KR100544945B1

KR100544945B1 - 밀리타리스동충하초 추출물을 유효성분으로 포함하는면역증진용 약학조성물

Info

Publication number: KR100544945B1
Application number: KR1020030084925A
Authority: KR
Inventors: 박태선; 이해미
Original assignee: 박태선
Priority date: 2003-11-27
Filing date: 2003-11-27
Publication date: 2006-01-24
Also published as: KR20050051179A

Abstract

본 발명은 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris) 열수추출물을 포함하는 면역증진을 위한 조성물로서, 상세하게는 본 발명의 밀리타리스동충하초 열수 추출물은 고형암을 이식받은 마우스 비장내의 T-세포, B-세포 및 NK-세포수를 유의적으로 증가시킴으로써 세포 및 체액 매개성 면역반응의 증진을 통해 수명연장효과 및 항종양 효과를 나타내며, 비장에 의한 IL-2 분비능을 증가시켜 숙주의 면역기능을 활성화시키므로, 면역증진을 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

밀리타리스동충하초, 면역증진, 항종양, NK-세포, T-세포

Description

밀리타리스동충하초 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 약학조성물{Pharmaceutical composition comprising an extract of Cordyceps militaris for enhancing immune system}

도 1은 밀리타리스동충하초 추출물의 투여가 고형암을 이식받은 마우스의 비장세포에 의한 IL-2 생성능에 미치는 영향을 측정한 결과도이다.

본 발명은 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris) 열수추출물을 포함하는 면역증진을 위한 조성물에 관한 것이다.

인체의 방어체계인 면역시스템의 조절을 이용한 암의 치료방법으로는 다음과 같이 구분될 수 있는데, 첫째는 인체 면역 시스템의 특징인 메모리(memory) 기능을 이용한 항원 특이적인 방법으로서 항원에 의해 활성화된 T 세포(cell mediated immunity)나 항체(humoral immunity)가 정확한 목표 세포(target cell)나 외부 미생물 등을 공격하여 방어 체계를 이루는 백신(vaccine) 등이 있으며, 둘째는 항원 비특이적인 것으로서 현재 항암 및 항바이러스 효과가 입증된 인터페론류 (interferon), T-세포 성장 요인(T-cell growth factor)으로 알려진 IL-2, 백혈구들의 생성을 촉진하는 GM-CSF 및 암세포를 직접 괴사시키는 TNF-α 등의 사이토카인(cytokine)이 있다. 이 사이토카인들은 세포 상호간의 정보를 유도하는 가용성 펩티드 조절 인자(soluble peptide regulatory factor)로서 면역학적 효과가 주 기능인 사이토카인을 이용하는데, 이들이 각각의 수용체를 통하여 면역 담당 세포의 증식과 분획에 나타나는 다양한 기능을 이용하여 면역시스템을 조절한다. 비특이적인 면역증강제(biological response modifier, BRM)는 면역계를 자극하여 숙주의 생물학적 반응을 변화시킴으로써 여러 가지 생리학적 효과를 나타내는 물질이다 (Kath R, Herlyn M., Current Opinion in Immunol, 1, pp863-866, 1989: Herlyn M, Menrad A, Koprowski H., J. Natl. Cancer Inst., 82, pp1883-1889, 1990).

항암 방어기전에 관여하는 세포의 종류는 다양하나 직접 암 살해능에 관계되는 기전은 크게 두 가지로 나누어지는데, 첫째는 세포독성 T 임파구(cytotoxic T lymphocytes, CTL)이며, 이 CTL은 흉선의존성이며 항원특이성이 매우 높고 면역기억이 있으며 조직적합 항원(major histocampatibility complex antigen, MHC antigen)의 통제를 받는 점이 특징이다. CTL은 암특이 면역반응, 특히 바이러스에 의한 암에 대한 작용이 매우 강력하나, 암살해능에 대한 감작 과정이 필요하므로 암세포에 대한 제1선 방어나 항암저항에 중심적인 역할을 하지는 않는다. 항암 방어기전의 두 번째는 자연살해 세포에 의한 기능이며 우리 몸의 종양 감시 체계에 직접 관여하는 세포로서, 미리 항원에 의한 감작이 없이도 신속하게 암살해능을 보 이며 면역성이 없는 종양에 대해서도 항암능을 나타내므로 넓은 범위의 항암능이 있다. 또한 MHC의 제한을 받지 않는다. 이러한 공통점에도 불구하고 자연살해 세포는 한가지 세포가 아니며 표현형이나 모양이 다양하다. NK(natural killer) 세포는 LCL(large granular lymphocytes)의 형태를 가지며, T 세포 수용체 유전자의 재배열이 없다는 특징을 가지고 있다. 따라서 NK 세포는 T세포와는 달리 T세포 수용체를 통하여 암세포를 인지하는 것이 아니다. NK 세포는 골수에서 처음 생성되나 간접적 세포파괴(mediated cytotoxicity)의 수행에 중요하다. 그러나 비장, 폐, 간, 복강, 소장 및 기관지 조직에도 발견된다. NK세포는 여러 동물에 다 분포되어 있어 사람 뿐만 아니라 각종 하등 무척추동물에서도 발견된다. NK 세포의 가장 중요한 기능은 종양의 성장과 전이에 대한 저항능이다. 최근에는 LAK(lymphokine activated killing) 현상의 주세포는 NK세포라고 알려져 있다. 이외에도 감염증에 대한 방어, 조혈세포나 임파세포의 성장조절, 그리고 여러 가지 활성물질 (cytokine)의 생산에도 NK세포가 관여한다. 즉 인터페론, 인터루킨-1, 인터루킨-2, 종양괴사 물질, 임파독성 물질, B세포 성장인자 등이 NK에 의해 만들어진다.

말초 혈액의 T 임파구 중에 일부는 자발적인 MHC 무제한 세포독성능을 나타내므로 NK와 그 특성이 매우 유사함이 알려져 있다. 이 임파구도 NK 세포와 같은 항원을 표현하고 있어 구분이 어려우며, NK세포가 이 임파구에 비해 훨씬 더 강한 독성능이 있으며, 또한 T 세포 성장인자(T cell growth factor, interleukin-2)는 암세포에 대한 임파구의 독성능을 유도시킨다. 처음에는 NK와 다른 임파구의 독특한 작용이라고 생각하여 LAK 세포라 명명하였다. 그러나 NK세포나 MHC 무제한 T 임 파구도 LAK 기능에 관여한다.

인체의 여러 암 조직내에서 T 임파구나 NK세포가 기능적으로 불활성 상태로 존재한다. 최근에는 이와 같은 암침윤 임파구(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)도 IL-2와 함께 배양하면 높은 세포독성능을 갖는다고 알려져 있으며, 이미 TIL을 이용한 항암 면역치료에 임상실험이 진행중이다.

동충하초속균은 자낭균강(子囊菌綱)의 맥각균목(麥角菌目) 동충하초과 (Cordyceps)에 속하며 전 세계에 널리 분포하고 있는 토양균이다. 중국에서 약용으로 이용되어 온 동충하초는 박쥐나방의 유충을 숙주로 하여 형성된 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis)가 주종을 이루는데, 티벳지역의 해발 3,000m 이상의 고원지대에서 서식하고 있고, 7,8월 여름 한 철에만 자실체가 발생하여 채집량이 많지 않은 약용식물이다(Samson RA., Studies in Mycology, 6, pp31-36, 1974).

지금까지 한국에서 동충하초로 채집, 분류된 것은 78종이며, 대표적인 동충하초로는 번데기동충하초, 큰매미동충하초, 유충흑색다발동충하초, 풍뎅이동충하초, 눈꽃동충하초, 노린재동충하초, 벌동충하초, 백강균 그리고 녹강균이 있다. 번데기동충하초를 포함한 많은 종류의 동충하초들은 인공적으로 자실체 형성이 가능한 것으로서 그 이용이 기대되고 있는데, 백강균과 녹강균은 농작물에 피해를 주는 해충을 방제하는 곤충기생균으로 앞으로 미생물 살충제로서 개발 가능성이 높은 균인 반면, 노린재동충하초, 벌동충하초는 한국에서 비교적 쉽게 발견되는 종류이나 균사의 생장이 느려 재배가 어려운 동충하초이다(정 보섭 및 신 민교, 향약대사전, 영림사, p45-46, 1998).

본 발명의 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)는 지하부에 묻혀있는 인시목의 번데기를 기주로 하여 단일 또는 총생의 자실체를 형성하여 기주의 머리부위에서 발생한다. 곤봉형의 자실체는 주황색빛을 띠며 길이가 2 내지 5㎝, 두께는 0.3 내지 0.5㎝이다.

그러나, 상기 문헌 어디에도 본 발명의 밀리타리스동충하초 추출물이 면역기능에 미치는 영향에 대한 어떠한 교시나 시사된 바 없다.

이에 본 발명자는 본 발명의 밀리타리스동충하초 열수 추출물이 고형암을 이식받은 마우스 비장내의 T-세포, B-세포 및 NK-세포수를 유의적으로 증가시키며, 또한 비장에 의한 IL-2 분비능을 유의적으로 증가시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 T-세포, B-세포, NK-세포수 및 비장에 의한 IL-2 분비능을 증가시켜 숙주의 면역기능을 활성화시키는 밀리타리스동충하초 열수추출물을 포함하는 면역증진을 위한 약학조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris) 추출물을 포함하는 면역증진을 위한 약학조성물을 제공한다.

상기 밀리타리스동충하초는 누에번데기 또는 누에애벌레 밀리타리스동충하초 를 포함한다.

또한, 상기 밀리타리스동충하초 추출물은 물 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급알콜 및 이들의 혼합용매에 가용한 추출물을 포함하며, 열수 추출에 의해 추출되어짐을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 밀리타리스동충하초 열수 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 밀리타리스동충하초를 시중 구입하여 누에번데기 밀리타리스동충하초는 냉동상태의 누에번데기를 원형의 플라스틱 용기에 분주한 후, 액체종균을 접종하여 재배하고, 누에애벌레 밀리타리스동충하초는 누에애벌레에 액체종균을 접종하여 배양 및 재배한 다음, 재배된 동충하초를 마쇄하여 분말화한 후, 동충하초 시료 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 5 내지 10배에 달하는 부피의 물 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 물로 70 내지 100℃에서 약 5시간 내지 12시간, 바람직하게는 5시간 내지 7시간 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열수 추출하여 진공여과에 의해 상층액을 회수한 다음, 상기의 과정을 2 내지 5회 반복 수행하여 상층액을 모으고 감압농축하여 밀리타리스동충하초 열수추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제법으로 얻어진 밀리타리스동충하초 열수추출물을 유효성 분으로 함유하는 면역증진을 위한 약학조성물을 제공한다.

또한, 밀리타리스동충하초는 식용으로 사용되어 오던 것으로서 이로부터 추출된 본 발명의 추출물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없는 식품이다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 밀리타리스동충하초 열수추출물의 면역증진 효과를 알아보기 위하여, 본 발명의 밀리타리스동충하초 열수추출물을 고형암을 이식받은 마우스에게 복강투여하여 마우스 비장내의 T-세포, B-세포 및 NK-세포수를 측정한 결과, 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었으며, 또한 비장에 의한 IL-2 분비능도 유의적으로 증가함을 관찰할 수 있었다.

본 발명의 면역증진을 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로 즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 면역증진 효과를 나타내는 상기 열수추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 밀리타리스동충하초 열수추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 면역증진 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 열수추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 열수추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 열수추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 열수추출물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 열수추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예들에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 누에번데기 및 누에애벌레 밀리타리스동충하초( Cordyceps militaris ) 열수추출물의 제조

밀리타리스동충하초 시료는 (주)머슈빌(성남시, 한국)로부터 제공받아 사용 하였으며, 누에번데기 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)는 냉동상태의 누에번데기를 원형의 플라스틱 용기에 분주한 후 액체종균을 접종하여 재배하였고, 누에애벌레(silkworm larva) 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)는 누에애벌레에 액체종균을 접종하여 배양 및 재배하였다. 재배된 동충하초 각 1 kg에 8ℓ의 증류수를 가한 후, 95℃에서 6시간 동안 가열하였다. 이 과정을 2회 반복 수행한 다음 여과지로 2회 여과하고, 여과액은 회전 진공 농축기를 사용하여 감압농축 및 동결건조하여 누에번데기 밀리타리스동충하초(수득량 170g) 및 누에애벌레 밀리타리스동충하초(수득량 170g) 열수추출물을 수득하였다.

파우더 상태의 동충하초 시료를 일정 농도의 멸균된 증류수에 용해시키고, 0.4 ㎛ 필터를 통해 여과시킨 후 하기의 실험에 사용하였다.

실시예 2. 누에번데기 및 누에애벌레 밀리타리스동충하초 내의 코디세핀 (Cordycepin) 농도 분석

동충하초시료의 코디세핀 농도 분석은 쿤닌감(Cunningham) 등(Cunningham KG, Hutchinson SA. et al., J. Chem. Soc., 51, pp2299-2300, 1951)의 방법을 이용하여 실시하였다. 즉, 동충하초 시료를 90℃에서 6시간 동안 끓인 후 여과하고, 2배 부피의 아세톤을 가한 다음 4℃에서 24시간 동안 방치하였다. 5,000×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 수거하고 용매를 완전히 증발시킨 다음, 증류수를 가하여 용해시키고 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 여과하였다. 시료의 코디세핀 함량은 알티마 C18 컬럼(Alltima C18 column, Shimatzu, Japan)이 장착된 고성능 액체 크로 마토그래피(HPLC)를 수행하여 분석하였다. 용출용매로 아세토니트릴:물(3:1) 혼합용매를 사용하여 1.5㎖/분의 유속으로 260nm에서 측정하였다.

실험결과, 누에번데기 동충하초 및 누에애벌레 동충하초에서 각각 0.2% 및 0.4%의 코디세핀이 검출되었다. 비교표준품으로 이용된 코디세핀(3'-deoxyadenosine)은 시그마사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

실험예 1. 면역장기의 무게 측정

1-1. 겨드랑이 고형암 유발

수컷 ICR계 마우스(체중 18 내지 22 g) 총 64마리를 대한실험동물센터로부터 구입하여, 일반 고형사료(삼양유지사료사, 한국)로 사육하면서 1주일간 실험실 환경에 적응시켰다. 사육실의 온도는 22±2.0℃, 습도는 55±5.0%를 유지하였으며, 명암주기는 12시간으로 조절하였다. 실험실 환경에 적응된 실험동물을 8군으로 분류하여 28일간 사육하였으며, 정상군(normal group, N)의 경우 암세포를 이식하지 않은 채 생리식염수만을 복강투여하였고, 대조군(control group, C)의 경우에는 암세포를 이식한 후 생리식염수를 투여하였다. 누에번데기 밀리타리스동충하초 50군(CMP50) 및 누에번데기 밀리타리스동충하초 100군(CMP100)의 경우 암세포를 이식한 후 각각 50 ㎎/㎏ 및 100 ㎎/㎏의 누에번데기 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris of silkworm pupa) 추출물을 복강투여하였다. 누에애벌레 밀리타리스동충하초 50군(CML50) 및 누에애벌레 밀리타리스동충하초 100군(CML100)의 경우 암세포를 이식한 후 각각 50 ㎎/㎏ 및 100 ㎎/㎏의 누에애벌레 밀리타리스동충하초 추 출물(Cordyceps militaris of silkworm larva)을 복강투여하였다. 또한 코디세핀 1군(C1) 및 코디세핀 2군(C2)의 경우 암세포를 이식한 후, 각각 1 ㎎/㎏ 및 2 ㎎/㎏의 코디세핀을 복강투여하였다.

마우스의 겨드랑이에 고형암을 유발하기 위하여 주사기를 이용하여 0.2 ㎖(1.0×10⁶ cells/mouse)의 육종암 세포인 사코마-180(sarcoma-180) 세포부유액을 실험동물의 왼쪽 겨드랑이에 피하이식하고, 24시간이 경과한 후부터 10일간 연속적으로 0.2㎖의 생리식염수, 밀리타리스동충하초 추출물 또는 코디세핀을 복강내에 투여하였다. 모든 실험동물을 대상으로 실험 시작일과 종료일(암세포 이식 3주 후), 두 차례에 걸쳐 체중을 측정하였다.

1-2. 면역장기의 무게 측정

밀리타리스동충하초 열수 추출물 및 코디세핀의 복강투여가 고형암을 이식받은 마우스의 면역 관련 장기의 무게에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 겨드랑이에 종양세포를 이식한 후 21일째 되는 날 경추탈골법에 의하여 실험동물을 치사시키고, 흉선, 비장 및 간을 적출하여 무게를 측정하였다.

실험결과, 체중증가량, 간 및 비장무게는 암세포를 이식받지 않은 정상군과 암세포를 이식받은 후 생리식염수를 투여받은 대조군 간에 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. 밀리타리스동충하초 열수추출물 또는 코디세핀 투여군의 간 및 비장무게는 대조군에 비해 통계적 유의성은 없었지만, 증가하는 경향을 보였으며, 겨드랑 이 피하조직에 암세포를 이식받고 3주가 경과한 시점에서 대조군의 흉선 무게는 63.4±6.2㎎으로 나타나 암세포를 이식받지 않은 정상군(77.6±4.1㎎)에 비해 더 낮은 경향을 보였고, CMP50군 및 CM100군의 흉선무게는 각기 87.6±12.5㎎과 90.8±6.2㎎으로 나타나 대조군에 비해 38 내지 43% 유의적으로 증가하였다(p<0.05). CML50 및 CML100군의 흉선무게 역시 생리식염수를 투여받은 대조군에 비해 40 내지 44% 유의하게 증가하였으며(p<0.05), 코디세핀 투여군의 흉선무게(78 내지 83㎎)는 대조군에 비해 15 내지 30% 더 높은 경향을 보였으나 통계적 유의성은 관찰되지 않았다(p>0.05). 상기 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

군	투여량 (mg/kg/d)	체중 증가 (g/3 wks)	간 무게 (g)	비장 무게 (g)	흉선 무게 (㎎)
정산군	생리 식염수	10.7±0.5	1.65±0.04	0.21±0.02	77.6±4.1^ab
대조군	생리 식염수	12.1±0.3	1.63±0.06	0.24±0.01	63.4±6.2^b
CMP	50 100	7.9±0.3 8.8±0.5	1.67±0.06 1.77±0.12	0.26±0.01 0.28±0.02	87.6±12.5^a 90.8±6.2^a
CML	50 100	9.2±0.5 8.5±0.2	1.56±0.08 1.57±0.06	0.29±0.04 0.29±0.01	89.0±6.4^a 91.2±5.4^a
코디세핀	1 2	8.9±0.2 9.4±1.2	1.76±0.12 1.79±0.17	0.26±0.01 0.24±0.02	82.6±3.0^ab 73.2±4.6^ab

실험예 2. 면역기능 측정

2-1. 비장세포의 준비

상기 실험예 1의 왼쪽 겨드랑이에 종양세포를 투여한 후 21일 간 사육한 마 우스의 비장을 적출하여, 4℃의 HBSS (Hank's Balance Salt Solution, GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, USA)로 2회 세척하였다. 이를 다시 30mm 세포배양용 접시에 옮기고 HBSS를 가한 후, 40 ㎛ 나일론 세포 여과기(nylon cell strainer)(Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA)를 이용하여 비장세포를 유리시키고 반복 여과하여 작은 조직편들을 제거하였다. 유리된 비장세포에 용해(lysis) 용액(50% 디에틸렌 글리콜 및 15% 포름알데히드가 혼합된 용액을 증류수와 1: 10 v/v의 비율로 혼합한 용액)을 가하고 실온에서 10분동안 방치하여 남아 있는 적혈구를 용혈시켰다. 원심분리 후 얻어진 침전물을 HBSS로 세척한 후 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 배양액에 현탁시켰다.

2-2. 면역세포수 측정

마우스의 비장에 존재하는 T-세포, B-세포 및 NK-세포수의 백분율을 간접면역형광법을 이용하여 측정하였다(Skehan P, Storeng R. et al., J. Nat. Cancer Inst., 82, pp1107-1112, 1990). 구체적으로, 약 6×10⁶cells/㎖의 수가 되도록 준비된 마우스 비장세포를 두개의 튜브에 각기 300 ㎕씩 첨가하고, 1,000×g에서 5분간 원심분리한 다음, 0.1% 아지화 나트륨(sodium azide)이 함유된 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.2) 500 ㎕를 가하여 현탁시킨 후, 1,000×g에서 5분간 윈심분리하여 세포침전물을 얻었다. 0.1% 아지화 나트륨 및 2% FBS가 함유된 PBS 용액에 단일항체 (PE-labled antimouse CD8 + FITC-labeled antimouse CD4 및 PE- labeled antimouse CD19 + FITC-labeled antimouse NK1.1)(Becton Dickinson, Mountain View, USA)를 각 10 ㎍/㎖ 농도가 되도록 혼합하여 세포침전물에 50 ㎕씩 첨가하고, 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 0.1% 아지화 나트륨이 함유된 빙냉상태의 PBS 용액 500 ㎕을 가하여 세척한 후 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 얻은 세포침전물에 고정 완충액(fixing buffer)(0.1% sodium azide + 1% paraformaldehyde가 함유된 PBS 용액) 300 ㎕를 넣어 잘 섞은 후, 유세포 분석기(FACScan, Becton Dickinson, Mountain View, USA)를 이용하여 면역세포의 수를 분석하였다.

실험결과, 정상군의 비장내 임파구 비율을 살펴보면, CD4+ 및 CD8+ T-세포가 각기 35.6 ±1.0% 및 17.7 ±0.9%로 존재하여 약 2.0의 CD4+/ CD8+ T-세포수의 비를 나타내었으며, 고형암 세포를 이식받은 대조군의 CD4+ 및 CD8+ T-세포수는 각기 20.2 ±2.2% 및 11.2 ±0.8%로 나타나 정상군에 비해 유의하게 낮았고(p<0.05), CD4+/ CD8+ 비율 역시 정상군에 비해 낮았으나, 통계적 유의성은 관찰되지 않았다(p>0.05). 한편, CMP50 및 CMP100군의 경우 CD4+ T-세포수가 각기 29.7 ±2.2% 및 31.5 ±1.3%로 나타나 대조군에 비해 유의하게 더 높았고, 마찬가지로 CD8+ T-세포 비율 역시 15.6 ±0.6% 및 15.7 ±1.6%로 대조군에 비해 유의성 있게 더 높았다(p<0.05). 아울러 CML50 및 CML100군의 CD4+ T-세포수(26.5 ±0.6% 및 27.5 ±0.7%) 및 CD8+ T-세포수(14.3 ±0.8% 및 15.9 ±1.3%) 역시 대조군에 비해 유의적으로 더 높았다(p<0.05). 한편, 코디세핀 투여군의 경우에는 비장내 CD4+ 및 CD8+ T-세포수가 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다. CD4+/CD8+ T-세포수 의 비는 모든 실험군과 대조군 간에 유의적인 차이가 없었는데, 이는 실험군에서 CD4+ 및 CD8+ T-세포수가 대조군에 비해 모두 유의하게 증가하였기 때문이다. B-세포에 해당되는 CD19 세포수는 정상군(40.8 ±1.3%)에 비해 암세포를 이식받은 대조군(34.6 ±2.1%)에서 감소하는 경향을 보였으며, CMP50군, CMP100군 및 CML100군의 경우, 대조군에 비해 증가하는 경향을 보였다(p<0.05). 비장내 NK-세포수는 CMP50군 및 CMP100군에서 4.0 ±0.6%와 3.7 ±0.5%로 나타나 대조군(1.9 ±0.2%)보다 96 내지 110% 증가하였다(p<0.05). CML50군(3.1 ±0.3%) 및 CML100군(3.6 ±0.2%)의 비장내 NK 세포수는 대조군에 비해 63 내지 89% 유의하게 증가하였고(p<0.05), C1 및 C2군의 경우에는 대조군보다 31 내지 36% 유의하게 증가하였다(p<0.05). 이상의 면역세포수 결과로 미루어 볼 때, 누에번데기 또는 누에애벌레 밀리타리스동충하초 열수추출물은 코디세핀 단일물질에 비해 비장의 면역세포수를 증가시키는 효과가 더 탁월함을 알 수 있었으며, 상기 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

군	투여량 (㎎/㎏/d)	CD4+ T-세포(%)	CD8+ T-세포(%)	CD4+/CD8+ 비율(%)	CD19 B-세포(%)	NK 세포(%)
정상군	생리 식염수	35.6±1.0^a	17.7±0.9^a	2.0±0.1	40.8±1.3^ab	2.9±0.2^bc
대조군	생리 식염수	20.2±2.2^c	11.2±0.8^d	1.8±0.2	34.6±2.1^bc	1.9±0.2^c
CMP	50 100	29.7±2.2^ab 31.5±1.3^ab	15.6±0.6^ab 15.7±1.6^ab	1.9±0.2 2.0±0.1	39.3±3.2^ab 44.0±3.0^a	4.0±0.6^a 3.7±0.5^a
CML	50 100	26.5±0.6^ab 27.5±0.7^ab	14.3±0.8^c 15.9±1.3^ab	1.9±0.1 1.9±0.1	35.4±0.9^bc 40.8±1.3^ab	3.1±0.3^bc 3.6±0.2^ab
코디세핀	1 2	24.5±0.7^bc 23.9±0.9^bc	12.3±0.4^cd 12.4±1.3^cd	2.0±0.1 1.9±0.2	32.4±2.5^c 36.8±2.4^bc	2.5±0.1^bc 2.6±0.9^bc

1-3. 인터루킨-2(lL-2) 농도 측정

5×10⁶ cells/㎖의 농도로 준비된 마우스 비장세포에 콘카나발린-A (concanavalin-A, Sigma, USA)를 100㎍/㎖의 농도가 되도록 가한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간동안 배양하였다. 배양액을 수거한 다음, 인터루킨-2(IL-2) 키트(BD Bioscience, USA)를 이용하여 IL-2의 농도를 측정하였다. 키트에서 제공된 ELISA 희석용액 50 ㎕를 96-웰 플레이트에 분주한 후, 배양액 시료 또는 키트에서 제공된 IL-2 표준액을 각각 50 ㎕씩 첨가하고 실온에서 2시간동안 방치하였다. 96-웰 플레이트에 있는 반응액을 아스피레이터(aspirator)를 이용하여 제거하고 PBS로 5회 세척한 후, 미리 혼합된 반응용액(anti-mouse IL-2 monoclonal antibody + avidin-horse radish peroxidase conjugated enzyme) 100 ㎕을 첨가하여 실온에서 1시간동안 방치하였다. 아스피레이터를 이용하여 웰내의 반응액을 제거하고 5회 세척하여, 기질로 사용된 3,3’,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 100 ㎕를 96-웰 플레이트에 가한 후 상온에서 30분간 배양하였다. 각 웰에 반응정지용액 50 ㎕씩을 가하고, ELISA 리더(Perkin Elmer사, Wallac 1420, Turkin, Finland)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과, 고형암을 이식받은 대조군의 경우 481 ±10.9 pg/㎖로 나타나 정상군(869 ±11.8 pg/ml)에 비해 유의하게 감소되었으며, CMP50 및 CMP100군의 경우 비장세포에 의한 IL-2 분비능이 생리식염수를 투여받은 대조군보다 41.8% 및 51.4% 유의적으로 증가되었고(p<0.05), CML50군 및 CML100군의 비장세포에 의한 IL-2 분비능 역시 대조군에 비해 33.3%와 33.4% 유의하게 증가하였다(p<0.05). 코디세핀을 투여받은 C1군 및 C2군의 경우 대조군에 비해 IL-2 분비능이 모두 유의하게 증가되었으나(p<0.05), 그 증가폭이 누에번데기 또는 누에애벌레 밀리타리스동충하초를 투여받은 군에 비해 더 적음을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

실험예 3. 통계처리

모든 자료의 통계분석은 SAS(Statistical Analysis system) PC 팩키지 (package)를 사용하여 실시하였고, 분석 수치는 평균 ±SEM으로 제시하였다. 농도를 달리한 두 가지 종류의 동충하초 열수추출물 또는 코디세핀의 효과는 일원 변량 분석(one way ANOVA)에 의해 p<0.05 수준에서 유의성을 평가하였으며, 통계적 유의성이 관찰된 경우 각 실험군의 평균값의 차이는 던칸의 다중 범위 테스트(Duncan's multiple range test)에 의해 검증하였다. 한편, 다양한 농도의 누에번데기동충하초, 누에애벌레동충하초, 또는 코디세핀으로 처리한 사코마-180(sarcoma-180) 세포주와 대조세포에서 관찰된 세포 생존율의 차이에 대한 유의성은 스튜던트 t-테스트 (Student's t-test)에 의해 p<0.05 수준에서 검증하였다.

본 발명의 동충하초 열수 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

동충하초 열수추출물 건조분말 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

동충하초 열수추출물 건조분말 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

동충하초 열수추출물 건조분말 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전 하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

동충하초 열수추출물 건조분말 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

동충하초 열수추출물 건조분말 100 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

동충하초 열수추출물 건조분말 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B₁ 0.13 ㎎

비타민 B₂0.15 ㎎

비타민 B₆ 0.5 ㎎

비타민 B₁₂0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

동충하초 열수추출물 건조분말 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 밀리타리스동충하초 추출물은 T-세포, B-세포, NK-세포수 및 비장에 의한 IL-2 분비능을 증가시켜 숙주의 면역기능을 활성화시킴으로, 이를 포함하는 조성물은 면역증진을 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

누에애벌레 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris of silkworm larva) 열수 추출물을 포함하는 면역증진을 위한 약학조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제