JP6033998B2 - プロバイオティクスの保存と送達 - Google Patents
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Description
Mogensen, G., Salminen, S., O’Brien, J., Ouwehand, A., Hozapfel, W., Shortt, C., Fonden, R., Miller, GD., Donohue, D., Playne, M., Crittenden, R., Bianchi-Salvadori, B. and R. Zink (2002)。 Food microorganisms - health benefits, safety evaluation and strains with documented history of use in foods Internat, Dairy Federation Bulletin No:377:4 - 9およびMogensen, G., Salminen, S., O’Brien, J., Ouwehand, A., Holzapfel, W., Shortt, C., Fonden, R., Miller, GD., Donohue, D., Playne, M., Crittenden, R., Bianchi-Salvadori, B. and R. Zink (2002) Inventory of microorganisms with a documented history of use in food Internat, Dairy Federation Bulletin No:377:10 - 19で述べられている。
・競争的排除(胃腸粘膜表面における適した位置を占有し、感染菌種の定着を防ぐ)
・ 酸性条件の生成(菌株による乳酸発酵により、胃腸のpH値は低下する)
・ 免疫介在性の応答への影響
・ 腐敗性、遺伝毒性腸反応の低減(ひいては前発癌物質レベルの低下)
・ バクテリオシンなどの抗菌剤を放出。
目標部位が小腸にある場合、バクテリア(おそらくいくつかの乳酸桿菌をのぞいて)は腸壁に十分な数付着しそうもないので、プロバイオティクスを毎日摂取することが必要である。しかし、目標部位が大腸であれば、バクテリアの増殖と定着の可能性があるので、連日の摂取は必要ではないかもしれない。
する耐性や抗生物質に対する耐性、細胞壁への接着性)を持つとは限らない。目標部位へ到達するまでの間のバクテリアの保護が通常必要となる。
米国特許第6060050号は、担体であり、かつ大腸をはじめとする胃腸管内の領域で増殖媒体または維持媒体としても作用する高アミロースデンプンと、ビフィズス菌などのプロバイオティクスバクテリアとを組み合わせることを開示している。
本発明の目的はプロバイオティクスを加工および貯蔵中の劣化から守り、胃腸管の特定部位への送達を可能にするために、これをカプセル化する方法を提供することである。
・ タンパク質と炭水化物の水性懸濁液中に、または
・ フィルム形成性のタンパク質と炭水化物と脂肪の水中油型エマルジョン中に、または・ 最終的にフィルム形成性タンパク質と炭水化物内に分散される油中に、
分散している、プロバイオティクスバクテリア製剤を提供する。
質をさす。たとえばラクトフェリンは望ましいバクテリアの増殖を強化することができる。通常プレバイオティクスは上部腸管で消化できない。プレバイオティクス炭水化物としては難消化性デンプン、じゃがいもデンプン、あるいはスタープラスなどの高アミロースデンプン、修飾デンプン(カルボキシル化デンプン、アセチル化デンプン、プロピオン化デンプン、およびブチル化デンプンを含む)、フルクトオリゴ糖、グルコオリゴ糖、キシロオリゴ糖、ダイズオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ミルクオリゴ糖、イヌリンオリゴ糖、などの非消化性オリゴ糖類、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、ガラクトマンナンあるいはこれらの消化生成物があげられるが、プレバイオティクス効果を与えることのできるその他のオリゴ糖類を除外するものではない。
生じる必要があるかは、カプセル化される特定のプロバイオティクス株の耐酸素性に応じて異なる。個々のタンパク質/炭水化物の組み合わせに対し、メイラード反応生成物の生成量は生じる色変化の程度によりモニターすることができる。これに代わる測定法は、未反応糖の分析である。
好ましい炭水化物は還元基を有する糖であり、好ましくは単糖類(例えばグルコース、フルクトース)、二糖類(例えばマルトース、ラクトース)、三糖類、オリゴ糖類およびグルコースシロップからなる群から選択される。蜂蜜を含め、還元糖源であればいかなるものも使用することができる。タンパク質とメイラード反応を起こさない炭水化物を使用してもよい。
本発明の好ましい実施態様を解説する。
材料
実施例で用いたプロバイオティクスバクテリアはビフィズス菌と乳酸桿菌であるが、同じプロセスによりプロバイオティクスバクテリアのその他の菌株およびそのブレンド物もまたカプセル化することができる。
脂質としては、植物油、動物油、ジグリセリド、トリグリセリド、n3系およびn6系の油など、がある。
使用したマイクロカプセル化方法
方法1:タンパク質と炭水化物を反応させた、または反応させない水性懸濁液中にプロバ
イオティクスバクテリアを入れる。
・ タンパク質と炭水化物の混合溶液を60℃で生成する(ここで炭水化物には難消化性デンプンが含まれており、このデンプンはそのまま用いてもよく、またはあらかじめミクロ流動化処理をしておいてもよい)。この混合物を98℃で30分加熱する。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアまたは濃縮物をミキサーを用いて反応溶液中に分散させる。Tiを120℃−160℃、Toを50℃−70℃としてスプレードライする。(Tiは入口空気の温度、Toは出口空気の温度である。)
・ タンパク質と炭水化物の混合溶液を60℃で生成する(ここで炭水化物には難消化性デンプンが含まれており、このデンプンはそのまま用いてもよく、またはあらかじめミクロ流動化処理をしておいてもよい)。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアまたは濃縮物をミキサーを用いて溶液中に分散させる。Tiを120℃−160℃、Toを50℃−70℃としてスプレードライする。
方法2:反応させた、または反応させていない、フィルム形成性タンパク質と炭水化物および脂肪の水中油型のエマルジョン中にプロバイオティクスバクテリアを入れる。
・ タンパク質と炭水化物の混合溶液を60℃で生成し(ここで炭水化物には難消化性デンプンが含まれており、このデンプンはそのまま用いてもよく、またはあらかじめミクロ流動化処理をしておいてもよい)、油を加え、混合物を350バールで均質化する。この均一化したエマルジョンを98℃で30分加熱する。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアをミキサーを用いて反応混合物中に分散させる。Tiを120℃−160℃、Toを50℃−70℃としてスプレードライする。
・ タンパク質と炭水化物の混合溶液を60℃で生成し(ここで炭水化物には難消化性デンプンが含まれており、このデンプンはそのまま用いてもよく、またはあらかじめミクロ流動化処理をしておいてもよい)、油を加え、混合物を250バールで均質化する。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアをミキサーを用いて混合物に分散させる。Tiを120℃−160℃、Toを50℃−70℃としてスプレードライする。
方法3:プロバイオティクスバクテリアを油に入れ、ついでそれを、反応させた、またはさせなかったフィルム形成性タンパク質と炭水化物中に分散させる。
・ タンパク質と炭水化物の混合溶液を60℃で生成する(ここで炭水化物には難消化性デンプンが含まれており、このデンプンはそのまま用いてもよく、またはあらかじめミクロ流動化処理をしておいてもよい)。混合物を98℃で30分加熱する。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアを油に分散させる。フリーズドライしたバクテリアの分散物をミキサーを用いて反応溶液中に加える。Tiを120℃−160℃、Toを50℃−70℃としてスプレードライする。
・ タンパク質と炭水化物の混合溶液を60℃で生成する(ここで炭水化物には難消化性デンプンが含まれており、このデンプンはそのまま用いてもよく、またはあらかじめミクロ流動化処理をしておいてもよい)。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアを油に分散させる。フリーズドライしたバクテリアの分散物をミキサーを用いて溶液中に加える。Tiを120℃−160℃、Toを50℃−70℃としてスプレードライする。
(方法1)
実施例1(タンパク質−糖によるカプセル化)
フリーズドライしたプロバイオティクスバクテリアのタンパク質−糖マトリックスによ
るカプセル化
(加工処理)
カゼインナトリウム、オリゴ糖および乾燥したグルコースシロップを含む混合物(Cas-oligo-DGS)溶液を60℃で調製する。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアをこの溶液中にミキサーを用いて分散させる。Ti/Toを160/65℃としてスプレードライする。
フリーズドライしたプロバイオティクスバクテリアの熱処理タンパク質−糖マトリックスによるカプセル化
(加工処理)
カゼインナトリウム、オリゴ糖および乾燥したグルコースシロップを含む混合物(Cas-oligo-DGS)溶液を60℃で調製する。混合物を98℃で30分熱し、10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアをこの反応溶液中にミキサーを用いて分散させる。Ti/To
を160/65℃としてスプレードライする。
フリーズドライしたプロバイオティクスバクテリアのタンパク質−糖−高アミロース
デンプンマトリックスによるカプセル化
(加工処理)
15重量%のカゼインナトリウム溶液を60℃で調製し、糖を加える。10重量%のHylon VII分散液を60℃で調製する。カゼインナトリウム−糖溶液とHylon VII分散液を混合する。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアをこのタンパク質−糖−デンプン混合物中にミキサーを用いて分散させる。Ti/Toを160/65℃としてスプレードライする。
フリーズドライしたプロバイオティクスバクテリアのタンパク質−糖−ミクロ流動化処理した高アミロースデンプンマトリックスによるカプセル化
加工処理
15重量%のタンパク質溶液を60℃で調製し、糖を加える。20重量%のHylon VII分散液を60℃で調製し、121℃で60分加熱し、冷ましてから残りの水を加えて全固形成分の濃度を10重量%とし、800バールで3回ミクロ流動化を行う。タンパク質−糖溶液とミクロ流動化したHylonVII分散液を合わせて混合する。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアをこのタンパク質−糖−デンプン混合物中にミキサーを用いて分散させる。Ti/Toを160/65℃としてスプレードライする。
実施例5(タンパク質−糖−油エマルジョンによるカプセル化)
フリーズドライしたプロバイオティクスバクテリアのタンパク質−糖−油エマルジョンによるカプセル化
(加工処理)
カゼインナトリウム、オリゴ糖および乾燥したグルコースシロップを含む混合物(Cas-oligo-DGS)溶液を60℃で調製し、ミキサーを用いて油を加え、250バールで均質化する。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアをこのエマルジョン中にミキサーを用いて分散させる。Ti/Toを160/65℃としてスプレードライする。
フリーズドライしたプロバイオティクスバクテリアの熱処理タンパク質−糖−油エマルジョンによるカプセル化
(加工処理)
カゼインナトリウム、オリゴ糖および乾燥したグルコースシロップを含む混合物(Cas-oligo-DGS)溶液を60℃で調製し、油を加えて250バールで均質化する。このエマルジョンを98℃で30分熱し、10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアをこのエマルジョン中にミキサーを用いて分散させる。Ti/Toを160/65℃としてスプレードライする。
フリーズドライしたプロバイオティクスバクテリアのタンパク質−糖−ミクロ
流動化した高アミロースデンプン−油エマルジョンによるカプセル化
(加工処理)
15重量%のタンパク質溶液を60℃で調製し、糖を加える。20重量%のHylon VII分散液を60℃で調製し、121℃で60分加熱し、冷まして残りの水を加えて全固形成分の濃度を10重量%とし、800バールで3回ミクロ流動化を行う。タンパク質−糖溶液とミクロ流動化したHylon VII分散液を合わせて混合する。油を加えて250バールで均質化する。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアをこのエマルジョン中にミキサーを用いて分散させる。Ti/Toを160/65℃としてスプレードライする。
実施例8(油添加後、タンパク質−糖によるカプセル化)
フリーズドライしたプロバイオティクスバクテリアを油に添加し、ついでタンパク質
−糖マトリックスでカプセル化する
(加工処理)
カゼインナトリウム、オリゴ糖および乾燥したグルコースシロップを含む混合物(Cas-oligo-DGS)溶液を60℃で調製する。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアを油中に分散させる。フリーズドライしたバクテリアを油中に分散させたものを、先の溶液にミキサーを用いて添加する。Ti/Toを160/65℃としてスプレードライする。
フリーズドライしたプロバイオティクスバクテリアを油に添加し、ついで熱処理タン
パク質−糖マトリックスでカプセル化する。
(加工処理)
カゼインナトリウム、オリゴ糖および乾燥したグルコースシロップを含む混合物(Cas-oligo-DGS)溶液を60℃で調製する。混合物を98℃で30分熱し、10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアを油に分散させる。ビフィドバクテリアBb−12分散液を先の溶液にミキサーを用いて加える。Ti/Toを160/65℃としてスプレードライする。
フリーズドライしたプロバイオティクスバクテリアを油に添加し、タンパク質−高ア
ミロースデンプンマトリックスでカプセル化する。
(加工処理)
15重量%のカゼインナトリウム溶液を60℃で調製する。10重量%のHylon VII分散液を60℃で調製する。カゼインナトリウム溶液とHylon VII分散液を合わせて混合する。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアを油に分散する。フリーズドライしたバクテリアの油分散液をタンパク質−デンプン混合物にミキサーを用いて添加する。Ti/Toを160/65℃としてスプレードライする。
フリーズドライしたプロバイオティクスバクテリアを油に添加し、タンパク質−ミク
ロ流動化した高アミロースデンプンマトリックスでカプセル化する。
(加工処理)
15重量%のカゼイン塩溶液を60℃で調製する。20重量%のHylon VII分散液を60℃で調製し、121℃で60分加熱し、冷まして残りの水を加えて全固形成分の濃度を10重量%とし、800バールで3回ミクロ流動化を行う。カゼインナトリウム溶液とミクロ流動化したHylon VII分散液を合わせて混合する。10℃に冷ます。フリーズドライしたバクテリアを油に分散させる。フリーズドライしたバクテリアの分散液をこのタンパク質−デンプン混合物にミキサーを用いて加える。Ti/Toを160/65℃としてスプレードライする。
フリーズドライしたプロバイオティクスバクテリアを油に添加し、タンパク質−糖−
ミクロ流動化した高アミロースデンプンマトリックスでカプセル化する。
(加工処理)
15重量%のタンパク質溶液を60℃で調製し、糖を加える。20重量%のHylon VII分散液を60℃で調製し、121℃で60分加熱し、冷まして残りの水を加えて全固形成分の濃度を10重量%とし、800バールで3回ミクロ流動化を行う。タンパク質−糖溶液とミクロ流動化したHylon VII分散液を合わせて混合する。10℃に冷ます。フリーズ
ドライしたバクテリアを油中に分散させる。フリーズドライしたバクテリアの分散液を、先のタンパク質−デンプン混合物中にミキサーを用いて加える。Ti/Toを160/65℃としてスプレードライする。
生菌数を数えるために、人工腸液(SIF)(後述)または脱イオン水(DI)にカプセル材料を溶解し、プロバイオティクスをマイクロカプセルから放出させた。スプレードライカプセル化サンプル1.0gを2つ用意し、人工腸液または脱イオン水10mlと混合し、100rpmで連続的に撹拌しながら、37℃で1−2時間培養した。放出された生菌の数は従来の微生物平板法によりおこなった。放出されたバクテリアを0.1%のペプトン(pH6.9−7.0)中で10倍に連続希釈した。サンプル中の油からのバクテリアの分散を容易にするために、撹拌に先立ちすべてのサンプルの最初の希釈液にはTween80(100μl)を加えた。ビフィズス菌は補強クロストリジウム寒天(RCA)上で培養し、乳酸菌はMRS(de Man-Rogosa-Sharpe)寒天培地で培養した。寒天平板は37℃で無酸素下で48時間培養し、カプセル化した物質のCFU/gを定量した。生存率(パーセント)は下記の通り計算した。
マイクロカプセル化処理がプロバイオティクスバクテリアの生存に与える良い効果を4つの領域で検討した。
・スプレードライ工程中の生存
・胃腸通過の際の生存(および放出)
・非冷蔵保存の際の生存
・低pHにおける生存
スプレードライ工程におけるマイクロカプセル化の利点
先に名前をあげた3つのプロバイオティクス菌株それぞれを、実施例に記載の技法を用いてマイクロカプセル化し、スプレードライした。スプレードライ工程で生き残ったプロバイオティクスバクテリアのパーセントを各マイクロカプセル化技法に対して求めた。ビフィドバクテリウム・インファンティスにおいては、フリーズドライしたバクテリアサンプルを再懸濁し、スプレードライして、フリーズドライしたバクテリアサンプルのカプセル化後のスプレードライによる生存率と比較することができた。
胃腸通過の際のマイクロカプセル化の利点
胃腸通過中の生存をシミュレートするために、マイクロカプセル化したプロバイオティクスとマイクロカプセル化をおこなわないプロバイオティクスの両方を胃と小腸の条件をシュミレートする2段階インビトロモデルに通した。ステージ1においてはそれぞれスプレードライしたカプセル化処理済みの1.0gのサンプルを二つ用意し、10mLの人工胃液(SGF)と混合して100rpmで連続的に撹拌しつつ、37℃で2時間培養した。2時間後、サンプルのpHを1Mの水酸化ナトリウム(生菌を損傷しないように滴下)を用いて6.8に調節し、このpHを調節したサンプルに人工腸液10mlを加えて、100rpmで連続的に撹拌しつつ、37℃でさらに3時間培養した。その後バクテリアの生菌数を測定した。
人工胃液(SGF)(pH1.2)
塩化ナトリウム(1.0g)、ペプシン1.6gおよび濃塩酸(36%)3.5mlを脱イオン水に溶かし全量を500mlとする。溶液の最終pHは1.2であった。
人工腸液(SIF)(pH6.8)
3.4gのリン酸水素カリウムを脱イオン水450mlに溶かす。これに38.5mlの0.2M水酸化ナトリウムと6.25gのパンクレアチン(8×米国薬局方グレード)を添加した。この溶液を4℃で一晩撹拌し、1Mの水酸化ナトリウムまたは0.2Mの塩酸を用いてpHを6.8に調節した。ついで、この溶液を脱イオン水で500mlにした。
マイクロカプセル化されなかったフリーズドライプロバイオティクスであるビフィドバクテリウム・インファンティスと比べて、マイクロカプセル化により、この菌株の生存は大きく保護された。方法2と3はもっとも保護性が高かった。この感受性プロバイオティクス株に対し、カプセル化したものでは、ほぼ100%の生存率が達成され、カプセル化しなかったものでは同じ条件で生存率が1万分の1(対数目盛(単位log10)で4)に減少した。
冷蔵せずに保存した際のマイクロカプセル化の利点
カプセル化したプロバイオティクスバクテリアとカプセル化しなかったプロバイオティクスバクテリアをそれぞれ25℃、相対湿度50%の条件で5週間にわたり保存し、その生存率を評価した。菌株の生存は2週間後と5週間後に評価した。生菌数は先に記載のようにして得た。
マイクロカプセル化により、プロバイオティクスであるビフィドバクテリウム・インファンティスの非冷蔵保存中の生存は、非カプセル化フリーズドライ菌と比較し、大きく保護された。
酸素などの環境条件に敏感である種由来のこのプロバイオティクス菌株を非冷蔵条件で2週間保存した時の生存率は、処理を行うことによって同じオーダー(対数目盛(log10)で1未満)に留まった。
図6はカプセル化しなかったバクテリアと比べ、プロバイオティクスであるビフィドバクテリウム・インファンティスはマイクロカプセル化により非冷蔵保存中の生存が大きく保護されたことを示す。方法2とタンパク質−RS(MF)によるカプセル化(方法1)処理が5週間の保存を通じビフィドバクテリウム・インファンティスの生存を維持するのに最も成功した。25℃と相対湿度50%の条件で5週間保存後、方法2を使用したマイクロカプセル化によれば生菌数の減少は対数目盛(単位log10)で2未満に維持されたが、一方カプセル化されなかったバクテリアに対しては、生菌数の落ち込みは対数目盛(単位log10)で8以上であった。
低pH環境におけるマイクロカプセル化の利点
マイクロカプセル化がバクテリアをやや低いpHから守る能力をpH4.0での培養例により評価した。カプセル化しスプレードライしたバクテリアとフリーズドライ後カプセル化を行わなかったプロバイオティクスバクテリア(0.12gのフリーズドライパウダー同等物)を0.2Mの酢酸バッファー(pH4.0)10mLに混合し、100rpmで連続的に撹拌しつつ37℃で2時間培養した。2時間の培養の後、サンプルのpHを1Mの水酸化ナトリウムを用いて6.8に調節し、37℃(室温)でさらに1時間培養して、カプセルからのバクテリアの放出を行った。サンプル中の生菌数を前に記載のようにして求めた。
本発明の基本的教示から逸脱せずに、本発明に記載のものとは異なる実施例において本発明を実現することも可能であることが当業者には明白であろう。
Claims (11)
- プロバイオティクスの保存期間を延長するために、一つ以上のプロバイオティクス微生物を、保護カプセル材料中にカプセル化する方法であって、
ここにおいて、該カプセル材料はフィルム形成性タンパク質と炭水化物を含み、ここにおいて、該フィルム形成性タンパクはカゼイン、大豆タンパク、乳清タンパク、ゼラチン、卵アルブミンおよび大豆タンパク加水分解物からなる群から選択され;そして
ここにおいて、該炭水化物は、還元糖末端を有し、該フィルム形成性タンパク質と炭水化物を含む水性縣濁液は、加熱工程によりメイラード反応生成物を生じる;及び/又は
ここにおいて、該炭水化物は難消化性デンプンである;
ここにおいて、該方法は以下の工程:
(1)フィルム形成性タンパク質と炭水化物の水性懸濁液を形成すること、並びに、
(2a)水分散性のプロバイオティクス微生物を該水性懸濁液中で混合する第一の工程と、フリーズドライおよびスプレードライから選択された乾燥の第二の工程を行うこと、又は
(2b)該水性懸濁液を油と混合して水中油型エマルジョンを形成し、油分散性のプロバイオティクス微生物をエマルジョン中で混合する第一の工程と、フリーズドライおよびスプレードライから選択された乾燥の第二の工程を行うこと、又は
(2c)プロバイオティクス微生物を油中で混合し、油を該水性懸濁液中に分散する第一の工程と、フリーズドライおよびスプレードライから選択された乾燥の第二の工程を行うこと、
を含む、前記方法。 - 前記炭水化物が還元糖末端を有し、該フィルム形成性タンパク質と炭水化物を含む水性縣濁液が、加熱工程によりメイラード反応生成物を生じる、請求項1に記載の方法。
- 一つ以上のプレバイオティクスが前記プロバイオティクス微生物と混合されている、請求項1または2に記載の方法。
- 前記カプセル材料中の前記炭水化物がプレバイオティクス炭水化物である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記タンパク質がカゼインまたは乳清タンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記炭水化物が難消化性デンプンである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記難消化性デンプンが、高アミロースデンプンである、請求項6に記載の方法。
- プロバイオティクス微生物を添加するカプセル化に先立ち、前記タンパク質と炭水化物を含む水性懸濁液が油または脂肪の存在下で熱処理されている、請求項2に記載の方法。
- 前記難消化性デンプンが加熱および/またはミクロ流動化により処理されている、請求項8に記載の方法。
- 前記プロバイオティクス微生物が、スプレードライまたはフリーズドライされ、粉末を形成している、請求項1に記載の方法。
- 前記プロバイオティクス微生物がビフィズス菌、乳酸桿菌、サッカロミセス、ラクトコッカス、連鎖球菌およびプロピオン酸菌属から選択される、請求項1に記載の方法。
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