KR20150011576A

KR20150011576A - 가시오가피 뿌리를 유효성분으로 함유한 면역증진용 약학적 조성물 및 기능성 식품 조성물

Info

Publication number: KR20150011576A
Application number: KR1020130086691A
Authority: KR
Inventors: 구교창
Original assignee: 제천한약영농조합법인
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2015-02-02

Abstract

본 발명은 면역증진용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 가시오가피 뿌리 또는 화학식 1의 엘레테로우사이드(Eleutheroside) B 또는 화학식 2의 엘레테로우사이드 E를 유효성분으로 함유한 면역증진용 약학적 조성물 및 상기 성분을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 건강식품 조성물에 관한 것이다. 가시오가피 뿌리 추출물, 엘레테로우사이드 B 및 E는 비장 세포의 증식율, 활성도, 사이토카인 분비능이 유의하게 증가하였고, 상기 추출물을 SD Rat에 4주간 강제 경구 투여 후 강제 수영 시간과 비장 및 흉선의 무게가 모두 유의하게 증가하였으며, 혈중 내 백혈구, 림프구, 호중구, 단핵백혈구의 개수가 모두 증가하였으며, 사이토카인 분비량이 유의하게 증가하였다.

Description

가시오가피 뿌리를 유효성분으로 함유한 면역증진용 약학적 조성물 및 기능성 식품 조성물 {A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR IMMUNITY IMPROVEMENT COMPRISING Acanthopanax sessiliflorus ROOT EXTRACTS as EFFECTIVE INGREDIENT and FUNTIONAL FOOD COMPOSITION}

본 발명은 면역증진용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 가시오가피 뿌리 또는 화학식 1의 엘레테로우사이드(Eleutheroside) B 또는 화학식 2의 엘레테로우사이드 E를 유효성분으로 함유한 면역증진용 약학적 조성물 및 상기 성분을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 건강식품 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 혈당강하, 체내 지질대사 개선, 항바이러스 활성, 심근경색치료 효과, 항산화체계 강화 기능에 효과가 있다.

최근 전반적인 소득 수준의 향상과 사회의 고령화 현상은 의료 체계나 질병의 치료 방식에 많은 변화를 일으키고 있다. 특히 당뇨, 고혈압, 퇴행성 뇌신경계 질환과 같은 만성 질환의 증가에 따라 질병의 치료보다는 예방 위주의 의료체계로 점진적으로 변화되어가고 있다. 이러한 변화와 더불어 합성의 약품보다는 생약이나 한약과 같이 오랜 임상 경험을 통해 그 효능이 알려지고, 비교적 안전하다고 여겨지고 있는 천연약물의 사용이 급속도로 증가하면 서 그에 대한 관심도 높아지고 있다.

최근 들어 세계 각국에서는 천연약물을 통한 신약개발을 중요한 연구테마로 삼고 있으며 천연약물 특허 신청건수가 날로 크게 증가하는 추세이다. 국제보건기구 (WHO)에 따르면 천연물의약품 시장은 600억 달러 이상의 가치를 가진다고 밝혔으며, 전 세계의 인구 중 80%가 1차적인 health care로 천연물의약품을 사용한다고 하였다. 실제로 현재 의약시장에서의 천연물의약품의 연간 판매액은 400억 US$에, 매년 평균 15% 이상의 성장률로 발전하고 있는 것으로 그 경제성과 성장가치는 급격하게 상승하고 있다. 통계 가능한 국내 천연물 시장의 살펴보면 천연물의약품은 약 4,000억원, 천연물공산품 5,000억원 등을 포함하여 건강과 관련된 천연물 소재 시장은 10조원을 상회할 것으로 추산되고 있다.

면역증강제의 개발 역사는 실질적으로 1900년대 초부터 세균의 세포막, 바이러스나 곰팡이의 추출물 또는 생성물 및 합성제제 등을 이용하여 숙주의 대식세포나 자연살해세포 (NK세포)들을 활성화시키는 등의 비특이적 면역반응을 유도하는 면역증강제가 연구 개발되면서 본격화되었으며, 이러한 면역증강제는 오늘날까지 만성적 감염 및 면역결핍증의 치료, 암의 면역요법 등에 널리 사용되고 있다. 특히 임상적으로 응용되고 있는 면역증강제는 주로 항암 면역요법으로 암세포에 대한 면역반응을 비특이적으로 증가시키는 데 목적을 두고 개발되었다. 제품화 되어 있는 면역증강제는 면역세포에 직접 작용하여 비특이적으로 면역반응을 증강시키는 면역강화제가 주를 이루고 있는데, 송아지 흉선에서 추출 및 정제한 비단백성 폴리펩타이드인 티모둘린 (thymodulin)과 식물 유래의 에키나신 (echinacin), 이소프리노신 (isoprinosin), 균체 용해물의 동결건조물, 상황균사체 성분 (polysaccharide Phellinus linteus), 표고버섯에서 추출한 다당체인 레티난 (lentinan) 등의 성분이 의약품 용도로 사용되고 있으며, 제형도 다양하여 정제, 캡슐, 액제, 팅크제, 연고, 분말, 스프레이 등 여러 가지 형태로 사용되고 있다. 또한 인삼, 가시오가피, 동충하초, 아가리쿠스, 다시마, 프로폴리스, 초유 등 많은 천연물 유래 면역증강물질들이 예방차원의 기능성식품 및 건강보조식품으로 사용되고 있다.

유용 식물자원으로 두릅나무과에 속하는 가시오가피는 낙엽성 활엽관목으로 그 생김새는 산삼을 닮았으며 한국의 지리산, 일본, 중국 등에 분포하고 주로 깊은 산지의 계곡에서 서식한다. 가시오가피 추출물은 한방에서 오랫동안 사용되어져 왔던 약재 중의 하나로 다양한 연구가 최근까지 계속해서 수행되어 오면서 약리학적 또는 생리학적으로 의미 있는 연구 결과들이 보고되어 졌다. 가시오가피 추출물의 주요 성분은 lignan (eleutheroside E)과 같은 화합물(acanthoside D)이 발견된 이래로 (-)-sesamine, phenolic glycoside, syringgaresinol diglucoside, B-sitosterol, isofraxidin, friedelin, syringin 등이 있고, 그 동안 이들 개별성분에 대한 기능분석이 주요 연구대상이 되어왔다.

가시오가피의 효능은 대단히 광범위하고, 독성이 거의 무시될 수 있을 정도이며, 계절에 따른 효능의 차이가 적다는 사실이 알려져 있다. 이와 같은 특징은 장기간 복용하는데 유리한 특성을 지니며, 재료식물의 채취시기 등이 까다롭지 않다는 장점을 나타내는 것으로 판단된다. 현재 보고된 약리 효과는 혈당강하, 체내 지질대사 개선, 항바이러스 활성, 심근경색치료 효과, 항산화체계 강화 기능 등 가시오가피에 대한 많은 임상적 연구가 이루어져왔지만 주로 나무의 근피나 줄기에서 추출된 것에 한정 되어 있다.

따라서 가시오가피 뿌리 추출물의 임상시험은 구전되고 있는(동의보감)의 기록을 과학적으로 구명함은 물론, 부작용이 전혀 없는 천연 식품소재로 면역 증진을 개선할 수 있다는 점에서 매우 중요하다.

이에, 본 발명자들은 가시오가피 뿌리 추출물의 효능을 확인하고자 제품 표준화, In-vitro 기전연구, In-vivo 효능연구를 통하여, 상기 추출물, 특히 엘레테로우사이드 B, 엘레테로우사이드 E 성분이 비장 세포의 증식율, 활성도, 사이토카인 분비능 등의 면역 증진의 In-vitro 효능과 SD Rat에 강제 수영 시간과 비장 및 흉선의 무게, 혈중 내 백혈구, 림프구, 호중구, 단핵백혈구의 개수의 증가, 사이토카인 분비량 증가 등의 In-vivo 효능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 가시오가피 뿌리 추출물, 또는 가시오가피 뿌리에서 추출된 엘레테로우사이드 B, 엘레테로우사이드 E 성분을 이용한 면역 증진용 약학적 조성물 및 상기 성분을 이용한 기능성 식품 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가시오가피 뿌리 추출물을 건조하여 분말화한 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 가시오가피 뿌리의 추출물로부터 분리된 하기 화학식 1의 엘레테로우사이드(Eleutheroside) B 또는 하기 화학식 2의 엘레테로우사이드 E를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

또한, 본 발명은 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 가시오가피 뿌리를 건조하여 분말화한 열수 추출물 또는 가시오가피 뿌리의 추출물로부터 분리된 상기 화학식 1의 엘레테로우사이드 B 또는 상기 화학식 2의 엘레테로우사이드 E를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 건강식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 가시오가피 뿌리 추출물을 건조하여 분말화한 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 면역 증진용 약학적 조성물에 있어서, 상기 추출물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 가시오가피 뿌리의 추출물로부터 분리된 하기 화학식 1의 Eleutheroside B 또는 하기 화학식 2의 Eleutheroside E를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

먼저, 본 발명자들은 먼저 제품 표준화를 위해 지표성분의 함량을 조사하였다. 구체적으로, 가시오가피 뿌리의 추출조적을 확립하기 위하여, 열수 및 주정에서 0, 30, 50, 70%별 엘레테로우사이드 B, E의 함량을 비교하고, 잔류농약 및 중금속을 분속하였다. 그리고 나서, In-vitro 기전을 연구하였다. 구체적으로, 가시오가피 뿌리 추출물의 면역증진 기전연구를 위하여, MTT Assay, 세포독성 T 림프구 기능 분석 등을 수행하였다. 최종적으로, In-vivo 효능을 연구하였다. 구체적으로, 가시오가피 뿌리 추출물의 실험동물에서의 효능을 평가하기 위하여, Rat와 mice를 이용한 면역증진 효능을 연구하였다.

본 발명에서 가시오가피 뿌리의 추출물로부터 분리된 화학식 1의 엘레테로우사이드(Eleutheroside) B 및 화학식 2의 엘레테로우사이드 E의 화학적 성질은 다음과 같다.

< Eleutheroside B >

화학식은 C₁₇H₂₀O₁₀이고, 분자량은 mol wt 385. 33이며, CAS Number는 [118 - 34 - 3]이고, 구조식은 상기 화학식 1과 같다.

< Eleutheroside E >

화학식은 C₃₄H₄₆O₁₈이고, 분자량은 mol wt 742. 71이며, CAS Number는 [39432 - 56 - 9]이고, 구조식은 상기 화학식 2와 같다.

본 발명의 가시오가피 뿌리 추출물은 각 약재를 물 또는 유기용매로 추출하여 얻을 수 있는데, 유기용매로는 저급알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 헥산 등을 예시할 수 있다. 저급알콜로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 예시할 수 있으며, 에탄올이 가장 바람직하다.

또는 가시오가피 뿌리 건조물 또는 분말에 1 내지 20배, 바람직하게는 2 내지 15배, 더욱 바람직하게는 10배의 물을 첨가하고 80 내지 150℃, 바람직하게는 100 내지 120℃의 온도에서 1 내지 24시간, 바람직하게는 3 내지 5시간, 더욱 바람직하게는 4시간 동안 추출한 후 여과하여 각 약재의 열수 추출물을 제조할 수 있으며, 이를 여과하여 얻어진 여액을 감압농축하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법들에서 추출공정은 필요에 따라 2회 이상 반복하여 실시할 수 있으며, 여과 후 얻어진 추출물을 동결 건조 또는 감압건조시켜 분말 형태로 만들 수도 있다.

본 발명의 가시오가피는 인삼과 함께 두릅나무과에 속하는 낙엽관목으로서 러시아, 중국, 한국의 고랭지에서 자생하는 약용식물이다. 가시오가피는 본초강목과 동의보감에서 그효능을 밝히고 있으며 특히 면역조절제 활성연구가 활발히 진행되고 있다.

본 발명은 가시오가피에 작용하는 면역활성에 관한 연구를 강제수영, 혈액학적 분석, 면역에 관련한 장기무게 등의 측정으로 가시오가피 뿌리 추출물의 효능을 연구하고자 하였다.

사이토카인은 신체의 방어체계를 제어하고 자극하는 신호물질로 사용되는 당단백질이며 펩타이드 중 하나로 면역, 감영병, 조혈기능, 조직회복등에 있어 중요한 역할을 한다. 특히 항원분자에 대해서 중성화 작용을 하고 그들에 대항하는 면역인자를 생성하는데 건강한 기능을 발휘하는 면역체계는 외부의 항원을 기억하고 있다가 다음에 동일한 항원이 침입할시 빠르게 반응을 할 수 있게 된다.

가장 중요한 면역기능은 Interleukin-1,2,6,12, Interferon gamma, Tumar necrosis factor, TNF로 알려진 사이토카인의 집단에 의해 수행되기 때문에 본 발명에서 사이토카인의 측정과 강제수영, 혈액학적분석, 비장세포의 세포증식, 활성 및 사이토카인 분비량 등으로 가시오가피뿌리추출물의 효능에 대해 연구하였다.

결론적으로 가시오가피 원료 물질과 열수 추출물에 대한 위해물질 분석결과, 두 경우 모두에서 잔류농약이 검출되지 않았으며, 중금속 분석결과 원물의 경우 납(Pb)이 1.61 ㎎/㎏, 수은(Hg)이 0.01 ㎎/㎏, 추출물에서는 카드뮴(Cd)이 0.03 ㎎/㎏, 납(Pb)이 0.40 ㎎/㎏ 검출되었으나 위해물질 기준 규격의 범위 이하에 있어 안정성을 검증하였다. 비장 세포의 증식율, 활성도, 사이토카인 분비능은 가시오가피 추출물에 의해 유의하게 증가하였다.

또한, 가시오가피 추출물을 4주간 강제 경구 투여 후 강제 수영 시간과 비장 및 흉선의 무게가 모두 유의하게 증가하였으며, 혈중 내 백혈구, 림프구, 호중구, 단핵백혈구의 개수가 모두 증가하였으며, 사이토카인 분비량이 유의하게 증가하였다. 따라서 가시오가피 추출물의 투여는 면역 증진에 도움을 줄 것으로 판단된다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 약리효과를 증진시키기 위해 약학적으로 허용가능한 다른 생약재 또는 그의 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 추출방법에 따라 생약재의 추출물을 제조한 후 약학 조성물에 가하거나 상기 가시오가피 뿌리의 약재와 생약재를 혼합한 후 상기 방법으로 추출하여 얻어진 추출물을 조성물에 포함시킬 수도 있다. 상기에서 '약학적으로 허용가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다.

경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다.

또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 면역 증진용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 '경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 유효 성분인 가시오가피 뿌리 추출물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 가시오가피 뿌리 추출물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 100 ㎍ 내지 5 ㎎, 가장 바람직하게는 500 ㎍ 내지 1 ㎎일 수 있다. 그러나, 상기 추출물의 용량은 약학적 조성물의 투여경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 추출물을 면역 증진용 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

또한, 본 발명은 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 가시오가피 뿌리를 건조하여 분말화한 열수 추출물 또는 가시오가피 뿌리의 추출물로부터 분리된 상기 화학식 1의 Eleutheroside B 또는 상기 화학식 2의 Eleutheroside E를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품 (functional food), 영양 보조제 (nutritional supplement), 건강식품 (health food) 및 식품 첨가제 (food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 가시오가피 뿌리 추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 가시오가피 뿌리 추출물과 면역 증진 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료 (알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품 (예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류 (예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품 (예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료 (예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 가시오가피 뿌리 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 가시오가피 뿌리 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

상기와 같이 구성되는 본 발명은 면역 증진용 약학적 조성물로서, 가시오가피 원료 물질과 열수 추출물에 대한 위해물질 분석결과, 두 경우 모두에서 잔류농약이 검출되지 않았으며, 중금속 분석결과 원물의 경우 납(Pb)이 1.61 ㎎/㎏, 수은(Hg)이 0.01 ㎎/㎏, 추출물에서는 카드뮴(Cd)이 0.03 ㎎/㎏, 납(Pb)이 0.40 ㎎/㎏ 검출되었으나 위해물질 기준 규격의 범위 이하에 있어 안정성을 검증하였다. 또한, 비장 세포의 증식율, 활성도, 사이토카인 분비능은 가시오가피 추출물에 의해 유의하게 증가하였다. 또한, 가시오가피 추출물을 SD Rat에 4주간 강제 경구 투여 후 강제 수영 시간과 비장 및 흉선의 무게가 모두 유의하게 증가하였으며, 혈중 내 백혈구, 림프구, 호중구, 단핵백혈구의 개수가 모두 증가하였으며, 사이토카인 분비량이 유의하게 증가하였다.

도 1은 본 발명의 가시오가피 열수 추출 공정을 간략히 나타낸 것이다.
도 2는 Eleutheroside B의 성분 표준 곡선 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 Eleutheroside E의 성분 표준 곡선 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 Eleutheroside B 0%의 크로마토그램(Chromatogram)이다.
도 5는 Eleutheroside B 30%의 크로마토그램(Chromatogram)이다.
도 6은 Eleutheroside B 50%의 크로마토그램(Chromatogram)이다.
도 7은 Eleutheroside B 70%의 크로마토그램(Chromatogram)이다.
도 8은 Eleutheroside E 0%의 크로마토그램(Chromatogram)이다.
도 9는 Eleutheroside E 30%의 크로마토그램(Chromatogram)이다.
도 10은 Eleutheroside E 50%의 크로마토그램(Chromatogram)이다.
도 11은 Eleutheroside E 70%의 크로마토그램(Chromatogram)이다.
도 12는 가시오가피 원물에 대한 한국식품연구원의 중금속검사 시험성적서이다.
도 13은 가시오가피 추출물에 대한 한국식품연구원의 중금속검사 시험성적서이다.
도 14는 가시오가피 원물의 잔류농약에 대한 전북대학교 환경자원인증센터의 시험성적서이다.
도 15는 가시오가피 추출물의 잔류농약에 대한 전북대학교 환경자원인증센터의 시험성적서이다.
도 16은 rat의 비장세포 증식율(A)과 활성도(B)에 대한 가시오가피 추출물(ASE)의 효과를 나타낸 그래프이다. 여기서 양성 대조군은 LPS, 다른 윗첨자를 갖는 열의 ConA.^a,b,c,d,e,f수치는 P<0.05의 유의차를 나타낸다. 상기 데이터는 평균 ± 표준편차 (n=3)으로 나타낸다.
도 17은 rat의 비장세포 TNF (A), IFN (B) 및 IL (C) 농도에 대한 가시오가피 추출물(ASE)의 효과를 나타낸 그래프이다. 여기서 다른 윗첨자를 갖는 열의 ^a,b,c,d,e수치는 P<0.05의 유의차를 나타낸다. 상기 데이터는 평균 ± 표준편차 (n=3)으로 나타낸다.
도 18은 rat의 체중, 식이 및 음수 섭취량 변화에 있어서, 가시오가피 추출물(ASE)의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 rat의 강제수영 테스트에 대한 가시오가피 추출물(ASE)의 효과를 나타낸 그래프이다. 여기서 다른 윗첨자를 갖는 열의 ^a,b수치는 P<0.05의 유의차를 나타낸다. 상기 데이터는 평균 ± 표준편차 (n=7)으로 나타낸다.
도 20은 rat의 비장 (A) 및 흉선 (B)의 절대적 장기 무게, IFN 비장 (C) 및 흉선 (D)의 체중에 대한 상대적 장기 무게에 대한 가시오가피 추출물(ASE)의 효과를 나타낸 그래프이다. 여기서 다른 윗첨자를 갖는 열의 ^a,b,c수치는 P<0.05의 유의차를 나타낸다. 상기 데이터는 평균 ± 표준편차 (n=7)으로 나타낸다.
도 21은 rat의 전체 혈액내 WBC (A), 림프구 (B), 호중구 (C) 및 단핵구 (D)에 대한 가시오가피 추출물(ASE)의 효과를 나타낸 그래프이다. 여기서 다른 윗첨자를 갖는 열의 ^a,b,c,d수치는 P<0.05의 유의차를 나타낸다. 상기 데이터는 평균 ± 표준편차 (n=7)으로 나타낸다.
도 22는 rat의 혈청내 TNF (A), IFN (B) 및 IL (C)에 대한 가시오가피 추출물(ASE)의 효과를 나타낸 그래프이다. 여기서 다른 윗첨자를 갖는 열의 ^a,b수치는 P<0.05의 유의차를 나타낸다. 상기 데이터는 평균 ± 표준편차 (n=7)으로 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 추출 공정(제조방법) 및 그에 관한 자료

식품의약품안전청고시 제2009-176호(2009.12.22)"건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정"제13조(제출자료의 내용 및 요건) 제4항 제조방법 및 그에 관한 자료중 '제조방법을 구체적으로 기재하며 특히, 제조공정에서 사용된 용매, 효소, 미생물 등 안전성·기능성 평가와 관련된 모든 사항에 관하여 상세히 기재한다'에 따라 제출 자료를 작성하였다.

구체적으로, 본 실험에서 사용한 가시오가피 뿌리는 2012년 1월~2월에 제천지역의 가시오가피를 채취하여 추출하였다. 추출과정은 130 ℓ 물에 6.5 ㎏의 용량으로 100℃에서 4시간 추출 후 100℃에서 농축하였으며 동결건조하여 냉장보관하였다. 그리고, 실험에는 각각 30, 100, 300 ㎎/㎏/일 투여하였다.

<실시예 2> 원료의 특성에 관한 자료

식약청고시 제 2009-176호 건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정 제 13조 (제출 자료의 내용 및 요건) 제5호 원료의 특성에 관한 자료 중 가"당해 원료를 특징 지울 수 있는 성상, 물성 등을 제출한다"와 나"당해 원료의 표준화를 확인하기 위한 기능성분(또는 지표성분)에 관한 자료 및 기능성분(또는 지표성분)에 관한 근거자료"에 따라 제출자료를 작성한다.

그 결과, 가시오가피 뿌리를 건조하여 분말화하여 열수 추출한 가시오가피 뿌리 분말은 고유한 향미를 지닌 흑갈색의 분말의 성상을 갖는다.

<실시예 3> 기능성분(또는 지표성분)에 대한 규격 및 시험방법에 관한 자료

<3-1> 기능성분의 특징

기능성분은 Eleutheroside B, Eleutheroside E를 설정하였다. 상기 기능성분의 함량은 하기 표 1과 같다.

기능성분	추출조건	(㎍/100 ㎍)
Eleutheroside B	0%	3.5±0.03
	30%	13.2±0.05
	50%	11.5±0.14
	70%	8.5±0.07
Eleutheroside E	0%	0.8±0.46
	30%	11.2±0.08
	50%	7.3±0.04
	70%	6.2±0.19

<3-2> 기능성분의 시험방법

시약 및 기구로 지표물질인 Eleutheroside B, E는 99% 순도의 fluka사의 analytical standard를 사용하였으며, Methanol, Acetonitrile, 증류수는 HPLC grade를 분석에 사용하였다. 표준물질을 제조하기 위하여, Eleutheroside B와 E는 각각 0.5 ㎎/㎖를 메탄올:증류수를 6:4 비율로 섞은 용액에 녹여서 사용하였다.

<3-3> 분석장비

분석장비로는 Agilent 1260 series의 HPLC를 이용하였다. 구체적으로, LC 조건(Agilent 1260 series)은 하기 표 2와 같다. 또한, Gradient Table은 표 3에, MS method는 표 4에 기재하였다.

Column	Eclipse pluse C18 5 ㎛ 4.6 X 250 ㎜
Column temperature	40℃
Flow rate	0.8 ㎖/min, no split
Mobile phase A	0.2% Acetic acid, DW
Mobile phase B	0.2% Acetic acid, ACN
Injection volume	10 ㎕

Time(min)	Flow Rate	%A	%B
0	0.8	10	90
2	0.8	10	90
20	0.8	30	70
25	0.8	30	70
27	0.8	10	90
45	0.8	10	90

Parameter	Positive ion mode
SPS value	500
Resolution mode	Ultra scan
Nebuliser pressure (infusion/LC flow)	40 psi
Dry gas flow rate (infusion/LC flow)	9 L/min
Dry gas temperature	365 oC
ICC target, max accu. time	200 000, 50 ms
Scan Range	50 - 800 m/z
Averages, rolling averages	5, 2

Reagents로는 <Water, HPLC grade or Nanopure>, <Methanol, HPLC grade>, <Acetonitrile, HPLC grade>를 사용하였다.

Chromatographic conditions은 <Column: Eclipse pluse C18, 5㎛, 4.6 x 250 ㎜, <Column Temperature: 40℃>, <Flow Rate: 0.8 ㎖/minute>, <Detector: 215 nm>, <Injection Volume: 10 ㎕>를 사용하였다.

<3-4> 기능성분의 calibration

먼저, Eleutheroside B의 표준곡선은 하기 표 5와 같다.(도 2)

	RT [min]	Int. Type	Area	Range [min]
170	10.7	Manual	4936	10.5 - 10.9
85	10.8	Manual	2540	10.7 - 11.0
42.5	10.9	Manual	1357	10.7 - 11.0
21.625	10.9	Manual	760	10.7 - 11.0
10.625	10.9	Manual	337	10.7 - 11.0
5.3125	10.9	Manual	168	10.7 - 11.0

또한, Eleutheroside E의 표준곡선은 하기 표 6과 같다.(도 3)

	RT [min]	Int. Type	Area	Range [min]
125	15.7	Manual	4936	15.6 - 15.9
125	15.7	Manual	2540	15.6 - 15.9
62.5	15.7	Manual	1357	15.6 - 15.9
31.25	15.7	Manual	760	15.6 - 15.9
15.625	15.7	Manual	337	15.6 - 15.9
7.8125	15.7	Manual	168	15.6 - 15.9

<실시예 4> 지표성분의 시험방법 검증(Metohd Validation)

건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정(식품의약품안정청 고시 제 2009-176호) 제 13조 (제출 자료의 내용 및 요건) 제 6호 기능성분(또는 지표성분)에 관한 자료 중 "나, 기능성분(또는 지표성분)의 시험방법은 기능성분(또는 지표성분)의 규격을 분석하는데 적합하여야 하며, 「건강기능식품의 기준 및 규격」, 「식품의 기준 및 규격」(식품의약품안전청 고시),「식품첨가물의 기준 및 규격」(식품의약품안전청 고시), 국제식품규격위원회 (Codex Alimentarius Commission, CAC) 규정, AOAC 방법 등에 따라 국내 · 외에서 공인된 방법을 사용하여야 한다. 다만, 공인된 방법이 없거나 더 타당하다고 인정되는 경우 신청자가 제시하는 시험방법을 사용할 수 있다. 이 경우 시험방법의 타당성을 밝히고자 표 7을 참고하여 제시하였다.

가시오가피 뿌리 추출물의 정량법은 건강기능식품공전에서 인정하는 공정서에 수재되어 있지 않으므로 상기의 규정에 따라 시험법의 검증(Valication)이 필요로 하며 별표 1의 자료인 특이성(Specificity), 정확성(Accuracy), 정밀성(Precision), 정량한계(Quantitation Limit), 직선성(Linearity) 및 범위(Range) 항목에 대한 실험을 실시하였다.

시험방법 타당성 (벨리데이션) 검토 항목의 정의 및 적용(제13조제6호나목 및 제7호나목 관련)

항목	정의	적용
		기능성분		유해물질 (정량)
		정량시험	확인시험	유해물질 (정량)
특이성 (Specificity)	불순물, 분해물, 배합성분 등의 혼재상태에서 분석대상물질을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력	예	예	예
정확성 (Accuracy)	측정값이 이미 알고 있는 참값이나 표준값에 근접한 정도	예	아니오	예
정밀성 (Precision)	균일한 검체로부터 여러 번 채취하여 얻은 시료를 정해진 조건에 따라 측정하였을 때 각각의 측정값들 사이의 근접성(분산정도)	예	아니오	예
정량한계 (Quantitation Limit)	적절한 정밀성과 정확성을 가진 정량값으로 표현할 수 있는 검체 중 분석대상물질의 최소량	아니오	아니오	예
직선성 (Linearity)	실험방법이 일정 범위에 있는 검체 중 분석대상물질의 양(또는 농도)에 대하여 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력	예	아니오	예
범위 (Range)	적절한 정밀성, 정확성 및 직선성을 충분히 제시할 수 있는 검체 중 분석대상물질의 양(또는 농도)의 하한값 및 상한값 사이의 영역	예	아니오	아니오

<4-1> Eleutheroside B의 기능성분 함량

Eleutheroside B의 측정된 질량농도는 하기 표 8과 같다. (도 4 내지 도 7)

#	RT [min]	Int. Type	Area	Range [min]	Measured mass concentration(㎍/㎖)	환산농도(㎍/㎎)
0%	11.5	Manual	1966	11.4 - 11.6	68.5	3.52
0%	11.5	Manual	1941	11.4 - 11.7	67.6	3.47
0%	11.5	Manual	1964	11.4 - 11.7	68.4	3.51

30%	11.4	Manual	3005	11.3 - 11.6	104.7	13.19
30%	11.5	Manual	3001	11.3 - 11.6	104.5	13.16
30%	11.5	Manual	3021	11.4 - 11.7	105.2	13.25

50%	11.5	Manual	1194	11.2 - 11.7	41.6	11.62
50%	11.5	Manual	1187.00	11.2 - 11.7	41.3	11.54
50%	11.5	Manual	1166	11.3 - 11.7	40.6	11.34

70%	11.5	Manual	3272	11.3 - 11.7	114.0	8.55
70%	11.5	Manual	3224	11.3 - 11.7	112.3	8.42
70%	11.5	Manual	3268	11.3 - 11.6	113.8	8.53

<4-2> Eleutheroside E의 기능성분 함량

Eleutheroside E의 측정된 질량농도는 하기 표 9와 같다.(도 8 내지 도 11)

#	RT [min]	Int. Type	Area	Range [min]	Measured mass concentration(㎍/㎖)	환산농도(㎍/㎎)
0%	15.8	Manual	1	15.7 - 15.8	0.0	0.00
0%	15.8	Manual	1	15.7 - 15.8	0.0	0.00
0%	15.9	Manual	2	15.8 - 16.0	0.1	0.8

30%	15.7	Manual	1697	15.6 - 15.8	68.0	11.14
30%	15.7	Manual	1703	15.6 - 15.9	68.2	11.17
30%	15.8	Manual	1720	15.7 - 15.9	68.9	11.29

50%	15.7	Manual	463	15.6 - 15.8	18.6	7.30
50%	15.7	Manual	461	15.6 - 15.9	18.5	7.26
50%	15.8	Manual	466	15.7 - 15.9	18.7	7.34

70%	15.8	Manual	1168	15.6 - 15.9	46.8	5.98
70%	15.8	Manual	1223	15.6 - 15.9	49.0	6.26
70%	15.8	Manual	1241	15.6 - 15.9	49.7	6.35

<실시예 5> 유해물질에 대한 규격 및 시험방법에 관한 자료

식약청고시 제 2009-176호 건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정 제 13조 (제출 자료의 내용 및 요건) 제7호 유해물질에 대한 규격 및 시험방법에 관한 자료 중 가"유해물질의 규격은 원재료 또는 제조과정으로 인한 유해물질의 오염 또는 잔류 가능성을 막고 안전성을 확보할 수 있도록 설정한다"에 따라 작성하였다. 본 발명에서는 하기 표 10에 따라 설정하였다.

유해물질규격설정항목(제13조제7호가목 관련)

원료	항목		규격	비고
모든 원료	중금속	납	< 10.8/일
		총비소	< 150/일
		카드뮴	< 3.0/일
		총수은	< 2.1/일
	미생물	대장균군	음성
		세균수	100/g (액상제품에 한함)
용매를 사용한 원료	잔류용매	헥산	< 0.005g/kg
		이소프로필알콜	0.05g/kg
		초산에틸
		메틸알콜
		아세톤	0.03g/kg
원재료에 대한 해당 규격이식품의 기준 및 규격에 설정되어 있는 원료	동물용 의약품	항생물질	식품의 기준 및 규격의 원재료의 잔류허용기준에 따름
		합성항균제
		구충제
		합성홀몬제
	곰팡이 독소	총아플라톡신 (B₁, B₂, G₁ 및 G₂의 합)
		파툴린
		오크라톡신
		기타곰팡이독소
	방사능 오염	¹³¹I	300Bq/Kg,
		¹³⁴Cs+¹³⁷Cs	370 Bq/Kg,

<5-1> 가시오가피 뿌리의 원물 및 추출물에 대한 중금속 및 잔류농약 검사

가시오가피 뿌리 원물과 추출물에 대하여 중금속 검사 및 잔류농약 검사는 전문 검사기관인 한국식품연구원과 전북대학교 환경자원분석인증센터에 의뢰하여 진행하였다.(도 12 내지 도 15)

가시오가피 원료 물질과 열수 추출물에 대한 위해물질 분석결과, 하기 표 11에 기재한 바와 같이, 두 경우 모두에서 잔류농약이 검출되지 않았으며, 중금속 분석결과 원물의 경우 납(Pb)이 1.61 ㎎/㎏, 수은(Hg)이 0.01 ㎎/㎏, 추출물에서는 카드뮴(Cd)이 0.03 ㎎/㎏, 납(Pb)이 0.40 ㎎/㎏ 검출되었으나 위해물질 기준 규격의 범위 이하에 있어 안정성을 검증하였다.

시험 항목	규격 g/day	가시오가피 (원물) ㎍/g	시험기관	가시오가피 (추출물) ㎍/g	시험기관	비고
카드뮴(Cd)	3.0	불검출 (0.0012 이하)	한국식품연구원	0.03	전북대학교 환경자원분석인증센터	통과
납(Pb)	10.8	1.61	한국식품연구원	0.40	전북대학교 환경자원분석인증센터	통과
비소(As)	150	불검출 (0.021 이하)	한국식품연구원	불검출 (0.002 이하)	전북대학교 환경자원분석인증센터	통과
수은(Hg)	2.1	0.01	한국식품연구원	불검출 (0.002 이하)	전북대학교 환경자원분석인증센터	통과
잔류 농약 (182종)	-	불검출	전북대학교 환경자원분석인증센터	불검출	전북대학교 환경자원분석인증센터	통과

아울러, 잔류농약 182종 검사 함목은 하기 표 12와 같다.

시험성분
나프로파마이드	메트코나졸	에톡사졸	클로치아니딘	페나미돈	프로페노포스
누아리몰	메파니피림	에트림포스	터부코나졸	페나자퀸	프탈리드
다이아지논	메페나셋	엔도설판	터부티라진	페노부카브	플루디옥쏘닐
데치오펜카브	메프로닐	오푸레이스	터브포스	페노치오카브	플루미옥사진
델타메쓰린	몰리네이트	옥사디아존	테부페노자이드	페녹사닐	플루실라졸
디니코나졸	보스칼리드	옥사밀	테부펜피라드	페니트로치온	플루아크리피림
디메쏘모르프	부타클로르	이미다크로프리드	테부피림포스	페림존	플루퀸코나졸
디메텐아미드	부프로페진	이미벤코나졸	테트라디폰	펜디메타린	플루토라닐
디메토에이트	브로모부타이드	이소프로치오란	테트라코나졸	펜발러레이트	플루페녹수론
디메틸빈포스	비터타놀	이소프로카브	테플루벤주론	펜부코나졸	피라조포스
디메피페레이트	비펜스린	이프로디온	테플루스린	펜시쿠론	피라크로스트로빈
디설포톤	빈클로졸린	이프로발리카브	톨리풀루아니드	펜치온	피라크로포스
디에토펜카브	사이목사닐	이프로벤포스	톨클로포스메틸	펜코나졸	피로쿠론
디치오피르	사이아조파미드	이피엔	트라로메스린	펜토에이트	피리다릴
디코폴	사이퍼메쓰린	인다노판	트리싸이클라졸	펜톡사존	피리다벤
디크로프루아니드	사이프로디닐	인도사카브	트리아디메폰	펜프로파스린	피리미노박메틸
디클로보스	사이프로코나졸	족사마이드	트리아조포스	펜피록시메이트	피리미디펜
디페노코나졸	사이플루쓰린	카두사포스	트리풀루라린	포레이트	피리미카브
디펜아마이드	사이할로쓰린	카바릴	트리프록시시트로빈	포사론	피리미타닐
디플루벤주론	사이할로포프부틸	카벤다짐	트리플루무론	포스치아제이트	피리미포스메틸
루페누론	시메코나졸	카보퓨란	트리플루미졸	포스파미돈	피리벤족심
마이클로부타닐	아닐로포스	캡탄	티아메톡삼	포클로르페누론	피리부티카브
말라치온	아세타미프리드	퀴노클라마인	티아조피르	폴펫	피리프록시펜
메치다치온	아족시스트로빈	크레속심메틸	티아클로프리드	푸라치오카브	피브로닐
메치오카브	아진포스메틸	크로마페노자이드	티오디카브	푸르시트리네이트	피페로포스
메타락실	아크리네쓰린	클로로타로닐	티플루자마이드	프로베나졸	할펜프록스
메타미포프	알디카브	클로르페나피르	파라치온	프로시미돈	헥사코나졸
메타벤티아주론	알라클로르	클로르플루아주론	파클로부트라졸	프로치오포스	에토프로포스
메토밀	에디펜포스	클로르피리포스메틸	퍼메쓰린	프로클로라즈
메트코나졸	에스프로카브	클로르피리포스	페나리몰	프로파닐
비에치시	엔드린	디엘드린	디디티	알드린

<5-2> 안전성에 관한 자료

식품의약품안전청(KFDA)- 현재 우리나라 식품위생법상 가시오가피는 한약재로써 식품으로 분류되어 식품으로 이용함에 문제가 없을 것으로 판단된다.

<실시예 6> 시험관 시험 및 동물시험

본 실험에서는 가시오가피 추출물의 면역 증강에 대한 효과를 규명하고자 비장세포의 증식율, 활성도, 사이토카인의 분비능을 시험관 시험을 통하여 관찰하였으며, 동물실험에서는 4주간 강제경구투여 후 강제수영, 비장 및 흉선의 무게 혈액분석, 사이토카인 분비량을 측정하였다.

그 결과, 비장 세포의 증식율, 활성도, 사이토카인 분비능은 가시오가피 추출물에 의해 유의하게 증가하였다. (도 16 및 도 17)

가시오가피 추출물을 SD Rat에 4주간 강제 경구 투여 후 강제 수영 시간과 비장 및 흉선의 무게가 모두 유의하게 증가하였으며, 혈중 내 백혈구, 림프구, 호중구, 단핵백혈구의 개수가 모두 증가하였으며, 사이토카인 분비량이 유의 하게 증가 하였다.(도 19, 도 21 및 도 22)

<6-1> 시험물질의 조제 및 방법, 안정성 및 균질성

시험물질은 검은색 분말의 가시오가피 뿌리를 사용하였다.

가시오가피 뿌리 추출물의 조제는 각각 30 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏, 300 ㎎/㎏의 농도로 D.W에 희석하여 사용하였으며 투여용량에 따라 실험당일 조제하였고 시료는 냉장보관하였다. 또한, 의뢰기관과의 협의하에 제공된 시료에 대한 안전성 균일성 등에 대한 검사를 실시하였으며 상기에 표시하였다.

<6-2> 시험관 시험

<6-2-1> 시험 세포주

한국세포주은행(서울, 한국)에서 분양받은 림프종 세포인 YAC-1 cell을 사용 하였다. YAC-1 세포는 10 % Fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin-streptomycin이 포함된 RPMI-1640(Gibco, Germany)을 이용하여 배양하였으며, 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다.

<6-2-2> 면역세포 분리 및 증식률 측정(도 16)

SD Rat 비장세포를 분리하기 위하여 비장을 적출, 핀셋이나 메쉬를 이용하여 단일세포 부유액을 만들었다. 단일세포 부유액을 RPMI-1640 배양액으로 3회 원심 침전하여 세척한 다음, Red blood cell lysing buffer (Sigma, USA)를 3분간 처리하여 적혈구를 제거 후 실험에 사용하였다.

가시오가피 추출물이 면역세포 증식률에 미치는 효과를 알아보기 위하여 WST-1 assay를 이용하였다. 비장세포를 2 x 10⁵cells/well 농도가 되게 희석한 후 96 well plate에 well 당 90 ㎕씩 넣고 가시오가피 추출물 1, 10, 100, 250, 500 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하여 세포 증식률을 평가하였다. 세포 배양액 100 ㎕에 WST-1 용액을 10 ㎕씩 첨가하여 1시간 동안 배양하여 Fluorescence Multi Detection Reader(Infinite 200, TECAN Group Ltd, Mㅴnnedorf, Switzerland)를 이용하여 405 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 대조군은 시료를 처리하지 않은 배양액으로 설정한 후 흡광도를 측정하였다. 세포의 증식율은 다음의 식에 따라 계산하였다.

세포 증식율 (%)=(시험군 흡광도 - 대조군 흡광도)/대조군 흡광도 x 100

이때, 모든 군의 흡광도는 blank 흡광도를 빼주었다.

<6-2-3> NK cell 활성 측정(도 16)

NK 활성도에 대한 세포독성 측정은 위의 실험방법에 의해 준비한 비장세포를 작동세포(effect cell)로 사용하고, 표적세포(taget cell)는 YAC-1 세포를 사용한다. 96 well plate에 작동세포 1x10⁵cell/well의 cell을 80 ㎕씩 넣고 가시오가피 추출물 1, 10, 100, 250, 500 ㎍/㎖의 농도를 1시간 동안 전처리 하였다. 이후 표적세포인 YAC-1 세포는 1x10⁴ (Targetcell : Effectcell=1:10)를 첨가한 후, 48시간 동안 배양하여 림프구종에 대한 비장세포의 세포독성 활성을 평가하였다.

비장 세포 활성도 (%) = (Yac-1 흡광도-(실험군 흡광도-비장세포 흡광도))/Yac-1 흡광도 X 100

모든 군의 흡광도는 blank 흡광도를 빼주었다.

<6-2-3> 사이토카인 측정 (도 17)

사이토카인의 측정은 분리된 비장세포를 24 well plate에 1x10⁶cells/well에 500 ul씩 분주하여 양성대조군은 Concanavalin A (Con A Sigma, CA, USA,) 2.5 ㎍/㎖와 Lipopolysaccharide(LPS, Sigma, CA, USA) 10 ㎍/㎖를 각각 비장세포에 첨가하고, 실험군은 가시오가피 추출물은 1, 10, 100, 250, 500 ㎍/㎖ 농도별로 비장세포에 첨가하여 37℃, 5% CO₂에서 24시간 배양하였다. 배양 상층액을 분리하여 interleukin(IL)-2, interferon(IFN)-γ, tumor necrosis factor(TNF)-α의 분비량을 ELISA cytokine kit를 이용하여 측정하였다.

<6-3> 동물 시험

<6-3-1> 실험동물

실험동물은 샘타코 바이오코리아(오산, 한국)에서 SD rat male 7주령 50마리를 분양받았으며 일주일 순화기간을 거쳐 체중을 측정후 Z열 방식으로 그룹을 배정하였다. 본 실험은 원광대학교의 동물실험윤리규정을 준수하여 수행하였다(WKU12-47).

<6-3-2> 강제수영(도 19)

강제수영 시험은 수조관(직경: 150 ㎝, 높이: 80 ㎝)에 체중의 10% 중량의 추를 꼬리상단부분에 달고 정상군을 제외한 모든 군에 실시하였으며 수영을 시작할 시부터 수영을 하지 않는 부동자세가 10초 이상이 될 때까지의 시간을 측정하여 기록하였다.

<6-3-3> 부검(도 20 내지 도 22)

부검은 강제수영 종료 직후 Ether로 흡입마취하여 복대정맥에서 채혈하여 1㎖의 혈액은 항응제를 혼합하여 WBC, lymphocyte, neutrophil, monocyte을 동물전용 자동 혈구 분석기(Fully Automatic Hematology Analyzer for Multispecies, Hemavet 950 FS, Drew Scientific Inc, TX, USA)을 이용하여 분석하였으며, 혈액의 일부를 채취하여 Serum과 혈액을 따로 분리하여 분석하기 전까지 냉동보관하여 사이토카인을 ELISA kit을 이용하여 분석하였다. 흉선, 비장, 간, 신장을 적출하여 Filter paper에 수분을 충분히 제거한 후 무게를 측정하였다.

<6-3-4> 통계처리

모든 실험결과는 통계 프로그램(SPSS ver.12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균 ± 표준오차(Mean ± S.E.)로 계산하였다. 각 군 간의 통계적 유의성 검정에 따른 통계분석은 ANOVA(one-way analysis of variance test)를 실시한 후 유의성이 있는 경우, p value가 0.05 미만일 때 Ducan's multiple range test로 사후 검정하였다.

<6-4> 시험관시험 결과

<6-4-1> 비장세포 증식율과 활성도(도 16)

비장 세포의 증식율은 가시오가피 추출물을 처리하지 않은 대조군(Control)에 비하여 1 ㎍을 처리한 군은 차이가 없었으나, 100 ㎍ ~ 500 ㎍을 처리한 군에서는 농도 의존적으로 증가하였다. 500 ㎍를 처리한 군에서는 양성대조군의 LPS 처리군에 비하여 증가하였으며, ConA를 처리한 군에서 가장 높은 증가율을 관찰하였다. 또한 비장세포가 암세포에 대한 세포독성의 활성은 가시오가피 추출물을 처리하지 않은 대조군(Control)에 비하여 1 ㎍을 처리한 군은 차이가 없었으나, 10~500 ㎍을 처리한 군에서는 농도의 의존적으로 증가하였다.

<6-4-2> 비장세포 사이토카인 분비량(도 17)

비장 세포의 TNF 분비량은 가시오가피 추출물을 처리하지 않은 대조군(Control)에 비하여 1 ㎍, 10 ㎍을 처리한 군은 차이가 없었으나, 100 ㎍, 250 ㎍을 처리한 군에서 증가하였다. 그러나 IFN과 IL의 분비량은 가시오가피 추출물을 처리하지 않은 대조군(Control)에 비하여 차이는 없었으나, IFN과 IL의 분비량 모두에서 가시오가피 추출물 100 ㎍, 250 ㎍를 처리한 군에서 증가하는 경향은 관찰할 수 있었다.

<6-5> 동물시험 결과

<6-5-1> 중량, 식이 및 음수 섭취량 변화(도 18)

실험동물의 체중, 먹이 및 음수 섭취량은 실험기간 동안의 유의적인 변화는 없었다.

<6-5-2> 강제 수영(도 19)

가시오가피 추출물을 4주간 강제 경구 투여 후 강제 수영 시간을 측정하였다. 가시오가피 추출물을 투여하지 않은 대조군(control)에 비하여 30 ㎎/㎏을 투여한 군의 강제 수영시간은 통계학적 유의성이 없었으나, 100 ㎎/㎏와 300 ㎎/㎏을 투여군의 강제 수영시간은 유의하게 증가하였다.

<6-5-3> 장기 무게(도 20)

rat의 간 및 콩팥의 무게에 있어서, 가시오가피 추출물(ASE)의 효과는 하기 표 13과 같다.

	Liver weight (g)	kidney weight (g)
	Liver weight (g)	Left	Right
Normal	10.84 ± 0.23	1.35 ±0.02	1.35 ±0.03
Control	10.78 ± 0.20	1.37 ±0.03	1.35 ±0.03
ASE30	10.75 ± 0.26	1.37 ±0.03	1.37 ±0.03
ASE100	10.71 ± 0.24	1.39 ±0.03	1.37 ±0.02
ASE300	10.52 ± 0.08	1.34 ±0.02	1.33 ±0.02

그 결과, 가시오가피 추출물을 4주간 강제 경구 투여 후 비장의 무게는(도 20의 A) 가시오가피 추출물을 투여하지 않은 대조군(control)이 정상군에 비하여 유의하게 감소하였다. 또한 대조군에 비하여 가시오가피 추출물 100 ㎎/㎏와 300 ㎎/㎏를 투여한 군에서 유의하게 증가하였으며, 체중을 고려한 비장의 중량(도 20의 C) 역시 유사한 결과를 관찰하였다.

또한 흉선의 무게는 가시오가피 추출물을 투여하지 않은 대조군(control)이 정상군에 비하여 유의하게 감소하였으며(도 20의 B), 대조군에 비하여 가시오가피 추출물 300 ㎎/㎏를 투여한 군에서 유의하게 증가하였으며, 체중을 고려한 비장의 중량(도 20의 D) 역시 유사한 결과를 관찰하였다. 간장과 신장의 무게는 모든 군에서 유의적인 변화는 없었다(표 13).

<6-5-4> 혈액학적 분석(도 21)

가시오가피 추출물을 4주간 강제 경구 투여 후 혈중 내 백혈구(white blood cell) 개수의 변화는 가시오가피 추출물을 투여하지 않은 대조군(control)에 비하여 30 ㎎/㎏ ~ 300 ㎎/㎏를 처리한 군에 유의하게 증가하였다. 또한 림프구(lymphocyte) 개수의 변화 역시 대조군에 비하여 30 ㎎/㎏~300 ㎎/㎏를 처리한 군에 유의하게 증가하였다. 이와 비슷한 결과로 호중구(neutrohoil)의 개수 변화 또한 대조군에 비하여 모든 실험군에서 증가하였다. 단핵백혈구(monocyte)의 개수는 대조군에 비하여 100 ㎎/㎏, 300 ㎎/㎏를 처리한 군에서 유의적인 증가를 하였다.(도 21)

<6-5-5> 사이토카인 분비(도 22)

가시오가피 추출물을 4주간 강제 경구 투여 후 혈청 내 사이토카인 (TNF, IFN, IL) 함량의 변화는 가시오가피 추출물을 투여하지 않은 대조군(control)에 비하여 가시오가피 추출물 300 ㎎/㎏를 투여한 군에서 유의하게 증가하였다.

가시오가피에는 가시오가피 배당체인 아칸토사이드(Acanthoside)와 면역성을 높여 주는 수용성 다당체가 있다. 특히 뿌리에는 가시오가피 배당체 뿐만 아니라 지링긴(Sylrgin), 쿠마린 배당체 등이 있다. 이들 성분들은 생체의 기능에 대해 활성을 부여하고 자기면역적인 질환에 대해서도 효과가 있다고 알려져 있으며 가시오가피 배당체는 RNA의 합성을 촉진하여 골수조혈과도 유효적인 효과가 있으며 오가키의 수용성 다당류는 탐식세포의 수를 증가시켜 백혈구를 증가시킨다.

<기타 제조예 1> 가시오가피 뿌리 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 치료제의 제조

본 발명자들은 상기 실시예를 통해 가시오가피 뿌리 열수 추출물의 면역 증진 효능이 뛰어남을 확인하여 가시오가피 뿌리 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 치료제를 하기와 같이 제조하였다. 또한, 하기 치료제의 제조예는 치료제 뿐만 아니라 건강식품의 제조에도 응용하여 사용될 수 있다.

<1-1> 가시오가피 뿌리 열수 추출물을 함유하는 연질캅셀(soft gelatin capsules)

가시오가피 뿌리 열수 추출물 20%

비타민 C 4.5%

비타민 D₃ 0.001%

황산망간 0.1%

밀납 10%

팜유 25%

홍화씨유 30.399%

<1-2> 추출물을 함유하는 정맥주사용 제제의 제조

가시오가피 뿌리 열수 추출물 0.2%

만니톨 0.3%

생리식염수 9.5%

<1-3> 추출물을 함유하는 정제(tablet)

가시오가피 뿌리 열수 추출물 35%

비타민 C 10%

비타민 D₃ 0.001%

황산망간 0.1%

결정셀룰로오즈 25.0%

유당 17.999%

스테아린산마그네슘 2%

<기타 제조예 2> 가시오가피 뿌리 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품의 제조

본 발명자들은 상기 실시예를 통해 가시오가피 뿌리 열수 추출물이 면역 증진 활성이 뛰어남을 확인하여 이를 유효성분으로 함유하는 기능성 식품을 하기와 같이 제조하였다.

<2-1> 음료의 제조

꿀 522 ㎎

치옥토산아미드 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

이노시톨 30 ㎎

오르트산 50 ㎎

가시오가피 뿌리 열수 추출물 0.48 ~ 1.28 ㎎

물 200 ㎖

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

<2-2> 츄잉껌의 제조

껌베이스 20 %

설탕 76.36 ~ 76.76 %

가시오가피 뿌리 열수 추출물 0.24 ~ 0.64 %

후르츠향 1 %

물 2 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.

<2-3> 캔디의 제조

설탕 50 ~ 60 %

물엿 39.26 ~ 49.66 %

가시오가피 뿌리 열수 추출물 0.24 ~ 0.64 %

오렌지향 0.1 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.

<2-4> 비스켓의 제조

박력1급 88 ㎏

중력1급 76.4 ㎏

정백당 16.5 ㎏

식염 2.5 ㎏

포도당 2.7 ㎏

팜쇼트닝 40.5 ㎏

암모 5.3 ㎏

중조 0.6 ㎏

중아황산나트륨 0.55 ㎏

쌀가루 5.0 ㎏

비타민 B1 0.003 ㎏

비타민 B2 0.003 ㎏

밀크향 0.16 ㎏

물 71.1 ㎏

전지분유 4 ㎏

대용분유 1 ㎏

제일인산칼슘 0.1 ㎏

살포염 1 ㎏

분무유 25 ㎏

가시오가피 뿌리 열수 추출물 0.2 ~ 0.5 ㎏

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 비스켓을 제조하였다.

<2-5> 아이스크림의 제조

유지방 10.0 %

무지유고형분 10.8 %

설탕 12.0 %

물엿 3.0 %

유화안정제(스팬, span) 0.5 %

향료(스트로베리) 0.15 %

물 63.31 ~ 62.91 %

가시오가피 뿌리 열수 추출물 0.24 ~ 0.64 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 아이스크림을 제조하였다.

<2-6> 쵸코렛의 제조

설탕 34.36 ~ 34.76 %

코코아 버터 34 %

코코아 매스 15 %

코코아 파우다 15 %

레시틴 0.5 %

바닐라향 0.5 %

가시오가피 뿌리 열수 추출물 0.24 ~ 0.64 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 초코렛을 제조하였다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

Claims

가시오가피 뿌리 추출물을 건조하여 분말화한 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 약학적 조성물.
가시오가피 뿌리의 추출물로부터 분리된 하기 화학식 1의 엘레테로우사이드(Eleutheroside) B 또는 하기 화학식 2의 엘레테로우사이드 E를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 약학적 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]
식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 가시오가피 뿌리를 건조하여 분말화한 열수 추출물 또는 가시오가피 뿌리의 추출물로부터 분리된 상기 화학식 1의 엘레테로우사이드 B 또는 상기 화학식 2의 엘레테로우사이드 E를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 건강식품 조성물.