ES2957783T3

ES2957783T3 - Protección de células microbianas frente a la degradación ácida

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Publication number: ES2957783T3
Application number: ES12704722T
Authority: ES
Inventors: Walter H Guenzburg; Eva Maria Brandtner; Brian Salmons Salmons; John A Dangerfield
Original assignee: Austrianova Singapore Pte Ltd
Current assignee: Austrianova Singapore Pte Ltd
Priority date: 2011-01-25
Filing date: 2012-01-25
Publication date: 2024-01-25
Anticipated expiration: 2032-01-25
Also published as: JP6081374B2; KR20140026369A; SG10201600517YA; EP2667858C0; JP2014508141A; WO2012101167A1; US20140023693A1; US20220062187A1; NZ613473A; CA2825473A1; MY175316A; SG192017A1; EP2667858A1; US11911516B2; CA2825473C; KR101902035B1; AU2012210575B2; EP2667858B1

Abstract

Se ha aplicado una tecnología de microencapsulación simple basada en sulfato de celulosa para encapsular células bacterianas u otras células microbianas, que producen y liberan enzimas digestivas y, por lo tanto, proporcionan un refugio resistente a los ácidos para estas células microbianas. Sorprendentemente, se descubrió que las esferas resultantes proporcionaban suficiente protección a las células encapsuladas frente al tratamiento con soluciones acuosas ácidas. De este modo, las células microencapsuladas de sulfato de celulosa, como los probióticos, ahora pueden sobrevivir al paso, por ejemplo, a través del estómago después del consumo por parte de un ser humano o animal con una tasa de supervivencia mayor que aquellas que no están dentro de una microcápsula. Después de pasar por el estómago, estas células entregan productos producidos por ellas, por ejemplo, enzimas u otros factores nutricionales. Por lo tanto, esta tecnología demuestra ser muy útil para proporcionar enzimas digestivas o beneficiosas y/o células microbianas vivas al tracto gastrointestinal inferior, donde podrían conferir sus beneficios para la salud al huésped. Se describe cómo se encapsulan las células con dicho material, y bajo qué condiciones las células encapsuladas sobreviven el paso del estómago y cómo las células microbianas o la enzima producida por dichas células microbianas pueden salir de las microcápsulas permitiendo que las células y/o las enzimas producidas dentro de las microcápsulas proporcionar su beneficio para la salud. Esta tecnología desempeñará un papel importante en la mejora de los alimentos, especialmente los alimentos probióticos o la entrega de aditivos alimentarios para mejorar la salud humana y animal y en la que estas células aún pueden liberar sus productos generados, por ejemplo, enzimas y/u otros factores nutricionales en el ambiente circundante después de haber estado expuesto primero a un ambiente ácido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Protección de células microbianas frente a la degradación ácida

La invención se refiere a una tecnología (simple) de microencapsulado basada en sulfato de celulosa que se ha aplicado al encapsulado de células bacterianas u otras células microbianas para la administración oral de estas células microbianas. Inesperadamente, se ha encontrado que las esferas resultantes proporcionan suficiente protección a las células encapsuladas frente al tratamiento con soluciones acuosas ácidas. De esta manera, las células microencapsuladas con sulfato de celulosa, tales como probióticos, ahora pueden sobrevivir al paso por, por ejemplo, el estómago, después del consumo por un ser humano o animal con una tasa de supervivencia más alta que aquellas no contenidas dentro de una microcápsula. Tras pasar el estómago, dichas células liberan productos producidos por ellas, p. ej., enzimas u otros factores de nutrición. Por lo tanto, esta tecnología demuestra ser muy útil para proporcionar enzimas digestivos o de otro modo beneficiosos y/o de células microbianas vivas, dentro del tracto gastrointestinal inferior, en donde conferirían su beneficio de salud al anfitrión. Se describe cómo se encapsulan células con dicho material y bajo qué condiciones sobreviven las células encapsuladas al paso por el estómago y cómo las células microbianas o enzimas producidos por dichas células microbianas pueden salir de las microcápsulas, permitiendo que las células y/o los enzimas producidos dentro de las microcápsulas proporcionen su beneficio de salud. Esta tecnología desempeñará una función importante en la mejora de los alimentos, especialmente alimentos probióticos o la administración de aditivos alimentarios para mejorar la salud humana y animal, y en la que estas células todavía son capaces de liberar sus productos generados, p. ej., enzimas y/o otros factores nutricionales, hacia el medio circundante después de haber estado expuestos anteriormente a un medio ácido.

ANTECEDENTES: ENZIMAS DIGESTIVOS

Los enzimas digestivos son enzimas que rompen las macromoléculas poliméricas (tales como las contenidas en los alimentos) en sus bloques constructivos más pequeños (tales como nutrientes y productos de desecho), con el fin de facilitar su absorción por el cuerpo. Se encuentran enzimas digestivos en el tracto digestivo de los animales, que en el contexto de la presente invención pueden ser cualesquiera, aunque preferentemente son mamíferos, especialmente rumiantes y otro tipo de ganado, animales de piscifactoría, tales como peces y crustáceos, mascotas y animales de compañía, aves y/o seres humanos, en los que ayudan en la digestión de los alimentos, así como dentro de las células, especialmente en sus lisosomas, en donde actúan manteniendo la supervivencia celular. Los enzimas digestivos son diversos y se encuentran en la saliva secretada por las glándulas salivales; en el estómago, secretadas por células de revestimiento del estómago; en los jugos pancreáticos, secretados por las células exocrinas del páncreas, y en las secreciones intestinales (del intestino delgado y del grueso), o como parte del revestimiento del tracto gastrointestinal. Los enzimas digestivos se clasifican basándose en sus sustratos diana: proteasas y peptidasas que cortan las proteínas en sus monómeros: los aminoácidos; las lipasas dividen las grasas en ácidos grasos libres y moléculas de glicerol; las carbohidrasas cortan los carbohidratos, tales como el almidón, en azúcares; las nucleasas dividen los ácidos nucleicos en nucleótidos.

En el sistema digestivo humano, los sitios principales de la digestión son la cavidad oral, el estómago y el intestino delgado. Los enzimas digestivos son secretados por diferentes glándulas exocrinas, incluyendo:

las glándulas salivales, las células secretorias en el estómago, las células secretorias en el páncreas y las glándulas secretorias en el intestino delgado. El páncreas produce enzimas digestivos, tales como lipasas, amilasas y proteasas que actúan en el intestino delgado. Las proteasas conocidas con la tripsina, la cromotripsina y la carboxipeptidasa.

El beneficio completo de los alimentos y los suplementos nutricionales se obtiene únicamente si el cuerpo posee suficientes enzimas para digerir correctamente los alimentos y absorber los nutrientes. Algunos enzimas digestivos se encuentran solo en los alimentos crudos que no se comen rutinariamente y no son parte de la dieta habitual de la mayoría de animales. Los enzimas digestivos producidos por el cuerpo animal pueden ser menos abundantes con la edad del animal: cuanta más edad tenga el animal, menos los producirá su cuerpo. La falta de enzimas digestivos puede contribuir a una multitud de enfermedades, incluyendo la artritis, la obesidad, el síndrome del intestino irritable, la cardialgia, el síndrome de fatiga crónica y otros. La falta de proteasas puede causar una digestión incompleta que puede conducir a alergias y a la formación de toxinas.

Se cree habitualmente que la toma de suplementos para incrementar los niveles de enzimas digestivos mejorará la capacidad del cuerpo de acceder y utilizar los nutrientes de los alimentos para obtener energía, crecimiento y reparación celulares. Los suplementos con frecuencia reducen el gas y la cardialgia, y mejoran la regularidad, mediante la mejora de la digestión. Se estima que 15 % de los estadounidenses sufre de artritis, que normalmente se caracteriza con adjetivos para la inflamación, tales como dolor, hinchazón, rigidez y enrojecimiento. Sin embargo, la artritis no es un único trastorno, sino el nombre de enfermedades articulares generadas por varias posibles causas, tales como la genética, las infecciones, lesiones físicas, alergias, estrés y una digestión incorrecta. El trabajo clínico realizado en la Transformation Enzyme Corporation ha revelado que la mayoría de los que padecen artritis responden bien al tratamiento con suplementos de proteasas y enzimas digestivos debido a que la artritis está relacionada con la inflamación y la digestión. Varios estudios han mostrado que los enzimas proteasas resultan tan eficaces como los fármacos metotrexato e indometacina en el alivio del dolor de la artritis, aunque sin sus efectos secundarios negativos. Mediante el incremento del apoyo a los sistemas digestivo e inmunitario se reduce la inflamación.

Una solución a los problemas de salud relacionados con una falta de enzimas digestivos es tomar suplementos orales de enzimas digestivos. La mayoría de enzimas digestivos vienen en cápsulas que simplemente se pueden tragar. Las cápsulas están hechas de gelatina (denominadas cápsulas de gel) o de mezcla de celulosa vegetal (denominadas cápsulas vegetales). La mayoría de compañías de suplementos se ha movido hacia las cápsulas vegetales a lo largo de los últimos 10 años para todos sus suplementos encapsulados. La mayoría de cápsulas de enzimas pueden abrirse y sacarse los polvos.

La simple deglución de cantidades adicionales de enzimas digestivos podría no ser la solución ideal, ya que la exposición al ácido del estómago al pasar por el mismo podría presentar un efecto perjudicial sobre los enzimas. Son problemas adicionales de proporcionar enzimas como suplemento alimentario el sabor de tales enzimas; algunos de ellos causan una "sensación de quemazón" en la boca, además de su sensibilidad a la humedad. Se ha informado que los enzimas no encapsulados pierden su potencia al exponerlos a la humedad normal del aire; por lo tanto, tampoco pueden tomarse en forma de una bebida o como ingrediente de una comida húmeda, a menos que se añadan inmediatamente antes del consumo.

La sensación de quemazón se produce cuando las proteasas empiezan a degradar parte de la capa muerte o células sobre la superficie de la piel. Estos enzimas sí eliminan células dañadas, infectadas o muertas. Si las proteasas se mantienen sobre la superficie de la piel durante un periodo prolongado, podrían eliminar las células muertas y exponer la piel sana subyacente. Esto puede llevar a irritaciones. En ocasiones, si los enzimas se toman en una bebida, que llegue a tocar el labio superior, las proteasas en ella pueden persistir y provocar una erupción en el labio.

También hay enzimas digestivos que son sensibles al ácido del estómago. Los enzimas pancreáticos no son estables en amplios intervalos de pH o temperatura y resultan destruidos por el ácido del estómago. De esta manera, necesitan protegerse durante su paso por el estómago.

PROBIÓTICOS

Uno de los segmentos en crecimiento más rápido en las industrias de la salud tanto humana como animal es la utilización de células probióticas (probióticos). Según la definición adoptada actualmente por la FAO/OMS, los probióticos son: "microorganismos vivos que, administrados en cantidades adecuadas, confieren un beneficio de salud al anfitrión". Las bacterias del ácido láctico (LAB Lb.) y las bifidobacterias son los tipos más habituales de microbios utilizados como probióticos, aunque también pueden resultar útiles determinadas levaduras y bacilos.

Las células microbianas probióticas son sensibles a diversas condiciones ambientales, tales como el pH, la humedad, la temperatura, el aire y la luz. En el caso de que dichas condiciones no se controlen adecuadamente, puede reducirse sustancialmente la viabilidad del producto (con frecuencia medida en unidades formadoras de colonias (ufc), o como tasas de actividad metabólica (tam)) y, por lo tanto, su eficacia.

Para que puedan utilizarse como compuestos beneficios, posiblemente incluso terapéuticos, en una dieta, las células microbianas probióticas necesitan protegerse a) durante el procedimiento de fabricación, y b) durante el almacenamiento dentro del producto, y c) durante su paso por el tracto digestivo, especialmente el estómago. En productos lácteos, tales como yogures, deben sobrevivir a las condiciones levemente ácidas durante un periodo de tiempo prolongado. La supervivencia del probiótico en los productos se ve afectada por un abanico de factores, incluyendo el pH, la postacidificación (durante el almacenamiento) en productos fermentados, la producción de peróxido de hidrógeno, la toxicidad del oxígeno (permeación de oxígeno a través del embalaje), las temperaturas de almacenamiento, la estabilidad en forma seca o congelada, el bajo crecimiento en leche, la falta de proteasas para degradar las proteínas lácteas a sustancias nitrogenadas más simples y la compatibilidad con el cultivo de inóculo tradicional durante la fermentación. Todas estas tensiones resultan en la muerte de un porcentaje significativo de estas células. Por lo tanto, la Federación Internacional de Lechería (IDF, por sus siglas en inglés) sugiere que deben estar vivas un mínimo de 107 células microbianas probióticas en el momento del consumo, por gramo de producto, para conseguir los beneficios de salud declarados. Sin embargo, se cree que este número puede reducirse significativamente en el caso de que la causa principal de la muerte celular, es decir, la degradación ácida de las células vivas en el estómago, pueda evitarse mediante la protección de las células frente a dicho medio ácido, incrementando de esta manera la tasa de supervivencia de las células en el estómago. Varias células microbianas probióticas también son capaces de producir enzimas digestivos también cuando pasan por el estómago y entran en el intestino.

MICROENCAPSULACIÓN

Una solución al problema de baja supervivencia de las células microbianas probióticas, por ejemplo durante el almacenamiento en productos lácteos fermentados o durante la exposición al ácido estomacal es la microencapsulación.

La encapsulación es el procedimiento de formación de un recubrimiento continuo que circunda una matriz interna que está totalmente contenida dentro de la pared de la cápsula en forma de núcleo de material encapsulado. Debe distinguirse de la "inmovilización", que se refiere al atrapamiento de material dentro o en toda la matriz. En contraste con la encapsulación, este es un procedimiento aleatorio que resulta en un tamaño de partícula no definido en el que se expone en la superficie un porcentaje de elementos inmovilizados. La microencapsulación ayuda a separar el material nuclear respecto de su entorno, mejorando de esta manera su estabilidad y extendiendo la vida útil del núcleo. La estructura formada mediante el agente de microencapsulación circundando a la sustancia nuclear se conoce como "pared". Las propiedades del sistema de paredes están diseñadas para proteger el núcleo y potencialmente para liberarlo bajo condiciones específicas, permitiendo simultáneamente que las moléculas pequeñas pasen hacia el interior y exterior de la membrana. Las cápsulas pueden presentar un tamaño entre submicrométrico y de varios milímetros y pueden presentar formas diferentes.

Se han sometido a ensayo varios biopolímeros de grado alimentario, tales como alginato, almidón, goma xantana, goma guar, goma garrofín y goma carragenano, así como proteínas del suero, como materiales de microencapsulación para proteger a las células microbianas sensibles al ácido, con diferentes niveles de éxito. Para una revisión reciente, ver Islam et al., "Microencapsulation of Live Probiotic Bacteria" J. Microbiol. Biotechnol. (2010), 20(10), 1367-1377. Hasta el momento no se ha informado del uso de una tecnología de microencapsulación que permite que los enzimas digestivos que se producen en el interior de células microbianas sean liberados a través de las paredes de una cápsula.

ALGINATOS

Los alginatos son polisacáridos aniónicos naturales constituidos de residuos de ácido D-manurónico y ácido L-gulurónico unidos linealmente mediante enlaces 1,4-glucosídicos. El alginato es un producto natural recuperado a partir de algas marinas que se considera no tóxico y la encapsulación con alginatos es una tecnología ampliamente utilizada por su fácil preparación, bajo precio y elevada biocompatibilidad (el material no afecta a la viabilidad de la mayoría de tipos de células encapsuladas). Los geles de alginato preparados a partir de alginato de Ca2+ son estables a pH bajo. Se hinchan en soluciones débilmente básicas. Al bajar el pH a valores inferiores a la pKa de los ácidos D-manurónico y L-gulurónico, no obstante, el alginato se convierte en ácido algínico con liberación de Ca2+ y se forma un gel más denso debido a la pérdida de agua.

Un artículo de Kaila Kailasapathy ("Microencapsulation of Probiotic Bacteria: Technology and Potential Applictions", Curr. Issues Intest. Microbiol. (2002), 3, 39-48) proporciona una buena visión general de las diferentes técnicas de microencapsulación que se han utilizado hasta su publicación.

Se ha informado de que aproximadamente 40 % más lactobacilos sobrevivieron a la congelación de leche helada cuando estaban atrapados en alginato cálcico que cuando no estaban atrapados. Se utilizó una solución acuosa de alginato o carragenano en aceite vegetal que contenía Tween-80 (emulsionante) y laurilsulfato sódico (surfactante) para encapsular células bacterianas probióticas. Se mezclaron las células bacterianas en una solución de alginato y se introdujeron en aceite para llevar a cabo la encapsulación. Se añadieron emulsionante y surfactante para estimular la formación de cápsulas.

Algunas de dichos procedimientos de laboratorio de microencapsulación implican tecnología de emulsión de agua en aceite. Sin embargo, esta técnica no resulta adecuada para todas las aplicaciones de producto alimentario debido a que, en primer lugar, el aceite residual en el material encapsulado puede resultar perjudicial para la textura y características organolépticas y puede no resultar adecuado para el desarrollo de productos lácteos bajos en grasa. En segundo lugar, el aceite residual, emulsionante y surfactante en el material encapsulado pueden resultar tóxicos para las células microbianas vivas y pueden interactuar con componentes alimentarios sensibles.

Se ha descrito, además, un método modificado de encapsulación con alginato-almidón, en el que el almidón Hi-maize prebiótico se incorporó durante la microencapsulación con alginato cálcico de las células probióticas. Las células encapsuladas en presencia de dicho almidón presentaban una vida útil prolongada en comparación con las encapsuladas sin el almidón. Los prebióticos son ingredientes alimentarios no digeribles que estimulan el crecimiento y/o la actividad de las células microbianas en el sistema digestivo que resultan beneficiosos para la salud corporal. Habitualmente, los prebióticos son carbohidratos (tales como oligosacáridos), aunque la definición puede incluir no carbohidratos; no son digeribles por el organismo hospedador (tal como un mamífero o un ser humano), aunque proporcionan beneficios a los microorganismos que puedan digerirlos. Sin embargo, las células microbianas encapsuladas no mostraron una tasa de supervivencia significativamente incrementada al someterlas a pH bajo y condiciones de elevada concentración de sales biliares durante los ensayos in vitro. Se expusieron a condiciones de pH 2, 3 o 4 durante 3 horas a 37 °C y las muestras se extrajeron cada hora. Resultó queLactobacillus acidophiluses más sensible aBifidobacterium,aunque la encapsulación no protegió las células microbianas frente a la degradación por soluciones acuosas ácidas (Sultana et al., "Encapsulation of probiotic microbial cells with alginate-starch and evaluation of survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt", International Journal of Food Microbiology, (2000), 62(1-2), 47-55).

Sin embargo, los probióticos no solo deben ser capaces de sobrevivir las condiciones de fabricación y almacenamiento de los alimentos, sino que también deben ser eventualmente adecuados para entrar en el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, también deben sobrevivir a la acidez gástrica, sales biliares, enzimas, metabolitos tóxicos, bacteriófagos, antibióticos y condiciones anaeróbicas, antes de que puedan ejercer su efecto beneficioso en el intestino.

Las cápsulas de alginato generadas convencionalmente con diámetros de entre 40 y 80 micrómetros se ha informado de que solo confieren una protección insignificante de las bifidobacterias al exponerlas a jugos gástricos simulados a pH 2,0, mientras que las microesferas de alginato más grandes (1 a 3 mm) protegieron las células encapsuladas más sustancialmente (Truelstrup-Hansen L, Allan-wojtas PM, Jin YL, Paulson A<t>, "Survival of free and calcium-alginate microencapsulatedBifidobacteriumspp. in simulated gastro-intestinal conditions", Food Microbiol. (2002), 19: 35-45).

En 2009, Nazzaro et al. encapsularon bacterias L. acidophilus en goma de alginato-inulina-xantano e informaron de que mejoraban significativamente la viabilidad celular tras la fermentación y el almacenamiento (6*1012 y 4><1010 células/ml frente a 4*1010 y 2><108 para las células libres, respectivamente), así como tasas de supervivencia mejoradas en ácido gástrico simulado (Nazzaro, F. et al., "Fermentative ability of alginate-prebiotic encapsulatedLactobacillus acidophilusand survival under simulated gastrointestinal conditions", Journal of Functional Foods (2009), 1(3), 319-323).

También últimamente, se ha descrito un nuevo método de microencapsulación basado en microesferas de gelatina que se entrecruzan con la genipina no citotóxica y se recubren con alginato entrecruzado por Ca2+ de fuentes externas e internas. La encapsulación es microesferas de gelatina recubiertas con alginato mejoró significativamente (P<0,05) la supervivencia deBifidobacteriumprobiótico durante la exposición a condiciones medioambientales adversas. La supervivencia celular tras la exposición a jugos gástricos simulados, pH 2,0, durante 5 minutos fue de solo 2 % y 1 % de las poblaciones iniciales para las microesferas de gelatina no recubiertas y las células libres, respectivamente. Sin embargo, 54 % y 20 % de las poblaciones iniciales sobrevivieron cuando las bacterias se encontraban en microesferas recubiertas con alginato producidas por fuentes externas e internas de Ca2+, respectivamente. Sin embargo, tras las pérdidas iniciales (5 min), las poblaciones de bifidobacterias cayeron a la misma tasa para todos los tratamientos a lo largo del periodo de incubación de 2 h. La reducción de la población viable en 3,45 unidades logarítmicas de las células deB. adolescentislibres fue similar a los resultados de otros, quienes han observado reducciones de aproximadamente 3 log de ufc por ml paraB. adolescentisexpuestas a jugo gástrico simulado (JGS, pH 2,0) durante 2 a 3 h (Annan N.T., Borza A.D. and Truelstrup Hansen L., "Encapsulation in alginate-coated gelatin microspheres improves survival of the probiotic Bifidobacterium adolescentis 15703T during exposure to simulated gastro-intestinal conditions", Food Research international , (2008), 41(2), 184-193).

El tiempo entre el inicio de su camino hasta el tracto intestinal inferior desde la boca y la liberación desde el estómago se ha informado que es de aproximadamente 90 min. Por lo tanto, cuando Khater et al. compararon las tasas de supervivencia de 12 cepas probióticas diferentes encapsuladas con alginato, la encapsulación se llevó a cabo según una versión modificada del protocolo de Sultana (tal como se ha descrito anteriormente (que implica el almidón Hi-Maize), bajo estrés ácido, se utilizaron tiempos de tratamiento de 30, 60 y 90 minutos en medio acidificado) (Khater y Ahmed, "Effect of Encapsulation on some Probiotic Criteria", Journal of American Science, (2010), 6 (10), 810-819). El estrés celular se inicia en el estómago, que presenta un valor de pH de tan solo 1,5. Sin embargo, en la mayoría de ensayos in vitro, se utilizó un pH 3,0 para someter a ensayo la resistencia a los ácidos. Por lo tanto, las células encapsuladas con alginato se compararon con las células no encapsuladas a un pH de 2 y a un pH de 3. Todas las cepas no encapsuladas resultaron fuertemente afectadas a pH 2,0, mientras que las bacterias encapsuladas con alginato sobrevivieron un poco más bajo pH 2,0. Sin embargo, las tasas de supervivencia globales eran más altas a pH 3,0 también para las células encapsuladas, indicando que los efectos del estrés ácido no pueden evitarse por completo.

Además, Khater et al. compararon las tasas de supervivencia de estas cepas encapsuladas con alginato y no encapsuladas después de la exposición a diferentes concentraciones de sales biliares, y también sometieron a ensayo el efecto del jugo gástrico simulado (JGS a pH 1,4) sobre la viabilidad de estas bacterias. Al incrementar los tiempos de exposición a 24 horas a pH 3,0 más 12 horas en una solución Oxgall de concentración 0,3 %, los resultados confirmaron que bajo estas condiciones la encapsulación con alginato incrementaba la tasa de supervivencia de las bacterias probióticas a un pH reducido seguido de un tratamiento con sales biliares. Para una cepa, la tasa de supervivencia después de las 36 horas de tratamiento se incrementó de 17 % a 34 %, y para otra cepa, de 37 % a 50 %. Sin embargo, las tasas de supervivencia entre células capsuladas y no encapsuladas diferían en solo aproximadamente 2 % tras una exposición de 3 horas a las condiciones de jugo gástrico simulado, un tratamiento aparentemente menos perjudicial para todas las cepas células, ya que las tasas de supervivencia incluso de células no encapsuladas se mantuvieron entre 89 % y 92 % en este experimento.

Sin embargo, en contraste, se ha informado de que ninguna de las células libres deLactobacillus bulgaricusKFRI 673 sobrevivió al periodo de 60 min en jugo gástrico simulado (JGS) a pH 2,0, mientras que las células no sobrevivieron un periodo de dos horas en líquido intestinal simulado (LIS), lo que sugiere queL. bulgaricusKFRI 673 es sensible al pH y no puede sobrevivir bajo condiciones de pH ácido (revisión por Islam, ver anteriormente). Además, Porubcan ha informado de que aproximadamente 99 % de la viabilidad de las células libres se pierde después de la exposición al estómago. Sus experimentos muestran que la exposición a ácido gástrico simulado a pH 1,6 durante un periodo de 90 min redujo drásticamente la viabilidad de todos los cultivos sometidos a ensayo (patente US n.° 7.122.370, Ejemplo 1).

Las patentes US n.° 7.122.370 y n.° 7.229.818 de Porubcan describen una encapsulación con alginato inducida por ácido, que es resistente a las condiciones de pH bajo. La formulación utilizada incluye una mezcla sustancialmente libre de agua de células probióticas con sales de alginato sódico o potásico. La mezcla se ha formado y se mantiene en un medio esencialmente libre de agua, mediante el recubrimiento de la mezcla de alginato/bacteria con un recubrimiento entérico, por ejemplo una cápsula hecha de celulosa o gelatina. Esta "macro"-cápsula pretende proteger la mezcla de células bacterianas y sales alginato frente a la humectación. Por lo tanto, básicamente la cápsula de celulosa sólida está proporcionando un recubrimiento entérico que protege la mezcla de dos componentes hasta que la cápsula se disuelve en el estómago, en donde a continuación se formarán microcápsulas resistentes al ácido, constituidas de ácido algínico y bacterias probióticas, en cuanto entran en contacto con el medio ácido en el estómago. Debido a la formación inducida por ácido de las microcápsulas, las células bacterianas probióticas aparentemente se encuentran protegidas de los jugos gástricos en el estómago durante la encapsulación. Porubcan reivindica que la celulosa como excipiente, que da a conocer que encapsula la mezcla de alginato y células y que proporciona una formulación que puede tragarse fácilmente, no es protectora con respecto al ácido gástrico en el estómago:

"Las bacterias probióticas se cultivan en los tanques en un medio de caldo durante aproximadamente 18 horas y después se recolectan mediante centrifugación y se liofilizan. Se utilizan los polvos liofilizados para rellenar cápsulas junto con excipientes de grado alimentario, tales como celulosa. El gran problema de este procedimiento es que rinde productos de vida útil reducida (incluso cuando se refrigeran) y baja supervivencia en el estómago: todas las UFC, literalmente 99,99 %, resultan eliminadas por el ácido del estómago".

Aunque dicho sistema proporciona una solución a proporcionar probióticos viables al cliente, sin embargo, no resulta adecuado para todos los usos como ingrediente alimentario, ya que genera cápsulas algo grandes, que necesitan tragarse intactas, y que no pueden masticarse para abrirlas.

Ya en 1995 se presentó una solicitud de patente que da a conocer diversos métodos de microencapsulación para lactobacilos y propone la administración oral de lactobacilos probióticos microencapsulados dentro de cápsulas farmacéuticamente aceptables, tal como cápsulas de gelatina, para prevenir la diarrea asociada a los antibióticos, en donde se describe la microencapsulación como medio para ampliar la vida útil bacteriana y para proteger las bacterias frente a la degradación durante su paso por el tracto gastrointestinal (patente US n.° 5.633.012). Se describen sistemas de microencapsulación en los que se utiliza alginato sódico solo o alginato y poli-L-lisina. Se describe un sistema en el que las bacterias se mezclan con hidroxipropilmetilcelulosa que se añade a la solución de una mezcla de copolímeros de éster de ácido acrílico metacrílico libremente permeables en agua y parcialmente permeables en agua, en acetona-isopropanol. El derivado de celulosa solo sirve de portador y no es parte de la cápsula. Dos otros procedimientos de microencapsulación descritos implican la utilización de polivinilpirrolidona o polivinilpovidona.

La solicitud de patente abandonada n.° US 2005/0266069A1 de Simmons es otra fuente exhaustiva de información sobre el estado de la técnica referido a los diferentes métodos de preparación de composiciones de microesferas probióticas estables. En ella, se describe una microesfera probiótica bastante compleja que comprende un núcleo de bacterias probióticas, un excipiente celulósico, un desintegrante y un aditivo, así como un recubrimiento entérico resistente a los líquidos gástricos. El recubrimiento entérico capaz de resistir los líquidos gástricos comprende un polímero o copolímero de ácido acrílico y/o ácido metacrílico y/o sus ésteres, ftalato de acetato de celulosa, ftalato de acetato de polivinilo y shellac.

En referencia a los métodos de producción de dichas cápsulas, existen generalmente dos enfoques diferentes. Simmons describe una técnica que implica la extrusión de soluciones de polímero, seguido de la esferonización, que puede comprender una serie de etapas no continuas conocidas como granulación (para formar una pasta extruíble), extrusión, esferonización y secado, seguido de otra etapa de recubrimiento de dichas microesferas.

Dicho método de producción bastante complejo contraste con la técnica mucho más simple que se utiliza para la generación de probióticos microencapsulados con sulfato de celulosa según la presente invención. Este último método simplemente implica dos etapas de dispersión de las células en la solución de sulfato de celulosa y la introducción de la mezcla en la forma, por ejemplo, de gotas, en una solución endurecedora, también denominada "baño de precipitación". Básicamente, las gotas preformadas esféricamente que están cargadas y que, por lo tanto, no se adhieren entre sí, caen en una solución endurecedora.

MICROCÁPSULAS DE SULFATO DE CELULOSA

En un campo diferente, es decir, en el área de las aplicaciones biomédicas y de atención sanitaria, se encapsulan células vivas con el objetivo de inyectarlas dentro del cuerpo de un paciente (es decir, implantarlas), en donde se espera que administren biomoléculas terapéuticas, sustratos o enzimas que a continuación atraviesen la membrana de la microcápsula, que las protege frente al ataque por el sistema inmunitario corporal y las localiza.

Una tecnología alternativa a la utilización del alginato descrita anteriormente, es decir, la formación de microcápsulas de complejo polielectrolito (CPE) por poliones de carga opuesta es un método simple y eficaz. Los sistemas de cápsulas de polielectrolito utilizados habitualmente son sulfato de celulosa sódica (en la presente memoria denominado NaCS)/cloruro de poli[dialil(dimetil)amonio] (en la presente memoria denominado pDADMAC), quitosano/alginato, quitosano/xantano, etc. pDADMAC es un homopolímero de amonio cuaternario. El nombre CAS de pDADMAC es 2-propén-1-amino, N,N-dimetil-N-propenilo, cloruro, homopolímero. Puede adquirirse con diferentes pesos moleculares.

El sistema de encapsulación de NaCS/pDADMAC formado mediante la adición de una solución de polianión NaCS en una solución de policatión pDADMAC se ha investigado sistemáticamente y cautiva por su simplicidad, reduciendo de esta manera los costes del procedimiento y elimina las potenciales fuentes de contaminantes. Las moléculas como los nutrientes y los productos de desecho pueden pasar fácilmente a través de los poros de las microcápsulas de sulfato de celulosa, en el caso de que las cápsulas se hayan preparado con moléculas de pDADMAC comparativamente pequeñas. El material es biocompatible y pudo documentarse la supervivencia a largo plazo para algunos tipos celulares que se encapsularon con este sistema. Se ha caracterizado y optimizado con fines biomédicos y las microcápsulas se han aplicado posteriormente con éxito, por ejemplo en el campo de la terapia tumoral, en la que las células vivas encapsuladas producen compuestos terapéuticos, tales como anticuerpos, que son liberados a través de los poros de las cápsulas dentro del cuerpo del paciente (patente US n.° 6.540.995, de Gunzburg et al., y la patente US n.° 6.426.088 de Piechaczyk et al.).

Los primeros experimentos llevado a cabo en el propio laboratorio mostraron que los protones ácidos H30 podían pasar fácilmente a través de las paredes de las cápsulas de sulfato de celulosa. Al encapsular partículas de CaCO3con sulfato de celulosa sódica y pDADMAC de pequeño tamaño, se disolvieron por completo al añadir una solución acuosa ácida. La disolución ocurría de una manera dependiente del tiempo. La fig. 2 muestra fotografías de dichas cápsulas con inclusiones de cristales de CaCO3que se disuelven lentamente, a un pH inferior a 6, de una manera dependiente del tiempo. Al reducir el pH adicionalmente de 7,5 a 3, el CO<2>generado forma burbujas dentro de las cápsulas.

Por lo tanto, resulta inesperado que las cápsulas de NaCS/pDADMAC son capaces de proteger a las células microbianas frente al efecto de un medio ácido.

La idea de utilizar esta tecnología de encapsulación basada en el sistema NaCS/pDADMAC con el fin de proteger las células microbianas frente a la degradación por el jugo gástrico en el estómago, y adicionalmente durante el paso por el intestino, se sometió a ensayo en la presente memoria e inesperadamente las células microbianas dentro de las cápsulas macroporosas constituidas de sulfato de celulosa y pDADMAC (figura 3) sobrevivieron al tratamiento ácido mucho más tiempo que las células no encapsuladas (figura 4), a pesar del tamaño bastante grande de poro de las cápsulas (demostrado en las patentes US n.° 6.540.995 y n.° 6.426.088, para permitir la liberación de macromoléculas) y las enseñanzas de la técnica de que la celulosa como excipiente no protege a las células frente a la degradación a través del jugo gástrico en el estómago. Además, las células mantuvieron su viabilidad y actividad metabólica. La mayoría de las células en este caso se mantuvieron encapsuladas durante su tratamiento con líquidos intestinales, tales como jugo duodenal; por lo tanto, las células están capacitadas para pasar por el tracto digestivo, por ejemplo, incluyendo el intestino, dentro de las microcápsulas y para liberar de esta manera los enzimas que produzcan, a través de los poros de las cápsulas hacia el medio circundante. Dependiendo de las condiciones de microencapsulación, puede ajustarse la liberación de células microbianas microencapsuladas en el tracto gastrointestinal, con el fin de mejorar la liberación de las células microbianas a partir de las microcápsulas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a la administración oral de un material microencapsulante específico y a métodos para proteger las células microbianas vivas, que podrían ser bacterias y levaduras, en particular células probióticas, que es un grupo heterólogo que consiste en levaduras concretos, hongos concretos y bacterias concretos, frente a la degradación por ácido en solución acuosa ácida, y para capacitarlas además para pasar por el tracto digestivo y permanecer viables. Se refiere, además, a la encapsulación de células microbianas que liberan enzimas, a través de los poros de las cápsulas hacia su medio circundante, tras haber sobrevivido al jugo gástrico ácido de los animales, que podrían ser vertebrados, aunque preferentemente son aves y mamíferos, para conseguir el beneficio de salud correspondiente. Debe entenderse que la invención tal como se describe a lo largo de todo el documento también puede aplicarse a otros subgrupos diferentes de animales. Sin embargo, los animales preferentes son las aves, concretamente aves que resultan útiles para la producción de alimentos, como gansos, pollos, pavos, peces, crustáceos o mamíferos, como roedores, perros o gatos, aunque particularmente mamíferos, los cuales resultan útiles para la producción alimentaria como rumiantes (vacas, cabras, ovejas, bisontes, alces, búfalos y ciervos) o cerdos. Sin embargo, resultan preferentes los seres humanos, con el fin de prevenir o tratar los desequilibrios gastrointestinales. Se proporcionan cápsulas macroporosas de sulfato de celulosa que contienen células microbianas, tales como células microbianas productoras de enzimas digestivos y especialmente probióticos, que son resistentes al tratamiento con solución acuosa acidificada con HCl, especialmente con ácido gástrico o líquido gástrico, durante un tiempo prolongado de por lo menos 1 h y que además son resistentes al tratamiento con líquidos intestinales, tales como líquido intestinal simulado (LIS) o jugo duodenal, etc. El procedimiento de microencapsulación de las células microbianas es inesperadamente simple. Los datos experimentales proporcionados en la presente memoria revelan que la microencapsulación de células microbianas con sulfato de celulosa sódica (NaCS) y poli[cloruro de dialil-dimetilamonio] (pDADMAC) resulta en que las microcápsulas macroporosas que protegen las células microbianas encapsuladas con éxito frente a la degradación en medio ácido, así como en el medio bastante básico de los jugos intestinales (el pH esencialmente es de aproximadamente 8). Incluso tras 90 min de tratamiento con HCl a pH 2,0, la actividad metabólica de las células microbianas encapsuladas todavía es elevada en comparación con las células no encapsuladas. Lo anterior resulta inesperado debido a que los iones hidronio (H<3>O<+>) se espera que se difundan rápidamente hacia el interior de la cápsula debido al tamaño relativamente grande de los poros (de aproximadamente 80 kDa o superior), tal como se ha mostrado en estudios que demuestran que las células encapsuladas con sulfato de celulosa sí permiten el paso de sustancias tan grandes como anticuerpos a través de sus poros en las paredes de la cápsula. Por algún motivo, la encapsulación con sulfato de celulosa sódica y pDADMAC que resultaba en superficies macroporosas de las cápsulas proporcionó, sin embargo, una protección significativa frente a la degradación con soluciones ácidas. Al tratarlas con líquidos intestinales, tales como jugo duodenal, las microcápsulas todavía permanecían intactas. Sin embargo, el tamaño de poro es suficientemente grande para permitir que los enzimas secretados por las células microbianas pasen a través de las paredes de las cápsulas y se liberen, por ejemplo, en el interior del tracto digestivo. Lo anterior permite el paso de un número elevado de células viables, metabólicamente activas, p. ej., probióticas, por el estómago hasta el interior del intestino.

La tecnología de microencapsulación de células, basada en la utilización de sulfato de celulosa sódica, que puede ser celulosa homogénea o heterogéneamente sulfatada, y pDADMAC, hasta el momento no se ha aplicado para proteger las bacterias encapsuladas o probióticos frente a la degradación ácida, ni frente a la degradación a lo largo de periodos prolongados de almacenamiento o ambos.

Es una realización de la invención proporcionar dicha tecnología para la utilización en la industria alimentaria. Las células microbianas encapsuladas resultan especialmente útiles para potenciar la ganancia de peso en animales de granja. La sustitución de, p. ej., poblaciones microbianas intrínsecas por cepas microbianas que proporcionan una composición enzimática más eficaz conduce a una utilización mejorada del alimento. Por lo tanto, la utilización de la tecnología y las microcápsulas tales como las descritas anteriormente en la industria alimentaria es otra realización de la invención.

Mediante la generación de un material de partida definido químicamente, que circunda a las células con dicha cápsula de PEC basado en celulosa, que no solo es de alta resistencia mecánica y buena compatibilidad, sino que también no resulta afectada por las condiciones ácidas y es capaz de responder a cambios en el medio circundante mediante la liberación de las células y/o productos celulares a partir de las cápsulas al pasar por el intestino, se consigue una solución al problema de la baja supervivencia de la mayoría de células, tales como probióticos, en productos dietéticos y en aditivos alimentarios administrados por vía oral.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 representa la estructura química de los polielectrolitos utilizados para la encapsulación.

La figura 1a) representa la estructura química del sulfato de celulosa sódica (NaCS).

La figura 1b) representa la estructura química del poli[cloruro de dialil-dimetil-amonio] (pDADMAC).

La figura 2 muestra una serie de fotografías que representan cápsulas constituidas de sulfato de celulosa y pDADMAC según la invención, que contienen CaCO<3>a diferentes valores de pH. Las primeras cápsulas se encuentran a un pH de 7,5 y contienen cristales de CaCO<3>. La última fotografía muestra las cápsulas a un pH de 3, en donde los cristales de CaCO<3>se disuelven y las burbujas de CO<2>son visibles dentro de las cápsulas.

Lo anterior demuestra que el ácido (H<3>O<+>) puede entrar libremente en las cápsulas y disolver los cristales de CaCO<3>.

Por lo tanto, resulta muy inesperado que las cápsulas de NaCS/pDADMAC sean capaces de proteger a las células microbianas frente al efecto de un medio ácido.

La figura 3 muestra una fotografía de microscopía óptica de células deLactobacillus acidophilusencapsuladas con NaCS/pDADMAC.

La figura 4 muestra la supervivencia deLactobacillus acidophiluslibres (cuadrados) frente a encapsuladas con NaCS/pDADMAC (rombos) bajo condiciones ácidas (HCl, pH 2) durante un periodo de hasta 4 horas. Se determinó la viabilidad mediante el ensayo Alamar Blue® y se midió en unidades de fluorescencia relativa (URF).

Descripción detallada de la invención

El objeto de la invención son células microbianas encapsuladas para la administración oral, que comprende cápsulas que presentan paredes de la cápsula porosas, en el que las paredes porosas de las cápsulas comprenden un complejo formado de sulfato de celulosa y poli[cloruro de dimetildialilamonio], que se caracterizan como resistentes al tratamiento con solución acuosa ácida, especialmente células bacterianas que son sensibles al tratamiento con solución acuosa ácida cuando no están encapsuladas. La tecnología de microencapsulación celular utilizada en la presente memoria se basa en la utilización de sulfato de celulosa sódica que puede producirse por celulosa homogénea o heterogéneamente sulfatada. El pDADMAC utilizado en los métodos según la invención es de peso molecular bastante pequeño, tal como han descrito Dautzenberg et al. (1999b). (Dautzenberg H. Schuldt U. Grasnick G. Karle P. Muller P. Lohr M. Pelegrin M, Piechaczyk M, Rombs KV, Gunzburg WH, Salmons B, Sailer RM.

"Development of cellulose sulfate-based poly electrolyte complex microcapsules for medical applications". Ann. N. Y. Acad. Sci. (1999), 875,46-63). En esta referencia se ha dado a conocer que la resistencia mecánica óptima de las paredes de cápsula puede conseguirse con pDADMAC de aproximadamente 20 kDa. Las cápsulas producidas de esa manera se caracterizan por presentar poros suficientemente grandes para permitir el paso de proteínas o anticuerpos monoclonales, de acuerdo con un tamaño de por lo menos 80 kDa o incluso de hasta 150 kDa. La dependencia del tamaño de poro y el tamaño del pDADMAC utilizado se han dado a conocer en Dautzenberg et al. (1999a) ("Size exclusion properties of polyelectrolyte complex microcapsules prepared from sodium cellulose sulphate and pDADMAC", Journal of Membrane Science, (1999), 162(1-2), 165-171). Resulta evidente que un peso molecular más bajo de pDADMAC resulta en un tamaño de poro más grande. Resulta preferente que las microcápsulas presenten tamaños de poro suficientemente grandes para permitir la liberación de enzimas a partir de las células microbianas que producen y excretan enzimas digestivos.

En una realización de la invención, las cápsulas presentan la forma de microcápsulas esféricas con un diámetro de entre 0,01 y 5 mm, preferentemente de entre 0,05 y 3 mm, y lo más preferentemente de entre 0,01 y 1 mm. También resulta preferente que las cápsulas presenten unas paredes de cápsula porosas, que son permeables a dichos enzimas digestivos. Las microcápsulas se caracterizan porque comprenden poros superficiales que permiten el paso de los enzimas. Resulta preferente que el tamaño de poro superficial de las paredes porosas de cápsula sea de entre 80 y 150 nm, para permitir el paso de los enzimas. Resulta especialmente preferente que los poros superficiales de las paredes porosas de cápsula presenten un valor de corte de peso molecular (MWCO, por sus siglas en inglés) de entre 50 y 200 kDa, preferentemente de entre 60 y 150 kDa, y lo más preferentemente, de entre 60 y 100 kDa.

Son ejemplos de los enzimas digestivos y sus tamaños las proteasas, tales como la subtilisina deB. subtilis,con un tamaño aproximado de 27 kDa, las alfa-amilasas de aproximadamente 63 kDa, las alfa-galactosidasas de aproximadamente 82 kDa, las proteasas bromelaína de aproximadamente 25 kDa, celulasas de aproximadamente 32 kDa, glucoamilasas de aproximadamente 78 kDa, pectinasas de aproximadamente 3 kDa y lipasas deBacillus subtilisde aproximadamente 20 kDa. El tamaño exacto puede variar de organismo a organismo. Algunos de estos enzimas también actúan como dímeros.

Resulta preferente que las células sean células que resulten beneficiosas para el animal según la presente invención después del consumo. Resulta preferente que las células se seleccionen del grupo que comprende levaduras, tales comoSaccharomyces, Debaromyces, Candida, PichiayTorulopsis; hongos, tales comoAspergillus, Rhizopus, Mucor,yPenicilliumyTorulopsis,y bacterias, tales comoBifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus, Geobacillusy probacteria, tales como Lactobacillus. En el contexto de la presente invención pueden seleccionarse células microbianas de grupos que comprenden levaduras, hongos y bacterias, y/o probióticos, o como realización adicional de la presente invención, pueden combinarse células microbianas de estos grupos. En el contexto de la presente invención el término "probióticos" y la expresión "células probióticas" se utilizan intercambiablemente.

Resulta preferente que dichas células microbianas encapsuladas, especialmente las que secretan enzimas digestivos, se seleccionan del grupo que contieneSaccharomyces, Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Bacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, PropionibacteriumyGeobacillus.

Más preferentemente, las células se seleccionan del grupo que comprendeSaccharomyces cereviseae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckisubsp.lactis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus lacti, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus(LactobacillusGG),Lactobacillus sake, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus halophilus, Streptococcus faecalis, Streptococcus thermophilus, Staphylococcus carnosusyStaphylococcus xylosus.

Resulta especialmente preferente que las células sean células probióticas. Resulta especialmente preferente que las células probióticas se seleccionen del grupo que comprendeLactobacillus acidophilus, Lactobacillus caseei, Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, Lactobacillus johnsonii, Lactococcus lactis subsp lactis, Lactococcus lactis subsp cremoris, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium angulatumyBifidobacterium longum.En una realización específica, las células son células deLactobacillus acidophiluso deBacillus subtilis.

Las células deLactobacillus acidophilusencapsuladas, que comprenden cápsulas que presentan paredes porosas de las cápsulas, en las que las paredes porosas de las cápsulas comprenden un complejo formado de sulfato de celulosa sulfatada homogénea o heterogéneamente y poli[cloruro de dimetildialilamonio], proporcionan de esta manera que dichas células encapsuladas sean resistentes a un tratamiento con solución acuosa ácida de un valor de pH de 2 durante un periodo de tiempo de entre 2 y 4 horas, y son por lo tanto, una realización específica de la invención. Es una realización preferente en la que las células son resistentes durante un periodo de tiempo de 2 horas.

Puede entenderse que el término "resistente" comprende una situación en la que la mayoría de células microbianas todavía es viable después de dicho tratamiento.

Resulta preferente que la mayoría de dichas células todavía sea viable después de dicho tratamiento con una solución acuosa ácida. Resulta especialmente preferente que la mayoría de células todavía sea metabólicamente activa después de dicho tratamiento y que las células todavía produzcan y liberen enzimas. En el presente contexto, se entiende que la mayoría es por lo menos 51 % de las células. Resulta preferente que 60 % a 90 % de las células permanezca viable. Resulta todavía más preferente que 60 % a 80 % de las células permanezca viable. Es una realización especialmente preferente que 60 % de las células permanezca viable después del tratamiento ácido.

Se entiende que por lo menos más de las células encapsuladas son metabólicamente activas después del tratamiento con una solución acuosa ácida que las células del mismo tipo que no han sido encapsuladas y tratadas bajo las mismas condiciones.

Es una realización preferente una en la que el tiempo de tratamiento con solución acuosa ácida es de entre 0,5 y 2,5 horas, preferentemente de entre 1 y 2 horas, y lo más preferentemente, de 1,5 horas. También es una realización preferente de la presente invención una en la que la solución acuosa ácida presenta un intervalo de pH de entre 1,0 y 3,0, preferentemente de entre 1,5 y 2,5, y lo más preferentemente es un pH de 2,0.

Es una realización preferente que las células encapsuladas según la invención produzcan y liberen enzimas digestivos, que se seleccionan del grupo que comprende amilasas, tales como alfa-amilasas, galactosidasas, especialmente alfagalactosidasas, proteasas, especialmente proteasa bromelaína y subtilisina, celulasas, hemicelulasas, pectinasas y lipasas. Resulta preferente que los enzimas se seleccionan del grupo que contiene los anteriormente indicados. Resulta especialmente preferente que las células encapsuladas se seleccionen del grupo deBifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Bacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, PropionibacteriumyGeobacillus.

En una realización preferente de la presente invención, las células microbianas son células deBacillus subtilisy los enzimas secretados son proteasas, especialmente la subtilisina. Otra realización de la invención relacionada con las células probióticas encapsuladas comprende cápsulas que presentan paredes porosas de las cápsulas, en las que las paredes porosas de las cápsulas comprenden un complejo polielectrolito formado a partir de los polielectrolitos con carga opuesta de sulfato de celulosa y poli[cloruro de dimetildialilamonio], proporcionando de esta manera que estas células probióticas encapsuladas sean resistentes al tratamiento con solución acuosa ácida, y en las que las cápsulas se caracterizan porque liberan por lo menos una parte de las células probióticas vivas bajo tratamiento con líquidos intestinales. La solución acuosa ácida puede ser jugo gástrico o líquido gástrico. El tratamiento con líquido intestinal comprende pasar por el intestino de un ave o de un mamífero, incluyendo un ser humano. Preferentemente, el líquido intestinal comprende jugo o líquido duodenal. Es una realización preferente que las células probióticas encapsuladas, que comprenden cápsulas tal como se ha indicado anteriormente, se caractericen como supervivientes de un tratamiento con líquido gástrico simulado (LGS), y en la que un tratamiento con líquido duodenal simulado o líquidos intestinales simulados (LIS) induce o causa la liberación de por lo menos una parte de las células probióticas hacia el exterior de las cápsulas.

Otra realización de la presente invención es proporcionar un suplemento alimentario que comprende dichas células microbianas encapsuladas, según las realizaciones diferentes indicadas anteriormente, que también se entiende que es una realización de la invención. Además, una formulación, preferentemente una formulación farmacéutica o composición farmacéutica que comprende células microbianas encapsuladas, preferentemente células bacterianas probióticas, o levaduras encapsuladas o células fúngicas encapsuladas, que preferentemente son células fúngicas probióticas tal como se ha indicado anteriormente, es otra realización de la invención. Las células microbianas encapsuladas pueden utilizarse como medicamento o agente profiláctico. Pueden utilizarse para tratar o prevenir la diarrea, incluyendo la diarrea causada por antibióticos y otras formas de sufrir de una población bacteriana desequilibrada en el intestino, sea en respuesta a un tratamiento antibiótico o no.

El sulfato de celulosa sódica utilizado en los métodos según la invención se produjo mediante el método de sulfatación homogénea partiendo de línteres de celulosa. Sin embargo, también resulta posible utilizar celulosa heterogéneamente sulfatada, ya que también material, según Dautzenberg et al. (1999b) ("Development of Cellulose Sulphate-based Poly electrolyte Complex Microcapsules for Medical Applications", Ann. N. Y. Acad. Sci., (1999), 875, 46-63.) resulta en la formación de cápsulas con poros grandes, de por lo menos 80 kDa.

Un suplemento alimentario que comprende dichas células microbianas encapsuladas o probióticos encapsulados también se entiende que es una realización de la invención. Además, una formulación, preferentemente una formulación farmacéutica que comprende células bacterianas o probióticos encapsulados, tal como se ha descrito anteriormente, es otra realización de la invención.

En el documento n.° WO2006/095021 (US 2009/0011033) se ha descrito un método que describe la producción de sulfato de celulosa de calidad suficiente. Resulta preferente que el sulfato de celulosa utilizado sea de un peso molecular entre 100 y 500 kDa, preferentemente de entre 200 y 400 kDa, y lo más preferentemente de entre 250 y 350 kDa. Los experimentos en la sección de Ejemplos de la presente solicitud se llevaron a cabo con material de NaCS (09-SuI-592) proporcionado por el Fraunhofer Institute of Applied Polymer Research (IAP) en Potsdam, Alemania.

La preparación de cápsulas de sulfato de celulosa se ha descrito en detalle en el documento n.° DE 4021 050 A1, de Dautzenberg. También se ha descrito en dicha referencia la síntesis del sulfato de celulosa; los métodos para una caracterización exhaustiva de las cápsulas de sulfato de celulosa se tratan ampliamente en H. Dautzenberg et al., Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech., (1993), 21(3), 399-405. Otras cápsulas de sulfato de celulosa se describen en el documento n.° GB 2.135.954. Las propiedades de las cápsulas de celulosa, es decir, el tamaño, el tamaño de poro, el grosor de pared y las propiedades mecánicas, dependen de varios factores, tales como, por ejemplo, circunstancias físicas bajo las que se han preparado las cápsulas, la viscosidad del baño de precipitación, su fuerza iónica, la temperatura, la rapidez de la adición de suspensión de células/sulfato de celulosa, la constitución de sulfato de celulosa, así como otros parámetros descritos por el grupo de Dautzenberg.

Generalmente, con el fin de formar las cápsulas, el sulfato de celulosa sódica se pone en contacto con una solución acuosa de pDADMAC, que puede adquirirse, p. ej., de Aldrich Co., EE. UU., o de Katpol Chemie, entre otros. Alternativamente, puede prepararse poli[cloruro de dimetildialilamonio] (pDADMAC, también denominado PDMDAAC) mediante polimerización de radicales de cloruro de dimetil-dialil-amonio (según la Universidad de Potsdam, Departamento de Química, Teltow, Alemania). Mansfeld y Dautzenberg sugieren utilizar una solución al 1,2 % (p/p) de PDMDAAC (pDADMAC) en agua destilada. Puede adquirirse pDADMAC en una diversidad de diferentes tamaños. Zhang et al. (Zhang, Yao y Guan, 2005, Preparation of macroporous sodium cellulose sulphate/poly(dimethyldiallylammonium chloride) capsules and their characteristics. Journal of Membrane Science. volumen 255, números 1 y 2, 2005, páginas 89 a 98) utilizaron un pDADMAC con un peso molecular de entre 200.000 y 350.000 Da, mientras que Dautzenberg sugiere un pDADMAC de un peso molecular entre 10.000 y 30.000 Da.

En el documento n.° WO2006/095021 (US 2009/0011033) se ha descrito un método que resulta en la producción de muestras de sulfato de celulosa de calidad suficiente. En este procedimiento, una mezcla de reacción de n-propanol y ácido sulfúrico sirvió como medio y agente de sulfatación.

El sulfato de celulosa sódica (Fig. 1a) sirve de polianión y el poli[cloruro de dialildimetilamonio] (pDADMAC) (fig. 1b), como policatión. Se utilizó la solución de NaCS para construir el núcleo de cápsula y la solución de pDADMAC como baño de precipitación que proporciona el segundo componente de reacción para la formación de PEC en la superficie de las gotas, formando de esta manera las cápsulas mediante el recubrimiento de las gotas con una membrana sólida. Puede utilizarse una máquina encapsuladora disponible comercialmente para formar las microcápsulas, que en el contexto de toda la invención también se denominan perlas o microesferas. Dicho encapsulador incluye una bomba perfusora que empuja una solución de NaCS con una velocidad definida por una boquilla y genera de esta manera un flujo de líquido continuo. Se fuerza que una unidad de pulsación haga oscilar el flujo líquido, en la que la oscilación superpuesta causa la fragmentación de la corriente líquida de salida o chorros en perlas de igual volumen. Con el fin de mejorar la monodispersabilidad de las perlas y reducir simultáneamente la coalescencia, se proporciona un campo eléctrico bajo la salida de la boquilla en dicho encapsulador. La carga electrostática en la fase libre causa una repulsión de las perlas individuales, de manera que se evita sustancialmente la agregación de las perlas individuales hasta la entrada en el baño de formación de complejo.

Las perlas esféricas formadas de esta manera se introducen en un baño formador de complejo, dentro del cual se forma la membrana externa de las cápsulas por interacción electrostática, por ejemplo entre el NaCS y la solución de pDADMAC. Bajo agitación constante, las cápsulas se mantienen en dicho sistema hasta alcanzar un grado deseado de endurecimiento en el recipiente correspondiente y a continuación se encuentran disponibles para el procesamiento posterior.

A falta de un encapsulador u otro sistema generador de gotas por chorro de aire, puede utilizarse una jeringa con un diámetro interior de entre 0,2 y 1,0 mm, posiblemente con un sistema de extrusión de bomba de jeringa adecuado. Alternativamente, la utilización de una pipeta Pasteur con, p. ej., un diámetro interno de 1,5 mm, también funciona para generar cápsulas resistentes a los ácidos según la presente invención.

Las cápsulas resultantes presentan un tamaño de poro suficientemente grande para permitir el paso de macromoléculas de hasta 80 kDa, o incluso de hasta 150 kDa, p. ej., proteínas anticuerpos. Las cápsulas producidas de esta manera se ha informado que presentan tamaños de poro suficientemente grandes para liberar a través de estos poros anticuerpos que han sido producidos por células de hibridoma dentro de estas cápsulas. La tecnología de encapsulación con sulfato de celulosa descrita por Dautzenberg et al. 1999b ("Development of Cellulose Sulphatebased Poly electrolyte Complex Microcapsules for Medical Applications") se utilizó para someter a ensayo si la producción in vivo de un anticuepro monoclonal neutralizante podía proteger a los ratones frente al retrovirus Fr-CasE (Pelegrin et al., "Immunotherapy of Viral Disease by in Vivo Production of Therapeutic Monoclonal Antibodies", Human Gene Therapy (2000), 11, 1407-1415). A partir de estos resultados resulta evidente que las cápsulas presentan poros de suficiente tamaño para permitir el paso de un anticuerpo monoclonal.

Sin embargo, se entiende que las sustancias y métodos de la invención no están limitados a la utilización de los ingredientes específicos descritos en la presente memoria; por el contrario, la invención comprende también la utilización de ingredientes adquiridos de otras fuentes o ingredientes producidos mediante métodos tales como los descritos anteriormente.

Antes de la encapsulación, las células microbianas se cultivan mejor hasta una DO 600 nm de 1 y se recolectan. Sin embargo, también resultan adecuadas otras DO 600 como punto de partida. A continuación, se encapsulan con sulfato de celulosa y pDADMAC de la manera siguiente:

las células microbianas se microencapsula con NaCS de acuerdo con el método de Dautzenberg et al. ("Preparation and Performance of Symplex Capsules", Makromol. Chem., Suppl. 9, 203-210, 1985; "A new method for the encapsulation of mammalian cells", Merten et al., Cytotechnology 7: 121-120, 1991; "Development of Cellulose Sulphate-based Polyelectrolyte Complex Microcapsules for Medical Applications", Annals of the New York Academy of Sciences, 875 (Bioartificial Organs II: Technology, Medicine, and Materials), 46-63, 1999b). En resumen, NaCS sirve como polianión y construye el núcleo de la cápsula. La solución de poli[cloruro de dialildimetilamonio] como policatión proporciona un baño de precipitación que proporciona el segundo componente de reacción para la formación de complejo polielectrolito en la superficie del núcleo de cápsula de sulfato de celulosa, formando de esta manera microcápsulas mediante recubrimiento con una membrana sólida de las gotas de núcleo de NaCS.

Los cultivos microbianos se cultivan hasta una densidad óptica que indique se encuentran en un estado totalmente viable; para la mayoría de células microbianas esta podría ser óptimamente una densidad óptica de 1. A continuación, una parte, por ejemplo 50 μl, 100 μl o 200 μl del cultivo bacteriano, se mezcla con aproximadamente 20 veces (se mezclan 100 μl con 2 ml) de ese volumen de solución de sulfato de celulosa sódica que contiene 1,8 % de sulfato de celulosa sódica (09-Sul-592 Fraunhofer Institute Golm, Alemania) y 0,9 % a 1 % de cloruro sódico. Seguidamente, se introducen pequeñas cantidades de esa solución, por ejemplo, gotas, en un baño de 1,3 % de pDADMAC de 24 kDa (tamaño medio entre 21 y 25 kDa). Lo anterior puede llevarse a cabo utilizando una jeringa y una aguja, en el caso de que no se disponga de ningún encapsulador o con el sistema generador de gotas tal como se ha indicado anteriormente. Tras un tiempo de endurecimiento de 4 min y varias etapas de lavado, las células encapsuladas se obtienen del baño y están listas para el uso o el almacenamiento.

Dichas células encapsuladas ahora ya pueden, adicionalmente a modo de una realización adicional de la invención, añadirse a diferentes tipos de alimento como ingredientes alimentarios. Alternativamente, pueden consumirse en forma de una composición farmacéutica o formulación farmacéutica. Por ejemplo, pueden proporcionarse en forma de (macro)cápsulas con un recubrimiento entérico, que hace que resulten adecuadas para tragar las cantidades correctas de microcápsulas para conseguir el beneficio de salud deseado, tal como además de reforzar la salud y función intestinal, incluyendo (según la cepa bacteriana seleccionada) la repoblación del tracto gastrointestinal después de la terapia antibiótica, compensando la intolerancia a la lactosa y respaldando el sistema inmunitario y reduciendo el colesterol. Entre los beneficios nutriciones se incluyen su papel en potenciar la biodisponibilidad del calcio, zinc, hierro, manganeso, cobre y fósforo, y la síntesis de vitaminas. Entre los beneficios terapéuticos de dichas células microbianas se incluyen la actividad antimicrobiana, la capacidad de asimilar el colesterol, una mejora de la intolerancia a la lactosa y actividad anticarcinogénica.

Tras la encapsulación, las células microbianas encapsuladas podrían cultivarse adicionalmente hasta que el volumen entero de la cápsula se haya llenado con células microbianas, que puede observarse como una masa densa bajo el microscopio. Cuanta mayor sea la densidad de llenado de las cápsulas con las células microbianas, más estarán protegidas del medio ácido y más células microbianas sobrevivirán el paso por el estómago o una incubación con soluciones acuosas ácidas o líquido gástrico.

Por lo tanto, es otra realización de la invención proporcionar un método para proteger las células frente a la degradación mediante el tratamiento con una solución acuosa ácida, mediante encapsulación, que comprende: a) suspender las células vivas en una solución acuosa de un polielectrolito de sulfato de celulosa sódica, b) introducir la suspensión en forma de partículas preformadas en un baño de precipitación que contiene una solución acuosa del polielectrolito de carga contraria poli[cloruro de dimetildialilamonio], c) terminar la reacción en el baño tras 1 a 60 min, preferentemente 3 a 10 min, más preferentemente 3 a 5 min, y lo más preferentemente, tras 4 min, d) recolectar las células encapsuladas del baño, e) opcionalmente incubar las células encapsuladas en un medio o solución que comprende factores nutricionales adicionales, f) opcionalmente incubar las células encapsuladas hasta que las cápsulas estén totalmente llenas con células, g) exponer las células encapsuladas al tratamiento con una solución acuosa ácida, que es conocido que degrada dichas células, en caso de que no estén encapsuladas, de manera que la mayoría de las células encapsuladas se mantiene viable. En este contexto, se entiende que "la mayoría" es por lo menos 51 % de las células, por lo menos 60 % o entre 60 % y 90 % de las células. En una realización preferente, entre 60 % y 80 % de las células mantiene la viabilidad.

Es una realización preferente de la invención, en la que el método según se reivindica proporciona protección frente al tratamiento ácido con una solución acuosa durante un periodo de entre 0,5 y 3 horas. En una realización preferente, el periodo es de entre 1 y 2 horas, y resulta especialmente preferente un periodo de 90 min. En la presente memoria se entiende que se consigue la protección en el caso de que una mayoría de las células todavía sea viable o todavía se mantenga metabólicamente activa, o en el caso de que conserven la viabilidad más de las células encapsuladas que de las células no encapsuladas que se han tratado bajo las mismas condiciones. Se entiende que "metabólicamente activo" muestra una lectura en un espectrofotómetro de UV-vis. a 570 nm tras la incubación con resazurina, que se reduce a resorufina fluorescente, que es significativamente diferente del nivel de fondo o de un valor de control negativo.

Además, resulta preferente que la solución acuosa ácida con la que se tratan las células sea jugo gástrico, líquido gástrico o líquido gástrico simulado, o jugo gástrico simulado. La exposición al tratamiento con solución ácida puede ser una incubación en solución acuosa ácida y es una realización preferente en la que dicho tratamiento se lleva a cabo bajo condiciones fisiológicas. Además, resulta preferente que las células encapsuladas sean adicionalmente resistentes al tratamiento con líquidos intestinales, tales como líquido intestinal simulado o jugo duodenal.

La expresión "líquido gástrico simulado" se entiende que comprende líquidos gástricos preparados artificialmente diferentes que han sido dados a conocer en la literatura. Uno de ellos se describe en la presente memoria a modo de ejemplo. El líquido gástrico simulado puede prepararse, por ejemplo, a partir del líquido gástrico básico y pepsina. El líquido gástrico básico se ha preparado de acuerdo con Clavel et al. (J. Appl. Microbiol. (2004), 97(1), 214-219) con algunas modificaciones. Contenía 4,8 g de NaCl (POCH, Polonia), 1,56 g de NaHCO<3>(<p>O<c>H, Polonia), 2,2 g de KCl (POCH, Polonia) y 0,22 g de CaCl<2>(POCH, Polonia) disueltos en 1 l de agua destilada. Tras someterlo a autoclave a 121 °C/15 min, se ajustó el pH del líquido gástrico básico a 2,4±0,2 utilizando HCl 1 M y se añadieron 2 mg de pepsina (Sigma Aldrich, EE. UU.) por cada 50 ml de líquido gástrico artificial.

La expresión "líquido intestinal simulado" se entiende que comprende líquidos intestinales o duodenales preparados artificialmente diferentes que han sido dados a conocer en la literatura. Uno de ellos se describe en la presente memoria a modo de ejemplo. El líquido duodenal simulado puede prepararse a partir de líquido duodenal básico y un complejo de enzimas. El líquido duodenal básico se ha preparado de acuerdo con Marteau et al. (J Dairy Sci. 1997: 80(6), 1031-37) con algunas modificaciones. Contenía 5,0 g de NaCl (POCH, Polonia), 0,6 g de KCl (POCH, Polonia), 0,03 g de CaCl<2>(POCH, Polonia) y 17 g de sales biliares (Merck, Alemania) disueltos en 1 l de NaHCO<3>1 mol/l (POCH, Polonia). Tras someter a autoclave a 121 °C/15 min, se ajustó el pH del jugo básico a 7,0±0,2 utilizando NaOH 1 mM y se añadió un complejo de enzimas. El complejo de enzimas comprendía enzimas pancreatina: 20000 F.I. P. unidades de lipasas, 16000 unidades F.I.P. de amilasas, 1200 unidades F.I.P. de proteasa (=2 cápsulas de Kreon® 10000 (300 mg de enzimas pancreatina) adquiridas de Solvay Pharmaceuticals, EE. UU.) añadidas por cada 50 ml de líquido.

Es otra realización de la invención proporcionar un método para producir células microbianas encapsuladas que generen y excreten enzimas digestivos, con sulfato de celulosa sódica y pDADMAC, resultando en microcápsulas que contienen células microbianas, que son resistentes al tratamiento con soluciones acuosas ácidas que presentan una pared porosa que permite que pasen los enzimas generados, que comprende las etapas siguientes:

i) suspender un cultivo de dichas células microbianas con una solución de sulfato de celulosa sódica, preferentemente que contiene 1,8 % de sulfato de celulosa sódica y 0,9 % a 1 % de cloruro sódico,

ii) introducir la suspensión en forma de partículas preformadas en un baño de precipitación que preferentemente comprende 1,3 % de pDADMAC de 24 kDa (20 a 25 kDa) y recolectar las microcápsulas que contienen células microbianas del baño. Resulta preferente que la reacción en el baño de precipitación se termina tras 1 a 60 min, preferentemente 1 a 10 min, más preferentemente 3 a 5 min, y lo más preferentemente, tras 4 min, por ejemplo mediante la adición de una cantidad en exceso de solución de lavado.

Una realización adicional de la invención comprende un método para prevenir la degradación ácida de las células microbianas probióticas mediante encapsulación con sulfato de celulosa sódica y pDADMAC, que comprende las etapas siguientes: suspensión de un cultivo de las células probióticas con una solución de sulfato de celulosa sódica que contiene 1,8 % de sulfato de celulosa sódica y 0,9 % a 1 % de cloruro sódico; introducir la suspensión en forma de partículas preformadas, por ejemplo mediante la utilización de una jeringa de 5 ml y una aguja 23G, en un baño de precipitación que comprende 1,3 % de pDADMAC de 24 kDa, en donde se entiende que el pDADMAC de 24 kDa es el tamaño medio, y recolectar las microcápsulas que contienen las células probióticas a partir del baño. Es una realización preferente en la que la reacción en el baño de precipitación se termina tras 3 a 5 min, preferentemente tras 4 min. Se especifica que pDADMAC de 24 kDa del proveedor Katpol Chemie comprende un intervalo de 20 a 25 kDa.

Para la microencapsulación de células deL. acidophilus,las células obtenidas del cultivo pueden mezclarse con NaCS tal como se ha descrito y las microcápsulas pueden producirse manualmente con una jeringa y una aguja, tal como se describe en el ejemplo.

Además, la invención proporciona un método para introducir células viables, que son sensibles al ácido gástrico si no están encapsuladas, en el intestino de los animales, incluyendo seres humanos, que comprende administrar células encapsuladas tal como se han descrito anteriormente.

Se proporciona, además, un método de tratamiento o prevención de la diarrea, la diarrea causada por antibióticos y otras formas de sufrir una población bacteriana no equilibrada en el intestino, mediante la administración de células encapsuladas según la invención en mamíferos que sufren, o se espera que sufran, de dicha diarrea, diarrea causada por antibióticos y otras formas de sufrir de una población bacteriana no equilibrada en el intestino.

El lector experto en la materia conocerá que la densidad celular, así como las concentraciones del NaCl, pueden modificarse. Además, la formación de cápsulas no se encuentra limitada al tiempo exacto de endurecimiento de 240 s. Además, la solución de NaCl puede sustituirse por una solución de PBS u otras soluciones tampón.

El tamaño de las cápsulas puede modificarse de 200 a 1200 μm de diámetro, si se producen en un procedimiento automatizado que implique un aparato, tal como el encapsulador IE-50R e IEM-40 de EncapBiosystems, Suiza, previamente distribuidos por Inotech. Es una realización preferente de la invención en la que el tamaño de cápsula es de entre 200 y 700 μm. y todavía más preferentemente en el que el tamaño de cápsula es de entre 200 y 500 μm.

Un método de producción alternativo implica la utilización de pipetas Pasteur. Al utilizar pipetas Pasteur para la producción de cápsulas manualmente, el diámetro de las microcápsulas alcanzó un tamaño de entre 3.000 y 5.000 μm.

De esta manera, una cápsula de tamaño grande requiere un modo diferente de incorporación por un consumidor informado, o paciente, que conoce que necesita tragar el suplemento dietético sin masticarlo previamente para permitir la protección completa frente al ácido del estómago de las células dentro de las microcápsulas intactas. De otro modo el tamaño no debería afectar a los tiempos de supervivencia durante el procesamiento y almacenamiento.

Es una realización preferente de la invención que el tamaño de las cápsulas sea de entre 500 y 700 μm de diámetro.

Es otra realización preferente que las cápsulas presenten un diámetro de por lo menos 3.000 μm al prepararlas manualmente, es decir, sin un aparato tal como un encapsulador.

Las células encapsuladas de esta manera pueden utilizarse como aditivos para alimentos, en casos en que esté previsto que las células encapsuladas sobrevivan al tratamiento con ácido del estómago. También pueden almacenarse durante periodos de tiempo prolongados a temperatura ambiente (TA).

Una formulación, tal como una formulación farmacéutica que comprende células microbianas encapsuladas según el método descrito anteriormente, es otra realización de la invención.

La aplicación de dichas nuevas sustancias y métodos tal como se han descrito en toda la presente memoria, tal como las células microbianas encapsuladas resistentes a líquidos ácidos, para la industria ganadera también es una realización de la invención. Debido a las similitudes con el sistema de digestión humana, los métodos y sustancias de la invención pueden utilizarse para la administración de probióticos beneficiosos en animales, especialmente seres humanos, con el fin de reducir los problemas gastrointestinales asociados mediante el incremento de la digestión del alimento y la absorción de los nutrientes. En relación con los fines de la ganadería, puede utilizarse la administración de probióticos beneficiosos para incrementar la producción cárnica. Debe entenderse que la invención tal como se describe a lo largo de todo el documento puede aplicarse en diferentes subgrupos de animales, tales como aves, especialmente aves que resultan útiles para la producción alimentaria, tales como gansos, pollos, pavos, peces, crustáceos o mamíferos, que resultan útiles para la producción de alimentos, tales como rumiantes (vacas, cabras, ovejas, bisontes, alces, búfalos y ciervos).

Anteriormente en la presente memoria se ha proporcionado un método para la preparación de células microbianas encapsuladas que producen y excretan enzimas digestivos, en las que estas cápsulas presentan paredes porosas de las cápsulas, que son permeables a dichos enzimas digestivos y son resistentes al tratamiento con soluciones acuosas ácidas. Ese método comprende suspender las células, que producen enzimas digestivos, en una solución acuosa de polielectrolito, seguido de la introducción de la suspensión en la forma de partículas preformadas, tales como gotas, en un baño de precipitación que contiene una solución acuosa de un polielectrolito de carga contraria.

Ejemplos

En los ejemplos a continuación se ha utilizado un ensayo para medir la actividad metabólica de las células, que se denomina ensayo AlamarBlue®. "AlamarBlue" es una marca comercial registrada de TREK Diagnostic Systems para un ensayo que proporciona, p. ej., Invitrogen o Promega. A continuación, el nombre AlamarBlue se utilizará para referirse a un ensayo que utiliza el ingrediente activo polvos reductores naturales de células vivas para convertir la resazurina, un compuesto que permea las células que es de color azul y prácticamente no fluorescente. Tras entrar en células metabólicamente activas, la resazurina, el pigmento indicador no fluorescente, se reduce para formar resorufina fluorescente roja brillante. La cantidad de fluorescencia producida es proporcionar al número de células vivas. Se añadieron 10 μl de AlamarBlue® a 100 μl de suspensión celular y se incubaron durante 2 h a 37 °C. Se leyó la fluorescencia de la placa de ensayo AlamarBlue® con un lector Tecan Infinite M200. La fluorescencia puede detectarse con cualquier lector de placas o espectrofotómetro de fluorescencia utilizando una configuración de filtro 560EX nm/590EM nm. Alternativamente, puede leerse la absorbancia de AlamarBIue® en un espectrofotómetro de UV-vis. a 570 nm.

Las células microbianas y probióticos utilizados para la encapsulación se suministran liofilizadas del proveedor correspondiente y después se cultivan en medio líquido. Se mantuvieron bajo congelación muestras de dichos cultivos en forma de reservas en glicerol para la utilización en experimentos separados.

Ejemplo 1: crecimiento de Lactobacillus acidophilus a una DO de 1,0.

Se inició un cultivo deLactobacillus acidophiluscon una muestra de 20 μl de la reserva bacteriana descongelada, mediante la inyección de la misma en 50 ml de MRS (nombrado por sus inventores: de Man, Rogosa y Sharpe, desarrollado en 1960; preparación de 1 litro de medio MRS: 51 g de polvos de caldo MRS, 1 g de polisorbato-80, 0,5 g de hidrocloruro de L-cisteína y 999 ml de H<2>O, ajustado a pH 6,2) en un matraz EM de 50 ml. La reserva se había conservado a -80 °C y se adquirió de DMS (número de catálogo: Ds M 20079) (Moro) Hansen y Mocquot (ATCC 4356). El cultivo se incubó durante la noche bajo agitación a 50 rpm y a 37 °C. El día 1 del experimento se determinó la densidad óptica del cultivo bacteriano a 600 nm en un Tecan Infinite M200. Normalmente una densidad óptica a 600 nm que proporcione una lectura de 1 corresponderá a la fase exponencial del crecimiento bacteriano. Se cultivaron las células hasta una lectura de DO 600 nm de 1 para garantizar que las células se encontraban en la fase exponencial antes de llevar a cabo las pruebas de estrés (ver la Tabla 1).

Tabla 1: perfil de cultivo deLactobacillus acidophilusen crecimiento durante la noche.

Ejemplo 2: supervivencia de células no encapsuladas deLactobacillus acidophilusen ácido clorhídrico,

Se preparó una solución de HCl 0,01 m en PBS (por sus siglas en inglés, solución salina tamponada) mediante la adición de 4,2 ml de HCl al 37 % a 500 ml de PBS. Se ajustó el valor del pH a 2,0 exactamente mediante la utilización de HCl 5 M.

Se añadieron 5 μl del cultivo de lactobacilos a 1 ml de ácido clorhídrico en PBS (solución salina tamponada con fosfato) en un tubo Eppendorf estéril por triplicado. A modo de control se añadieron 5 μl del mismo cultivo de lactobacilos a 1 ml de PBS en un tubo Eppendorf estéril por triplicado en el punto temporal de 0 h. Los ensayos de ácido clorhídrico se llevaron a cabo en diferentes puntos temporales, es decir, tras 1 h, 1,5 h y 2 h de tiempo de exposición.

En los diversos puntos temporales se centrifugaron todos los tubos Eppendorf a 3000xg durante 1 min para eliminar el ácido clorhídrico. Se lavaron dos veces con medio MRS y se añadieron 100 μl de medio MRS al pellet. Se resuspendió el pellet en el mismo y se transfirió la totalidad a una placa de 96 pocillos.

Se llevó a cabo un ensayo de AlamarBlue, tal como se ha descrito anteriormente, para determinar las actividades metabólicas de las células bacterianas.

Tabla 2: viabilidad deLactobacillus acidophiluslibres determinada como lecturas de AlamarBlue en URF tras diferentes tiempos de exposición a HCl.

Ejemplo 3: encapsulación de células deLactobacillus acidophilusen NaCS y pDADMAC.

Se mezclaron 100 μl del cultivo bacteriano con una densidad óptica de 1 con 2 ml de solución de sulfato de celulosa sódica que contenía 1,8 % de sulfato de celulosa sódica (09-Sul-592, suministrado por el Fraunhofer Institute) y cloruro sódico al 1 %, y se introdujeron en un baño de 150 ml de 1,3 % de pDADMAC de 24 kDa utilizando una jeringa de 5 ml y una aguja 23 G.

El tiempo de endurecimiento para las cápsulas en el baño de pDADMAC fue de 4 min. A continuación, se lavaron las cápsulas una vez durante 8 min con 300 ml de 1xPBS y una vez durante 4 min con 300 ml de 1xPBS. A lo anterior siguieron 3 lavados con 30 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato cada vez y 3 lavados con 30 ml de medio MRS cada vez. A continuación, se transfirieron las cápsulas a un matraz cónico de 250 ml que contenía 100 ml de medio MRS fresco. Estas cápsulas se cultivaron en un incubador a 37 °C a una velocidad de 50 rpm.

El ensayo de AlamarBlue anteriormente descrito se llevó a cabo con células de lactobacilos encapsuladas. El ensayo se llevó a cabo por triplicado en un blanco (100 μl de medio LB 10 μl de Alamar-Blue) y en las cápsulas (100 μl de medio MRS 10 μl de Alamar-Blue). Las muestras que comprendían las células en suspensión y el pigmento indicador se incubaron durante 2 horas en la placa a 37 °C y después se midieron.

Tabla 3: viabilidad deLactobacillus acidophilusencapsuladas determinada como lecturas de AlamarBlue en URF el día 2 después de la encapsulación.

Ejemplo 4: supervivencia en ácido clorhídrico de bacterias deLactobacillusencapsuladas.

Tras confirmar que las cápsulas eran viables, se llevaron a cabo los ensayos con ácido clorhídrico con las cápsulas deLactobacillus. Se introdujo 1 cápsula a 1 ml de ácido clorhídrico en solución salina tamponada con fosfato en cada pocillo de una placa de 24 pocillos en diferentes tiempos: a las 4 h, a las 3 h, a las 2 h y tras 1 h, por triplicado. A modo de control del experimento, se añadió 1 cápsula a 1 ml de solución tamponada con fosfato en el punto temporal 0 h, por triplicado.

En el tiempo 0 h, la solución salina tamponada con fosfato ácido clorhídrico se sustituyó por medio MRS. Las cápsulas se lavaron dos veces con medio MRS y después se transfirieron una a una a una placa de 96 pocillos. Se añadieron 100 μl de medio MRS fresco y 10 μl de Alamar-Blue y se incubaron durante 2 horas. La placa de ensayo de AlamarBlue se leyó en un Tecan Infinite M200.

Tabla 4: viabilidad de lactobacilos encapsulados determinada como lecturas de AlamarBlue en URF tras diferentes tiempos de exposición a HCl.

Una comparación entre las lecturas de AlamarBlue de bacterias lactobacilos libres y bacterias encapsuladas tras los ensayos de HCl muestra que, tras 2 h en HCl, la viabilidad de las bacterias libres cayó drásticamente, indicando que las bacterias libres no sobreviven al tiempo de exposición de 2 horas en HCl. Las lecturas de URF de bacterias encapsuladas, por el contrario, se mantuvieron altas incluso tras 4 horas de exposición a HCl, indicando una mayor viabilidad y una supervivencia mejorada en cápsulas en el medio de HCl.

La cepa deLactobacillusencapsulada y metabólicamente activa se mantuvo altamente viable más allá de las 4 horas en el medio de solución salina con ácido clorhídrico, pH 2,0, mientras que las bacteriasLactobacillusno encapsuladas no sobrevivieron más allá de 1,5 horas en un medio de solución salina con ácido clorhídrico a pH 2 (figura 4).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Células microbianas encapsuladas para la administración oral,

en las que las células microbianas son células bacterianas y/o células de levadura, en las que las células microbianas están encapsuladas en una microcápsula que presenta paredes porosas de las cápsulas, en las que las paredes porosas de las cápsulas consisten en un complejo formado por sulfato de celulosa sódica y poli[cloruro de polidimetildialilamonio],

en las que los poros en la superficie de las paredes porosas de las cápsulas presentan un valor de corte de peso molecular de entre 50 y 200 kDa,

en las que, a pesar de que las paredes porosas de las cápsulas, las células microbianas están protegidas frente a la degradación por las soluciones acuosas ácidas,

en las que las células microbianas encapsuladas sobreviven al tratamiento con solución acuosa ácida que presenta un intervalo de pH de entre 1,0 y 3,0 durante por lo menos 1,5 horas, y en las que las células microbianas se liberan por lo menos parcialmente en el intestino del animal.

2. Células microbianas encapsuladas según la reivindicación 1, en las que las células producen y excretan enzimas digestivos, y en las que las paredes porosas de las cápsulas son permeables a dichos enzimas digestivos.

3. Célula microbiana encapsulada según la reivindicación 1 o 2, en la que la solución acuosa ácida es jugo gástrico simulado, jugo gástrico o ácido gástrico, y en la que las microcápsulas liberan los enzimas generados por las células microbianas tras el tratamiento con líquido intestinal o líquido duodenal, en el que el líquido intestinal es líquido intestinal simulado (LIS) y el líquido duodenal es líquido duodenal simulado (LDS).

4. Células microbianas encapsuladas según la reivindicación 1, en la que la mayoría de células microbianas sobreviven al paso por el estómago de un animal, en el que mayoría se define como por lo menos 51 % de las células.

5. Células microbianas encapsuladas según la reivindicación 4, en las que el animal es un ave, en el que el ave preferentemente se selecciona del grupo que comprende pavos, pollos y gansos, o en el que el animal es un mamífero en el que el mamífero se selecciona preferentemente del grupo que comprende cerdos, rumiantes, gatos, perros y seres humanos.

6. Células microbianas encapsuladas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en las que las microcápsulas presentan un diámetro de entre 0,01 y 5 mm.

7. Células microbianas encapsuladas según la reivindicación 1, en las que las células microbianas son una mezcla de diferentes células microbianas o en las que las células de levadura se seleccionan preferentemente del grupo que comprendeSaccharomyces, Debaromyces, Candida, PichiayTorulopsis;o en las que las células bacterianas se seleccionan preferentemente del grupo que comprendeBifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus, Geobacillusy probacterias tales comoLactobacillus.

8. Células microbianas encapsuladas según la reivindicación 1 o 7, en las que las células microbianas se seleccionan del grupo que comprendeSaccharomyces cereviseae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus caseisubsp.casei, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckisubsp.lactis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus lacti, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus(Lactobacillus g G), Lactobacillus sake, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus holophilus, Streptococcus faecalis, Streptococcus thermophilus, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus caseei, Lactobacillus delbrueckiisubspbulgaricus, Lactobacillus johnsonii, Lactococcus lactissubsplactis, Lactococcus lactissubspcremoris, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium angulatumyBifidobacterium longum.

9. Células microbianas encapsuladas según la reivindicación 1, en las que las células se seleccionan de entreLactobacillus acidophilusyBacillus subtilis,en las que las células encapsuladas producen y excretan enzimas digestivos y en las que las células, a pesar de estar encapsuladas en unas paredes porosas, son resistentes al tratamiento con soluciones acuosas ácidas de un valor de pH de 2 durante un periodo de tiempo de entre 2 y 4 horas.

10. Células encapsuladas según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3 y 6, en las que los enzimas digestivos se seleccionan del grupo que comprende alfa-amilasas, glucoamilasas, alfa-galactosidasas, proteasas, proteasas bromelaína, subtilisina, celulasas, pectinasas y lipasas, o en las que las células encapsuladas son deBacillus subtilisy el enzima digestivo es subtilisina.

11. Suplemento alimentario que comprende células microbianas encapsuladas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y que opcionalmente es un portador adecuado.

12. Composición farmacéutica que comprende células microbianas encapsuladas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un portador adecuado.

13. Método para proteger las células microbianas frente a la degradación por el tratamiento con una solución acuosa ácida, mediante microencapsulación, que comprende:

a) suspender las células microbianas vivas en una solución acuosa de un polielectrolito de sulfato de celulosa sódica,

b) introducir la suspensión en forma de microcápsulas preformadas en una baño de precipitación que contiene una solución acuosa del polielectrolito de carga contraria poli[cloruro de dimetildialilamonio], c) terminar la reacción en el baño tras 1 a 10 minutos, preferentemente 3 a 5 minutos, y más preferentemente tras 4 minutos,

d) recolectar del baño las células encapsuladas.

14. Método para producir células microbianas encapsuladas que generan y excretan enzimas digestivos según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10 con sulfato de celulosa sódica y poli[cloruro de dimetildialilamonio], resultando en microcápsulas que contienen células microbianas que son resistentes al tratamiento con soluciones acuosas ácidas y en las que las microcápsulas presentan paredes porosas que permiten que pasen los enzimas generados, que comprende las etapas siguientes:

i)) suspender un cultivo de células microbianas con una solución de sulfato de celulosa sódica, preferentemente que contiene 1,8 % de sulfato de celulosa sódica y 0,9 % de cloruro sódico, ii) introducir la suspensión en forma de microcápsulas preformadas en un baño de precipitación, que preferentemente comprende 1,3 % de poli[cloruro de dimetildialilamonio],

iii) recolectar del baño las microcápsulas que contienen células microbianas, preferentemente tras someterlas a un lavado.

15. Células microbianas encapsuladas, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o una composición farmacéutica según la reivindicación 12, para la utilización en el tratamiento o la prevención de diarrea, diarrea causada por antibióticos, artritis, obesidad, síndrome del intestino irritable, cardialgia, síndrome de fatiga crónica y otras formas de sufrimiento por una población bacteriana no equilibrada en el intestino.