KR101902035B1 - 산성 분해로부터 미생물 세포의 보호 - Google Patents

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에바 마리아 브란트너
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존 에이. 댄저필드
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Abstract

단순한 셀룰로스 설페이트 기초의 마이크로캡슐화 기술이 소화 효소를 생산하고 방출하는 박테리아 또는 다른 미생물 세포를 캡슐화함으로써 미생물 세포를 위한 산 내성 보호소를 제공하기 위해 적용되었다. 놀랍게도, 생성된 구는 산성 수용액을 사용한 처리로부터 캡슐화된 세포에 대한 충분한 보호를 제공하는 것으로 확인되었다. 이에 따라, 셀룰로스 설페이트 마이크로캡슐화된 세포, 예컨대 프로바이오틱스는 이제 예를 들어, 마이크로캡슐 내에 있지 않는 것보다 더욱 높은 생존율로 인간 또는 동물에 의한 소비 후 위(stomach)를 통한 통과를 생존할 수 있다. 위를 통과한 후, 이들 세포는 이들에 의해 생산된 생성물, 예를 들어 효소 또는 다른 영양 인자를 전달한다. 따라서, 이러한 기술은 소화 효소 또는 달리 유익한 효소 및/또는 살아있는 미생물 세포를, 이들이 숙주에게 이들의 건강상의 유익함을 줄 수 있는, 하부의 위장관 내에 제공하는데 매우 유용함을 보여준다. 세포가 어떻게 상기 물질로 캡슐화되는지, 어떠한 조건 하에서 캡슐화된 세포가 위 통과를 견디는지, 및 미생물 세포 또는 상기 미생물 세포에 의해 생산된 효소가 어떻게 마이크로캡슐 내의 세포 및/또는 생산된 효소가 이들의 건강상의 유익함을 제공하는 것을 허용하는 마이크로캡슐을 나올 수 있는지 설명된다. 이러한 기술은 식품, 특히 프로바이오틱 식품의 개선 또는 인간 및 동물 건강을 개선하기 위한 식품 첨가제의 전달에 있어 중요한 역할을 할 것이며, 이때 이들 세포는 먼저 산성 환경에 노출된 이후에도 여전히 이들의 생성된 생성물, 예를 들어 효소 및/또는 다른 영양 인자를 주변 환경에 방출할 수 있다.

Description

산성 분해로부터 미생물 세포의 보호{PROTECTION OF MICROBIAL CELLS FROM ACIDIC DEGRADATION}
본 발명은 소화 효소를 생산하고 방출하는 박테리아 또는 다른 미생물 세포를 캡슐화함으로써 미생물 세포를 위한 산 내성 보호소를 제공하기 위해 적용되어온 (단순한) 셀룰로스 설페이트계의 마이크로캡슐화 기술에 관한 것이다. 놀랍게도, 생성된 구(sphere)는 산성 수용액을 사용한 처리로부터 캡슐화된 세포에 대한 충분한 보호를 제공하는 것으로 확인되었다. 이에 따라, 셀룰로스 설페이트 마이크로캡슐화된 세포, 예컨대 프로바이오틱스는 이제 예를 들어, 마이크로캡슐 내에 있지 않는 것보다 더욱 높은 생존율로 인간 또는 동물에 의한 소비 후 위(stomach)를 통한 통과를 생존할 수 있다. 위를 통과한 후, 이들 세포는 이들에 의해 생산된 생성물, 예를 들어 효소 또는 다른 영양 인자를 전달한다. 따라서, 이러한 기술은 소화 효소 또는 달리 유익한 효소 및/또는 살아있는 미생물 세포를, 이들이 숙주에게 이들의 건강상의 유익함을 줄 수 있는, 하부의 위장관 내에 제공하는데 매우 유용함을 보여준다. 세포가 어떻게 상기 물질로 캡슐화되는지, 어떠한 조건 하에서 캡슐화된 세포가 위 통과를 견디는지, 및 미생물 세포 또는 상기 미생물 세포에 의해 생산된 효소가 어떻게 마이크로캡슐 내의 세포 및/또는 생산된 효소가 이들의 건강상의 유익함을 제공하는 것을 허용하는 마이크로캡슐을 나올 수 있는지 설명된다. 이러한 기술은 식품, 특히 프로바이오틱 식품의 개선 또는 인간 및 동물 건강을 개선하기 위한 식품 첨가제의 전달에 있어 중요한 역할을 할 것이며, 이때 이들 세포는 먼저 산성 환경에 노출된 이후에도 여전히 이들의 생성된 생성물, 예를 들어 효소 및/또는 다른 영양 인자를 주변 환경에 방출할 수 있다.
소화 효소
소화 효소는, 신체에 의한 이들의 흡수를 용이하게 하기 위하여, 중합체성 거대분자(예컨대, 식품 내에 함유되어 있는 것)를 이들의 더욱 작은 빌딩 블록(예컨대, 영양소 및 노폐물)으로 분해하는 효소이다. 소화 효소는 동물의 소화관에서 발견되며, 본 발명의 맥락에서 상기 동물은 임의의 동물일 수 있으나, 바람직하기로 포유동물, 특히 반추동물 및 다른 가축, 수산 양식 동물, 예컨대 어류 및 새우, 애완동물 및 반려동물, 조류 및/또는 인간이며, 이때 이들은 식품은 물론 세포 내부, 특히 이들이 세포 생존을 유지하는 기능을 하는 이들의 리소좀 내의 소화를 돕는다. 소화 효소는 다양하며 타액선에 의해 분비되는 타액, 위 내벽 세포에 의해 분비되는 위액, 췌장 외분비 세포에 의해 분비되는 췌장즙, 및 장(소장 및 대장) 분비액 내에서, 또는 위장관의 내벽의 일부로서 발견된다. 소화 효소는 이들의 표적 기질에 기초하여 분리된다: 프로테아제 및 펩티다제는 단백질을 이들의 단량체인 아미노산으로 자르고; 리파제는 지방을 3종의 지방산 및 글리세롤 분자로 분할하며; 카보하이드라제는 전분과 같은 탄수화물을 당으로 자르고; 뉴클레아제는 핵산을 뉴클레오티드로 분할한다.
인간 소화계에서, 소화의 주요 장소는 구강, 위, 및 소장이다. 소화 효소는 다음을 포함하는 상이한 외분비선에 의해 분비된다: 타액선, 위 내의 분비 세포, 췌장 내의 분비 세포, 소장 내의 분비선. 췌장은 소장 내에서 작용하는 소화 효소, 예컨대 리파제, 아밀라제 및 프로테아제를 생산한다. 알려져 있는 프로테아제는 트립신, 크로모트립신 및 카복시펩티다제이다.
식품 및 영양 보충제의 완전한 유익함은 신체가 상기 식품을 적절하게 소화시키고 영양소를 흡수하기에 충분한 효소를 갖는 경우에만 얻어진다. 일부 소화 효소는 일상적으로 섭취하지 않고 대부분의 동물이 흡수하는 일상적인 식이의 일부가 아닌 로우 푸드(raw food) 내에서만 발견된다. 동물의 신체에 의해 생산된 소화 효소는 동물의 연령에 따라 덜 풍부하게 될 수도 있다. 즉, 더욱 나이 든 동물일수록, 이들의 신체 생산이 덜하다. 소화 효소의 부족은 관절염, 비만, 과민성 대장 증후군, 속쓰림, 만성 피로 증후군 등을 포함하는 무수한 병의 원인이 될 수 있다. 프로테아제의 부족은 알러지와 독소의 형성을 초래할 수 있는 불완전한 소화를 일으킬 수 있다.
소화 효소의 수준을 증가시키기 위한 보충제를 섭취하는 것은 에너지, 세포 성장 및 수복(repair)을 위한 식품 영양소에 접근하고 이를 사용하는 신체의 능력을 개선하는 것으로 일반적으로 여겨진다. 한 사람의 소화를 개선함으로써, 보충제는 종종 가스와 속쓰림을 감소시키고 규칙성을 개선할 것이다.
약 15 %의 미국인이 일반적으로 통증, 팽창, 강직, 및 홍반(redness)과 같은 염증에 대한 수식어로 특징지어지는 관절염으로 고통받고 있다. 그러나, 관절염은 단일 질환이 아니고, 유전적 특징, 감염, 육체적 손상, 알러지, 스트레스 및 불완전한 소화와 같은 다수의 가능한 원인 유래의 관절 질환의 통칭이다. Transformation Enzyme Corporation의 임상적 연구는 관절염이 염증 및 소화와 관련이 있기 때문에 대부분의 관절염 환자가 프로테아제 및 소화 효소 보충제의 처리에 잘 반응한다는 점을 밝혔다. 몇몇의 연구는 프로테아제 효소가 부정적인 부작용 없이, 관절염 통증 완화용 약물 메토트렉세이트 및 인도메타신만큼 효과적임을 보여주었다. 소화계 및 면역계의 지원을 증가시킴으로써 염증이 감소된다.
소화 효소의 부족에 관련된 건강상의 문제에 대한 해결책은 소화 효소 보충제를 경구적으로 섭취하는 것이다. 대부분의 소화 효소는 간단하게 삼킬 수 있는 캡슐로 입수된다. 캡슐은 젤라틴(겔 캡슐로 불림) 또는 식물성 셀룰로스 블렌드(야채 캡슐로 불림) 중 어느 하나로 만들어진다. 대부분의 보충제 회사는 모든 이들의 캡슐화된 보충제를 위하여 지난 10년 동안 야채 캡슐의 방향으로 가고 있다. 대부분의 효소 캡슐은 개봉되어 분말이 쏟아져 나올 수 있다.
소화 효소의 추가량을 단순히 삼키는 것은 위를 통해 통과할 때 위산에 대한 노출이 상기 효소에 대한 해로운 영향을 줄 수 있기 때문에 이상적인 해결책이 아닐 수 있다. 식품 보충제로서 효소를 제공함에 있어 추가적인 문제는 이러한 효소의 맛(이들 중 일부는 입 안에서 "타는 듯한 느낌(burning sensation)"을 야기함)과 수분에 대한 이들의 민감성이다. 비-캡슐화 효소는 이들이 일반적인 대기 습기에 노출될 때 이들의 효능을 잃으며, 이에 따라 이들이 또한 소비 직전에 첨가되지 않는 한, 드링크로서 섭취될 수 없거나 습한 음식의 성분으로서 섭취될 수 없는 것으로 보고되어 왔다.
타는 듯한 느낌은 프로테아제가 피부 표면 상의 죽은 층 또는 세포의 일부를 분해하기 시작할 때 야기된다. 이들 효소는 손상된, 감염된, 또는 죽은 세포를 제거한다. 프로테아제가 연장된 기간 동안 피부 표면 상에 남아 있는 경우, 이들은 죽은 세포를 제거하고 아래의 건강한 피부를 노출시킬 수 있다. 이는 자극을 초래할 수 있다. 때때로 효소가 윗입술에 닿는 드링크로 섭취되는 경우, 프로테아제가 남을 수 있고 그곳에 발진을 야기할 수 있다.
게다가, 위산에 민감한 소화 효소도 있다. 췌장 효소는 pH 또는 온도의 넓은 범위에서 안정하지 않고 위산에 의해 파괴된다. 따라서, 이들은 위를 통해 통과하는 동안 보호될 필요가 있다.
프로바이오틱스
인간 및 동물 건강산업 모두에서 가장 빠르게 성장한 부분 중의 하나가 프로바이오틱 세포(프로바이오틱스)의 사용이다. FAO/WHO에 의해 현재 채택된 정의에 따르면, 프로바이오틱스(probiotics)는 "적당한 양으로 투여될 때 숙주에 건강상의 유익함을 주는 살아있는 미생물"이다. 유산균(lactic acid bacteria, LAB, Lb.) 및 비피도 박테리아가 프로바이오틱스로서 사용되는 가장 일반적인 타입의 미생물이나; 특정한 효모 및 바실러스가 또한 유용할 수 있다.
프로바이오틱 미생물 세포는 pH, 수분, 온도, 공기 및 빛과 같은 다양한 환경 조건에 민감하다. 이들 조건이 적절하게 조절되지 않을 때, 제품의 생존력(종종 콜로니 형성 단위(cfu), 또는 대사 활성 비율(mar)로서 측정됨)과 이에 따라 이의 효능이 실질적으로 감소할 수 있다.
식이 중의 유익한, 잠재적으로 심지어 치료적인 화합물로서 사용되기 위하여, 프로바이오틱 미생물 세포는 a) 제조 과정 도중에, b) 제품 내에 저장 도중에, 및 c) 소화관, 특히 위를 통해 통과하는 동안 보호될 필요가 있다. 요구르트와 같은 유제품에서, 이들은 장기간의 시간 동안 온화한 산성 조건을 생존해야 한다. 제품 내 프로바이오틱 생존율은 pH, 발효 제품 내 후-산성화(저장 도중), 과산화수소 생산, 산소 독성(포장을 통한 산소 침투), 저장 온도, 건조 또는 동결 형태의 안정성, 우유 중에서의 나쁜 성장, 우유 단백질을 더욱 단순한 질소 물질로 분해하는 프로테아제의 부족 및 발효 도중의 전통적인 스타터 배양과의 상용성(compatibility)을 포함하는 다양한 인자에 의해 영향을 받는다. 모든 이들 스트레스는 상당한 퍼센트의 이들 세포의 사멸을 초래한다. 그러므로, International Dairy Federation (IDF)은 호평받는 건강상의 유익함을 달성하기 위하여, 제품의 그램 당 최소한 107 프로바이오틱 미생물 세포가 소비 시점에 살아있어야 한다고 제안한다. 그러나, 이러한 수는 세포를 이러한 산성 환경으로부터 보호하고 이에 따라 위 내의 세포의 생존율을 증가시킴으로써 세포 사멸의 주요 원인, 즉 위 내에서의 살아있는 세포의 산성 분해를 피할 수 있을 때 유의적으로 감소할 수 있는 것으로 여겨진다. 다수의 프로바이오틱 미생물 세포는 또한 위를 통해 통과하고 장으로 들어갈 때에도 소화 효소를 생산할 수 있다.
마이크로캡슐화
예를 들어 발효 유제품 내에서의 저장 도중에 또는 위산에 대한 노출 도중에 프로바이오틱 미생물 세포의 나쁜 생존율의 문제에 대한 하나의 해결책은 마이크로캡슐화이다.
캡슐화는 캡슐화된 물질의 코어로서 캡슐 벽 내에 완전히 들어 있는 내부 매트릭스 주변에 연속적인 코팅을 형성하는 과정이다. 매트릭스 내에 또는 이를 통해 물질을 트래핑하는 것을 언급하는 "고정(immobilisation)"과 구별되어야만 한다. 캡슐화와 반대로, 이는 고정화된 구성요소 중의 일정 퍼센트가 표면에 노출되는 분명하지 않은 입자 크기를 초래하는 무작위적인 과정이다. 마이크로캡슐화는 코어 물질을 이의 환경으로부터 분리시킴으로써, 이의 안정성을 개선하고 코어의 저장 수명을 연장하는데 도움이 된다. 코어 물질 주변에 마이크로캡슐화제에 의해 형성되는 구조는 벽(wall)으로 알려져 있다. 벽 시스템의 특성은 작은 분자가 막의 안팎으로 통과하도록 허용하면서 코어를 보호하고 이를 특정한 조건 하에서 잠재적으로 방출하도록 설계된다. 캡슐은 마이크론 이하로부터 수 밀리미터의 크기에 이를 수 있으며 다양한 형태일 수 있다.
알지네이트, 전분, 잔탄검, 구아검, 로쿠스트 빈 검 및 카라기난 검 뿐만 아니라 유청 단백질과 같은 몇몇의 식품 등급의 바이오폴리머가 다양한 성공률로 산 민감성 미생물 세포를 보호하기 위하여 마이크로캡슐화 물질로서 시험되어 왔다. 최근의 연구의 경우, Islam et al . "Microencapsulation of Live Probiotic Bacteria" J. Microbiol. Biotechnol. (2010), 20(10), 1367-1377을 참고한다. 지금까지 아무도 미생물 세포의 내부에서 생산되는 소화 효소를 캡슐 벽을 통해 방출되게 하는 마이크로캡슐화 기술의 사용을 보고한 바 없다.
알지네이트
알지네이트는 1-4 글리코사이드 결합에 의해 선형으로 접합된 D-만뉴론산과 L-글루론산 잔기로 이루어진 천연 음이온성 다당류이다. 알지네이트는 해초로부터 회수된 천연물이며, 비독성인 것으로 여겨지고 알지네이트 캡슐화는 이의 단순한 제조 및 저가 및 우수한 생체적합성(상기 물질은 대부분의 타입의 캡슐화된 세포의 생존력에 영향을 주지 않음)으로 인하여 널리 사용되는 기술이다. Ca2 + 알지네이트로부터 만들어진 알지네이트 겔은 낮은 pH에서 안정하다. 이들은 약한 염기성 용액 중에서 팽창한다. 그러나, pH가 D-만뉴론산과 L-글루론산의 pKa 값 아래로 낮아질 때, 알지네이트는 Ca2 +의 방출, 및 수분 손실로 인한 더욱 치밀한 겔의 형성과 함께 알긴산으로 전환된다.
Kaila Kailasapathy의 논문("Microencapsulation of Probiotic Bacteria: Technology and Potential Applictions", Curr. Issues Intest. Microbiol. (2002), 3, 39-48)은 그 당시까지 사용되어온 다양한 마이크로캡슐화 기술의 우수한 개요를 제공한다.
트래핑되지 않았을 때보다 칼슘 알지네이트 내에 트래핑되었을 때 약 40 % 이상의 유산균이 아이스 밀크의 동결에 생존하는 것으로 보고되었다. 트윈 80(유화제) 및 소듐 라우릴 설페이트(계면활성제)를 함유하는 식물성 오일 중의 알지네이트 또는 카라기난의 수용액이 프로바이오틱 박테리아 세포를 캡슐화하기 위해 사용되었다. 박테리아 세포를 알지네이트의 용액 중에 혼합하고 오일 내에 적하시켜 캡슐화를 달성하였다. 유화제 및 계면활성제는 캡슐 형성을 촉진하기 위하여 첨가하였다.
이들 마이크로-캡슐화 실험실 과정 중 일부는 유중수(water-in-oil) 에멀젼 기술을 수반한다. 그러나, 이러한 기술은 첫째로, 캡슐화 물질 중의 잔여 오일이 질감 및 감각수용특성에 좋지 않을 수 있고, 저-지방 유제품의 개발에 적합하지 않을 수 있기 때문에 모든 식료품 적용에 적합하지 않을 수 있다. 둘째로, 캡슐화 물질 중의 잔여 오일, 유화제 및 계면활성제가 살아있는 미생물 세포에 유독할 수 있고 민감한 식품 성분과 상호작용할 수 있다.
또한, 변형된 알지네이트-전분 캡슐화 방법이 개시되었으며, 여기에서 프리바이오틱 하이-메이즈 전분(prebiotic Hi-maize starch)이 프로바이오틱 세포의 칼슘-알지네이트 마이크로캡슐화 도중에 혼입되었다. 이러한 전분의 존재 하에 캡슐화된 세포는 전분 없이 캡슐화된 세포에 비해 연장된 저장 수명을 가졌다. 프리바이오틱스는 신체의 건강에 이로운 소화계 내의 미생물 세포의 성장 및/또는 활성을 촉진하는 소화 불가능한 식품 성분이다. 전형적으로, 프리바이오틱스는 탄수화물(예컨대, 올리고당)이나, 상기 정의는 비-탄수화물을 포함할 수 있으며, 이들은 숙주 생물(예컨대, 포유동물 또는 인간)에 의해 소화가능하지 않으나, 이를 소화할 수 있는 미생물에게는 유익함을 제공한다. 그러나, 캡슐화된 미생물 세포는 시험관 내 테스트 도중에 낮은 pH와 높은 담즙산염 조건에 처했을 때 유의적으로 증가된 생존률을 보이지 않았다. 이들은 37℃에서 3 시간 동안 pH 2, 3 또는 4의 조건에 노출되었고 샘플을 매시간 취하였다. 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus)가 비피도박테리움(Bifidobacterium)보다 더욱 민감하나, 캡슐화가 미생물 세포가 산성 수용액에 의하여 분해되는 것을 막지 않았음이 밝혀졌다(Sultana et al . "Encapsulation of probiotic microbial cells with alginate-starch and evaluation of survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt", International Journal of Food Microbiology, (2000), 62(1-2), 47-55).
그러나, 프로바이오틱스는 식품의 제조 및 저장 조건에서 생존할 수 있어야만 할 뿐만 아니라 최종적으로 장(gut)으로 들어가도록 맞춰져야 한다. 그러므로, 이들은 또한 장 내에서 이들의 유익한 효과를 발휘할 수 있기 전에, 위의 산도, 담즙산염, 효소, 독성 대사산물, 박테리오파지, 항생제 및 혐기성 조건에서 생존해야 한다.
40-80 마이크로미터의 직경을 갖는 통상적으로 생성된 알지네이트 캡슐이 pH 2.0의 모의 위즙(simulated gastric juice)에 노출되었을 때 비피도박테리아를 단지 미미하게 보호하는데 반해 더욱 큰 알지네이트(1-3 mm) 마이크로스피어가 더욱 실질적으로 캡슐화된 세포를 보호하는 것으로 보고되었다(Truelstrup-Hansen L, Allan-wojtas PM, Jin YL, Paulson AT, "Survival of free and calcium-alginate microencapsulated Bifidobacterium spp . in simulated gastro-intestinal conditions.", Food Microbiol. (2002), 19: 35-45.).
2009년에, Nazzaro 등은 엘. 아시도필러스(L. acidophilus) 박테리아를 알지네이트-이눌린-잔탄검 내에 캡슐화하였고 발효 및 저장 후(각각, 유리 세포에 대하여 6x1012 및 4x 1010 cells/ml 대 4x1010 및 2x108) 유의적으로 강화된 세포 생존력 뿐만 아니라 모의 위산 내에서의 향상된 생존율을 보고하였다(Nazzaro, F. et al ., "Fermentative ability of alginate-prebiotic encapsulated Lactobacillus acidophilus and survival under simulated gastrointestinal conditions", Journal of Functional Foods (2009), 1(3), 319-323).
또한, 최근에 비-세포독성의 제니핀(genipin)으로 가교된 후 외부 및 내부원 유래의 Ca2 +에 의해 가교되는 알지네이트로 코팅되는 젤라틴 마이크로스피어 기초의 신규한 마이크로캡슐화 방법이 개시된 바 있다. 알지네이트-코팅된 젤라틴 마이크로스피어 내의 캡슐화는 불리한 환경 조건에 노출되는 동안 프로바이오틱 비피도박 테리움의 생존율을 유의적으로 향상시켰다(P < 0.05). 5분 동안 pH 2.0의 모의 위즙에 노출된 후 세포 생존율은 코팅되지 않은 젤라틴 마이크로스피어와 유리 세포에 대하여 각각 초기 개체수의 단지 2 % 및 1 %이었다. 그러나, 박테리아가 외부 및 내부 Ca2 +-원에 의해 제조된 알지네이트-코팅된 마이크로스피어 내에 있는 경우에는 초기 개체수의 54 % 및 20 %가 각각 생존하였다. 그러나, 초기 손실(5분) 이후에, 비피도박테리아의 개체수가 2 시간 인큐베이션 기간에 걸쳐 모든 처리에 대하여 동일한 속도로 감소하였다. 유리 비 . 아돌레센티스(B. adolescentis) 세포에 대한 3.45 log 단위까지의 생존 가능한 개체수의 감소가, 2 내지 3 시간 동안 모의 위즙(SGJ, pH 2.0)에 노출된 비. 아돌레센티스에 대한 약 3 log cfu ml의 감소를 관찰한 다른 이들에 의한 발견과 유사하였다(Annan N.T., Borza A.D. and Truelstrup Hansen L., "Encapsulation in alginate-coated gelatin microspheres improves survival of the probiotic Bifidobacterium adolescentis 15703T during exposure to simulated gastro-intestinal conditions", Food Research international, (2008), 41(2), 184-193).
입을 거친 하부 장관으로의 이들의 여정의 시작과 위로부터의 방출 사이의 시간은 약 90분인 것으로 보고되었다. 따라서, Khater 등이 산성 스트레스 하에서 알지네이트로 캡슐화된 12종의 상이한 프로바이오틱 균주 - 캡슐화는 술타나(Sultana)의 프로토콜 개정판에 따라 수행됨(하이-메이즈 전분을 수반하여 상기 기재된 바와 같음) -의 생존율을 비교했을 때, 산성화된 매질 내에서 30, 60 및 90분의 처리 시간을 사용하였다(Khater & Ahmed, "Effect of Encapsulation on some Probiotic Criteria", Journal of American Science, (2010), 6 (10), 810-819). 세포의 스트레스는 1.5까지 낮은 pH 값을 갖는 위에서 시작한다. 그러나, 대부분의 시험관 내 분석에서, pH 3.0이 산 내성을 테스트하기 위해 사용된다. 따라서, 알지네이트 캡슐화된 세포는 pH 2 및 pH 3에서 비-캡슐화된 세포와 비교하였다. 모든 비-캡슐화된 균주는 pH 2.0에서 강하게 영향을 받는 반면, 알지네이트 캡슐화된 박테리아는 pH 2.0에서 약간 더 오래 생존하였다. 그러나, 전반적인 생존율은 캡슐화된 세포도 pH 3.0에서 더욱 높았으며, 이는 산성 스트레스의 영향이 완전히 방지될 수 없음을 나타낸다.
더 나아가, Khater 등은 상이한 농도의 담즙산염에 노출시킨 후 이들 알지네이트 캡슐화 및 비-캡슐화 균주의 생존율을 비교하였고, 또한 이들 박테리아의 생존력에 대한 모의 위즙(pH 1.4의 SGJ)의 영향을 테스트하였다. 노출 시간을 pH 3.0에서 24 시간 플러스 0.3 % 농축 우담즙 용액에서 12 시간까지 증가시켰을 때, 그 결과는 이들 조건 하에서 알지네이트 캡슐화가 낮은 pH 이후 담즙산염으로의 처리의 프로바이오틱 박테리아의 생존력을 증가시킨다는 점을 입증한다. 하나의 균주의 경우, 36 시간 처리 후 생존율이 17%에서 34%로 증가하였고 다른 균주의 경우 37%에서 50%로 증가하였다. 그러나, 캡슐화 및 비-캡슐화 세포 간의 생존율은 모의 위즙 조건에서 3 시간 노출 후 단지 대략 2%까지 차이가 났으며, 비-캡슐화 세포의 생존율 조차도 이 실험에서 89% 내지 92%로 유지되었기 때문에, 처리는 모든 세포 균주에 대하여 명백히 덜 해롭다.
그러나, 대조적으로, 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) KFRI 673의 유리 세포는 pH 2.0의 모의 위액(SGF)에서 60분 기간을 전혀 생존하지 못한데 반해, 상기 세포는 모의 장액(SIF)에서 2시간의 기간을 생존하였음이 보고된 바 있으며, 이는 엘. 불가리쿠스 KFRI 673이 pH-민감성이고 산성 pH 조건에서 생존할 수 없다는 점을 나타낸다(Islam에 의해 검토됨, 상기 참조).
또한, Porubcan은 유리 세포의 생존력의 약 99%를 이들이 위에 노출된 후 잃게 됨을 보고하였다. 이의 실험은 90분의 기간 동안 pH 1.6의 모의 위산에 대한 노출이 테스트된 모든 배양물의 생존력을 급격하게 감소시킨다는 점을 보여준다(US 7,122,370, 실시예 1).
Porubcan의 미국특허 7,122,370호 및 7,229,818호는 산 유도된 알지네이트로의 캡슐화를 개시하고 있으며, 이는 낮은 pH 조건에 대해 내성이 있다. 사용된 제형은 나트륨 또는 칼륨 알지네이트염과 프로바이오틱 세포의 실질적으로 무수의(water free) 혼합물을 포함한다. 상기 혼합물은 알지네이트/박테리아 혼합물을 장용 피복, 예를 들어 셀룰로스 또는 젤라틴으로 만들어진 캡슐로 코팅시킴으로써, 본질적으로 무수의 환경으로 형성되고 유지되었다. 이러한 "마크로"-캡슐은 박테리아 세포 및 알지네이트 염의 혼합물이 습하게 되는 것을 방지하는 것으로 여겨진다. 따라서, 근본적으로 고체 셀룰로스 캡슐은 캡슐이 위에서 용해된 다음, 여기에서 이들이 위의 산성 환경과 접촉하자마자 알긴산과 프로바이오틱 박테리아로 만들어진 산 내성 마이크로캡슐을 형성할 때까지 상기 2 성분 혼합물을 보호하는 장용 피복을 제공하는 것이다. 마이크로캡슐의 산 유도된 형성으로 인하여, 프로바이오틱 박테리아 세포는 캡슐화된 동안에 위에서 위즙으로부터 보호되는 것으로 보인다. Porubcan은, 알지네이트와 세포의 혼합물을 캡슐화하고 쉽게 삼킬 수 있는 제형을 제공하는 것으로 밝혀진, 부형제로서의 셀룰로스가 위에서 위산에 관해 보호적이지 않다는 점을 언급한다(http://www.survivalprobiotics.com/randy_commentary.html (last seen on 15-Nov-2010) :
"프로바이오틱 박테리아는 약 18 시간 동안 브로쓰 배지의 탱크 내에서 생장시킨 다음 원심분리로 수집하고 동결건조시킨다. 동결건조된 분말을 셀룰로스와 같은 식품 등급 부형제와 함께 캡슐 내에 충진시킨다. 이러한 과정에 따른 큰 문제점은 나쁜 저장-수명(냉장된 경우에 조차) 및 나쁜 생존율 - 모든 CFU, 사실상 99.99%가 위산에 의해 사멸됨 - 을 갖는 제품을 산출한다는 것이다."
이러한 시스템이 소비자에게 생존력이 있는 프로바이오틱스를 제공하는 하나의 해결책을 제공하나, 이는 그대로 삼킬 필요가 있고, 물어뜯어 개봉할 수 없는 다소 큰 캡슐을 생성하기 때문에, 식품 성분으로서의 모든 용도에 대하여 적합하지 않다.
이미 1995년에, 유산균에 대한 다양한 마이크로캡슐화 방법을 개시하고, 약학적으로 허용가능한 캡슐, 예컨대 젤라틴 캡슐 내에 마이크로캡슐화된 프로바이오틱 유산균을 항생제 관련 설사를 예방하기 위하여 경구 투여하는 것을 제안하는 특허 출원이 출원되었으며, 이때 마이크로캡슐화는 박테리아의 저장 수명을 연장하고, 박테리아가 소화관을 통과하는 동안 분해되는 것을 방지하기 위한 수단으로서 개시되어 있다(미국특허 5,633,012호). 나트륨 알지네이트 단독 또는 알지네이트 및 폴리 L-라이신을 사용한 마이크로캡슐화 시스템이 개시되어 있다. 박테리아가 히드록시프로필메틸셀룰로스와 혼합되어, 아세톤-이소프로판올 중의 자유로운 수투과성 및 부분적인 수투과성의 아크릴계 메타크릴산 에스테르 공중합체의 혼합물의 용액에 첨가되는 시스템이 개시되어 있다. 셀룰로스 유도체는 단지 담체로서의 역할을 하며, 캡슐의 일부가 아니다. 여기에 개시된 2종의 다른 마이크로캡슐화 공정은 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리비닐포비돈의 사용을 수반한다.
Simmons의 포기된(abandoned) 미국특허출원 2005/0266069 A1호는 안정한 프로바이오틱 마이크로스피어 조성물의 다른 제조 방법에 관한 최신 기술 수준에 대한 정보의 또 다른 종합적인 공급원이다. 여기에는, 프로바이오틱 박테리아, 셀룰로스성 부형제, 붕해제 및 첨가제의 코어뿐만 아니라, 위액에 내성인 장용 피복을 포함하는 다소 복잡한 프로바이오틱 마이크로스피어가 개시되어 있다. 위액에 대해 내성일 수 있는 장용 피복은 아크릴산 및/또는 메타크릴산 및/또는 이들의 에스테르의 중합체 또는 공중합체, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 및 셸락(shellac)으로 이루어진다.
이러한 캡슐을 제조하는 방법과 관련하여, 일반적으로 2종의 상이한 접근법이 있다. Simmons는 중합체 용액의 압출 후, 과립화(압출가능한 페이스트를 형성하기 위함), 압출, 구형화 및 건조로 알려진 일련의 비연속식 단계를 포함할 수 있는 구형화, 뒤이어 상기 마이크로스피어를 코팅하는 또 다른 단계를 포함하는 기술을 개시하고 있다.
이러한 다소 복잡한 제조 방법은 본 발명에 따른 셀룰로스 설페이트 마이크로캡슐화 프로바이오틱의 생성을 이용하는 훨씬 더 간단한 기술과 대조적이다. 후자는 단순히, 세포를 셀룰로스 설페이트 용액 중에 분산시키는 단계 및 상기 혼합물을, 침전 배쓰(precipitation bath)으로도 언급되는, 경화 용액으로 방울 형태로 도입시키는 단계의 2 단계를 포함한다. 하전되고 이에 따라 함께 붙지 않는 근본적으로 미리형성된 구형의 방울이 경화 용액 속에 빠진다.
셀룰로스 설페이트 마이크로캡슐
다른 분야에 있어, 즉 생물의학 및 건강관리 적용의 영역에서, 살아있는 세포는 이들을 환자의 신체 내부에 주입(즉, 이들을 이식)하기 위한 목적으로 캡슐화하며, 여기에서 이들은 치료적 생체분자, 기질 또는 효소를 전달할 것으로 기대되며 그 다음 마이크로캡슐의 막을 통과하여 이들이 신체의 면역 시스템에 의해 공격받는 것으로부터 보호하고 이들을 국부화시킨다.
상기 기재된 알지네이트의 사용에 대한 대안적인 기술, 즉 반대로 하전된 다가이온에 의해 다가전해질 복합체(PEC) 마이크로캡슐의 형성은 간단하고 효과적인 방법이다. 일반적으로 이용되는 다가전해질 캡슐 시스템은 소듐 셀룰로스 설페이트(본 명세서에서 NaCS로서 언급됨)/폴리[디알릴(디메틸)암모늄 클로라이드](본 명세서에서 pDADMAC로서 언급됨), 키토산/알지네이트, 키토산/잔탄 등이다. pDADMAC는 4차 암모늄 단일중합체이다. pDADMAC의 CAS 명칭은 2-프로펜-1-아미늄,N,N-디메틸-N-프로페닐-,클로라이드 단일중합체이다. 이는 상이한 분자량으로 구입할 수 있다.
다가양이온 pDADMAC의 용액 내로 다가음이온 NaCS의 용액을 적하하여 형성시킨 NaCS/pDADMAC 캡슐화 시스템이 체계적으로 조사되어 왔고 이의 단순함과 이에 따른 공정 비용의 감소 및 오염물의 잠재적인 원천의 제거로 인해 이는 이목을 사로잡았다. 캡슐이 비교적 작은 pDADMAC 분자로 만들어진 경우, 영양소 및 노폐물과 같은 분자는 셀룰로스 설페이트 마이크로캡슐 기공을 쉽게 통과할 수 있다. 상기 물질은 생체적합성이며, 이러한 시스템으로 캡슐화된 일부 세포 타입에 대하여 장기간 생존이 기록될 수 있었다. 이는 생물의학적인 목적을 위하여 특징지어지고 최적화되었으며, 이후에 마이크로캡슐이 예를 들어 종양 치료법 분야에서 성공적으로 적용되었고, 여기에서 캡슐화된 살아있는 세포는 항체와 같은 치료 화합물을 생산하고, 이는 환자의 신체 내부에서 캡슐 기공을 통해 방출된다(Gunzburg 등의 미국특허 6,540,995호 및 Piechaczyk 등의 미국특허 6,426,088호).
사내에서 수행된 첫 번째 실험은 산성 양성자 H3O+가 셀룰로스 설페이트 캡슐 벽을 쉽게 통과함을 보여주었다. CaCO3 입자가 소듐 셀룰로스 설페이트 및 작은 크기의 pDADMAC로 캡슐화된 경우, 이들은 산성 수용액이 첨가되었을 때 완전히 용해하였다. 상기 용해는 시간 의존적인 방식으로 발생한다. 도 2는 시간 의존적인 방식으로 pH 6 이하에서 서서히 용해되는, CaCO3 결정을 끼워 넣은 이러한 캡슐의 사진을 보여준다. pH가 pH 7.5로부터 pH 3으로 추가로 감소되는 경우, 발생된 CO2는 캡슐 내에서 기포를 형성한다.
따라서, NaCS/pDADMAC 캡슐이 산성 환경의 영향으로부터 미생물 세포를 보호할 수 있다는 점은 놀라운 일이다.
미생물 세포를 위 내의 위즙을 통한 분해로부터, 더 나아가 장을 통과하는 동안 보호하기 위하여 이러한 NaCS/pDADMAC 시스템에 기초한 캡슐화 기술을 사용한다는 개념이 본 명세서에서 테스트되었고, 놀랍게도 셀룰로스 설페이트 및 pDADMAC로 만들어진 거대다공성 캡슐 내부의 미생물 세포(도 3)가, 캡슐의 다소 큰 기공 크기(거대분자의 방출을 허용하는 것으로 특허 US 6,540,995 및 US 6,426,088에서 입증됨), 및 부형제로서의 셀룰로스가 위 내의 위즙을 통한 분해로부터 세포를 보호하지 않는다는 당업계의 교시에도 불구하고, 비캡슐화 세포(도 4)보다 훨씬 더 오래 산 처리에 대해 생존하였다. 더 나아가, 세포는 생존가능하고 대사적으로 활성인 것으로 유지되었다. 그 다음 대부분의 세포는 장액, 예컨대 십이지장즙으로 처리되는 동안 캡슐화된 채로 유지되었으며, 이에 따라 세포는 마이크로캡슐 내에서 예를 들어 장을 포함하는 소화관을 통해 통과할 수 있고, 이에 따라 이들이 생산하는 효소를 이들의 주변 환경으로 캡슐 기공을 통해 방출할 수 있다. 마이크로캡슐화 조건에 의존하여, 마이크로캡슐로부터의 미생물 세포의 방출을 개선하기 위하여 소화관 내에서의 마이크로캡슐화 미생물 세포의 방출이 조정될 수 있다.
본 발명은 특정한 마이크로캡슐화 물질의 용도, 및 박테리아와 진균 또는 효모와 같은 다른 미생물, 특히 특정한 효모, 특정한 진균 및 특정한 박테리아로 이루어진 이종의 군(group)인 프로바이오틱 세포일 수 있는 살아있는 미생물 세포를 산성 수용액 중에서의 산성 분해로부터 보호하고, 추가로 이들을 생존가능하게 유지하면서 소화관을 통해 통과할 수 있게 하는 방법에 관한 것이다. 이는 또한 척추동물일 수 있으나, 바람직하기로 조류 및 포유동물일 수 있는 동물의 산성 위즙에 대해 생존한 후, 그에 따른 건강상의 유익함을 얻기 위하여, 효소를 이들의 주변 환경에 캡슐 기공을 통해 방출하는 미생물 세포의 캡슐화에 관한 것이다. 전체 문헌을 통하여 개시된 바와 같은 본 발명은 동물의 다양한 다른 하위군에도 또한 적용될 수 있는 것으로 이해된다. 그러나, 바람직한 동물은 조류, 특히 거위, 닭, 칠면조와 같은 식품 제조용으로 유용한 조류, 어류, 새우, 또는 설치류, 개 또는 고양이와 같은 포유동물, 특히 반추동물(소, 염소, 양, 바이손, 무스, 엘크, 버팔로, 사슴) 또는 돼지와 같은 식품 제조용으로 유용한 포유동물이다. 그러나, 가장 바람직하기로는 위장의 불균형을 예방 또는 치료하기 위한 인간이다. HCl 산성화된 수용액, 특히 위산 또는 위액 처리에 대해 적어도 1시간의 연장된 시간 동안 내성이 있고, 모의 장액(SIF) 또는 십이지장즙 등과 같은 장액 처리에 추가로 내성이 있는, 소화 효소를 생산하는 미생물 세포, 특히 프로바이오틱과 같은 미생물 세포를 함유하는 거대다공성 셀룰로스 설페이트 캡슐이 제공된다. 미생물 세포를 마이크로캡슐화하는 과정은 놀랍게도 간단하다. 본 명세서에 제공된 실험 데이터는 나트륨 셀룰로스 설페이트(NaCS) 및 폴리[디알릴-디메틸-암모늄 클로라이드] (pDADMAC)를 사용한 미생물 세포의 마이크로캡슐화가 거대다공성 마이크로캡슐을 초래하고 이는 캡슐화된 미생물 세포를 산성 환경, 뿐만 아니라 장즙의 다소 염기성 환경(pH는 본질적으로 대략 8임)에서의 분해로부터 성공적으로 보호한다는 점을 밝힌다. pH 2.0에서 HCl로 90분 처리 후에도, 캡슐화된 미생물 세포의 대사 활성은 여전히 비캡슐화 세포에 비해 높다. 이는 셀룰로스 설페이트 캡슐화된 세포가 캡슐 벽 내의 이들의 기공을 통해 항체만큼 큰 물질의 통과를 허용한다는 점을 입증하는 조사에서 보여준 바와 같이, 수소 이온(H3O+)이 비교적 큰 기공 크기(약 80 kDA 또는 그 이상)로 인하여 캡슐 내로 급속하게 확산될 것으로 예측되기 때문에 놀랍다. 어떤 이유인지, 그럼에도 불구하고 거대다공성 캡슐 표면을 초래하는 나트륨 셀룰로스 설페이트 및 pDADMAC를 사용한 캡슐화는 산성 용액에 의한 분해에 대한 상당한 보호를 제공한다. 십이지장즙과 같은 장액으로 처리된 경우, 마이크로캡슐은 여전히 온전하게 남아 있다. 그러나, 기공 크기는 미생물 세포에 의해 분비되는 효소가 캡슐 벽을 통과하여 예를 들어 소화관 내로 방출되도록 허용하기에 충분히 크다. 이는 많은 수의 생존가능한, 대사적으로 활성인 예를 들어 프로바이오틱 세포의 위를 통한 장 내로의 통과를 가능하게 한다.
동종 또는 이종의 설페이트화 셀룰로스 중 어느 하나일 수 있는 나트륨 셀룰로스 설페이트, 및 pDADMAC의 사용에 기초한, 세포 마이크로캡슐화 기술은 지금까지 산성 분해로부터 캡슐화된 박테리아 또는 프로바이오틱을 보호하기 위하여 적용된 바 없었으며 연장된 저장 기간 동안의 분해 또는 둘 다에도 적용된 바 없었다.
본 발명의 일 구현예는 이러한 기술을 식품 산업에 사용하기 위해 제공하는 것이다. 캡슐화된 미생물 세포는 특히 가축(farm animal)의 체중 증가를 강화하는데 유용하다. 예를 들어 고유한 미생물 집단의 더욱 효과적인 효소 조성물을 제공하는 미생물 균주로의 치환은 강화된 식품 활용으로 이어진다. 따라서, 식품 산업에서의 상기 기재된 바와 같은 기술 및 마이크로캡슐의 사용은 본 발명의 또 다른 구현예이다.
높은 기계적 강도와 우수한 생체적합성을 가질 뿐만 아니라 산성 조건에 의해 영향을 받지 않고, 장을 통해 통과할 때 캡슐로부터 세포 및/또는 세포 생산물을 방출함으로써 주변 환경의 변화에 반응할 수 있는, 이러한 셀룰로스 기초의 PEC 캡슐로 세포를 둘러싸는 화학적으로 정의된 출발 물질로부터 생산함으로써, 세포, 예컨대 식이요법 제품 및 경구적으로 투여되는 식품 첨가제의 프로바이오틱의 대다수의 나쁜 생존 문제점에 대한 해결책을 달성한다.
도 1은 캡슐화에 사용된 다가전해질의 화학적 구조를 나타낸다.
도 1a)는 나트륨 셀룰로스 설페이트(NaCS)의 화학적 구조를 나타낸다.
도 1b)는 폴리[디알릴-디메틸-암모늄 클로라이드] (pDADMAC)의 화학적 구조를 나타낸다.
도 2는 상이한 pH 값의 CaCO3를 포함하는, 본 발명에 따른 셀룰로스 설페이트 및 pDADMAC로 만들어진 캡슐을 나타내는 일련의 사진도를 보여준다. 첫 번째 캡슐은 pH 7.5이고 CaCO3 결정을 포함한다. 마지막 사진은 pH 3의 캡슐을 보여주며, 여기에서 CaCO3 결정은 용해되어 CO2의 기포가 캡슐 내부에서 관찰된다. 이는 산(H3O+)이 자유롭게 캡슐로 들어가서 CaCO3 결정을 용해시킬 수 있음을 입증한다. 따라서, NaCS/pDADMAC 캡슐이 산성 환경의 영향으로부터 미생물 세포를 보호할 수 있다는 점은 매우 놀라운 일이다.
도 3은 NaCS/pDADMAC 캡슐화 락토바실러스 아시도필러스 세포의 광학 현미경 사진을 보여준다.
도 4는 유리(사각형) 대 NaCS/pDADMAC 캡슐화(마름모꼴) 락토바실러스 아시도필러스의 산성 조건(HCl, pH 2)에서의 4 시간까지의 기간 동안의 생존율을 보여준다. 생존력은 Alamar Blue®에 의해 측정되었으며 상대 형광 단위(RFU)로 평가되었다.
본 발명의 대상은 다공성 캡슐 벽을 갖는 캡슐을 포함하는 캡슐화된 미생물 세포로서, 이때 상기 다공성 캡슐 벽은 셀룰로스 설페이트 및 폴리[디메틸디알릴-암모늄 클로라이드]로부터 형성된 복합체를 포함하고, 상기 캡슐화된 미생물 세포는 산성 수용액 처리에 내성이 있는 것, 특히 캡슐화되지 않을 경우 산성 수용액 처리에 민감한 박테리아 세포인 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서 사용된 세포 마이크로캡슐화 기술은 동종 또는 이종으로 설페이트화된 셀룰로스 중 어느 하나에 의하여 제조될 수 있는 나트륨 셀룰로스 설페이트의 사용에 기초한다. 본 발명에 따른 방법에 사용된 pDADMAC는 Dautzenberg et al . (1999b)에 개시되어 있는 바와 같이 다소 작은 분자량이다 (Dautzenberg H, Schuldt U, Grasnick G, Karle P, Muller P, Lohr M, Pelegrin M, Piechaczyk M, Rombs KV, Gunzburg WH, Salmons B, Saller RM. "Development of cellulose sulfate-based polyelectrolyte complex microcapsules for medical applications", Ann . N. Y. Acad . Sci . (1999), 875,46-63). 여기에는, 캡슐 벽의 최적 기계적 강도는 약 20 kDa의 pDADMAC를 사용하여 달성될 수 있다는 점이 개시되어 있다. 이러한 방식으로 제조된 캡슐은 적어도 80 kDa 또는 심지어 150 kDa까지의 크기에 따라, 단백질 또는 단일클론 항체의 통과를 허용하기에 충분히 큰 기공을 갖는 것을 특징으로 한다. 기공 크기와 사용된 pDADMAC의 크기의 의존성은 Dautzenberg et al . (1999a)에 개시된 바 있다 ("Size exclusion properties of polyelectrolyte complex microcapsules prepared from sodium cellulose sulphate and pDADMAC", Journal of Membrane Science, (1999), 162(1-2), 165-171). 더욱 낮은 분자량의 pDADMAC가 더욱 큰 기공 크기를 초래한다는 점이 분명하다. 소화 효소를 생산하고 분비하는 미생물 세포로부터 효소의 방출을 허용하기에 충분히 큰 기공 크기를 갖는 마이크로캡슐이 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에서, 캡슐은 0.01 내지 5 mm, 바람직하기로 0.05 내지 3 mm, 가장 바람직하기로 0.01 내지 1 mm의 직경을 갖는 구형 마이크로캡슐의 형태를 갖는 것이다. 또한, 캡슐은 상기 소화 효소에 대해 투과성이 있는 다공성 캡슐 벽을 갖는 것이 바람직하다. 마이크로캡슐은 효소가 통과하도록 허용하는 표면 기공을 포함하는 것을 특징으로 한다. 다공성 캡슐 벽의 표면 기공 크기는 효소가 통과하도록 허용하기 위하여 80 내지 150 nm인 것이 바람직하다. 다공성 캡슐 벽의 표면 기공은 50 내지 200 kDa, 바람직하기로 60-150 kDa, 가장 바람직하기로 60 내지 100 kDa의 분자량 컷 오프(MWCO)를 갖는 것이 특히 바람직하다.
소화 효소 및 이의 크기의 예로는 약 27 kDa의 크기를 갖는 비. 서브틸리스(B. Subtilis) 유래의 서브틸리신(Subtilisin)과 같은 프로테아제, 약 63 kDA의 알파-아밀라제, 약 82 kDa의 알파-갈락토시다제, 약 25 kDA의 브로멜라인 프로테아제, 약 32 kDa의 셀룰라제, 약 78 kDa의 글루코아밀라제, 약 35 kDa의 펙티나제, 및 약 20 kDa 크기의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 리파제이다. 정확한 크기는 생물체에 따라 달라질 수 있다. 이들 효소 중 일부는 또한 다이머(dimer)로서 작용한다.
상기 세포는 소비 후 본 발명에 따른 동물에 유익한 세포인 것이 바람직하다. 상기 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces), 데바로마이세스(Debaromyces), 칸디다(Candida), 피키아(Pichia) 및 토룰롭시스(Torulopsis)와 같은 효모, 아스퍼질러스(Aspergillus), 리조푸스(Rhizopus), 뮤코(Mucor), 페니실리움(Penicillium) 및 토룰롭시스와 같은 진균, 비피도박테리움(Bifidobacterium), 박테리오데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 푸조박테리움(Fusobacterium), 멜리소코커스(Melissococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 펩토스트렙토코커스(Peptostrepococcus), 바실러스(Bacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 마이크로코커스(Micrococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 웨이셀라(Weissella), 에어로코커스(Aerococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 지오바실러스(Geobacillus)와 같은 박테리아, 및 락토바실러스(Lactobacillus)와 같은 프로박테리아를 포함하는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 문맥에서, 미생물 세포는 효모, 진균 및 박테리아 및/또는 프로바이오틱을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있거나, 본 발명의 다른 구현예로서 미생물 세포는 이들 군으로부터 조합될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 용어 프로바이오틱 또는 프로바이오틱 세포는 교환가능하게 사용된다.
이들 캡슐화된 미생물 세포, 특히 소화 효소를 분비하는 것은 사카로마이세스, 비피도박테리움, 락토바실러스, 엔테로코커스, 스트렙토코커스, 바실러스, 락토코커스, 류코노스톡, 페디오코커스, 프로피오니박테리움 및 지오바실러스를 포함하는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
더욱 바람직하기로, 상기 세포는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cereviseae), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러 스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 앙굴라툼(Bifidobacterium angulatum), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 락 토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락 토바실러스 아밀로보러스(Lactobacillus amylovorus), 락 토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락 토바실러스 불리리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락 토바실러 스 카제이 아종. 카제이(Lactobacillus casei subsp . casei), 락 토바실러스 카제이 시로타(Lactobacillus casei Shirota), 락 토바실러스 커바터스(Lactobacillus curvatus), 락 토바실러스 델브루엑키 아종. 락티스(Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis), 락 토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락 토바실러스 파시미너스(Lactobacillus farciminus), 락 토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락 토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락 토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락 토바실러스 락티(Lactobacillus lacti), 락 토바 실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락 토바실러스 펜토사세우스(Lactobacillus pentosaceus), 락 토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락 토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락 토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)(락 토바실러스 지지)(Lactobacillus GG)), 락 토바실러 스 사케(Lactobacillus sake), 락 토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 마이크로코커스 바리안스(Micrococcus varians ), 페디오코커스 아시디락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 아시디락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 할로필러스(Pediococcus halophilus), 스트렙토코커스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커 스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스타필로코커스 카르노수스(Staphylococcus carnosus), 및 스타필로코커스 자일로수스(Staphylococcus xylosus)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
상기 세포는 프로바이오틱 세포인 것이 특히 바람직하다. 상기 프로바이오틱 세포는 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus caseei), 락토바실러스 델브루엑키 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus ), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토코커스 락티스 아종 락티스(Lactococcus lactis subsp lactis), 락토코커스 락티스 아종 크레모리스(Lactococcus lactis subsp cremoris), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테 리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테 리움 앙굴라툼(Bifidobacterium angulatum) 및 비피도박테 리움 롱굼(Bifidobacterium longum)을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다. 하나의 특정한 구현예에서, 상기 세포는 락토 바실러스 아시도필러스 또는 바실러스 서브틸리스 세포이다.
따라서, 본 발명의 특정한 구현예는 다공성 캡슐 벽이 동종 또는 이종으로 설페이트화된 셀룰로스 설페이트 중 어느 하나 및 폴리[디메틸디알릴-암모늄 클로라이드]로부터 형성된 복합체를 포함함으로써 캡슐화된 세포가 2 내지 4 시간의 기간 동안 2의 pH 값의 산성 수용액 처리에 대해 내성이 있는, 다공성 캡슐 벽을 갖는 캡슐을 포함하는, 캡슐화된 락토바실러스 아시도필러스 세포이다. 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 2 시간의 기간 동안 내성이 있는 것이다.
용어 "내성이 있는(resistant)"은 대다수의 미생물 세포가 이러한 처리 후에 여전히 생존가능한 상황을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
대다수의 이들 세포가 이러한 산성 수용액 처리 후에 여전히 생존가능한 것이 바람직하다. 대다수의 세포가 이러한 처리 후에 여전히 대사적으로 활성이고 상기 세포가 여전히 효소를 생산하고 방출하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 문맥에서, 상기 대다수는 적어도 51%의 세포인 것으로 이해된다. 60% 내지 90%의 세포가 생존가능하게 남아 있는 것이 바람직하다. 60% 내지 80%의 세포가 생존가능하게 남아 있는 것이 더욱더 바람직하다. 60%의 세포가 산 처리 후에 생존가능하게 남아 있는 것이 특히 바람직한 구현예이다. 적어도 캡슐화된 세포가 산성 수용액 처리 후에, 캡슐화되지 않고 동일한 조건 하에서 처리된 동일한 타입의 세포보다 대사적으로 활성인 것으로 이해된다.
바람직한 구현예에서, 산성 수용액의 처리 시간은 0.5 내지 2.5 시간, 바람직하기로 1 내지 2 시간, 가장 바람직하기로 1.5 시간이다. 또한, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 산성 수용액은 1.0 내지 3.0, 바람직하기로 1.5 내지 2.5의 pH 범위를 가지며, 가장 바람직하기로 2.0의 pH이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 캡슐화된 세포는 아밀라제, 예컨대 알파-아밀라제, 갈락토시다제, 특히 알파-갈라고토시다제, 프로테아제, 특히 브로멜라인 프로테아제 및 서브틸리신, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 펙티나제 및 리파제를 포함하는 군으로부터 선택되는, 소화 효소를 생산하고 방출한다. 상기 효소는 상기를 포함하는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 캡슐화된 세포는 비피도박테리움, 락토바실러스, 엔테로코커스, 스트렙토코커스, 바실러스, 락토코커스, 류코노스톡, 페디오코커스, 프로피오니박테리움 및 지오바실러스의 군으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 미생물 세포는 바실러스 서브틸리스 세포이고 분비되는 효소는 프로테아제, 특히 서브틸리신이다. 캡슐화된 프로바이오틱 세포와 관련된 본 발명의 또 다른 구현예는 다공성 캡슐 벽이 반대로 하전된 다가전해질 셀룰로스 설페이트 및 폴리[디메틸디알릴-암모늄 클로라이드]로부터 형성된 다가전해질 복합체를 포함함으로써 이들 캡슐화된 프로바이오틱 세포가 산성 수용액 처리에 내성이 있으며, 상기 캡슐이 장액 처리시 살아있는 프로바이오틱 세포의 적어도 일부를 방출하는 것을 특징으로 하는, 다공성 캡슐 벽을 갖는 캡슐을 포함한다. 산성 수용액은 위즙 또는 위액일 수 있다. 장액 처리는 조류, 또는 인간을 포함하는 포유동물의 장을 통해 통과하는 것을 포함한다. 바람직하기로, 장액은 십이지장즙 또는 십이지장액을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 캡슐을 포함하는 캡슐화된 프로바이오틱 세포는 모의 위액(SGF) 처리에 대해 견디는 것을 특징으로 하며, 이때 모의 십이지장액 또는 모의 장액(SIF) 처리는 캡슐 밖으로의 적어도 일부의 프로바이오틱 세포의 방출을 유발하거나 야기한다.
본 발명의 또 다른 구현예는, 본 발명의 구현예인 것으로 또한 이해되는, 상기 기재된 바와 같은 다양한 구현예에 따른 이러한 캡슐화된 미생물 세포를 포함하는 식품 보조제(food supplement)를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 또 다른 구현예는 캡슐화된 미생물 세포, 바람직하기로 프로바이오틱 박테리아 세포, 또는 캡슐화된 효모, 또는 바람직하기로 상기 기재된 바와 같은 프로바이오틱 진균 세포인 캡슐화된 진균 세포를 포함하는 제형, 바람직하기로 약학적 제형 또는 약학적 조성물이다. 캡슐화된 미생물 세포는 약제 또는 예방제로서 사용될 수 있다. 이들은 항생제에 의해 야기된 설사, 및 항생제 치료에 대해 반응하거나 반응하지 않는, 장내 불균형 박테리아 집단으로 고통받는 다른 형태를 포함하는 설사를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 나트륨 셀룰로스 설페이트는 셀룰로스 린터(linter)를 사용하여 시작하는 동종으로 설페이트화하는 방법으로 제조되었다. 그러나, 적어도 80 kDa의 큰 기공을 갖는 캡슐의 형성을 초래하는, Dautzenberg et al. (1999b)("Development of Cellulose Sulphate-based Polyelectrolyte Complex Microcapsules for Medical Applications", Ann. N. Y. Acad. Sci., (1999), 875, 46-63)에 따른 이러한 물질처럼, 이종으로 설페이트화된 셀룰로스를 사용하는 것이 또한 가능하다.
이러한 캡슐화된 미생물 세포 또는 캡슐화된 프로바이오틱을 포함하는 식품 보조제가 본 발명의 일 구현예인 것으로 또한 이해된다. 더 나아가, 상기 기재된 바와 같은, 캡슐화된 박테리아 세포 또는 프로바이오틱을 포함하는 제형, 바람직하기로 약학적 제형이 본 발명의 또 다른 구현예이다.
WO/2006/095021 (US 20090011033)에, 충분한 품질(quality)의 셀룰로스 설페이트의 제조를 나타내는 방법이 개시되어 있다. 사용되는 셀룰로스 설페이트는 100-500 kDa, 바람직하기로 200-400 kDa, 가장 바람직하기로 250-350 kDa의 분자량인 것이 바람직하다. 본 출원의 실시예 부분의 실험은 독일 포츠담의 Fraunhofer Institute of Applied Polymer Research (IAP)에 의해 제공되는 NaCS 물질 (09-Sul-592)을 사용하여 수행되었다.
셀룰로스 설페이트 캡슐의 제조는 Dautzenberg의 DE 40 21 050 A1에 상세하게 설명되어 있다. 또한, 셀룰로스 설페이트의 합성은 그 안에 개시되어 있으며, 셀룰로스 설페이트 캡슐의 종합적인 특징화를 위한 방법은 H. Dautzenberg et al ., Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech., (1993), 21(3), 399-405에서 광범위하게 다루고 있다. 다른 셀룰로스 설페이트 캡슐이 GB 2 135 954에 개시되어 있다. 상기 셀룰로스 캡슐의 특성, 즉 크기, 기공 크기, 벽 두께 및 기계적 강도는 예를 들어 캡슐이 제조된 물리적 상황, 침전 배쓰의 점도, 이의 이온 강도, 온도, 세포/셀룰로스 설페이트 현탁액의 첨가 빠르기, 셀룰로스 설페이트의 구성과 같은 여러 인자들 뿐만 아니라 Dautzenberg 그룹에 의해 개시된 다른 파라미터에 의존한다.
일반적으로, 캡슐을 형성하기 위하여, 나트륨 셀룰로스 설페이트는, 몇몇을 열거하자면 예를 들어 Aldrich Co., USA 또는 Katpol Chemie로부터 입수할 수 있는, pDADMAC 수용액과 접촉시킨다. 대안적으로, 폴리[디메틸디알릴-암모늄 클로라이드] (pDADMAC, 또는 PDMDAAC로서 또한 언급됨)는 (독일 텔토브의 University of Potsdam, Department of Chemistry에 의하면) 디메틸-디알릴-암모늄 클로라이드의 라디칼 중합을 통해 제조할 수 있다. Mansfeld 및 Dautzenberg는 증류수 중의 PDMDAAC (pDADMAC)의 1.2 % (w/v) 용액을 사용하는 것을 제안한다. pDADMAC는 다양한 상이한 크기로 구입할 수 있다. Zhang 등(Zhang, Yao and Guan, 2005 Preparation of macroporous sodium cellulose sulphate/poly(dimethyldiallylammonium chloride) capsules and their characteristics. Journal of Membrane Science. Volume 255, Issues 1-2, 2005, Pages 89-98)은 200,000-350,000 Da의 분자량을 갖는 pDADMAC를 사용한 반면, Dautzenberg는 10,000-30,000 Da의 분자량의 pDADMAC를 제안한다.
WO/2006/095021 (US 20090011033)에, 충분한 품질의 셀룰로스 설페이트 샘플을 초래하는 방법이 개시되어 있다. 이러한 공정에서, n-프로판올 및 황산의 반응 혼합물은 설페이트화 매질 및 작용제로서의 역할을 하였다.
나트륨 셀룰로스 설페이트(도 1a)는 다가음이온으로서의 역할을 하고 폴리[디알릴디메틸암모늄 클로라이드] (pDADMAC)(도 1b)는 다가양이온으로서의 역할을 한다. NaCS 용액은 캡슐 코어를 구축하기 위해 사용되며 pDADMAC 용액은 방울의 표면에서의 PEC 형성을 위한 제2 반응 성분을 전달하는 침전 배쓰로서 작용함으로써, 고체 막으로 상기 방울을 피막시킴으로써 캡슐을 형성한다. 상업적으로 이용가능한 캡슐화 기계가, 전체 발명의 맥락에서 비드 또는 마이크로스피어로도 언급되는, 마이크로캡슐을 형성하는데 사용될 수 있다. 이러한 캡슐화 장비(encapsulator)는 노즐을 통해 정해진 속도로 NaCS 용액을 밀어내어 지속적인 액체 흐름을 생성하는 퍼퓨셔 드라이브(perfussor drive)를 포함한다. 상기 액체 흐름을 맥동(pulsation) 단위로 진동시키며, 이때 겹치는 진동은 출구 액체 스트림의 중단 또는 동일한 부피의 비드로의 분출을 야기한다. 비드의 단일-분산성을 향상시키고 동시에 유착(coalescence)을 감소시키기 위하여, 전기장이 이러한 캡슐화 장비의 노즐 출구 아래에 제공된다. 유리 상(free phase)의 정전기적 하전은 개개의 비드의 반발 작용을 야기하여, 복합체-형성 배쓰로의 진입까지 개개의 비드의 응집을 실질적으로 방지한다.
이러한 방식으로 형성된 구형 비드는 복합체-형성 배쓰 내로 적하되며, 그 안에서 캡슐의 외부 막이, 예를 들어 NaCS 및 pDADMAC 용액 간의, 정전기적 상호작용에 의하여 캡슐 주변에 형성된다. 지속적인 교반 하에, 캡슐은 해당 용기 내에서 원하는 경화 정도에 도달할 때까지 이러한 시스템 내에 머무르며 그 다음 추가적인 공정에 이용할 수 있다.
캡슐화 장비 또는 다른 에어젯 방울 생성기 시스템의 부재시에는, 시린지를 아마도 적합한 시린지 펌프 압출 시스템과 더불어 0.2 내지 1.0 mm 내부 직경 니들과 함께 사용할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 1.5 mm의 내부 직경을 갖는 파스츄어 피펫의 사용으로 본 발명에 따른 산 내성의 캡슐을 생성시킨다.
생성된 캡슐은 80 kDa까지 또는 심지어 150 kDa까지의 거대분자, 예를 들어 항체 단백질이 통과하도록 허용하기에 충분히 큰 기공 크기를 갖는다. 이러한 방식으로 제조된 캡슐은 이들 캡슐 내의 하이브리도마 세포로부터 생산된 항체를 이들 기공을 통해 방출하기에 충분히 큰 기공 크기를 갖는 것으로 보고되었다. Dautzenberg et al. 1999b ("Development of Cellulose Sulphate-based Polyelectrolyte Complex Microcapsules for Medical Applications")에 기재된 셀룰로스 설페이트 캡슐화 기술이, 생체 내에서 중화 단일클론 항체의 생산이 Fr-CasE 레트로바이러스에 대해 마우스를 보호할 수 있는지 여부를 시험하기 위해 사용되었다(Pelegrin et al., "Immunotherapy of Viral Disease by in Vivo Production of Therapeutic Monoclonal Antibodies", Human Gene Therapy (2000), 11,1407-1415). 이들 결과로부터, 캡슐이 단일클론 항체가 통과하도록 허용하기에 충분히 큰 기공을 갖는 것이 명백하다.
그러나, 본 발명의 물질 및 방법은 본 명세서에 개시된 특정한 성분의 사용으로 제한되지 않으며; 대신에 본 발명은 다른 공급원으로부터 구입한 성분, 또는 상기 기재된 바와 같은 방법으로 제조된 성분의 사용을 또한 포함하는 것으로 이해된다.
캡슐화 전에, 미생물 세포는 1의 OD 600 nm로 최고로 성장되고 수집된다. 그러나, 다른 OD 600이 또한 개시점으로서 적합하다. 그 다음, 이들은 하기와 같이 셀룰로스 설페이트 및 pDADMAC로 캡슐화된다:
미생물 세포는 Dautzenberg 등("Preparation and Performance of Symplex Capsules", Makromol. Chem., Suppl. 9, 203-210, 1985; "A new method for the encapsulation of mammalian cells", Merten et al., Cytotechnology 7:121-120, 1991; "Development of Cellulose Sulphate-based Polyelectrolyte Complex Microcapsules for Medical Applications" Annals of the New York Academy of Sciences, 875 (Bioartificial Organs II: Technology, Medicine, and Materials), 46-63, 1999b)의 방법에 따라 NaCS를 사용하여 마이크로캡슐화된다. 간략히 언급하면, NaCS는 다가음이온으로서의 역할을 하고 캡슐 코어를 구축한다. 다가양이온으로서의 폴리[디알릴디메틸-암모늄 클로라이드] 용액은 셀룰로스 설페이트 캡슐 코어의 표면에서의 다가전해질 복합체 형성을 위한 제2 반응 성분을 전달하고, 이에 따라 NaCS 코어 방울을 고체 막으로 피막시킴으로써 마이크로캡슐을 형성하는 침전 배쓰를 제공한다.
미생물 배양물은, 최고 1의 광학 밀도일 수 있는, 대부분의 미생물 세포에 대하여, 이들이 완전히 생존가능한 상태에 있는 것을 나타내는 광학 밀도까지 성장시킨다. 그 다음, 상기 박테리아 배양물의 일부분, 예를 들어 50 ul, 100 ul, 또는 200 ul을 1.8 % 나트륨 셀룰로스 설페이트(09-Sul-592, Fraunhofer Institute Golm, Germany) 및 0.9 % 내지 1 % 염화 나트륨을 함유하는 나트륨 셀룰로스 설페이트 용액의 약 20배(100 ul은 2 ml와 혼합됨)의 부피와 혼합한다. 그 다음, 이러한 용액의 소량씩을, 예를 들어 방울들을 1.3 % 24 kDa (21-25 kDa 평균 크기) pDADMAC의 배쓰 내로 도입시킨다. 캡슐화 장비가 이용가능하지 않거나 상기 기재된 바와 같은 방울 생성기 시스템이 없는 경우, 이는 시린지 및 니들을 사용하여 수행할 수 있다. 4분의 경화 시간 및 수 차례의 세척 단계 이후에, 캡슐화된 세포가 배쓰로부터 얻어지고 사용 또는 저장을 위해 준비된다.
이때 이들 캡슐화된 세포는 본 발명의 또 다른 구현예로서 식품 성분으로서 식품의 다양한 타입에 추가적으로 첨가될 수 있다. 대안적으로, 이들은 약학적 조성물 또는 약학적 제형으로서 소비될 수 있다. 예를 들어, 이들은 이를, 정확한 양의 마이크로캡슐을 삼키고, 장 건강 및 기능의 지원 이외의, (선택된 박테리아 균주에 따라) 항생제 치료 이후 소화관의 개체군 증가(repopulating), 락토스 과민증 상쇄, 면역 시스템 지원 및 콜레스테롤 감소를 포함하는, 원하는 건강상의 유익함을 얻는데 적합하게 만드는, 장용 피복을 갖는 (마크로-)캡슐로서 제공될 수 있다. 영양상의 유익함은 칼슘, 아연, 철, 망간, 구리 및 인의 생체이용률과 비타민의 합성을 강화하는데 있어서의 이들의 역할을 포함한다. 이들 미생물 세포의 치료상의 유익함은 항미생물 활성, 콜레스테롤을 소화흡수하는 능력, 개선된 락토스 과민증 및 항-발암 활성을 포함한다.
캡슐화 이후, 캡슐화된 미생물 세포는 전체 캡슐 부피가 미생물 세포로 채워질 때까지 추가로 배양될 수 있으며, 이는 현미경에서 치밀한 덩어리로 보여질 수 있다. 캡슐이 미생물 세포로 더욱 치밀하게 채워질수록, 이들은 산성 환경으로부터 더욱 보호되고 더욱 많은 미생물 세포가 위 통과, 또는 산성 수용액 또는 위액과의 인큐베이션에서 생존한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 구현예는 a) 살아있는 세포를 다가전해질 나트륨 셀룰로스 설페이트의 수용액 중에 현탁시키는 단계, b) 미리 형성된 입자 형태의 상기 현탁액을 반대로-하전된 다가전해질 폴리[디메틸디알릴-암모늄 클로라이드]의 수용액을 포함하는 침전 배쓰 내로 도입시키는 단계, c) 상기 배쓰 내의 반응을 1 내지 60분, 바람직하기로 3-10 분, 더욱 바람직하기로 3-5 분, 가장 바람직하기로 4 분 후에 종결시키는 단계, d) 캡슐화된 세포를 배쓰로부터 수집하는 단계, e) 선택적으로 추가적인 영양 인자를 포함하는 매질 또는 용액 내에서 상기 캡슐화된 세포를 인큐베이션시키는 단계, f) 선택적으로 캡슐이 완전히 세포로 채워질 때까지 상기 캡슐화된 세포를 인큐베이션시키는 단계, g) 상기 캡슐화된 세포를, 이들이 캡슐화되지 않은 경우 상기 세포를 분해하는 것으로 알려져 있는 산성 수용액 처리에 노출시켜, 대다수의 캡슐화된 세포를 생존가능하게 유지시키는 단계를 포함하는 캡슐화를 통해, 산성 수용액 처리에 의해 분해되는 것으로부터 세포를 보호하는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 맥락에서, 대다수는 세포의 적어도 51 %, 세포의 적어도 60 % 또는 60 내지 90 %인 것으로 이해된다. 바람직한 구현예에서, 세포의 60 % 내지 80 %가 생존가능하게 유지된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 청구된 바와 같은 방법은 0.5 내지 3 시간의 기간 동안 수용액을 사용한 산 처리에 대한 보호를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 상기 기간은 1 내지 2 시간이고, 특히 바람직하기로는 90 분의 기간이다. 본 명세서에서, 대다수의 세포가 여전히 생존가능하거나 또는 여전히 대사적으로 활성인 경우, 또는 동일한 조건 하에서 처리된 캡슐화되지 않은 세포와 비교했을 때 더욱 많은 캡슐화된 세포가 생존가능하게 유지된 경우에 보호가 달성되는 것으로 이해된다. 대사적으로 활성인 것은 형광성 레조루핀으로 환원되는 레자주린과의 인큐베이션 이후 570 nm에서의 UV-Vis 분광광도계 상에서의 기록이 바탕 또는 음성 대조구 값과 유의적으로 차이가 있음을 보여주는 것으로서 이해된다.
또한, 세포를 처리하는 산성 수용액이 위즙, 위액, 모의 위액, 또는 모의 위즙 중 어느 하나인 것이 바람직하다. 산성 용액 처리에 대한 노출은 산성 수용액 중에서의 인큐베이션일 수 있고, 바람직한 구현예에서 상기 처리는 생리적인 조건 하에서 수행된다. 더 나아가, 캡슐화된 세포는 모의 장액과 같은 장액, 또는 십이지장즙으로 처리되는 것에 대해 추가로 내성이 있는 것이 바람직하다.
용어 "모의 위액"은 문헌에 개시되어 있는 다양한 인공적으로 제조된 위액을 포함하는 것으로 이해된다. 이들 중 하나가 예로서 본 명세서에 개시된다: 모의 위액은 예를 들어 기본 위액과 펩신으로 제조될 수 있다. 기본 위액은 일부 변형시켜 Clavel et al. (J Appl Microbiol. (2004), 97(1), 214-219)에 따라 제조되어 왔다. 이는 1 L의 증류수 중에 용해된 4.8 g의 NaCl (POCH, Poland), 1.56 g의 NaHCO3 (POCH, Poland), 2.2 g의 KCl (POCH, Poland), 및 0.22 g의 CaCl2 (POCH, Poland)를 함유하였다. 121℃/15 분에서 오토클레이브시킨 후, 기본 위액의 pH를 1 M HCl을 사용하여 2.4±0.2로 조정하고, 상기 모의 위액의 50 mL 당 2 mg의 펩신 (Sigma Aldrich, USA)을 첨가하였다.
용어 "모의 장액"은 문헌에 개시되어 있는 다양한 인공적으로 제조된 장액 또는 십이지장액을 포함하는 것으로 이해된다. 이들 중 하나가 예로서 본 명세서에 개시된다: 모의 십이지장액은 기본 십이지장액과 효소 복합체로 제조될 수 있다. 기본 십이지장액은 일부 변형시켜 Marteau et al. (J Dairy Sci. 1997: 80(6),1031-37)에 따라 제조될 수 있다. 이는 1 L의 1 mol/L NaHCO3 (POCH, Poland) 중에 용해된 5.0 g의 NaCl (POCH, Poland), 0.6 g의 KCl (POCH, Poland), 0.03 g의 CaCl2 (POCH, Poland), 및 17 g의 담즙산염 (Merck, Germany)을 함유하였다. 121℃/15 분에서 오토클레이브시킨 후, 기본 즙의 pH를 1 M NaOH을 사용하여 7.0±0.2로 조정하고, 효소 복합체를 첨가하였다. 췌장 효소: 20000 F.I.P. 단위의 리파제, 16000 F.I.P. 단위의 아밀라제, 1200 F.I.P. 단위의 프로테아제(Solvay Pharmaceuticals, USA로부터 구입한 Kreon® 10000의 2개의 캡슐 (300 mg 췌장 효소))로 구성된 효소 복합체를 액 50 mL 당 첨가하였다.
본 발명의 또 다른 구현예는, 하기 단계를 포함하는, 산성 수용액 처리에 대해 내성이 있고 생성된 효소가 통과하도록 허용하는 다공성 벽을 갖는, 미생물 세포를 포함하는 마이크로캡슐을 초래하는, 나트륨 셀룰로스 설페이트 및 pDADMAC를 사용하여, 소화 효소를 생성하고 분비하는 캡슐화된 미생물 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다:
i) 이러한 미생물 세포의 배양물을, 바람직하기로 1.8 % 나트륨 셀룰로스 설페이트 및 0.9 내지 1 % 염화 나트륨을 함유하는, 나트륨 셀룰로스 설페이트 용액으로 현탁시키는 단계, 및
ii) 미리 형성된 입자 형태의 상기 현탁액을, 바람직하기로 1.3 % 24 kDa (20-25 kDa) pDADMAC를 포함하는 침전 배쓰 내로 도입시키고 상기 배쓰로부터 미생물 세포를 포함하는 마이크로캡슐을 수집하는 단계. 상기 침전 배쓰 내의 반응은 예를 들어 과량의 세척액을 첨가하여 1-60 분 후, 바람직하기로 1-10 분, 더욱 바람직하기로 3-5 분, 가장 바람직하기로 4 분 후에 종결되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구현예는, 하기 단계를 포함하는, 나트륨 셀룰로스 설페이트 및 pDADMAC를 사용한 캡슐화에 의하여 프로바이오틱 미생물 세포의 산성 분해를 예방하는 방법을 포함한다: 프로바이오틱 세포의 배양물을 1.8 % 나트륨 셀룰로스 설페이트 및 0.9 % - 1 % 염화 나트륨을 함유하는 나트륨 셀룰로스 설페이트 용액으로 현탁시키는 단계, 미리 형성된 입자 형태의 상기 현탁액을 예를 들어 5 ml 시린지 및 23G 니들을 사용하여 1.3 % 24 kDa pDADMAC(여기에서, 24 kDa pDADMAC는 평균 크기로서 이해되는 것임)를 포함하는 침전 배쓰 내로 도입시키는 단계, 및 프로바이오틱 세포를 포함하는 마이크로캡슐을 배쓰로부터 수집하는 단계. 바람직한 구현예에서, 침전 배쓰 내의 반응은 3-5 분 후, 바람직하기로 4 분 후에 종결된다. 제조업자 Katpol Chemie의 24 kDa pDADMAC가 20-25 kDa의 범위를 포용하기 위해 지정된다.
엘. 아시도필러스(L. acidophilus) 세포의 마이크로캡슐화의 경우, 배양물로부터 얻은 세포를 기재된 바와 같은 NaCS와 혼합할 수 있고 마이크로캡슐을 실시예에 기재된 바와 같이 시린지와 니들을 사용하여 손으로 제조할 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 캡슐화된 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 포함한 동물의 장 내로, 캡슐화되지 않은 경우 위산에 민감한, 생존가능한 세포를 도입하는 방법을 제공한다.
또한, 설사, 항생제 야기된 설사 및 장 내 불균형의 박테리아 집단으로 고통받는 다른 형태에 걸렸거나 걸릴 것으로 예측되는 포유동물에게 본 발명에 따른 캡슐화된 세포를 투여함으로써 설사, 항생제 야기된 설사 및 장 내 불균형의 박테리아 집단으로 고통받는 다른 형태를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
숙련된 측정자는 세포 밀도뿐만 아니라 NaCl의 농도가 달라질 수 있음을 알 것이다. 또한, 캡슐의 형성은 240 초의 정확한 경화 시간으로 제한되지 않는다. 또한, NaCl 용액이 PBS 용액 또는 다른 버퍼 용액으로 대체될 수 있다.
이전에 Inotech에 의해 공급된, EncapBioSystems, Switzerland의 캡슐화 장비 IE-50R 및 IEM-40과 같은 장치를 수반하는 자동화된 공정으로 제조되는 경우, 캡슐의 크기는 200 - 1200 um의 직경으로 다양할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 캡슐 크기는 200 - 700 um이고, 더욱더 바람직하기로 캡슐 크기는 200 - 500 um이다.
대안적인 제조 방법은 파스츄어 피펫의 사용을 포함한다. 손으로 캡슐을 제조하기 위해 파스츄어 피펫을 사용하는 경우, 마이크로캡슐의 직경은 3,000 - 5,000 um의 크기에 달하였다.
이에 의한 큰 크기의 캡슐은, 손상되지 않은 마이크로캡슐 내의 세포의 위산으로부터의 완전한 보호를 허용하기 위하여, 건강보조식품(dietary supplement)을 먼저 씹지 않고 삼킬 필요가 있다는 것을 인식하는, 알고 있는 소비자, 또는 환자에 의한 다른 방식의 섭취를 필요로 한다. 상기 크기는 가공 및 저장 동안 생존 시간에 달리 영향을 주지 않아야 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 캡슐의 크기는 500 내지 700 um의 직경이다.
다른 바람직한 구현예에서, 캡슐은 손으로 제조되는 경우, 즉 캡슐화 장비와 같은 장치가 없는 경우, 적어도 3,000 um의 직경을 갖는다.
이와 같이 캡슐화된 세포는, 상기 캡슐화된 세포가 위산 처리에 대해 생존하기로 되어 있는 경우에, 식품에 첨가제로서 사용될 수 있다. 이들은 또한 상온(RT)에서 연장된 기간 동안 저장될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는 상기 기재된 방법에 따른 캡슐화된 미생물 세포를 포함하는 제형, 예컨대 약학적 제형이다.
농업 산업을 위한, 산성 액에 대한 내성이 있는 캡슐화된 미생물 세포와 같은, 전체적으로 기재된 바와 같은 이들 새로운 물질 및 방법의 적용이 또한 본 발명의 구현예이다. 인간 소화 시스템과의 유사성으로 인하여, 본 발명의 방법 및 물질은 음식 소화, 영양 흡수를 증가시킴으로써 소화관 관련 문제를 감소시키기 위하여, 동물, 특히 인간에게 유익한 프로바이오틱을 전달하는데 사용될 수 있다. 농업 목적과 관련하여, 유익한 프로바이오틱의 전달은 육류 생산을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 전체 문헌 내내 기재된 바와 같은 본 발명은 조류, 특히 거위, 닭, 칠면조와 같은 식품 제조용으로 유용한 조류, 어류, 새우와 같은 동물 또는 반추동물(소, 염소, 양, 바이손, 무스, 엘크, 버팔로, 사슴)과 같이 식품 제조용으로 유용한 포유동물의 다양한 하위군에 적용될 수 있는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 상기에 소화 효소를 생산하고 분비하는 캡슐화된 미생물 세포를 제조하는 방법이 제공되며, 여기에서 이들 캡슐은 상기 소화 효소에 대해 투과성이 있고 산성 수용액 처리에 내성이 있는 다공성 캡슐 벽을 갖는다. 이러한 방법은 소화 효소를 생산하는 세포를 다가전해질의 수용액 중에 현탁시킨 후, 미리 형성된 입자, 예컨대 방울 형태의 현탁액을 반대로-하전된 다가전해질의 수용액을 포함하는 침전 배쓰 내로 도입시키는 것을 포함한다.
실시예
하기 실시예에서, AlamarBlue® 분석으로 명명되는, 세포의 대사 활성을 측정하는 분석이 이용되었다. "AlamarBlue"는 예를 들어 Invitrogen 또는 Promega에 의해 제공되는 분석에 대한 TREK Diagnostic Systems에 의한 등록 상표이다. 이하에서, 명칭 AlamarBlue는 청색이고 사실상 비-형광성인 세포 투과성 화합물인 레자주린을 전환하기 위해 살아있는 세포의 활성 성분 천연 환원력을 사용하는 분석을 언급하는데 사용될 것이다. 대사적으로 활성인 세포를 진입시키면, 비-형광성 지시 염료인 레자주린이 밝은 적색-형광성 레조루핀으로 환원된다. 생성되는 형광의 양은 살아있는 세포의 수에 비례한다. 10 ul의 AlamarBlue®가 100 ul의 세포 현탁액에 첨가되고 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션되었다. AlamarBlue® 분석 플레이트의 형광은 Tecan Infinite M200 판독기로 기록하였다. 형광은 560EX nm/590EM nm 필터 세팅을 사용하는 임의의 플레이트 판독기 또는 형광 분광광도계로 측정될 수 있다. 대안적으로, AlamarBlue®의 흡광도는 570 nm에서 UV-Vis 분광광도계 상에서 기록될 수 있다.
캡슐화를 위해 사용된 미생물 세포 및 프로바이오틱은 그에 따른 공급자로부터 동결 건조된 채로 전달된 다음, 액체 매질 내에서 배양되었다. 이들 배양물의 샘플은 개별적인 실험에 사용하기 위하여 글리세롤 스톡(glycerol stock)으로서 동결 유지되었다.
실시예 1: 락토바실러스 아시도필러스 의 1.0의 OD까지의 성장
락토바실러스 아시도필러스의 배양을 해빙된 박테리아 스톡으로부터의 20 ul 샘플을 사용하여 이를 50 ml EM 플라스크 내의 50 ml MRS (이의 발명자들에 의해 명명됨: de Man, Rogosa 및 Sharpe, 1960년에 개발됨; 1 리터의 MRS 배지의 제조: 51g MRS 브로쓰 분말, 1g 폴리소르베이트 80, 0.5g L-시스테인 하이드로클로라이드 및 pH 6.2로 조정된 999ml의 H2O) 내로 주입시킴으로써 시작하였다. 스톡은 -80℃에서 보관하였으며 DSM (카탈로그 번호 DSM 20079) (Moro) Hansen and Mocquot (ATCC 4356)로부터 구입하였다. 상기 배양물을 50 rpm에서 쉐이킹하면서 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션시켰다. 실험 1일째에, 박테리아 배양물의 광학 밀도를 Tecan Infinite M200 상에서 600 nm로 측정하였다. 전형적으로, 1의 기록을 주는 600 nm에서의 광학 밀도가 박테리아 성장의 지수기(exponential phase)에 해당할 것이다. 세포가 스트레스 테스트를 수행하기 전에 지수기에 있는 것을 확실히 하기 위하여, 세포를 1의 OD 600 nm 기록까지 성장시켰다 (표 1 참조).
표 1: 하룻밤 동안 성장시킨 락토바실러스 아시도필러스 배양 프로파일.
Figure 112013075958518-pct00001

실시예 2: 염산 중에서의 비-캡슐화된 락토바실러스 아시도필러스 세포의 생존
PBS (인산염 완충 식염수) 중의 0.01M HCl 용액을, 500 ml PBS에 4.2 ml의 37% HCl을 첨가함으로써 제조하였다. 5M HCl을 사용하여 pH 값을 정확히 2.0으로 조정하였다.
5 ul의 락토바실러스 배양물을 3개의 멸균 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube) 내의 1 ml의 PBS (인산염 완충 식염수 염 용액) 중의 염산에 첨가하였다. 대조구로서, 5 ul의 동일한 락토바실러스 배양물을 0 시간 시점에 3개의 멸균 에펜도르프 튜브 내의 1 ml의 PBS에 첨가하였다. 염산 시험을 다른 시점, 즉 1 시간, 1.5 시간 및 2 시간의 노출 시간 이후에 수행하였다.
다양한 시점에, 모든 에펜도르프 튜브를 1 분 동안 3000 x g의 속도로 원심분리시켜 염산을 제거하였다. 이들을 MRS 배지로 2회 세척하고 100 ul의 MRS 배지를 상기 펠렛 내에 첨가하였다. 상기 펠렛을 그 안에서 재현탁시키고 모두 96 웰 플레이트에 옮겼다.
상기 기재된 바와 같은, AlamarBlue 분석을 박테리아 세포의 대사 활성을 측정하기 위하여 수행하였다.
표 2: HCl에 대한 상이한 노출 시간 이후 RFU의 AlamarBlue 기록으로 측정된 유리 락토바실러스 아시도필러스의 생존력
Figure 112013075958518-pct00002

실시예 3: NaCS 및 pDADMAC 내에서의 락토바실러스 아시도필러스 의 캡슐화
1의 광학 밀도를 갖는 100 ul의 박테리아 배양물을, 1.8 % 나트륨 셀룰로스 설페이트 (09-Sul-592, Fraunhofer Institute에 의해 제공됨) 및 1 % 염화 나트륨을 포함하는 2 ml의 나트륨 셀룰로스 설페이트 용액과 혼합하고, 5 ml 시린지 및 23G 니들을 사용하여 1.3 % 24 kDa pDADMAC의 150 ml 배쓰 내로 적하시켰다.
pDADMAC 배쓰 내에서의 캡슐을 위한 경화 시간은 4 분이었다. 그 다음, 캡슐을 300 ml의 1xPBS로 8분 동안 1회 세척하고 300 ml의 1x PBS로 4 분 동안 1회 세척하였다. 이들을 이후 30 ml 1x 인산염 완충 식염수로 각각 3회 세척하고 30 ml MRS 배지로 각각 3회 세척하였다. 그 다음, 캡슐을 100 ml의 새로운 MRS 배지를 포함하는 250 ml 원뿔형 플라스크에 옮겼다. 이들 캡슐을 50 rpm의 속도로 37℃ 인큐베이터에서 배양시켰다.
상기 기재된 AlamarBlue 분석을 캡슐화된 락토바실러스 세포에 대해 수행하였다. 상기 분석을 블랭크 (100 ul LB 배지 + 10 ul alamar -blue) 상에서 3번 수행하고 캡슐 (100 ul MRS 배지 + 10 ul Alamar-Blue) 상에서 3번 수행하였다. 현탁된 세포 및 지시 염료를 포함하는 샘플을 37℃의 플레이트에서 2 시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 측정하였다.
표 3: 캡슐화 후 2일째의 RFU의 AlamarBlue 기록으로서 측정되는 캡슐화된 락토바실러스 아시도필러스의 생존력
Figure 112013075958518-pct00003

실시예 4: 염산 중에서의 캡슐화된 락토바실러스 박테리아의 생존
캡슐이 생존가능한 것을 확인한 후에, 염산 시험을 락토바실러스 캡슐에 대해 수행하였다. 1 ml의 인산염 완충 식염수 중의 염산에 대한 1 캡슐을 상이한 시점, 4 시간, 3 시간, 2 시간 및 1 시간에 24 웰 플레이트의 각각의 웰에 넣었으며 이를 3회 반복 실험하였다. 상기 실험에 대한 대조구로서, 1 캡슐을 0 시간 시점에 1 ml 인산염 완충 식염수에 첨가하였으며 이를 3회 반복 실험하였다.
0 시간에, 염산 인산염 완충 식염수 용액을 MRS 배지로 대체하였다. 캡슐을 MRS 배지로 2회 세척한 다음 1 대 1로 96 웰 플레이트에 옮겼다. 100 ul의 새로운 MRS 배지 및 10 ul alamar blue를 첨가하고 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. AlamarBlue 분석 플레이트를 Tecan Infinite M200 상에서 기록하였다.
표 4: HCl에 대한 상이한 노출 시간 이후 RFU의 AlamarBlue 기록으로 측정되는 캡슐화된 락토바실러스의 생존력
Figure 112013075958518-pct00004

HCl 시험 이후 락토바실러스 유리 박테리아 및 캡슐화된 박테리아의 AlamarBlue 기록의 비교는 HCl 중에서 2 시간 이후에 유리 박테리아의 생존력이 급격하게 떨어졌음을 보여주며 이는 유리 박테리아가 HCl 중에서의 2 시간의 노출 시간에 대해 생존하지 못함을 나타낸다. 그러나, 캡슐화된 박테리아의 RFU 기록은 심지어 HCl에 대한 4 시간의 노출 이후에도 높게 유지되며 이는 HCl 환경에서 캡슐의 더욱 높은 생존력과 향상된 생존율을 나타낸다.
대사적으로 활성인 캡슐화된 락토바실러스 균주는 pH 2.0의 염산염 용액의 환경에서 4 시간 이상으로 매우 생존가능하게 유지된 반면, 비캡슐화된 락토바실러스 박테리아는 pH 2의 염산염 용액 환경에서 1.5 시간 이상 생존하지 못한다 (도 4).

Claims (36)

  1. 캡슐화된 미생물 세포를 포함하는, 설사, 항생제 야기된 설사, 관절염, 비만, 과민성 대장 증후군, 속쓰림, 또는 만성 피로 증후군의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물로서, 상기 미생물 세포가 락토바실러스 속 균주를 포함하고, 상기 미생물 세포가 다공성 캡슐 벽을 갖는 마이크로캡슐 내에 캡슐화되며, 상기 다공성 캡슐 벽이 나트륨 셀룰로스 설페이트 및 폴리[디메틸디알릴-암모늄 클로라이드]로부터 형성된 복합체를 포함하고, 상기 마이크로캡슐이 산성 수용액에 의하여 분해되는 것으로부터 상기 미생물 세포를 보호하고, 상기 다공성 캡슐 벽의 표면 기공이 50 내지 200 kDa 사이의 분자량 컷 오프를 가지고, 상기 표면 기공이 미생물 세포로부터 장으로의 효소의 통과 또는 방출을 허용하기에 충분히 큰 기공 크기를 갖는 것인, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 캡슐화된 세포가 효소를 생산하고 분비하며, 상기 다공성 캡슐 벽이 상기 효소에 대해 투과성이 있는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 산성 수용액이 모의 위즙, 위즙 또는 위산인 것인, 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 마이크로캡슐이 장액 또는 십이지장액 처리시 상기 미생물 세포에 의해 생성된 효소를 방출하는 것인, 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 장액이 모의 장액 (SIF)이고 상기 십이지장액이 모의 십이지장액 (SDF)인 것인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 대다수의 캡슐화된 미생물 세포가 적어도 1.5시간 동안 1.0 내지 3.0의 pH 범위를 갖는 산성 수용액 처리에서 생존하는 것인, 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 대다수의 미생물 세포가 산성 수용액 처리에서 생존하는 것인, 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 대다수가 상기 세포의 51% 이상으로 정의되는 것인, 약학적 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 상기 미생물 세포가 동물의 소화관 내에서 적어도 부분적으로 방출되는 것인, 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 동물이 포유동물 또는 조류인 것인, 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조류가 칠면조, 닭 및 거위를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지, 반추 동물, 고양이, 개 및 인간을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 마이크로캡슐이 0.01 내지 5 mm의 직경을 갖는 것인, 약학적 조성물.
  17. 삭제
  18. 제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주가 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 아밀로보러스(Lactobacillus amylovorus), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이 아종. 카제이(Lactobacillus casei subsp. casei), 락토바실러스 카제이 시로타(Lactobacillus casei Shirota), 락토바실러스 커바터스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루엑키 아종. 락티스(Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파시미너스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 락티(Lactobacillus lacti), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 펜토사세우스(Lactobacillus pentosaceus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)(락토바실러스 지지)(Lactobacillus GG)), 락토바실러스 사케(Lactobacillus sake), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus caseei), 락토바실러스 델브루엑키 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus), 및 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii)를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
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  27. 제1항에 있어서, 상기 캡슐화된 세포가 소화 효소를 생산하고 분비하며, 상기 세포가 다공성 캡슐 벽을 갖는 마이크로캡슐 내에 캡슐화되고, 상기 다공성 캡슐 벽이 나트륨 셀룰로스 설페이트 및 폴리[디메틸디알릴-암모늄 클로라이드]로부터 형성된 복합체를 포함함으로써 캡슐화된 세포가 2 내지 4시간 동안 pH 2의 산성 수용액 처리에 대해 내성이 있는, 캡슐화된 락토바실러스 아시도필러스 세포를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 소화 효소가 알파 아밀라제, 글루코아밀라제, 알파 갈락토시다제, 프로테아제, 브로멜라인 프로테아제, 서브틸리신, 셀룰라제, 펙티나제 및 리파제를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  29. 삭제
  30. 제1항 내지 제8항, 제12항 내지 제16항, 제18항, 제27항, 및 제28항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물 및 선택적으로 적합한 담체를 포함하는 식품 보조제.
  31. 삭제
  32. 하기 단계 a) 내지 d)를 포함하는 마이크로캡슐화를 통해, 산성 수용액 처리에 의해 분해되는 것으로부터 미생물 세포를 보호하는 방법:
    a) 살아있는 미생물 세포를 다가전해질 나트륨 셀룰로스 설페이트의 수용액 중에 현탁시키는 단계;
    b) 미리 형성된 마이크로캡슐 형태의 상기 현탁액을 반대로-하전된 다가전해질 폴리[디메틸디알릴-암모늄 클로라이드]의 수용액을 포함하는 침전 배쓰 내로 도입시키는 단계;
    c) 상기 배쓰 내의 반응을 1-10분 후에 종결시키는 단계; 및
    d) 캡슐화된 세포를 상기 배쓰로부터 수집하는 단계,
    여기서 상기 미생물 세포는 락토바실러스 속 균주를 포함하고,
    상기 미생물 세포는 다공성 캡슐 벽을 갖는 마이크로캡슐 내에 캡슐화되며, 상기 다공성 캡슐 벽이 나트륨 셀룰로스 설페이트 및 폴리[디메틸디알릴-암모늄 클로라이드]로부터 형성된 복합체를 포함하고,
    상기 마이크로캡슐은 산성 수용액에 의하여 분해되는 것으로부터 상기 미생물 세포를 보호하고,
    상기 다공성 캡슐 벽의 표면 기공은 50 내지 200 kDa 사이의 분자량 컷 오프를 가지고, 상기 표면 기공이 미생물 세포로부터 장으로의 효소의 통과 또는 방출을 허용하기에 충분히 큰 기공 크기를 갖는 것임.
  33. 하기 단계 i) 내지 iii)을 포함하는, 나트륨 셀룰로스 설페이트 및 폴리[디메틸디알릴-암모늄 클로라이드]를 사용하여 효소를 생성하고 분비하며 산성 수용액 처리에 대해 내성이 있는 미생물 세포를 포함하고, 생성된 효소가 통과하도록 허용하는 다공성 벽을 갖는 마이크로캡슐을 생성하는, 캡슐화된 미생물 세포를 제조하는 방법:
    i) 미생물 세포의 배양물을, 1.8 중량% 나트륨 셀룰로스 설페이트 및 0.9 중량% 염화나트륨을 함유하는, 나트륨 셀룰로스 설페이트 용액으로 현탁시키는 단계;
    ii) 미리 형성된 마이크로캡슐 형태의 상기 현탁액을 1.3 중량% 폴리[디메틸디알릴-암모늄 클로라이드]를 포함하는 침전 배쓰 내로 도입시키는 단계; 및
    iii) 미생물 세포를 포함하는 마이크로캡슐을 세척한 후에 상기 배쓰로부터 이들을 수집하는 단계,
    여기서 상기 미생물 세포는 락토바실러스 속 균주를 포함하고,
    상기 미생물 세포는 다공성 캡슐 벽을 갖는 마이크로캡슐 내에 캡슐화되며, 상기 다공성 캡슐 벽이 나트륨 셀룰로스 설페이트 및 폴리[디메틸디알릴-암모늄 클로라이드]로부터 형성된 복합체를 포함하고,
    상기 마이크로캡슐은 산성 수용액에 의하여 분해되는 것으로부터 상기 미생물 세포를 보호하고,
    상기 다공성 캡슐 벽의 표면 기공은 50 내지 200 kDa 사이의 분자량 컷 오프를 가지고, 상기 표면 기공이 미생물 세포로부터 장으로의 효소의 통과 또는 방출을 허용하기에 충분히 큰 기공 크기를 갖는 것임.
  34. 삭제
  35. 제1항 내지 제8항, 제12항 내지 제16항, 제18항, 제27항, 및 제28항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 장 내로 생존가능한 미생물 세포를 도입하는 방법.
  36. 삭제
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