CN103074280B

CN103074280B - 一种干酪乳杆菌及其生产胞外多糖的方法

Info

Publication number: CN103074280B
Application number: CN201310016045.3A
Authority: CN
Inventors: 唐彦君; 刘宁; 王辰元
Original assignee: Northeast Agricultural University; Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University; Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2013-01-16
Filing date: 2013-01-16
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2033-01-16
Also published as: CN103074280A

Abstract

一种干酪乳杆菌及其生产胞外多糖的方法，保藏编号为CGMCC No.6818。本发明是采用CGMCC No.6818发酵生产CGMCC No.6818，所述胞外多糖产量较高，其组成与现有胞外多糖不同，采用脱脂乳粉培养基，发酵液中胞外多糖产量可达831.85mgL。

Description

一种干酪乳杆菌及其生产胞外多糖的方法

技术领域

本发明涉及一种干酪乳杆菌及其生产胞外多糖的方法。

背景技术

乳酸菌产胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的黏多糖或荚膜多糖。大量研究表明，乳酸菌胞外多糖除了可以作为增稠剂、凝胶剂和稳定剂等食品添加剂应用于食品加工中外，在抗肿瘤、抑菌、消炎、增强机体免疫力等方面起着重要的作用。乳酸菌产胞外多糖作为食品级乳酸菌天然发酵产物，具有食用安全的天然优势，因此开发和利用这些具有特定生理功能的乳酸菌胞外多糖成为药物研究和保健品生产具有极好的经济效益、社会效益和应用前景。作为食用乳酸菌中的一员，干酪乳杆菌在干酪、酸乳等发酵食品中有着越来越广泛的应用，但据目前已有文献报道，干酪乳杆菌胞外多糖的产量较低，一般不超过200mg/L。更高产量的干酪乳杆菌胞外多糖的制备方法未见报道。因此，研制一种制造高产量干酪乳杆菌胞外多糖的方法，可填补该领域空白，具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种干酪乳杆菌SCJ010，用于发酵生产胞外多糖。

所述干酪乳杆菌SCJ010筛选自然发酵酸菜汁，已于2012年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6818，建议分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述胞外多糖分子量为2.4×10⁶Da，由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖和核糖构成，上述物质摩尔比为205:215:5:5:2:2:1。

本发明还提供一种生产上述胞外多糖的方法，是用CGMCC No.6818发酵生产胞外多糖。

所述生产胞外多糖的方法，是将CGMCC No.6818接入脱脂乳粉培养基发酵生产胞外多糖。

接入干酪乳杆菌的菌的活菌数为10⁶-10⁸个/mL。

接入干酪乳杆菌的接种量为3-5%。

干酪乳杆菌发酵温度为30-34℃，发酵时间为12-18h，所述发酵温度为干酪乳杆菌常用温度。

所述脱脂乳粉培养基组成如下：8-14%脱脂乳粉，4-8%的葡萄糖和2.0-2.8%酪蛋白胨。

是将干酪乳杆菌CGMCC No.6818接种于脱脂乳粉培养基发酵，发酵液经沸水浴后离心，收集上清液，向上清液中加入三氯乙酸，放置一段时间，离心，将上清液旋转蒸发浓缩，再向浓缩后的上清液中加入乙醇，静置后离心，将沉淀用去离子水溶解,，离心取上清液透析，得透析截留液，真空冷冻干燥制粉，得到干酪乳杆菌胞外多糖。

所述透析袋透析截留分子量极限为12000-14000Da。

优选技术方案如下：

⑴将干酪乳杆菌活化液按体积百分比4%的接种量接种于改进的脱脂乳粉培养液中，在30-34℃条件下发酵12-18h，制得发酵液；

⑵将上述发酵液在沸水浴中加热10-15min后，在4℃下以10000g离心20min，收集上清液；

⑶向上清液中加入质量浓度为800g/L的三氯乙酸至终质量浓度为40gL，4℃放置10-12h，10000g离心20min，收集上清液；

⑷将得到的上清液用旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩，水浴锅温度为50-80℃；

⑸浓缩后的上清液中加入体积分数为95%的乙醇至终体积分数为75%，4℃下静置10-16h，再于4℃8000-10000g离心15-20min，收集沉淀；

⑹将沉淀用去离子水溶解，离心取上清液透析3d，每6-8h换水1次；

⑺收集透析截留液，利用真空冷冻干燥机进行冷到干燥制得干酪乳杆菌胞外多糖粉末。

干酪乳杆菌胞外多糖含量的测定采用常规硫酸-苯酚法。

①试剂

脱脂奶粉培养基：含脱脂奶粉，葡萄糖、酪蛋白胨、K₂HPO₄。

80%苯酚：80g苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）

80%三氯乙酸（80%TCA）：80g TCA加15g水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

浓硫酸、葡萄糖、甲醇、硼氢化钠、乙酸酐、吡啶和氯仿：均为分析纯。

②设备

高速冷冻离心机、分析天平、分光光度计、500mL容量瓶、250mL三角瓶、10mL灭菌移液管、1mL灭菌移液管、0.1mL灭菌移液管、酒精灯、离心管。

③制作标准曲线：准确称取标准葡萄糖20mg于500mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8mL，各以蒸馏水补至2.0mL，然后加入6%苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以2.0mL水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖浓度，纵坐标为光密度值，绘制标准曲线，如图1所示。

④胞外多糖的提取与测定

取发酵液20mL，离心(9960r/min，20min，4℃)去菌体，取上清液沸水浴10min，冷却至室温，加80%的三氯乙酸溶液至质量浓度为4%，4℃静置过夜，9960r/min离心20min,取上清液，用去离子水透析3d，每8h换水1次。以相同的方法处理未接种的培养基，作为测定多糖含量的空白对照。吸取0.2ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却室温放置20min充分进行显色反应，之后于490nm测OD值。

⑤发酵液中该多糖含量按如下公式计算：

干酪乳杆菌胞外多糖分子量的测定采用凝胶色谱法。

色谱条件为：色谱柱为Agilent PL aquagel-OH mixed柱（300mm×7.5mm，i.d.8μm），柱温30℃；流动相为水，流速1mL/min；进样量50μL；示差折光检测器，检测温度35℃。

干酪乳杆菌胞外多糖的单糖成份测定采用Agillent6890-5973气相色谱-质谱联用仪。

分析条件：

色谱柱：DB-5(60m×0.25mm×0.20μm)；

程序升温：初始温度200℃，升温速率为25℃/min，终末温度250℃，保持11min；

进样口温度：250℃；

四级杆温度：150℃；

离子源温度：230℃；

传输线温度：280℃；

载气：He；流速:1mL/min；

电离方式：EI，70eV；

质量扫描范围：50-550amu。

样品处理过程：

称取20mg干酪乳杆菌胞外多糖，溶解在2.0mol·L^-1的三氟乙酸中，封管并于110℃水解；取出冷却后，将水解液低于50℃减压蒸干，然后加入甲醇蒸干，备用。

取上述多糖水解样品，溶于2mL蒸馏水中，加入硼氢化钠，还原反应2h，蒸干；将还原后的糖醇置于110℃烘箱中加热，加入乙酸酐和吡啶，100℃反应1h，蒸干。将乙酰化的产物用4mL氯仿溶解后过滤，上机测定。

本发明具有如下优点：

1）EPS产量较高，仅采用脱脂乳粉培养基，发酵液中胞外多糖产量即可达到400-831.85mg/L；

2）胞外多糖分子量为2.4×10⁶Da，由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖和核糖构成，上述物质摩尔比为205:215:5:5:2:2:1。实验表明,该多糖可促进小鼠肠道派氏集合淋巴结CD4⁺T向Th17细胞分化。

3）

附图说明

图1葡萄糖标准曲线

具体实施方式

实施例1：

⑴按14%脱脂乳粉，6%葡萄糖，2.6%酪蛋白胨配制改进的脱脂乳粉培养液，并灭菌。

⑵将干酪乳杆菌活化液按体积百分比4%的接种量接种于培养液中，在32℃条件下发酵12h，制得发酵液。将发酵液在沸水浴中加热15min后，在4℃下以10000g离心20min，收集上清液。向上清液中加入质量浓度为800g/L的三氯乙酸至终质量浓度为40g/L，4℃放置12h，10000g离心20min，收集上清液，用旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩。浓缩后的上清液中加入体积分数为95%的乙醇至终体积分数为75%，4℃下静置12h，再于4℃下10000g离心20min，收集沉淀，用去离子水溶解,，离心取上清液透析3d，每8h换水1次。收集透析截留液，利用真空冷冻干燥机进行冷到干燥制得干酪乳杆菌胞外多糖粉末。

本实施方式方法得干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)胞外多糖，主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖和核糖构成，摩尔比为205:215:5:5:2:2:1。分子量为2.4×10⁶Da。EPS产量为780.85mg/L。

实施例二：

⑴按10%脱脂乳粉，8%葡萄糖，2.4%酪蛋白胨配制改进的脱脂乳粉培养液，并灭菌。

⑵将干酪乳杆菌活化液按体积百分比5%的接种量接种于培养液中，在30℃条件下发酵16h，制得发酵液。将发酵液在沸水浴中加热15min后，在4℃下以10000g离心20min，收集上清液。向上清液中加入质量浓度为800g/L的三氯乙酸至终质量浓度为40g/L，4℃放置12h，10000g离心20min，收集上清液，用旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩。浓缩后的上清液中加入体积分数为95%的乙醇至终体积分数为75%，4℃下静置12h，再于4℃下10000g离心20min，收集沉淀，用去离子水溶解,，离心取上清液透析3d，每8h换水1次。收集透析截留液，利用真空冷冻干燥机进行冷到干燥制得干酪乳杆菌胞外多糖粉末。

本实施方式方法得干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)胞外多糖，主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖和核糖构成，摩尔比为205:215:5:5:2:2:1。分子量为2.4×10⁶Da。EPS产量为688.95mg/L。

实施例三：

⑴按8%脱脂乳粉，4%葡萄糖，2.0%酪蛋白胨配制改进的脱脂乳粉培养液，并灭菌。

⑵将干酪乳杆菌活化液按体积百分比3%的接种量接种于培养液中，在34℃条件下发酵18h，制得发酵液。将发酵液在沸水浴中加热15min后，在4℃下以10000g离心20min，收集上清液。向上清液中加入质量浓度为800g/L的三氯乙酸至终质量浓度为40g/L，4℃放置12h，10000g离心20min，收集上清液，用旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩。浓缩后的上清液中加入体积分数为95%的乙醇至终体积分数为75%，4℃下静置12h，再于4℃下10000g离心20min，收集沉淀，用去离子水溶解，离心取上清液透析3d，每8h换水1次。收集透析截留液，利用真空冷冻干燥机进行冷到干燥制得干酪乳杆菌胞外多糖粉末。

本实施方式方法得干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)胞外多糖，主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖和核糖构成，摩尔比为205:215:5:5:2:2:1。分子量为2.4×10⁶Da。EPS产量为429.45mg/L。

实施例四：

⑴按12%脱脂乳粉，4%葡萄糖，2.6%酪蛋白胨配制改进的脱脂乳粉培养液，并灭菌。

⑵将干酪乳杆菌活化液按体积百分比4%的接种量接种于培养液中，在30℃条件下发酵14h，制得发酵液。将发酵液在沸水浴中加热15min后，在4℃下以10000g离心20min，收集上清液。向上清液中加入质量浓度为800g/L的三氯乙酸至终质量浓度为40g/L，4℃放置12h，10000g离心20min，收集上清液，用旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩。浓缩后的上清液中加入体积分数为95%的乙醇至终体积分数为75%，4℃下静置12h，再于4℃下10000g离心20min，收集沉淀，用去离子水溶解,，离心取上清液透析3d，每8h换水1次。收集透析截留液，利用真空冷冻干燥机进行冷到干燥制得干酪乳杆菌胞外多糖粉末。

本实施方式方法得干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)胞外多糖，主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖和核糖构成，摩尔比为205:215:5:5:2:2:1。分子量为2.4×10⁶Da。EPS产量为508.25mg/L。

实施例五：

⑴按12%脱脂乳粉，6%葡萄糖，2.8%酪蛋白胨配制改进的脱脂乳粉培养液，并灭菌。

⑵将干酪乳杆菌活化液按体积百分比5%的接种量接种于培养液中，在32℃条件下发酵14h，制得发酵液。将发酵液在沸水浴中加热15min后，在4℃下以10000g离心20min，收集上清液。向上清液中加入质量浓度为800g/L的三氯乙酸至终质量浓度为40g/L，4℃放置12h，10000g离心20min，收集上清液，用旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩。浓缩后的上清液中加入体积分数为95%的乙醇至终体积分数为75%，4℃下静置12h，再于4℃下10000g离心20min，收集沉淀，用去离子水溶解,，离心取上清液透析3d，每8h换水1次。收集透析截留液，利用真空冷冻干燥机进行冷到干燥制得干酪乳杆菌胞外多糖粉末。

本实施方式方法得干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)胞外多糖，主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖和核糖构成，摩尔比为205:215:5:5:2:2:1。分子量为2.4×10⁶Da。EPS产量为562.70mgL。

实施例六：

取该多糖，对小鼠连续灌胃7天，于灌胃结束后24小时，脱颈椎处死小鼠，分离小肠的派氏集合淋巴结，ELISA方法分析PP组织匀浆上清液中细胞因子IL-17的含量，流式细胞术测定PP单细胞悬液Th17细胞比例。结果表明，EPS能够促进PP的IL-17分泌，在EPS剂量100mg/kg时，IL-17分泌量最高；也能促进Th17细胞比例的增长；EPS剂量为200mg/kg时，Th17细胞比例达到最大。

Claims

1.一种干酪乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.6818。

2.一种发酵生产胞外多糖的方法，是用CGMCC No.6818发酵生产胞外多糖。

3.权利要求2所述方法，其特征在于，是将CGMCC No.6818接入脱脂乳粉培养基发酵生产胞外多糖。

4.权利要求2所述方法，其特征在于，所用脱脂乳粉培养基组成为：8-14%脱脂乳粉，4-8%的葡萄糖和2.0-2.8%酪蛋白胨。

5.权利要求2所述方法，其特征在于，所述干酪乳杆菌的活菌数为10⁶-10⁸个/mL。

6.权利要求2所述方法，其特征在于，所述干酪乳杆菌的接种量为3-5%。

7.权利要求2所述方法，其特征在于，发酵温度为30-34℃，发酵时间为12-18h。

8.权利要求2所述方法，其特征在于，将干酪乳杆菌CGMCC No.6818接种于脱脂乳粉培养基发酵，发酵液经沸水浴后离心，收集上清液，向上清液中加入三氯乙酸，放置一段时间，离心，将上清液旋转蒸发浓缩，再向浓缩后的上清液中加入乙醇，静置后离心，将沉淀用去离子水溶解，离心取上清液透析，得透析截留液，真空冷冻干燥制粉，得到干酪乳杆菌胞外多糖。

9.权利要求2所述方法，其特征在于，具体方法如下：

⑴将干酪乳杆菌活化液按体积百分比4%的接种量接种于脱脂乳粉培养液中，在30-34℃条件下发酵12-18h，制得发酵液；

⑵将上述发酵液在沸水浴中加热10-15min后，收集发酵上清液；

⑶向上清液中加入质量浓度为800g/L的三氯乙酸至终质量浓度为40g/L，4℃放置10-12h，离心收集上清液；

⑺收集透析截留液，利用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥制得干酪乳杆菌胞外多糖粉末。