KR100546442B1

KR100546442B1 - 밀리타리스 동충하초 추출물을 함유하는 항암용 조성물

Info

Publication number: KR100546442B1
Application number: KR1020030084926A
Authority: KR
Inventors: 박태선; 이해미
Original assignee: 박태선
Priority date: 2003-11-27
Filing date: 2003-11-27
Publication date: 2006-01-25
Also published as: KR20050051180A

Abstract

본 발명은 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris) 열수추출물을 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 밀리타리스 동충하초 열수추출물은 종양세포의 성장을 억제하고, 사코마-180(Sarcoma-180) 세포주로 유발한 마우스의 복강암 및 고형암에 대하여 뛰어난 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라 암이 유발된 마우스의 수명연장 효과도 나타내므로, 항암용 조성물로써 의약품 및 건강기능식품에 사용될 수 있다.

밀리타리스, 동충하초, 열수추출물, 항암, 종양세포, 조성물, 의약품, 건강기능식품.

Description

밀리타리스 동충하초 추출물을 함유하는 항암용 조성물{Composition comprising the extract of Cordyceps militaris for anti-cancer}

도 1a 내지 1c는 사코마-180세포에서 밀리타리스 동충하초 열수추출물 또는 코디세핀의 세포증식억제 효과를 측정한 것으로, 도 1a는 사코마-180세포를 누에번데기 밀리타리스 동충하초로 처리시 결과도이고, 도 1b는 사코마-180세포를 누에애벌레 밀리타리스 동충하초로 처리시 결과도이며, 도 1c는 사코마-180세포를 코디세핀으로 처리시 결과도이고,

도 2a 내지 2c는 밀리타리스 동충하초 열수추출물 또는 코디세핀의 투여가 사코마-180 복강 종양세포를 이식한 ICR계 마우스의 체중에 미치는 효과를 측정한 것으로, 도 2a는 누에번데기 밀리타리스 동충하초를 투여시 결과도이고, 도 2b는 누에애벌레 밀리타리스 동충하초를 투여시 결과도이며, 도 2c는 코디세핀을 투여시 결과도이고,

도 3a 내지 3d는 밀리타리스 동충하초 열수추출물 또는 코디세핀의 투여가 사코마-180 복강 종양세포를 이식한 ICR계 마우스의 생존율에 미치는 효과를 측정한 것으로, 도 3a는 누에번데기 밀리타리스 동충하초를 투여시 결과도이고, 도 3b 는 누에애벌레 밀리타리스 동충하초를 투여시 결과도이며, 도 3c는 코디세핀을 투여시 결과도이고, 도 3d는 누에번데기 밀리타리스 동충하초, 누에애벌레 밀리타리스 동충하초 및 코디세핀의 투여시를 서로 비교한 도이다.

본 발명은 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris) 열수추출물을 함유하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

암이란 일반적으로 인체조직을 이루고 있는 세포의 세포주기에 이상이 생겨 정상적으로 분화하지 않고, 성장을 조절할 수 없이 커진 것 중 악성종양인 것을 말한다. 발암과정은 개시(initiation), 촉진(promotion) 및 진행 (progression)과 같이 적어도 세단계 이상으로 이루어져 있는 다단계의 과정이다. 다단계 발암과정 중에서 개시단계는 여러 과정이 포함된 비가역적인 과정으로 발암 물질의 흡수, 분배, 이동, 대사 활성화/해독, DNA와의 공유결합, DNA의 구조적 손상 등으로 진행된다. 만약 DNA의 돌연변이가 원상태로 수복(repair)되지 않는다면 개시화된 혹은 변형된 세포는 클론의 발현(clonal expression)을 통해 신생물을 만들게 되고 결국 최종 악성종양으로 발전하게 된다. 만약 다단계 발암과정의 특정 부분이 억제, 지연 혹은 역전될 수 있으면 전체적으로는 악성종양의 생성을 방지할 수 있는데, 이것이 바로 식이 식물 성분들(dietary phytochemicals)을 이용한 화학적 암예방의 목적이다.

이와 같은 화학적 암예방을 위하여 영양소와 식품이 다단계발암 과정에 미치는 영향에 대해 많은 연구가 되어 있으며, 발암물질의 대사를 변화시켜 결국 DNA 부가물의 생성을 줄이는 것이 중요한 방법으로 인식되어졌다. 그러나, 대사 효소의 이중성을 고려하여 볼 때 특정 발암 물질의 대사 활성화의 저해와 동시에 해독화 효소를 저해할 수도 있고, 또한 해독 효소의 증진이 동시에 관련 발암 물질과 내부 물질의 대사에도 영향을 주어 예상치 못한 부작용이 따를 수 있다.

따라서 최근의 화학적 암예방 물질로는 개시 단계를 저해하는 항-개시제(anti-initiator)를 찾는 것이 아니라 개시화된 상태나 전암 상태의 세포가 악성종양으로 발전하는 것을 차단할 수 있는 암세포분열 억제 및 암세포전이 억제 활성을 갖는 물질을 찾아내려고 하고 있다. 이러한 범주에 속하는 화학적 암 예방제로는 세포의 신호전달 체계를 변형시킬 수 있는 물질, 종양 유전자의 활성화를 막는 물질, 폴리아민(polyamine) 대사를 저해하는 물질, 세포간극(gap junction)에서의 세포간 신호전달을 촉진하는 물질, 세포사멸 유도제, 혈관생성(angiogenesis) 저해제 등이 있다(Kelloff GJ., et al., Chemical Induction of cancer, Birkhauser, pp73-122, 1995).

동충하초(冬蟲夏草)란 겨울 기간동안 곤충의 체내에 서식하면서 양분을 흡수하여 숙주를 파괴시킨 후, 여름이 되면 곤충의 몸밖으로 식물체가 자라나는 모습에서 그 명칭이 유래되었다. 즉, 동충하초균의 포자 또는 균사가 곤충 또는 균핵에 침입하여 기주 안에 내생균핵을 만든 다음, 밖으로 자실체를 형성하는 것이 바로 동충하초버섯이다.

식물 분류체계상 동충하초는 자낭균강(Ascomycota), 맥각균목(Clavicipitales), 맥각균과(Clavicipitaceae)에 속하며 코디셉스(Cordyceps), 포도넥트리아(Podonectria), 토루비엘라(Torrubiella ) 등의 세가지 종이 있는데, 그 중 대표적인 것이 코디셉스 종이다(Kobayasi Y., Trans Mycol. Soc. Japan, 23, pp329-364, 1982). 전 세계적으로 현재까지 약 800여종의 동충하초균이 알려져 있으며, 이 중 국내에서 채집 및 분류된 것은 78종이다(성재모, 한국의 동충하초, 교학사, pp62-90, 1996). 예로부터 약용으로 알려진 동충하초는 시넨시스 동충하초(Cordyceps sinensis)이며, 그 외에도 누에번데기 동충하초(C. militaris), 매미다발 동충하초(C. sobolifera), 균핵 동충하초( C. ophioglossoides), 유충흑색다발 동충하초(C. martialis), 및 노랑다발 동충하초(C. bassiona) 등이 알려져 있다(Su CH., et al., Mycotaxon, 26, pp337-344, 1986).

동충하초는 기주 특이성이 낮아 여러 곤충을 기주로 하는 경우가 많으며, 일반적으로 균명을 사용하여 명명되나(Kobayasi Y., et al., Iconography of vegetable wasps and plant worms, Hoikusha Publishing Company Ltd, pp280-295, 1983), 천연에서 얻을 수 있는 자연산 동충하초는 매우 희귀하여 확보가 어렵고, 따라서 다양한 종류의 동충하초가 인공 재배되고 있으며 이에 관한 성분 및 효능연구가 진행되고 있다.

국내 식품공전상에 분류되어 있는 '식품원재료 분류표'에 의하면 식품으로 사용할 수 있는 동충하초의 종류로는 눈꽃 동충하초(Paecilomyces japonica/ Paecilomyces tenuipes)와 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)가 있다.

한편, 오 등(Oh SW., et al., Korean J. Food Sci. Technol., 35(1), pp15-22. 2003)은 기주로 누에애벌레 또는 번데기를 사용하여 인공 재배된 파에시로마이세스 테뉴이페스(Paecilomyces tenuipes)의 성분을 분석한 결과, 같은 종류의 동충하초라 할지라도 재배되는 기주에 따라 영양성분 및 코디세핀 함량이 달라질 수 있음을 제시하였다.

그러나, 상기 문헌 어디에도 본 발명의 밀리타리스 동충하초 열수추출물의 항암활성에 대한 어떠한 교시나 시사된 바 없다.

따라서 본 발명자는 본 발명의 밀리타리스 동충하초 열수 추출물의 항암 활성을 평가한 결과, 그 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항암 활성을 갖는 밀리타리스 동충하초 열수추출물을 함유하는 항암용 조성물을 제공하기 위한 것으로, 본 발명의 밀리타리스 동충하초 추출물은 항암용 조성물로써 이를 함유하는 의약품 및 건강기능식품을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris) 추출물을 함유하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.

상기 밀리타리스 동충하초는 누에번데기 밀리타리스 동충하초 또는 누에애벌레 밀리타리스 동충하초를 포함한다.

또한, 상기 밀리타리스 동충하초 추출물은 물 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 및 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함하며, 열수 추출에 의해 추출되어짐을 특징으로 한다.

상기 암은 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암 등의 고형암 또는 복수암 등으로부터 선택된 하나 이상의 질환을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 누에번데기 밀리타리스 동충하초는 냉동상태의 누에번데기를 원형의 플라스틱 용기에 분주한 후, 액체종균을 접종하여 재배하였고, 누에애벌레 밀리타리스 동충하초는 누에애벌레에 액체종균을 접종하여 배양 및 재배하였다. 재배된 동충하초를 마쇄하여 분말화한 후, 시료 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 5 내지 10 배에 달하는 부피의 물 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C₁내지 C₄의 저급알콜의 극성용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 물로 약 70 내지 100 ℃에서 약 5 내지 24 시간 동안, 바람직하게는 3 내지 9시간 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열수 추출하여 진공여과에 의해 상층 액을 회수한 다음, 상기의 과정을 2 내지 5회 반복 수행하여 상층액을 모으고 감압농축하여 밀리타리스 동충하초 추출물, 바람직하게는 밀리타리스 동충하초 열수추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제법으로 수득된 밀리타리스 동충하초 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.

밀리타리스 동충하초 추출물의 항암 활성을 측정한 결과, 종양세포의 성장을 억제하고, 사코마-180(Sarcoma-180) 세포주로 유발한 마우스의 복강암 및 고형암에 대하여 뛰어난 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라 암이 유발된 마우스의 수명연장 등 우수한 효과를 나타내었다.

본 발명의 밀리타리스 동충하초 추출물은 식용으로 사용되어 오던 것으로서 이로부터 추출된 본 발명의 추출물은 역시 독성 및 부작용이 거의 없으므로 치료 및 예방 목적으로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 항암용 약학 조성물은, 상기 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.02 ~ 90 중량 %로 포함한다.

또한, 본 발명의 추출물을 포함하는 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 이와 함께 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해, 약제학적으로 통상으로 허용되는 약학적 제제, 예를 들면 액제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 액상제제 에어로졸 등의 경구형 제형, 피복용 연고제 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 약학 조성물 에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 밀리타리스 동충하초 추출물은 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설 속도, 환자의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 0.001 % ∼ 30 %의 유효성분을 함유하는 내용제제로 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있고, 환자의 성별, 나이 및 질병의 정도에 따라서 그 사용량을 증감할 수 있다. 또한 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 암의 예방 및 개선 효과를 나타내는 상기 밀리타리스 동충하초 열수추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 밀리타리스 동충하초 열수추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능 식품류 등이 있다.

또한 암의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 밀리타리스 동충하초 열수추출물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강기능식품 조성물의 경우는 전체 식품 중량의 0.1 내지 15 중량 %, 바람직하게는 1 내지 10 중량 %로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물에는 100 ㎖를 기준으로 1 ∼ 30 g, 바람직하게는 3 ∼10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 열수추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등), 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 ∼ 20 g, 바람직하게는 약 5 ∼ 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 누에번데기 및 누에애벌래 밀리타리스 동충하초의 열수추출물 제조

밀리타리스 동충하초 시료는 (주)머슈빌(성남시, 한국)로부터 제공받아 사용하였으며, 누에번데기 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris of silkworm pupa)는 냉동상태의 누에번데기를 원형의 플라스틱 용기에 분주한 후 액체종균을 접종하여 재배하였고, 누에애벌레 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris of silkworm larva)는 누에애벌레에 액체종균을 접종하여 배양 재배하였다. 재배된 누에번데기 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris of silkworm pupa) 및 누에애벌레 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris of silkworm larva) 각각 1 kg에 8ℓ의 물을 가하여 95 ℃에서 6시간 동안 열수추출한 다음 추출액을 여과하는 과정을 2차례 반복한 후 동결 건조하여 분말상태의 누에번데기 밀리타리스 동충하초의 열수추출물 170 g 및 누에애벌레 밀리타리스 동충하초의 열수추출물 170 g을 수득(수율 17 %)하였다. 분말상태의 동충하초 시료는 일정 농도의 멸균된 증류수에 용해시키고, 0.4 ㎛ 여과기(filter)를 통해 여과시킨 후 사용하였다.

실험예 1. 밀리타리스 동충하초 열수 추출물의 마우스에 대한 항암효과

1-1. 실험재료

상기 실시예 1의 누에번데기 밀리타리스 동충하초의 열수추출물 및 누에애벌레 밀리타리스 동충하초의 열수추출물을 시료로 사용하였다.

또한, 비교표준품으로 이용된 코디세핀(3'-deoxyadenosine)은 시그마사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

1-2. 코디세핀 농도 분석

상기 실시예 1의 각 밀리타리스 동충하초 열수추출물의 코디세핀 농도 분석 은 커닝험 등(Cunningham KG., et al., J. Chem. Soc., 51, pp2299-2300, 1951)의 방법을 이용하여 실시하였다.

먼저, 동충하초 추출물을 90 ℃에서 6시간 동안 끓인 후 여과하고, 2배 부피의 아세톤을 가한 후 4 ℃에서 24시간 동안 방치한 다음, 5,000 ×g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 수거하여 용매를 완전히 증발시키고, 증류수를 가하여 용해시킨 후 0.45 ㎛ 여과기(filter)를 사용하여 여과하였다. 시료의 코디세핀 함량은 올티마(Alltima) C18 (Shimatzu, Japan) 칼럼(column)이 장착된 HPLC를 이용하여 260 nm에서 측정하였다.

그 결과, 누에번데기 밀리타리스 동충하초 열수추출물 시료의 경우 0.2 %, 누에애벌레 밀리타리스 동충하초 열수추출물 시료의 경우 0.4 %의 코디세핀이 검출되었다.

1-3. MTT 테스트

밀리타리스 동충하초 추출물의 세포독성을 평가하기 위하여 MTT 테스트(Carmichael J. et al., Cancer Res., 47, pp936-949, 1987)를 실시하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; MTT) 테스트는 살아있는 세포의 미토콘드리아내 탈수소효소가 노란색의 수용성 물질인 MTT에 의해 포르마잔(formazan)으로 전환된 양을 나타내며, 생존하는 세포수와 비례한다. 본 연구에서 이용된 암세포주는 사코마-180(sarcoma-180)으로 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다.

먼저, 동결상태의 세포주를 해동시킨 후, 10 % 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 100 units/㎖ 페니실린(penicillin)과 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)이 함유된 RPMI 1640(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, USA) 배지를 사용하여 95 % O₂와 5 % CO₂ 가스가 공급되는 37 ℃ 배양기에서 배양하였다. 사코마-180 세포주를 5×10⁵ 세포/㎖ 농도가 되도록 각 웰(well)에 첨가하여 24시간 동안 배양시킨 후, 0∼1000 ㎍/㎖ 농도의 상기 실시예 1의 누에번데기 밀리타리스 동충하초 및 누에애벌레 밀리타리스 동충하초의 열수추출물 시료 또는 0∼20 ㎍/㎖ 농도의 코디세핀 시료를 첨가하고 48시간 동안 배양하였다. 여기에 MTT 용액(5 mg/㎖) 20 ㎕씩 첨가하고 4시간 동안 배양시켜 포르마잔을 형성시켰다. 아스피레이터(Aspirator)를 이용하여 조심스럽게 배양액을 제거하고, DMSO 150 ㎕를 첨가하여 포르마잔을 녹인 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 하기의 수학식 1에 준해 세포생존율을 산출하였고, 생존 세포율은 중복 측정된 3회 반복실험의 평균값으로 제시하였다. 이와 같이 사코마-180 세포주에 누에번데기 동충하초, 누에애벌레 동충하초 및 코디세핀의 농도를 달리하여 48시간동안 처리한 후 MTT 테스트를 실시한 결과를 도 1a, 1b 및 1c에 나타내었다.

세포생존율(%)= (시료로 처리된 세포의 흡광도/대조세포의 흡광도) ×100

도 1a에서 보면, 100 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖ 및 1000 ㎍/㎖ 농도의 누에번데기 밀리타리스 동충하초 열수추출물 시료로 종양세포를 전처리한 결과, 세포생존율이 대조세포의 각기 68.3 ±2.1 %, 55.1 ±0.9 % 및 51.4 ±3.5 % 수준으로 유의하게 감소하였다(p<0.05). 또한, 도 1b를 보면, 누에번데기 밀리타리스 동충하초 시료와 같은 농도의 누에애벌레 동충하초 열수추출물 시료로 종양세포를 전처리한 결과 세포생존율이 대조세포의 각기 60.1 ±2.5 %, 49.8 ±3.7 % 및 45.4 ±0.1 %로 유의하게 감소하였다(p<0.05). 따라서 본 실험에 사용된 두가지의 밀리타리스 동충하초는 모두 농도 의존적으로 사코마-180 세포의 분열을 억제함을 알 수 있었다.

한편, 도 1c를 보면, 코디세핀을 0.2∼20 ㎍/㎖ 범위에서 농도를 달리하여 종양세포에 전처리한 결과, 10 ㎍/㎖ 및 20 ㎍/㎖ 농도에서 세포생존율이 대조세포의 75.1 ±0.5 % 및 57.2 ±0.9 %로 유의하게 감소하였다(p<0.05).

본 연구에서 이용된 동충하초 시료의 코디세핀 함량은 누에번데기 동충하초의 경우 0.2 %, 누에애벌레 동충하초의 경우 0.4 %임을 감안할 때, MTT 테스트에서 유의적인 효과를 나타낸 코디세핀 농도(10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖)는 500 ㎍/㎖ 및 1000 ㎍/㎖ 농도로 사용된 동충하초 시료에 함유된 코디세핀 농도의 5∼10배에 해당됨을 알 수 있다.

이상의 결과를 종합해 볼 때, 누에번데기 밀리타리스 동충하초 및 누에애벌레 밀리타리스 동충하초 열수추출물의 암세포 성장 억제능은 코디세핀 단일성분에 의한 효과보다 더 우수한 것으로 사료된다.

1-4. 실험동물 및 암 유발

1-4-1. 복강암 유발

총 88마리의 수컷 ICR계 마우스(18∼22 g body wt.)를 대한실험동물센터로부터 구입하여 일반 고형사료(삼양유지사료사)로 사육하면서 1주일간 실험실 환경에 적응시켰다. 사육실의 온도는 22 ±2.0 ℃, 그리고 습도는 55 ±5.0 %를 유지하였으며, 명암주기는 12시간으로 조절하였다. 실험실 환경에 적응된 실험동물을 다음과 같이 11군 (n=8)으로 분류하여 40일간 사육하였다.

정상군(normal group, N)의 경우 암세포를 투여하지 않은 채 생리식염수만을 복강투여하였고, 대조군(control group, C)의 경우에는 암세포를 투여한 후 생리식염수를 투여하였다.

누에번데기 밀리타리스 동충하초 50군(이하, CMP50이라 함), 누에번데기 밀리타리스 동충하초 100군(이하, CMP100이라 함) 및 누에번데기 밀리타리스 동충하초 200군(이하, CMP200이라 함)의 경우 암세포를 투여한 후 상기 실시예 1의 누에번데기 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris of silkworm pupa) 열수추출물을 각각 50 mg/kg, 100 mg/kg 및 200 mg/kg 복강투여하였다.

누에애벌레 밀리타리스 동충하초 50군(이하, CML50이라 함), 누에애벌레 밀리타리스 동충하초 100군(이하, CML100이라 함) 및 누에애벌레 밀리타리스 동충하초 200군(이하, CML200이라 함)의 경우 암세포를 투여한 후 상기 실시예 1의 누에애벌레 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris of silkworm larva) 열수추출물을 각각 50 mg/kg, 100 mg/kg 및 200 mg/kg 복강투여하였다.

또한 비교표준품으로 이용된 코디세핀 1군(이하, C1이라 함), 코디세핀 2군(이하, C2라 함) 및 코디세핀 4군(이하, C5라 함)의 경우 암세포를 투여한 후 각각 1 mg/kg, 2 mg/kg 및 4 mg/kg의 코디세핀을 복강투여하였다. 마우스는 복강암을 유발시키기 위하여 0.2 ㎖(1.0 ×10⁶세포/마우스)의 사코마-180 세포 부유액을 복강내에 주사한 다음, 복강내 암세포를 이식하고, 24시간이 경과한 후부터 10일간 연속적으로 생리식염수 또는 0.2 ㎖의 밀리타리스 동충하초 열수추출물 또는 코디세핀 용액을 복강 내에 투여하였다. 실험 18일째까지 3일 간격으로 모든 실험동물의 체중을 측정하였다. 이와 같이 세포를 복강내에 이식받은 후 누에번데기 밀리타리스 동충하초 및 누에애벌레 밀리타리스 동충하초 열수추출물 또는 코디세핀을 10일간 복강 투여받은 마우스의 체중변화가 도 2a, 2b 및 2c에 나타내었다. 본 실험에서 18일까지 체중변화를 측정한 이유는 18일째에 대조군이 모두 사망하였기 때문이다.

도 2a, 2b 및 2c를 보면, 대조군의 경우 사코마-180 세포를 이식한 후 10일째부터 체중이 급격히 증가하기 시작하였으며, 18일째에는 41 ±0.5 g으로 나타나 정상군(30 ±0.6 g)의 약 1.4배에 달하였다. 한편, 복강 내에 종양세포를 이식 받은 후 10일간 코디세핀을 투여받은 군의 18일째 체중증가량은 식염수를 투여 받은 대조군에 비해 유의하게 더 적었으며(p<0.05), 누에번데기 밀리타리스 동충하초 및 누에애벌레 밀리타리스 동충하초 열수 추출물을 투여받은 군의 체중증가량은 코디세핀을 투여 받은 군에 비해 더 적게 나타났다(p<0.05).

상기와 같이 동충하초 추출물 또는 코디세핀을 투여받은 군에서 대조군에 비해 체중증가폭이 더 적게 나타난 것은 복수암의 성장이 저해되었기 때문인 것으로 사료되며, 아울러 코디세핀 단일성분에 비해 동충하초 열수추출물은 더 우수한 복수암 성장 저해효과를 나타내는 것으로 생각된다.

한편, 도 2b에서와 같이, 누에애벌레 동충하초를 200 mg/kg 수준으로 투여받은 군의 경우 15일째부터 체중이 복수암을 이식 받지 않은 정상군 보다도 오히려 더 낮은 수준으로 감소하기 시작하여, 18일째는 유의적으로 감소하였다(p<0.05).

1-4-2. 수명연장 실험

복강내에 암세포를 이식한 이후부터 40일간 생존 여부를 관찰하였으며, 하기 수학식 2에 준해 수명연장 백분율(prolongation ratio, %)을 산출하였다(Goldin R., et al., J. Nat. Cancer Inst., 66, pp1192-1308, 1981).

수명연장백분욜(%)= (A-B/B) ×100

* A: 실험군의 평균수명(일), B: 대조군의 평균수명(일)

그 결과 동충하초 추출물이 복강암이 유발된 마우스의 수명연장효과에 미치는 효과는 하기 표 1 및 도 3a, 3b, 3c, 및 3d에 나타내었다.

하기 표 1을 보면, 암세포를 이식받은 후 식염수를 투여받은 대조군의 경우 평균 생존일수는 14.3 ±0.7일로 나타났다. 한편 50 mg/kg(CMP50), 100 mg/kg (CMP100) 및 200 mg/kg (CMP200)의 누에번데기 밀리타리스 동충하초 열수추출물을 투여받은 군의 평균 생존일수는 33.2 ±6.0일, 25.7 ±5.3일 및 27.0 ±4.5일로 나타나, 대조군에 비해 각기 132 %, 80 % 및 89 % 유의하게 증가되었다.

또한 50 mg/kg(CML50), 100 mg/kg (CML100) 및 200 mg/kg(CML200)의 누에애벌레 밀리타리스 동충하초 열수추출물을 투여받은 군의 평균생존일수는 생리식염수를 투여받은 대조군에 비해 90 %, 83 % 및 52 % 유의적으로 증가되었다. 따라서 누에번데기 또는 누에애벌레 동충하초 열수추출물 모두 50 mg/kg의 농도로 투여된 경우 가장 뛰어난 수명 연장효과를 나타냈으며, 이 농도에서 누에번데기 동충하초는 누에애벌레 동충하초에 비해 복강암을 이식받은 마우스의 수명을 연장시키는 효과가 더 우수한 경향을 보였다(p>0.05).

코디세핀 투여군의 경우 1 mg/kg (C1), 2 mg/kg (C2) 및 4 mg/kg (C4) 농도에서 평균 생존일수가 22.0 ±5.8일, 27.3 ±5.3일 및 24.8 ±4.5일로 나타나, 대조군에 비해 각기 54 %, 91 % 및 73 % 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 코디세핀군의 경우에는 2 mg/kg/d 농도에서 가장 우수한 수명 연장효과를 나타냈고, 동충하초 추출물에 함유된 코디세핀 함량의 5∼10배에 해당되는 양이 투여되었음에도 불구하고 코디세핀은 동충하초 추출물에 비해 수명연장효과가 더 적었음을 알 수 있다.

또한, 실험 종료일까지 복강암이 유발된 마우스의 생존율을 살펴보면, 대조군의 경우 종양세포를 이식하고 18일째에, CML200군은 33일째에, 그리고 C1군과 C4군의 경우에는 35일째에 모두 사망하였다. 실험 종료일인 40일째까지 군당 총 8마 리의 실험동물 중 CMP50군의 경우 4마리가, 그리고 CMP100군, CMP200군, CML50군 및 C2군의 경우에는 각기 2마리가, CML100군의 경우에는 1마리가 생존하였다(도 3a, 3b, 3c 및 3d 참조).

시료	투여량 (mg/kg/d, i.p.)	생존시간 (일수)	수명연장 백분율¹⁾ (%)
대조군	살린(Saline)	14.3 ±0.7^c	-
CMP	50 100 200	33.2 ±6.0^a 25.7 ±5.3^ab 27.0 ±4.5^ab	132 79.7 88.8
CML	50 100 200	27.1 ±4.4^ab 26.2 ±2.6^ab 21.8 ±3.4^bc	89.5 83.2 52.4
코디세핀	1 2 4	22.0 ±5.8^bc 27.3 ±5.3^ab 24.8 ±4.5^bc	53.8 90.9 73.4
수치는 각 그룹의 8마리 쥐 평균 ±SEM 동일 칼럼내 다른 알파벳은 일방향 ANOVA에 의해 11개의 실험군중 유의적으로 차이가 있음을 나타냄(p<0.05). 처치는 1 ×10⁶ 사코마-180 세포의 복강내 투여후 10일 동안 유지됨 ¹⁾ 수명연장율(5): b-a ×100 a a: 대조군 생쥐의 생존시간(Survival time of control mice) b: 처치된 생쥐의 생존시간(Survival time of treated mice) CMP : 누에 애벌레 밀리타리스 동충하초 CML: 누에 번데기 밀리타리스 동충하초

1-5. 겨드랑이 암 유발 및 고형암 성장 저지 실험

1-5-1. 겨드랑이 암 유발

총 64마리의 수컷 ICR계 마우스(18∼22 g 체중)를 대한실험동물센터로부터 구입하여 일반 고형사료(삼양유지사료사)로 사육하면서 1주일간 실험실 환경에 적응시켰다. 사육실의 온도는 22 ±2.0 ℃, 그리고 습도는 55 ±5.0 %를 유지하였으며, 명암주기는 12시간으로 조절하였다. 실험실 환경에 적응된 실험동물을 다음과 같이 8군(n=8)으로 분류하여 28일간 사육하였다. 정상군(normal group, N)의 경우 암세포를 이식하지 않은 채 생리식염수만을 복강투여하였고, 대조군(control group, C)의 경우에는 암세포를 이식한 후 생리식염수를 투여하였다.

누에번데기 밀리타리스 동충하초 50군(CMP50) 및 누에번데기 밀리타리스 동충하초 100군(CMP100)의 경우 암세포를 이식한 후 상기 실시예 1의 누에번데기 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris of silkworm pupa)를 각각 50 mg/kg 및 100 mg/kg의 열수추출물을 복강투여하였다. 누에애벌레 밀리타리스 동충하초 50군(CML50) 및 누에애벌레 밀리타리스 동충하초 100군(CML100)의 경우 암세포를 이식한 후 누에애벌레 밀리타리스 동충하초 열수추출물(Cordyceps militaris of silkworm larva)을 각각 50 mg/kg 및 100 mg/kg을 복강투여하였다. 또한 코디세핀 1군(C1) 및 코디세핀 2군(C2)의 경우 암세포를 이식한 후 각각 1 mg/kg 및 2 mg/kg의 코디세핀을 복강투여하였다.

이 후, 마우스의 겨드랑이에 고형암을 유발하기 위하여 주사기를 이용하여 0.2 ㎖(1.0×10⁶ 세포/마우스)의 사코마-180 세포부유액을 실험동물의 왼쪽 겨드랑이에 피하이식하고, 24시간이 경과한 후부터 10일간 연속적으로 0.2 ㎖의 생리식염수, 밀리타리스 동충하초 추출물 또는 코디세핀을 복강내에 투여하였으며, 모든 실험동물을 대상으로 실험 시작일과 종료일 (암세포 이식 3주 후), 두차례에 걸쳐 체중을 측정하였다.

1-5-2. 고형암 성장 저지 실험

겨드랑이에 종양세포를 이식한 후 21일째 되는 날 경추 탈골법에 의하여 실험동물을 치사시키고, 생성된 고형암을 적출하여 무게를 측정한 후 하기 수학식 3에 준해 종양 성장저지 백분율(prolongation ratio, %)을 산출하였다(Goldin R., et al., J. Natl. Cancer Inst., 66, pp1192-1308, 1981). 이와 함께, 흉선, 비장 및 간을 적출하고, 그 무게를 측정하였다.

종양 성장저지능(%)= (A-B)/A ×100

*A:대조군의 고형암 무게(g), B:실험군의 고형암 무게(g)

그 결과, 밀리타리스 동충하초의 투여가 암세포를 이식받은 마우스의 고형암 성장에 미치는 효과를 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 2를 보면, 사코마-180 세 포를 ICR 마우스의 겨드랑이에 이식한 후 10일 동안 식염수를 복강투여하고 21일째에 치사시켜 종양무게를 측정한 결과, 2.45 ±0.30 g으로 나타났다.

한편, 50 mg/kg(CMP50) 및 100 mg/kg(CMP100)의 누에번데기 밀리타리스 동충하초 열수추출물을 복강투여한 군의 경우, 실험 21일째의 종양무게가 각기 1.29 ±0.17 g 및 1.04 ±0.04 g으로 나타나 대조군에 비해 고형암 성장이 47.3 % 및 57.6 % 유의하게 억제되었다(p<0.05).

또한, 50 mg/kg(CML50) 및 100 mg/kg(CML100)의 누에애벌레 밀리타리스 동충하초열수추출물을 투여한 군의 고형암 무게는 동일량의 누에번데기 밀리타리스 동충하초를 투여받은 군에 비해 감소하는 경향을 나타냈고, 대조군에 비하여는 고형암의 성장이 35.5 % 및 37.1 % 유의하게 억제되었다(p<0.05). 따라서 누에번데기 동충하초는 누에애벌레 동충하초에 비해 고형암 성장 저지효과가 더 우수한 경향을 보였다.

한편, 코디세핀 투여군의 경우 1 mg/kg(C1) 및 2 mg/kg(C2)농도에서 21일째 종양무게가 대조군에 비해 26.1 % 와 29.8 % 유의하게 더 낮았다(p<0.05). 본 연구에서 이용된 동충하초 시료의 코디세핀 함유량은 누에번데기 동충하초의 경우 0.2 %, 그리고 누에애벌레 동충하초의 경우 0.4 %이며, 따라서 본 실험에 사용된 코디세핀 농도는 동충하초 시료에 함유된 코디세핀 농도보다 누에번데기 동충하초의 경우 10배, 그리고 누에애벌레 동충하초의 경우 5배정도 더 높은 농도이다.

결과적으로 동충하초 열수추출물은 코디세핀 단일성분에 비해 고형암 성장 저지효과가 더 우수한 것으로 사료된다.

그룹	투여량 (mg/kg/d)	종양무게 (g)	저해율¹⁾ (%)
대조군	살린	2.45 ±0.30^a	-
CMP	50 100	1.29 ±0.17^bc 1.04 ±0.04^c	47.3 57.6
CML	50 100	1.58 ±0.02^bc 1.54 ±0.04^bc	35.5 37.1
코디세핀	1 2	1.81 ±0.22^b 1.72 ±0.09^b	26.1 29.8
수치는 각 그룹의 8마리 쥐 평균 ±SEM 동일 칼럼내 다른 알파벳은 일방향 ANOVA에 의해 11개의 실험군중 유의적으로 차이가 있음을 나타냄(p<0.05). 처치는 1 ×10⁶ 사코마-180 세포의 복강내 투여후 10일 동안 유지됨 ¹⁾ 저해율(%): b-a ×100 a a:대조군 생쥐의 종양무게(Tumor weight of control mice) b:처치된 생쥐의 종양무게(Tumor weight of treated mice) CMP : 누에 애벌레 밀리타리스 동충하초 CML: 누에 번데기 밀리타리스 동충하초

하기에 상기 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 주사제제의 제조

실시예 1의 동충하초 열수추출물 건조분말....100 ㎎

소디움 메타비설파이트......................3.0 ㎎

메틸파라벤.................................0.8 ㎎

프로필파라벤...............................0.1 mg

주사용 멸균증류수...........................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2 ㎖로 한 후, 2 ㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1의 동충하초 열수 추출물 건조분말....200 ㎎

유당........................................100 ㎎

전분........................................100 ㎎

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

실시예 1의 동충하초 열수 추출물 건조분말....100 ㎎

유당........................................50 ㎎

전분........................................50 ㎎

탈크........................................2 ㎎

스테아린산 마그네슘.........................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

실시예 1의 동충하초 열수 추출물 건조분말...1000 ㎎

설탕.........................................20 g

이성화당.....................................20 g

레몬향......................................적량

정제수를 가하여 전체 1000 ㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 5. 건강 식품의 제조

실시예 1의 동충하초 열수 추출물 건조분말...1000 ㎎

비타민 혼합물..............................적량

비타민 A 아세테이트........................70 ㎍

비타민 E..................................1.0 ㎎

비타민 B1.................................0.13 ㎎

비타민 B2.................................0.15 ㎎

비타민 B6.................................0.5 ㎎

비타민 B12................................0.2 ㎍

비타민 C..................................10 ㎎

비오틴....................................10 ㎍

니코틴산아미드...........................1.7 ㎎

엽산......................................50 ㎍

판토텐산 칼슘............................0.5 ㎎

무기질 혼합물............................적량

황산제1철...............................1.75 ㎎

산화아연................................0.82 ㎎

탄산마그네슘............................25.3 ㎎

제1인산칼륨..............................15 ㎎

제2인산칼슘..............................55 ㎎

구연산칼륨...............................90 ㎎

탄산칼슘................................100 ㎎

염화마그네슘............................24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 6. 건강 음료의 제조

실시예 1의 동충하초 열수 추출물 건조분말..1000 ㎎

구연산....................................1000 ㎎

올리고당...................................100 g

매실농축액..................................2 g

타우린......................................1 g

정제수를 가하여..........................전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 밀리타리스 동충하초 추출물은 항암 활성이 매우 우수하며 세포독성이 없으므로, 항암용 약학조성물로써 의약품 또는 건강기능식품으로 사용할 수 있다.

Claims

누에 애벌레 밀리타리스 동충하초 (Cordyceps militaris of silkworm larva) 열수 추출물을 함유하는 고형암 예방 및 치료용 약학조성물.
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제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.02 ~ 90 중량 %로 포함하는 약학 조성물.
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