PL233582B1

PL233582B1 - Szczep bakterii mlekowych Lactobacillus rhamnosus

Info

Publication number: PL233582B1
Application number: PL422602A
Authority: PL
Inventors: Katarzyna Slizewska; Agnieszka Chlebicz
Original assignee: Politechnika Lodzka
Priority date: 2017-08-21
Filing date: 2017-08-21
Publication date: 2019-11-29
Also published as: PL422602A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest szczep bakterii mlekowych Lactobacillus rhamnosus, o właściwościach probiotycznych.

Dotychczas znane są szczepy bakterii z gatunku Lactobacillus rhamnosus, jak Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillusrhamnosus Lc705, Lactobacillusrhamnosus ATCC 8530, Lactobacillus rhamnosus CASL oraz z opisu patentowego PL 226 294 szczep Lactobacillus rhamnosus BioPL1.

Wiadomo jest, iż preparaty probiotyczne podawane zwierzętom hodowlanym w paszy lub zaaplikowane oralnie wpływają korzystnie na ich wzrost poprzez stymulujące oddziaływanie na przewód pokarmowy i procesy w nim zachodzące. Odpowiednio dobrane bakterie probiotyczne determinują przyswajanie paszy, pełniąc jednocześnie rolę regulatora równowagi mikroorganizmów przewodu pokarmowego zwierząt. Efekty działania preparatów probiotycznych zbliżone są do efektów uzyskanych w wyniku zastosowania antybiotyków paszowych, bowiem jedne i drugie redukują liczbę bakterii patogennych, jednak sposób ich działania jest różny. Probiotyki nie powodują żadnych skutków ubocznych i nie implikują odkładania się szkodliwych substancji obcych, stąd nie mają okresu karencji i nie ma niebezpieczeństwa ich przedawkowania. Z punktu widzenia konsumenta i producenta żywności, ważne jest również, że stosowanie probiotyków dzięki możliwości obniżania, a nawet całkowitej eliminacji konieczności stosowania antybiotyków, jest sposobem otrzymywania bezpiecznej żywności.

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii mlekowych z gatunku Lactobacillus rhamnosus, który oznaczono symbolem ŁOCK 1087 i który został zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu pod numerem B/00121.

Szczep bakterii ŁOCK 1087 wyizolowano z pomiotu indyków rzeźnych.

Szczep ŁOCK 1087 jest to Gram-dodatnia pałeczka, nieruchliwa, nieprzetrwalnikująca. Jest szczepem o właściwościach probiotycznych, stanowiącym homolog bakterii z gatunku Lactobacillus rhamnosus o sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNA przedstawionej na końcu opisu.

W celu określenia przynależności gatunkowej nowego szczepu ŁOCK 1087 zsekwencjonowano region DNA kodujący gen 16S rRNA o długości 1400 pz. Otrzymaną sekwencję nukleotydową genu 16S rRNA porównano za pomocą programu BLASTN 2.6.0+ z sekwencjami dostępnymi w bazie National Center of Biotechnology Information (NCBI) oraz programie DNA Baser v4.36.0. Na podstawie porównania sekwencji nukleotydowych genów 16S rRNA bakterii z gatunku Lactobacillus rhamnosus JCM 1136 stwierdzono podobieństwo nowego szczepu bakterii do gatunku Lactobacillus rhamnosus z prawdopodobieństwem 99,86%.

Nowy szczep ŁOCK 1087 hoduje się na podłożu Rogosa przeznaczonym do hodowli bakterii z rodzaju Lactobacillus sp., przejrzystym, o barwie żółto-brązowej, o składzie w g/l: pepton kazeinowy - 10,0, ekstrakt drożdżowy - 5,0, D(+)glukoza - 20,0, fosforan potasu - 6,0, cytrynian amonu - 2,0, Tween 80 1,0, octan sodu - 15,0, siarczan magnezu - 0,575, siarczan żelaza II - 0,034, siarczan manganu - 0,12, agar - 15,0, o pH 5-6, w temperaturze 15-45°C, korzystnie 37°C w czasie 48 godzin. Na podłożu Rogosa szczep rośnie w postaci biało-kremowych, okrągłych kolonii, o gładkiej powierzchni i regularnych brzegach, o średnicy około 1-2 mm.

Szczep ŁOCK 1087 hoduje się także w podłożu płynnym MRS, stanowiącym modyfikację podłoża Rogosa, zawierającym jako źródło glukozę, o składzie w g/l: ekstrakt drożdżowy - 4,0, ekstrakt mięsny 10,0, pepton z kazeiny - 10,0, D(+)glukoza - 20,0, Tween 80 - 1,0, wodorocytrynian amonu - 2,0, fosforan dwupotasowy - 2,0, octan sodu - 5,0, siarczan magnezu 7-wodny - 0,20, siarczan magnezu 4-wodny - 0,05, o pH 5-6, w temperaturze 15-45°C, korzystnie 37°C w czasie 48 godzin. W podłożu tym szczep rośnie tworząc jednorodne zmętnienie pożywki.

Do wzrostu szczep preferuje środowisko wzbogacone w CO2 wprowadzony w ilości 5% (v/v). Rośnie jednak zarówno w warunkach tlenowych, jak i względnie beztlenowych.

Cechy morfologiczne szczepu ŁOCK 1087

W obrazie mikroskopowym bakterie mają kształt krótkich, prostych pałeczek o długości 4-5 μm i o szerokości do 1 μm. Pałeczki nie wytwarzają przetrwalników.

Cechy fizjologiczne i biochemiczne szczepu ŁOCK 1087

Szczep nie wytwarza katalazy oraz oksydazy cytochromowej. Wybarwia się na Gram (+).

PL 233 582 B1

Badanie metabolizmu glukozy w warunkach tlenowych i beztlenowych na pożywce Hugh-Leifsona w wysokich słupach wykazało, że szczep ŁOCK 1087 jest zdolny do rozkładu glukozy zarówno w obecności tlenu, jak i w warunkach beztlenowych, czyli na drodze fermentacji.

Test API 50 CHL wykazał, że szczep ŁOCK 1087 jest zdolny do fermentacji następujących sacharydów i ich pochodnych: glicerolu, rybozy, galaktozy, glukozy, fruktozy, mannozy, sorbozy, ramnozy, inozytolu, mannitolu, sorbitolu, metylo-a,D-mannopiranozydu, metylo-a,D-glukopiranozydu, N-acetyloglukozaminy, amygdaliny, arbutyny, esculiny, salicyny, celobiozy, maltozy, laktozy, sacharozy, trehalozy, inuliny, melecytozy, gencjobiozy, D-turanozy, tagatozy, glukonianu.

Szczep ŁOCK 1087 charakteryzuje się metabolizmem względnie heterofermentatywnym. Glukozę fermentuje z wytworzeniem kwasu mlekowego w ilości 11,19 μmol/ml, kwasu octowego (3,79 μmol/ml), kwasu masłowego (0,49 μmol/ml), aldehydu octowego (0,07 μmol/ml) i etanolu (0,15 μmol/ml).

Test API ZYM wykazał, że szczep ŁOCK 1087 wykazuje aktywność następujących enzymów: fosfatazy alkalicznej, esterazy, a-galaktozydazy, β-galaktozydazy, β-glukozydazy, α-glukozydazy, kwaśnej fosfatazy, fosfoamidazy, arylamidazy leucyny, arylamidazy waliny, arylamidazy cysteiny, a-fukozydazy.

Szczep ŁOCK 1087 nie wytwarza siarkowodoru, ani amoniaku z argininy, nie wykazuje zdolności rozkładu H2O2.

Zdolność szczepu ŁOCK 1087 do wykorzystywania prebiotyków

Szczep ŁOCK 1087 jest zdolny do wzrostu w podłożu zawierającym jako jedyne źródło węgla prebiotyki, jak skrobia, β-glukan, maltodekstryna, inulina, pektyna, jednak wzrost jest zróżnicowany i zależny od rodzaju i stężenia sacharydu. Najlepszym źródłem węgla jest inulina w stężeniu 2%. Z porównania wzrostu szczepu w obecności prebiotyków i w obecności glukozy (próba odniesienia) wynika, że w przypadku wszystkich przebadanych prebiotyków wzrost jest lepszy lub porównywalny, co obrazuje wykres 1 na rysunku.

Również w wyniku fermentacji inuliny szczep wytwarza najwyższe ilości kwasu mlekowego przy najwyższym udziale kwasu L(+) mlekowego wynoszącym 86%. Oprócz kwasu mlekowego produktami fermentacji prebiotyków (skrobi, β-glukanu, maltodekstryny, inuliny i pektyny) są kwas octowy, kwas masłowy, aldehyd octowy i etanol.

Cechy probiotyczne szczepu ŁOCK 1087

Szczep ŁOCK 1087 spełnia kryteria stawiane bakteriom probiotycznym, co stwierdzono w wyniku badań in vitro wykonanych według procedur zalecanych przez FAO/WHO.

Nowy szczep wykazuje wysoką odporność na niskie pH (kwasowość soku żołądkowego) w zakresie od 2,0 do 3,0.

Szczep ŁOCK 1087 wykazuje również wysoką odporność na sole żółci w stężeniach 1% i 2%.

Szczep ŁOCK 1087 wykazuje oporność w stosunku do antybiotyków najczęściej stosowanych u zwierząt hodowlanych, jak penicylina, kanamycyna, amoksycylina, doksycyklina, erytromycyna, tetracyklina.

Wykazuje również oporność w stosunku do kokcydiostatyków, jak diclazuril, decoquinat, narazyna-nikrabazyn.

Wykazuje aktywność antagonistyczną w stosunku do patogenów jelitowych zwierząt i odpowiedzialnych za zoonozy ludzi, takich jak Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Listeria monocytogenes.

Posiada niską aktywność fekalną. Spośród trzech enzymów: β-glukozydazy, β-glukuronidazy i ureazy aktywna jest tylko β-glukozydaza.

Wykazuje zdolności detoksyfikacyjne mykotoksyn, jak aflatoksyn Bi, ochratoksyna A, fumonizyna, toksyna T-2, zearalenon, deoksyniwalenol, które najczęściej mogą stanowić zanieczyszczenie zbóż i pasz dla zwierząt.

Cechy biotechnologiczne szczepu ŁOCK 1087

Cechy biotechnologiczne szczepu ŁOCK 1087 określono w trzech pożywkach fermentacyjnych (mieszankach paszowych (P1, P2 i P3) o następującym składzie zmielonych ziaren: P1 - 50% pszenicy, 30% jęczmienia i 20% kukurydzy, P2 - 40% pszenicy, 30% jęczmienia, 20% kukurydzy i 10% żyta, P3 - 40% pszenicy, 30% jęczmienia, 20% kukurydzy i 10% soi. Kompozycje pożywek fermentacyjnych ustalono na bazie ziaren stosowanych w żywieniu zwierząt monogastrycznych. Mieszanki paszowe roztworzono w wodzie w proporcjach: 1 : 1,0; 1 : 1,5; 1 : 2,0. Pożywki fermentacyjne zaszczepiono zawiesiną bakterii w ilości 106 jtk/ml. Dynamikę wzrostu w pożywkach fermentacyjnych (jtk/g paszy) oznaczono w 4, 8, 12, 16, 24 i 30 godzinie hodowli, a próbą odniesienia była hodowla w pożywce MRS (jtk/ml pożywki).

PL 233 582 Β1

Dynamikę wzrostu szczepu przedstawiono w postaci wykresu 2 na rysunku, zaś parametry wzrostu szczepu w pożywkach fermentacyjnych oraz w pożywce MRS przedstawiono w poniższej tablicy.

Tablica

Szczep

Plon komórek N [jtk/g; jtk/ml]

Produktywność P [jtk/kgxh; jtk/lxh]

Właściwa szybkość wzrostu μ [h¹]

Faza adaptacyjna [h]

Pożywka fermentacyjna

PI

P2

P3

PI

P2

P3

PI

P2

P3

PI

P2

P3

Lb. rhamnosus LOCK 1087

5,99 xl0⁹

2,30 x]0'°

9,60 χίο⁷

2,00 xl0

7,66 χίο¹¹

3,07 χίο⁹

0,19

0,17

3,25

2,34

4,57

Pożywka kontrolna MRS

Lb. rhamnosus LOCK 1087

6,96xl0⁸

2,31xlO¹⁰

0,19

0,74

Okazało się, iż plon biomasy oraz produktywność hodowli są uzależnione od składu pożywki fermentacyjnej i najwyższe wartości, w odniesieniu do podłoża kontrolnego MRS, otrzymuje się dla hodowli w pożywce fermentacyjnej P2. Plon komórek w tej pożywce wynosi 2,30 χ 10¹⁰ jtk/g, a produktywność szczepu wzrasta do poziomu 7,66 χ 10¹¹ jtk/kg χ h. Stwierdzono ponadto, że optymalną pożywką dla wzrostu szczepu LOCK 1087 jest pożywka o stosunku zmielonych ziaren (mąki) do wody 1 :1,5. W tych warunkach bakteria osiąga najwyższy przyrost biomasy, również produktywność jest wyższa w porównaniu do proporcji mąki do wody 1 :1,0 oraz 1 :2,0.

Szczep LOCK 1087 wykazuje także trwałość przechowalniczą w postaci liofilizatu w warunkach chłodniczych (4-5°C) oraz w temperaturze pokojowej (25°C) podczas 4 miesięcy przechowywania.

Szczep LOCK 1087 znajduje zastosowanie jako dodatek do pasz dla zwierząt monogastrycznych w profilaktyce występowania chorób bakteryjnych i zatruć wywołanych mykotoksynami oraz w celu poprawiania bezpieczeństwa chowu zwierząt.

Przedmiot wynalazku ilustrują poniższe przykłady.

Przykład I

Szczep LOCK 1087 hodowano w podłożu płynnym Rogosa (firmy Difco) o składzie w g/l: pepton kazeinowy -10,0, ekstrakt drożdżowy - 5,0, D(+)glukoza - 20,0, fosforan potasu - 6,0, cytrynian amonu

- 2,0, Tween 80 -1,0, octan sodu -15,0, siarczan magnezu - 0,575, siarczan żelaza II - 0,034, siarczan manganu - 0,12, agar- 15,0, o pH 5-6, w obecności CO2 wprowadzonego w ilości 5% (v/v), wtemperaturze 37°C w warunkach tlenowych.

Po 48 godzinach hodowli wyhodowane komórki oddzielono od podłoża na wstrząsarce uzyskując gęstość 6,50 χ 10⁸ komórek/ml.

Przykład II

Szczep LOCK 1087 hodowano w podłożu płynnym MRS (firmy Merck), o składzie w g/l: ekstrakt drożdżowy - 4,0, ekstrakt mięsny - 10,0, pepton z kazeiny - 10,0, D(+)glukoza - 20,0, Tween 80 - 1,0, wodorocytrynian amonu -2,0, fosforan dwu potasowy-2,0, octan sodu-5,0, siarczan magnezu 7-wodny

- 0,20, siarczan magnezu 4-wodny- 0,05, o pH 5-6, w obecności CO2 wprowadzonego w ilości 5% (v/v), w temperaturze 37°C w warunkach względnie beztlenowych, w temperaturze 37°C.

Po 48 godzinach hodowli wyhodowane komórki oddzielono od podłoża na wstrząsarce uzyskując gęstość 6,96 χ 10⁸ komórek/ml.

PL 233 582 Β1

Przykład III

Bakterie otrzymane jak w przykładzie I umieszczono w środowisku o pH 2 i 3. W środowisku pH 3,0 przeżywalność komórek po 60 minutach wynosiła 99%, a po 240 minutach 96%. Natomiast w środowisku o pH 2,0 po 60 minutach przeżyło 96% komórek, a po 240 minutach 91%.

Przykład IV

Bakterie otrzymane jak w przykładzie I poddano działaniu żółci o stężeniach 1% i 2% w czasie do 4 godzin. Po 4 godzinach inkubacji przy stężeniu żółci 2% przeżywalność komórek wynosiła 93%, a przy stężeniu żółci 1% przeżyło 96% komórek bakterii.

Przykład V

Liofilizat bakterii otrzymanych jak w przykładzie I przechowywano w temperaturze 4-5°C oraz w temperaturze pokojowej 25°C w ciągu 4 miesięcy. Po tym czasie nastąpiło obniżenie liczby żywych komórek o 7% dla temperatury chłodniczej i o 16% dla temperatury pokojowej. Temperatura chłodnicza zapewniła większą stabilność i trwałość.

Wykaz sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNA szczepu bakterii Lactobacillus rhamnosus LOCK 1087, która określa jego przynależność gatunkową:

GCTTGCATCTTGATTTGATTTTGAACGAGTGGCGGTACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAAATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAATacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCrACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACTCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTAGGGAGCG w której: A - oznacza adeninę, G - guaninę, C - cytozynę, T - tyminę.

Claims

Zastrzeżenie patentowe

1. Szczep bakterii mlekowych Lactobacillus rhamnosus LOCK 1087 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu pod numerem B/00121, o właściwościach probiotycznych.