申請專利範圍第1項所述之營養食品的組合物，其 中該組合物包括0.01-1%多醣體。 3. 如申π專利範圍第1項所述之營養食品的組合物，其 中該組合物包括卜99%多醣體。 4· 一種自磨碎大豆以此則义（L. ) Merr·萃取多醣 體的方法，包括： 浸泡磨碎的豆子在水中或一有機溶劑和水的混合液 中，以溶解多醣體； 以加入〉儿澱增進劑沉澱脂肪酸與蛋白質；以及 收集上清液， 其中該有機溶劑包括乙醇。 5·如申請專利範圍第4項所述之方法，更進一步包含在 收木步驟後’移除具有低於8〇KDal分子量的化合物。 申月專利範圍第5項所述之方法’移除程序係以壓 析或超過濾進行’以同時減少上清液的體積。 7·如申请專利範圍第4項所述之方法，更進一步包拓 收集上清液後，7 ^ L 少匕枯在 Λ乙醇由上清液選擇性的沉澱多醣體。 23 1327066 8.種自磨碎大豆/53/ (l, ) Merr·萃取多聽 體的方法，包括： 浸泡磨碎的豆子於水中或一有機溶劑和水的混合液，以 溶解多醣體； 收集上清液；以及 由上/月液中移除具有低於80KDal分子量的化合物， 其中該有機溶劑包括乙醇。 9. 如申5月專利範圍第8項所述之方法，移除步驟係以壓 力透析或超過據進行，以同時減少上清液之體積。 10. —種增加一需要之個體血球細胞數目的藥學組合 物’包含一有效量之富含多醣體、由大豆 Merr.製備之萃取物，其中該萃取物包括具有α _(1, 6)鍵結 D-葡萄糖殘基之骨架的多醣體。 η·如申請專利範圍第10項所述之藥學組合物，其中該 血球細胞係類骨髓系細胞。 _ 12.如申睛專利範圍第11項所述之藥學組合物，其中類 骨髓系細胞為白血球。 13.如申清專利範圍第12項所述之藥學組合物其中白 • 血球為嗜中性球或單核球。 14·如申請專利範圍第10項所述之藥學組合物，其中多 醣體係投與至該個體體。 15 ‘如申晴專利範圍第14項所述之藥學組合物，其中該 血球細胞係類骨髓系細胞。 16 如由上主 •甲請專利範圍第10項所述之藥學組合物，其中骨 24 1327066 髓細胞或周邊血球細胞係由該個體收集，與多醣體培養於一 培養基，以及植回該個體中。 17.—種多醣體，包含一 α_(1，6)鍵結卜葡萄糖殘基之 骨架’以及具有-或多個半乳糖、甘露醣、或葡萄糖殘基之 支鏈，該多醣體係以一萃取方法由大豆則又α ) Merr.製備’該萃取方法包括： …包磨碎的旦子在水中或_有機溶劑和水的混合液 中，以溶解多醣體； 以加入沉澱增進劑沉澱脂肪酸與蛋白質；以及 收集上清液， 其中該有機溶劑包括乙醇。 復如申請專利範圍第17項所 係以一 U，3)-或urn結合至 體/、中該支鍵 基的㈠或C-4位置。 至h個骨架葡萄糖殘 19. 如申請專利範圍第π /iL…· 項所迷之多黯體，：慈磁· 參 /+乳糖/甘露醣的殘基比率為89/5/6。 ，、葡Π糖 20. —種增加一需要之 物，包含-胞數目的藥學組合 ϊ之如申5月專利範 作為活性成分。 弟1 7項所述之多醣體 21·如申請專利範圍第2〇項所 多醣體係如中^ 、 ’、予、及合物，其中該 22如申-直❹ 。項所述之多醣體。 .如甲印專利範圍第21項 萄糖/半乳糖/甘露 ’、干缒合物，其中葡 〇〇 ]坟暴比率為89/5/6。 •如申請專利範圍第2。項所述之筚學 、衆子紱合物，其中該 25 U27Q66 血球細胞係類骨髓系細胞。 24·如申請專利範圍第23項所述之藥學組合物，其中該 類骨髓系細胞為白血球。 .以 25. 如申請專利範圍帛24項所述之藥學組合物，其中該 類月髓系白血球為嗜中性球或單核球。 ^ 26. 如申請專利範圍帛2〇項所述之藥學組合物，其中該 多醣體係投與至該個體。 、〜 27. 如申請專利範圍第26項所述之藥學組合物 血球細胞係類骨髓系細胞。 八 _ 28·如中請專利範圍帛20項所述之藥學組合*，其卜 髓細胞或周圍血球細胞传由兮棚雜+在 月 ❹㈣體收#’以於培養基中的多 醣體處理，以及植回該個體。 2 9. —種預防或治療—雲要夕彻脚& — 除而要之個體的癌症的藥學組合 物’包括一有效量之富会容脑骑 , 田3夕醣體、由大豆) Merr.製備的萃取物作Α 作為活性成分，其中該萃取物包括一具 有α-(1，6)鍵結D_葡萄糖殘基之骨架的多醣體。 申叫專利範圍第29項所述之藥學組合物，其中該 癌症為白血病。 申-青專利範圍第29項所述之藥學組合物，其中該 癌症為固態腫瘤。 32.種預防需要之個體產生癌症的藥學組合物，包 括-有效量之如中請專利範圍第17項所述之多醣體作為活 性成分。 申月專利範圍第32項所述之藥學組合物，其中該 26 1327066 癌症為白血病。 34.如申請專利範圍第32項所述之藥學組合物，其中 該癌症為固態腫瘤。

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