KR101275375B1 - 밀리타리스 동충하초 추출물 제조방법 및 이에 따라 제조된 밀리타리스 동충하초 추출물을 포함하는 건강보조식품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 동충하초 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 (S1) 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)를 분쇄하여 분말화하는 단계; (S2) 분말화된 밀리타리스 동충하초에 물과 오가피 잎을 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계; (S3) 상기 혼합물을 60 ~ 100℃에서 1~3시간 동안 1차 추출하는 단계; 및 (S4) 1차 추출물을 110 ~ 140℃에서 1~3시간 동안 2차 추출하는 단계;를 포함하는 밀리타리스 동충하초 추출물 제조방법에 대한 것이다.
상기한 본 발명에 따르면 밀리타리스 동충하초를 이용하여 특유의 이취와 비린 맛을 효과적으로 제거하여 기호성이 증진될 뿐 아니라, 인터루킨의 양적 변화를 유도하여 면역증강 효능을 높인 동충하초 추출물을 얻을 수 있다.
상기한 본 발명에 따르면 밀리타리스 동충하초를 이용하여 특유의 이취와 비린 맛을 효과적으로 제거하여 기호성이 증진될 뿐 아니라, 인터루킨의 양적 변화를 유도하여 면역증강 효능을 높인 동충하초 추출물을 얻을 수 있다.
Description
본 발명은 기호성이 증진될 뿐만 아니라 면역증강 효능이 우수한 밀리타리스 동충하초 추출물 제조방법 및 이에 따라 제조된 밀리타리스 동충하초 추출물을 포함하는 건강보조식품에 관한 것이다.
동충하초는 겨울철에는 곤충의 몸에 들어가 월동을 하면서 양분을 흡수하여 곤충을 죽게 하고 여름철이 되면 죽은 그 곤충의 몸에서 풀(버섯)을 만든다는 모습에서 명명된 일종의 버섯이다. 동충하초속 버섯균주는 분류학적으로 볼 때 자낭균문(Ascomycota), 핵균강(Pyrenomycetes), 육자균목(Clavicipitaceae), 동충하초속(Codyceps)에 속하며 한국을 비롯한 중국, 일본 등 전 세계적으로 100 속 300여종이 알려져 있다. 그 중에서 밀리타리스 동충하초는 주로 나비목(Lepidoptera)의 유충 또는 번데기를 기주로 하여, 주황색의 곤봉형자좌를 형성하는 곤충기생균(Entomopathogenic fungi)의 일종이며, 자낭각은 반돌출형이며 원통형의 자낭안에 실모양의 자낭포자들이 존재한다.
동충하초에 대한 효능으로 생리활성 물질인 코디세핀(Cordycpin)이 알려져 있는데 3-deoxyadenosine 계통의 천연 화합물로서 항세균, 항종양 및 항암 효과가 있음이 임상실험에서 밝혀졌다.
특히, 본 발명에서 이용하는 밀리타리스 동충하초의 자실체는 여러 동충하초 중에서도 코디세핀(Cordycepin)을 상대적으로 많이 함유하고 있어서 그 자실체는 폐를 보호하고 신장을 튼튼히 하는 것으로 알려져 있으며 결핵, 황달 등의 치료와 강장제로서의 효과가 널리 인정되고 있을 뿐만 아니라 주로 병후의 신체조절, 보약 등에 사용되는 고가의 한방 약재로 이용되고 있으며 특히 밀리타리스 동충하초의 약리 성분 중에는 면역 기능을 강화하는 성질이 함유되어 있어 감기, 폐결핵, 만성기침, 천식, 발작, 빈혈, 남성의 성적기능 장애, 고혈압 등에 효과를 나타내고 있다. 특히 약재로 사용되고 있는 자실체의 성분 중 코디세핀이라는 천연 면역증강 물질의 유용한 약리 성분이 밝혀지면서 밀리타리스 동충하초에 관한 관심이 날로 증가되고 있다. 최근 중국 및 일본 등 과학자들의 연구결과를 종합하여 보면 밀리타리스 동충하초에는 면역 기능을 가오하시키는 성분이 함유되어 있어서 세포 면역을 촉진시켜 각종 종양과 바이러스 감염에 대한 저항력을 높이는 등의 효과가 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 특히 국내에서는 밀리타리스 동충하초에 대한 연구에 항암성분인 에르고스테롤 페로사이드(Ergosterol peroxide)가 규명된 바 있다. 이러한 연구결과에 따르면 밀리타리스 동충하초는 암을 예방할 뿐만 아니라 스트레스 해소에도 효과가 크므로 이용 분야가 매우 넓은 특징을 가지고 있다. 그러나 위와 같은 유용성이 있는 밀리타리스 동충하초는 생산에 있어서 누에 유충, 누에 번데기, 곡물 배지의 단독 또는 혼합의 형태로 배지를 조성하여 재배를 하고 있는데 생산성이 균일하지 못하고, 원료인 누에 유충 또는 번데기의 수급이 용이하지 못하여 배지의 가격이 비싸기 때문에 실제 밀리타리스 동충하초의 가격이 비싸 많이 응용되지 못하고 있는 실정이다.
또한, 배지의 조성물로 포함된 누에 유충 또는 번데기의 성분 때문에 비린 맛이 강하고 향 또한 좋지 못할 뿐만 아니라 곤충에 대한 혐오스러운 인식 때문에 일반 소비자들로부터 널리 애용되지 못하므로 식품으로서의 활용은 매우 미미한 실정이다.
본 발명은 밀리타리스 동충하초를 이용하여 특유의 이취와 비린 맛을 효과적으로 제거하여 기호성이 증진될 뿐 아니라, 인터루킨의 양적 변화를 유도하여 면역증강 효능을 높인 동충하초 추출물의 제조방법을 제공하고자 한다. 본 발명은 또한 이러한 제조방법에 따라 얻어지는 추출물을 포함하는 건강보조식품을 제공하고자 한다.
이에 본 발명은 바람직한 제1구현예로서 (S1) 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)를 분쇄하여 분말화하는 단계; (S2) 분말화된 밀리타리스 동충하초에 물과 오가피 잎을 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계; (S3) 상기 혼합물을 60 ~ 100℃에서 1~3시간 동안 1차 추출하는 단계; 및 (S4) 1차 추출물을 110 ~ 140℃에서 1~3시간 동안 2차 추출하는 단계;를 포함하는 밀리타리스 동충하초 추출물 제조방법을 제공한다.
상기 제1구현예에 의한 밀리타리스 동충하초 추출물 제조방법에서, (S2) 단계에서의 오가피 잎은 밀리타리스 동충하초 100 중량부에 대하여 10 ~ 100 중량부 첨가하는 것일 수 있다.
상기 제1구현예에 의한 밀리타리스 동충하초 추출물 제조방법에서, 오가피 잎은 밀리타리스 동충하초 100 중량부에 대하여 40 ~ 60 중량부로 첨가하는 것일 수 있다.
상기 제1구현예에 의한 밀리타리스 동충하초 추출물 제조방법에서, (S2) 단계에서의 물은 밀리타리스 동충하초 중량 대비 10 ~ 50배 중량을 첨가하는 것일 수 있다.
본 발명은 바람직한 제2구현예로서 상기의 제조방법에 따라 제조된 밀리타리스 동충하초 추출물을 포함하는 건강보조식품을 제공한다.
본 발명에 따르면, 기호성이 증진될 뿐 아니라, 면역증강 효능이 우수한 동충하초 추출물 및 이를 포함하는 건강보조식품을 얻을 수 있다.
도 1은 HPLC를 이용한 코디세핀 표준품의 검량선을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물의 인터루킨-2 생산유도 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물의 인터루킨-4 생산유도 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물의 인터루킨-10 생산유도 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물의 인터루킨-12 생산유도 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물의 TNF-a 생산억제 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물과 일반 동충하초 열수 추출물의 인터루킨-2 생산유도 효과를 비교한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물과 일반 동충하초 열수 추출물의 인터루킨-4 생산유도 효과를 비교한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물의 인터루킨-2 생산유도 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물의 인터루킨-4 생산유도 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물의 인터루킨-10 생산유도 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물의 인터루킨-12 생산유도 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물의 TNF-a 생산억제 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물과 일반 동충하초 열수 추출물의 인터루킨-2 생산유도 효과를 비교한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물과 일반 동충하초 열수 추출물의 인터루킨-4 생산유도 효과를 비교한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 동충하초 추출물의 제조방법을 제공하는 것으로, 동충하초를 열수추출시 오가피 잎을 첨가함으로써 비린 맛을 제거하고, 각기 다른 온도 및 시간으로 2 단계의 열수추출을 함으로써 남아있는 비린 맛을 제거하고, 인터루킨의 생산유도 효과를 높여 면역증강 효능을 개선한 밀리타리스 동충하초 추출물을 제조한다.
이를 위하여 본 발명은 (S1) 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)를 분쇄하여 분말화하는 단계; (S2) 분말화된 밀리타리스 동충하초에 물과 오가피 잎을 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계; (S3) 상기 혼합물을 60 ~ 100℃에서 1~3시간 동안 1차 추출하는 단계; 및 (S4) 1차 추출물을 110 ~ 140℃에서 1~3시간 동안 2차 추출하는 단계;를 포함하는 밀리타리스 동충하초 추출물 제조방법을 제공한다.
상기 (S1) 단계에서는 밀리타리스 동충하초를 180 ~ 200 mesh 범위 내의 크기로 분쇄하는 것이 동충하초에 함유된 유효 활성성분이 잘 추출되게 하므로 바람직하다.
(S2) 단계에서는 상기 분쇄된 밀리타리스 동충하초에 물과 오가피 잎을 첨가한다.
이때, 물은 밀리타리스 동충하초의 중량 대비 10 ~ 50배의 중량으로 첨가하는 것이 바람직하고, 오가피 잎은 동충하초 100 중량 대비 10 ~ 100 중량부를 첨가하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 오가피 잎을 동충하초 100 중량 대비 40 ~ 60 중량부로 첨가하는 것이다. 오가피 잎을 40 ~ 60 중량부 첨가하는 경우 비린 맛과 이취가 없고 맛이 조화로워서 기호도가 가장 높다.
이와 같이, 밀리타리스 동충하초 추출물 제조시 동충하초 분말 외에 오가피 잎과 함께 추출하면 동충하초 특유의 이취와 비린 맛을 제거할 수 있게 된다.
(S3) 단계에서는 상기 혼합물을 60 ~ 100℃에서 1 ~ 3시간 동안 1차 추출한다. (S3) 단계에서는 밀리타리스 동충하초와 오가피 잎을 함께 열수추출함으로써 이취와 비린 맛을 제거하고, 밀리타리스 동충하초 내에 함유되어 있는 유효 활성 성분들을 추출한다. 1차 추출시의 추출온도는 비린내를 가장 효과적으로 제거할 수 있는 60 ~ 100℃ 범위 내, 보다 바람직하게는 90 ~ 100 ℃ 범위 내인 것이 바람직하다.
(S4) 단계에서는 상기 1차 추출물을 110 ~ 140℃에서 1~3시간 동안 2차 추출한다.
(S4) 단계에서는 1차 단계를 거친 후에도 오가피 잎에 흡착되는 등 남아 있을 수 있는 미량의 비린 맛을 마저 제거할 수 있을 뿐 아니라 남아 있는 잡균을 제거할 수 있어 바람직하다. 1차 추출시의 추출온도는 멸균이 가능한 110 ~ 140℃ 범위 내인 것이 바람직하다.
또한, 상기와 같이 2단계에 거쳐 열수추출하는 경우 1단계만 거치는 경우보다 오가피 잎의 생리 비활성 물질의 흡착과 유효성분의 높은 추출 효율성으로 인하여 동충하초 추출물의 인터루킨의 생산유도효과를 10% 가량 향상시킬 수 있다.
상기와 같이 본 발명에 따라 오가피 잎을 첨가하고, 1차 및 2차 열수추출하여 제조한 밀리타리스 동충하초 추출물은 동충하초 특유의 이취 및 비린 맛이 없을 뿐 아니라 면역증강 효능이 매우 우수하다.
다음으로, 상기한 방법에 의해 제조된 동충하초 추출물을 포함하는 건강 보조식품에 대해 설명한다.
본 발명에 따른 건강 보조식품은 식품학적으로 허용 가능한 표고버섯, 복분자, 구기자, 포도당 등과 같은 기능성 첨가물 또는 풍미나 식미를 향상시킬 수 있는 첨가물 등을 더 포함할 수 있다.
그리고, 본 발명에 따른 건강 보조식품은 상술한 방법에 의해 제조되는 밀리타리스 동충하초 추출물을 포함하여 다양한 형태의 것으로 제조될 수 있는데, 일례로 타블렛, 환, 그래뉼, 음료 등을 들 수 있다. 좋기로는 한 번에 섭취하기 좋도록 양 또는 크기를 조절하여 그래뉼 또는 타블렛의 형태로 제조되는 것이 바람직하다. 이러한 다양한 형태의 건강 보조식품 중에 포함되는 밀리타리스 동충하초 추출물의 함량은 식품의 총 중량 대비 적어도 50중량% 이상, 바람직하기로는 식품의 총 중량 대비 50~80중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다.
이와 같이 제조된 본 발명에 따른 건강 보조식품은 동충하초가 가질 수 있는 이취, 비린 맛 또는 원료에 대한 혐오감 없이 편리하게 식용으로 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
밀리타리스 동충하초는 본 발명자들이 직접 재배한 밀리타리스 동충하초를 동결건조하여 사용하였다.
실시예
1
밀리타리스 동충하초를 분쇄기로 분쇄한 후, 동충하초 100g에 물 4L를 가하고, 오가피 잎을 20g 첨가하여 100℃에서 3시간 추출한 후, 121℃에서 1시간 더 추출하였다.
실시예
2
오가피 잎을 40g 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 동충하초 추출물을 제조하였다.
실시예
3
오가피 잎을 50g 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 동충하초 추출물을 제조하였다.
실시예
4
오가피 잎을 60g 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 동충하초 추출물을 제조하였다.
실시예
5
오가피 잎을 80g 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 동충하초 추출물을 제조하였다.
실시예
6
오가피 잎을 100g 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 동충하초 추출물을 제조하였다.
비교예
1
분쇄기로 분쇄한 동충하초 100g에 물 4L를 가하고, 100℃에서 3시간 추출하여 동충하초 추출물을 제조하였다.
비교예
2
오가피 잎을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 동충하초 추출물을 제조하였다.
비교예
3
추출시 2차 추출은 하지 않고 1차 추출만 하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 동충하초 추출물을 제조하였다.
실험예
1: 코디세핀 함량 측정
상기 추출물을 여과지로 여과한 후, 원심분리(8,000 rpm)하여 얻은 상층액을 HPLC를 이용하여 코디세핀 피크의 면적비로 계산하였고 이때, 시중에서 구입한 코디세핀 표준품을 이용하여 검량선을 작성하였다(도 1 참조). 그리고, 상기 실시예 및 비교예에서 제조된 동충하초 추출물의 코디세핀 함량을 하기 표 1에 나타내었다.
| 추출조건 | 코디세핀 함량 (mg/ml) |
|||||||
| No. | 동충하초 (g) | 오가피잎 (g) | 1차추출 온도(℃) | 1차추출 시간(h) | 2차추출 온도(℃) | 2차추출 시간(h) | 물 (L) |
|
| 실시예 1 | 100 | 20 | 100 | 3 | 121 | 1 | 4 | 0.71±0.05 |
| 실시예 2 | 100 | 40 | 100 | 3 | 121 | 1 | 4 | 0.59±0.02 |
| 실시예 3 | 100 | 50 | 100 | 3 | 121 | 1 | 4 | 0.63±0.02 |
| 실시예 4 | 100 | 60 | 100 | 3 | 121 | 1 | 4 | 0.68±0.05 |
| 실시예 5 | 100 | 80 | 100 | 3 | 121 | 1 | 4 | 0.61±0.03 |
| 실시예 6 | 100 | 100 | 100 | 3 | 121 | 1 | 4 | 0.75±0.06 |
| 비교예 1 | 100 | 0 | 100 | 3 | 121 | 0 | 4 | 0.69±0.04 |
| 비교예 2 | 100 | 0 | 100 | 3 | 121 | 1 | 4 | 0.65±0.03 |
| 비교예 3 | 100 | 50 | 100 | 3 | 121 | 0 | 4 | 0.67±0.05 |
상기 표 1에서 나타낸 바와 같이 오가피 잎의 첨가에 따른 추출액의 코디세핀 함량은 큰 변화가 없었으며, 1차 추출 후, 2차 추출을 행하였음에도 추출액의 코디세핀 함량은 변화하지 않음으로써 고온에서도 오가피 잎에 의한 코디세핀의 분해 또는 흡착 등은 일어나지 않은 것을 알 수 있었다.
실험예
2: 오가피 잎을 이용한 비린내 제거
밀리타리스
동충하초 추출물의 기호도 조사
상기 실시예 및 비교예에서 각각의 조건으로 제조된 동충하초 추출물의 관능적 특성을 분석하였다. 본 실험에 흥미가 있고 차이 식별 능력이 있는 50명을 관능검사 요원으로 선정하여 이들에게 색, 맛, 향 및 전반적 기호도를 평가하는 요령을 훈련시킨 후, 전반적인 기호도 등에 대한 관능시험을 3점 채점법으로 실시하였다. 이때 색깔은 3 진하다, 2 보통이다, 1 연하다로 나타냈으며 향기는 3 좋다, 2 보통이다, 1 나쁘다 이고, 비린 맛 정도는 3 많다, 2,보통이다, 1 적다로 나타내었으며 전반적인 맛은 3 좋다, 2 보통이다, 1 미흡하다로 평가하였으며 전체적인 기호도는 3 좋다, 2 보통이다, 1 미흡하다로 하였다. 상기와 같이 관능검사를 실시한 결과는 표 2에 나타내었다.
| No. | 색깔 | 향기 | 비린 맛 | 전반적 맛 | 전체적 기호도 |
| 실시예 1 | 2.8 | 1.9 | 2.6 | 2.4 | 2.4 |
| 실시예 2 | 3.0 | 2.1 | 2.2 | 2.5 | 2.4 |
| 실시예 3 | 2.8 | 2.3 | 1.8 | 2.3 | 2.7 |
| 실시예 4 | 2.9 | 2.1 | 1.8 | 2.5 | 2.5 |
| 실시예 5 | 3.0 | 2.1 | 1.9 | 2.4 | 2.6 |
| 실시예 6 | 3.0 | 2.3 | 1.8 | 2.6 | 2.6 |
| 비교예 1 | 3.0 | 1.7 | 2.8 | 1.2 | 1.7 |
| 비교예 2 | 3.0 | 1.9 | 2.6 | 1.4 | 1.9 |
| 비교예 3 | 3.0 | 2.1 | 2.1 | 1.8 | 2.1 |
표 2에 나타낸 바와 같이, 9개 시험군에서 관능평가를 실시한 결과, 색깔에 있어서는 시험군에 따른 큰 변화를 나타내지 않았으며 향기, 비린 맛, 전반적인 맛, 전체적인 기호도에서는 시험군 제조 방법에 따른 변화가 나타났다. 즉, 오가피 잎을 첨가하여 추출한 추출액(실시예)에서 향기와 비린 맛의 기호도가 높게 나타났으며, 이는 오가피 잎을 첨가함으로써 추출액의 비린 맛을 제거시킴으로써 전반적인 맛의 향상과 전체적인 기호도 상승으로 이어지는 결과라고 할 수 있다.
실험예
3:
밀리타리스
동충하초 추출물에 의한 면역증강 효과 측정
실험동물, 시약 및 시료
암컷 C57BL/6 마우스로서 생후 8주 내외, 체중 25 g 내외의 것을 대한바이오링크(충청북도 음성군)로부터 구입하여 실험에 사용하였다. 시료는 실시예 3의 동충하초 추출물과 시중에서 구입한 동충하초 추출물(풀무원), 코디세핀 표준품을 사용하였고, LPS는 Escherichia coli (serotype 026:B6)에서 분리 정제된 표품(Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Mo, USA)을 사용하였고 Con A는 Pharmacia사 제품(Pharmacia Fine Chemicals, Code 17-0450-01, Sweden)을 사용하였다. IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, TNF-α를 측정하기 위한 시약은 Mouse IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, TNF-α ELISA kit(BioLegend, San Diego, CA, USA)을 이용하였다.
비장세포배양
마우스 비장세포의 분리는 경부를 탈구하여 희생시킨 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하여 4oC의 Hank's balanced salt solution(HBSS, Gibco, Grand Island, U.S.A.)으로 2회 세척하였다. 이를 직경 60 mm의 조직배양용 접시(Costar, Cambridge, U.S.A.)에 옮기고 다시 신선한 HBSS를 가한 후 핀셋으로 가볍게 문질러 비장세포를 유리시켰다. 이 세포부유액을 15 ml 원심관(Falcon, Oxnard, U.S.A.)에 옮긴 후 2 - 3분 동안 실온에 방치한 다음 세포부유액의 상층액을 새로운 15 ml 원심관에 옮겼다. 이 세포를 300 g에서 5 - 10분 원심한 후 HBSS로 1회 원심 세척한 다음 혼입된 적혈구를 tris-buffered 0.87% NH4Cl용액으로 3분간 처리한 후 HBSS로 2회 원심 세척하여 사용하였다.
비장세포배양 상층액 준비는 미리 준비된 비장세포 부유액을 10% 가 되게 소 태아혈청을 가한 RPMI 1640 (Gibco BRL., Grand Island, NY, USA) 배지로 ml 당 2 × 106 세포가 되도록 조절하여, 24 wells tissue culture plate (Costar, Cambridge, MA, USA)에 1 ml씩 분주한 후 각각의 시료(실시예 3, 시판품, 코디세핀, 증류수, 비교예 3) 1.0, 3.0, 10.0 μg을 각각 적용시켜 37℃, 5% CO2 배양기에 배양하였다. 또한 LPS 2.0 μg이나 Con A 2.0 μg 과의 복합작용도 함께 시험하였다. 대조군으로는 증류수를 사용하였다. 배양시간은 상기의 조건에 6, 24, 48, 72시간으로 하였다. 배양이 끝난 후 전량 배양액을 수거한 다음 300× g에서 10분간, 10,000× g에서 30분간 원침 시킨 후 그 상층액을 수거하여 -70℃에 보관하였다.
인터루킨 함량측정
미리 96 wells microplate에 mouse IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, TNF-a에 대한 capture 항체를 coating buffer에 희석하여 100 μl 씩을 분주한 후 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 다음날 plate를 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 assay diluent 200 μl 씩을 분주한 후 실온에서 1시간동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 plate의 각 well에 시료(배양액) 100 μl 씩 을 적하하여 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 detection 항체 100 μl 씩을 분주한 후 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 avidin-horseradish peroxidase 액 100 μl 씩을 적하하여 다시 실온에서 30분 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 7 번 세척한 후 tetramethylbenzidine이 포함된 기질액 100 μl 씩을 적하하여 실온에서 15분 동안 방치한 후 stop액 100 μl 씩을 가하여 반응을 정지시켰다. Optical density는 microplate reader (Model 550 microplate reader, Bio-Rad, Richmond, USA)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.
상기 실험의 결과를 도 2 ~ 도 6에 나타내었다.
면역세포 중의 하나인 세포의 증식과 분화를 촉진하는 인터루킨-2에 있어서는 본 발명에 의하여 제조된 시료(실시예 3)가 대조군(control)군 시료, 코디세핀표준품, 타사의 시판품보다 인터루킨-2의 생산을 최대 1.7배 증가시켰으며(도 2 참조), 알레르기 반응에 중요한 역할을 하는 인터루킨-4에 있어서는 코디세핀 표준품의 시료는 대조군 보다 생산량이 감소하였으나 본 발명에 따른 동충하초 추출물은 대조군 보다 약 1.8배 생산을 유도하는 것으로 나타났다(도 3 참조).
선천면역과 세포매개 면역반응의 억제를 통한 면역조절을 담당하는 하는 인터루킨-10은 본 발명에 따른 동충하초 추출물이 타 시료보다 7배 높은 생산량을 유도하는 것으로 나타났다(도 4 참조).
또한, NK세포를 자극하여 Th-1세포를 유도하는 인터루킨-12의 유도에 있어서도 본 발명에 따라 제조된 동충하초 추출물이 타 시료보다 최대 6.8배 높은 생산량을 유도하는 것으로 나타났다(도 5 참조).
한편, 급성 염증을 유도하는 것으로 알려진 TNF-a(Tumor Necrosis Factor-a)는 대조군이나 타 시료보다 1.5배 유도를 억제하는 것으로 나타났다(도 6 참조).
또한, 도 7은 본 발명을 위한 동충하초 1차 추출물과 최종 제조된 조제물의 인터루킨-2 생산유도 효과를 비교한 것이고, 도 8은 본 발명을 위한 동충하초 1차 추출물과 최종 제조된 조제물의 인터루킨-4 생산유도 효과를 비교한 것이다. 상기 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 2단계 추출방법에 따라 제조된 추출물은 제1단계만의 추출물보다 약 10%정도 인터루킨의 생산유도효과를 높이는 것으로 나타났다.
이상에서 상술한 바와 같이 본 발명에 따른 동충하초 추출물은 비린 맛이 없어 기호도가 증진될 뿐만 아니라, 정제된 코디세핀 단일 시료 또는 기존 방법에 의한 일반적인 동충하초 열수추출물보다 면역을 증가시키는 각종 인터루킨의 생산을 더 많이 유도를 하는 것으로 나타났으며 이로 인하여 면역증강을 위한 건강보조식품에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
Claims (5)
- (S1) 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)를 분쇄하여 분말화하는 단계;
(S2) 분말화된 밀리타리스 동충하초에 물과 오가피 잎을 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계;
(S3) 상기 혼합물을 60 ~ 100℃에서 1~3시간 동안 1차 추출하는 단계; 및
(S4) 1차 추출물을 110 ~ 140℃에서 1~3시간 동안 2차 추출하는 단계;를 포함하는 인터루킨-10 및 인터루킨-12 생산 증진능을 가지는 밀리타리스 동충하초 추출물 제조방법.
- 제1항에 있어서, (S2) 단계에서의 오가피 잎은 밀리타리스 동충하초 100 중량부에 대하여 10 ~ 100 중량부 첨가하는 것을 특징으로 하는 인터루킨-10 및 인터루킨-12 생산 증진능을 가지는 밀리타리스 동충하초 추출물 제조방법.
- 제2항에 있어서, 오가피 잎은 밀리타리스 동충하초 100 중량부에 대하여 40 ~ 60 중량부로 첨가하는 것을 특징으로 하는 인터루킨-10 및 인터루킨-12 생산 증진능을 가지는 밀리타리스 동충하초 추출물 제조방법.
- 제1항에 있어서, (S2) 단계에서의 물은 밀리타리스 동충하초 중량 대비 10 ~ 50배 중량을 첨가하는 것을 특징으로 하는 인터루킨-10 및 인터루킨-12 생산 증진능을 가지는 밀리타리스 동충하초 추출물 제조방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 인터루킨-10 및 인터루킨-12 생산 증진능을 가지는 밀리타리스 동충하초 추출물을 포함하는 건강보조식품.
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