CN109700781A - 一种靶向肠道的益生菌微胶囊及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物制剂，旨在提供一种靶向肠道的益生菌微胶囊及其制备方法。该微胶囊包括益生菌和作为第一壁材的海藻酸钠，以及第二壁材、缓冲盐和益生元，并由位于外层的海藻酸钠与二价金属离子钙交联形成稳定胶球。本发明使用液体喷雾方法与二价金属离子钙交联形成稳定胶球，避免了现有微胶囊制备技术中温度过高难以控制，容易致使菌体失活的缺点。第一壁材与第二壁材的混合使用，能够降低胃液或者肠液中小分子或离子渗透作用，使活菌到达肠道的量显著提高。微胶囊颗粒的粒度能够保持均一，表面积差异小，进而带来口服后效果稳定的效果。能在胃液和肠液中保持很好的稳定性，利于提高益生菌的生存率，在口服后可靶向肠道。

Description

一种靶向肠道的益生菌微胶囊及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种微生物制剂，具体涉及一种靶向肠道的益生菌微胶囊及其制备方法。

背景技术

大量研究已表明,益生菌活菌摄入可通过调节肠道微生态，对防治各类疾病、维持人身体健康起到举足轻重的作用。益生菌制品被指出有望在将来替代粪菌移植(FMT)在临床上使用。然而多数益生菌稳定性差，常温贮存影响产品保质期。据研究指出，现有市场上绝大多数含有益生菌的产品，其活菌实际量远小于标注量。此外，活菌自身抗性差，口服摄入后受到消化道内胃酸、胆汁、酶、抗生素等化学因素和胃肠道的蠕动等物理因素等复杂环境影响，存活可能性极低，最终影响菌体益生作用的发挥。

益生菌经过微囊化后提高了对高温、酸碱性等不良环境的抵抗能力，同时提高益生菌在贮存以及运输过程中的活性。现有的益生菌微囊制剂，多数为单层和多层包埋，通过多种材料的混合，使用流化床进行包埋，然而这些技术存在以下一些问题：1)使用喷雾干燥方法，温度过高难以控制，容易致使菌体失活；2)胃液或者肠液中小分子或离子容易渗入微囊，致使活菌到达肠道的量显著降低；3)粒度不均一，表面积差异大，造成口服后效果差异显著。因此需要设计更有效的传递系统，以利于进一步提高益生菌的生存率，做种提高益生作用效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中益生菌制剂存在的缺陷和不足，提出一种靶向肠道的益生菌微胶囊及其制备方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种靶向肠道的益生菌微胶囊，包括益生菌和作为第一壁材的海藻酸钠；该益生菌微胶囊中还包括第二壁材、缓冲盐和益生元，并由位于外层的海藻酸钠与二价金属离子钙交联形成稳定胶球；

所述第二壁材是明胶、果胶、角叉菜胶、壳聚糖、黄原胶、阿拉伯胶、抗性淀粉、蛋白粉、聚氯乙烯(PVP)、醋酸纤维素钛酸酯(CAP)、羟丙甲纤维素领苯二甲酸酯(HPMCP)、或聚乙烯醇酞酸酯(PVAP)中的一种或多种；所述缓冲盐是纳米或微米颗粒形式的碳酸钙、氢氧化镁、氧化锌或氧化镁；所述益生元是乳果糖、菊粉、高直链玉米淀粉粉末或低聚寡糖中的一种或几种。

本发明中，在所述益生菌微胶囊中，益生菌、第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元的质量比例关系为：0.1～0.5∶0.4～4∶0.4～4∶0.1～1∶0.5～3。

本发明中，所述益生菌微胶囊的颗粒直径在200μm～800μm之间。

本发明进一步提供了前述益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)离心处理益生菌发酵液，收集湿菌体；用生理盐水洗涤2～3遍后，配置成浓度为9～11log₁₀CFU/mL的益生菌混悬液；

(2)取第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元，一并加入纯净水中配置成混合溶液；混合溶液中各组分的质量百分比浓度分别为：第一壁材0.4～4％，第二壁材0.4～4％，缓冲盐0.1～1％，益生元0.5～3％；

(3)将步骤(1)中的益生菌混悬液按体积比1∶50加入到步骤(2)中的混合溶液中混合均匀，然后用微胶囊发生器滴入摩尔浓度为0.1～0.2M的氯化钙溶液中，钙化形成益生菌微胶囊颗粒；静置固化0.5～1h后用生理盐水洗涤，再经冷冻干燥，得到益生菌微胶囊干粉。

本发明中，所述步骤(3)中，微胶囊发生器的喷头孔径为100～300μm。

发明原理描述：

本发明提出的益生菌微胶囊，其中肠溶性壁材是由海藻酸和其它壁材混合而成。混合壁材能够保证微胶囊顺利通过胃环境而不被破坏或降解，在进入肠道后壁材才会发生崩解、溶解或者降解，释放出胶囊内部的芯材。单一壁材在胃肠道环境中对菌体的保护作用弱，本发明中混合壁材的保护作用明显增强，相比单一壁材可以显著提高益生菌存活率。

碳酸钙或氧化锌或氢氧化镁(Mg(OH)₂)或氧化镁(MgO)的微米或纳米粒子，呈白色、无味、无毒、难溶于水，在水中为悬浊液，并且可以中和氢离子(例如MgO+2H⁺＝Mg²⁺+H₂O)。因此，缓冲盐的加入可显著增强益生菌在胃酸中的抗逆性，此外可以填补材料间的空隙，形成致密的保护层

益生元的作用：2016年12月国际益生菌益和生元科学协会(ISAPP)专家组在最新科学和临床证据基础上更新了益生元定义，是一种可以被微生物选择性利用以赋予宿主健康益处的底物。益生元是能促进益生菌生长繁殖的一类结构和性质不同的物质，它们不被或很少被宿主酶系和其他细菌酶系所分解。益生元不能直接对机体起作用，而是通过益生菌发挥生理功能。益生菌通过调理人体肠道菌群，产生一些有益物质直接起作用。

各组分特定的配伍关系，能够带来的好处是：壁材促使形成大小均一的微胶囊，将益生菌包裹在内，适量的纳米粒子的加入保证不影响材料间的交联的同时，填补微胶囊内部空隙，使得微胶囊更加致密，保证与外界环境隔离。益生元是益生菌的特定的食物，将增加菌体在肠道内黏附定植的黏附定植率。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)使用液体喷雾方法与二价金属离子钙交联形成稳定胶球，避免了现有微胶囊制备技术中温度过高难以控制，容易致使菌体失活的缺点。

(2)第一壁材与第二壁材的混合使用，能够降低胃液或者肠液中小分子或离子渗透作用，使活菌到达肠道的量显著提高。

(3)使用液体喷雾方法生成微胶囊，由于在比重接近的液体环境下生成稳定胶球，使得微胶囊颗粒的粒度能够保持均一，表面积差异小，进而带来口服后效果稳定的效果。

(4)本发明制备的益生菌微胶囊，能在胃液和肠液中保持很好的稳定性，利于提高益生菌的生存率，在口服后可靶向肠道。

附图说明

图1为实施例1中海藻酸钠-明胶益生菌微胶囊的电镜结构；

图2为实施例2中加有纳米粒的海藻酸钠明胶微胶囊电镜结构图。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步说明，但并非用以限制本发明的范围，任何熟悉相关技能的本领域技术人员，所能轻易达成的修饰的改变均应涵盖于本发明的范围内。各实施例中使用到的益生菌、试剂或辅材，除特别明示外均为本领域公知通用或可市购获得的产品。

实施例1

益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)取益生菌为唾液乳杆菌Li01(11log10CFU/mL，CGMCC 7045)，离心处理其发酵液，收集湿菌体；用生理盐水洗涤2～3遍后，配置成浓度为9log₁₀CFU/mL的益生菌混悬液；

(2)取第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元，一并加入纯净水中配置成混合溶液；混合溶液中各组分的质量百分比浓度分别为：第一壁材1％，第二壁材1％，缓冲盐0.6％，益生元1％；

(3)将步骤(1)中的益生菌混悬液按体积比1∶50加入到步骤(2)中的混合溶液中混合均匀，然后用微胶囊发生器滴入摩尔浓度为0.1M的氯化钙溶液中，钙化形成益生菌微胶囊颗粒；微胶囊发生器的喷头孔径为200μm。静置固化1h后用生理盐水洗涤，再经冷冻干燥，得到益生菌微胶囊干粉，其颗粒直径在400μm～600μm之间。

上述益生菌微胶囊产品中，包括益生菌和作为第一壁材的海藻酸钠；以及第二壁材、缓冲盐和益生元，并由位于外层的海藻酸钠与二价金属离子钙交联形成稳定胶球；所述第二壁材是明胶；缓冲盐是缓冲盐形式的Mg(OH)₂；所述益生元是乳果糖。其中，益生菌、第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元的质量比例关系为：0.1∶1∶1∶0.6∶1。

该微胶囊的对菌体作用见表1与表2。

表格1唾液乳杆菌Li01在模拟人胃液中的存活率

表格2唾液乳杆菌Li01在模拟人肠液中的存活率

实施例2

益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)取益生菌为Li05(11log₁₀CFU/mL，CGMCC 7049)，离心处理其发酵液，收集湿菌体；用生理盐水洗涤2～3遍后，配置成浓度为10log₁₀CFU/mL的益生菌混悬液；

(2)取第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元，一并加入纯净水中配置成混合溶液；混合溶液中各组分的质量百分比浓度分别为：第一壁材1％，第二壁材0.4％，缓冲盐1％，益生元3％；

(3)将步骤(1)中的益生菌混悬液按体积比1∶50加入到步骤(2)中的混合溶液中混合均匀，然后用微胶囊发生器滴入摩尔浓度为0.15M的氯化钙溶液中，钙化形成益生菌微胶囊颗粒；微胶囊发生器的喷头孔径为200μm。静置固化0.5h后用生理盐水洗涤，再经冷冻干燥，得到益生菌微胶囊干粉，其颗粒直径在400μm～600μm之间。

上述益生菌微胶囊产品中，包括益生菌和作为第一壁材的海藻酸钠；以及第二壁材、缓冲盐和益生元，并由位于外层的海藻酸钠与二价金属离子钙交联形成稳定胶球；所述第二壁材是果胶；缓冲盐是纳米或微米颗粒形式的MgO；所述益生元是乳果糖。其中，益生菌、第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元的质量比例关系为：0.5∶1∶0.4∶1∶3。该微胶囊的对菌体作用见表3与表4。

表格3戊糖片球菌Li05在模拟人胃液中的存活率

表格4戊糖片球菌Li05在模拟人小肠液中的存活率

实施例3

益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)取益生菌为TC01(11log10CFU/mL，CGMCC 12728)，离心处理其发酵液，收集湿菌体；用生理盐水洗涤2～3遍后，配置成浓度为9log₁₀CFU/mL的益生菌混悬液；

(2)取第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元，一并加入纯净水中配置成混合溶液；混合溶液中各组分的质量百分比浓度分别为：第一壁材4％，第二壁材2％，缓冲盐0.1％，益生元0.5％；

(3)将步骤(1)中的益生菌混悬液按体积比1∶50加入到步骤(2)中的混合溶液中混合均匀，然后用微胶囊发生器滴入摩尔浓度为0.1M的氯化钙溶液中，钙化形成益生菌微胶囊颗粒；微胶囊发生器的喷头孔径为300μm。静置固化1h后用生理盐水洗涤，再经冷冻干燥，得到益生菌微胶囊干粉，其颗粒直径在500μm～800μm之间。

上述益生菌微胶囊产品中，包括益生菌和作为第一壁材的海藻酸钠；以及第二壁材、缓冲盐和益生元，并由位于外层的海藻酸钠与二价金属离子钙交联形成稳定胶球；所述第二壁材是明胶；缓冲盐是纳米颗粒形式的氧化锌；所述益生元是低聚寡糖。其中，益生菌、第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元的质量比例关系为：0.4∶4∶2∶0.1∶0.5。该微胶囊的对菌体作用见表5与表6。

表格5长双歧杆菌TC01在模拟人胃液中的存活率

表格6长双歧杆菌TC01在模拟人肠液中的存活率

实施例4

(1)取益生菌为唾液乳杆菌Li01(11log10CFU/mL，CGMCC 7045)，离心处理其发酵液，收集湿菌体；用生理盐水洗涤2～3遍后，配置成浓度为10log₁₀CFU/mL的益生菌混悬液；

(2)取第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元，一并加入纯净水中配置成混合溶液；混合溶液中各组分的质量百分比浓度分别为：第一壁材1％，第二壁材0.8％，缓冲盐0.4％，益生元2％；

(3)将步骤(1)中的益生菌混悬液按体积比1∶50加入到步骤(2)中的混合溶液中混合均匀，然后用微胶囊发生器滴入摩尔浓度为0.1M的氯化钙溶液中，钙化形成益生菌微胶囊颗粒；微胶囊发生器的喷头孔径为200μm。静置固化1h后用生理盐水洗涤，再经冷冻干燥，得到益生菌微胶囊干粉，其颗粒直径在400μm～600μm之间。

上述益生菌微胶囊产品中，包括益生菌和作为第一壁材的海藻酸钠；以及第二壁材、缓冲盐和益生元，并由位于外层的海藻酸钠与二价金属离子钙交联形成稳定胶球；所述第二壁材是黄原胶；缓冲盐是缓冲盐形式的Mg(OH)₂；所述益生元是乳果糖。其中，益生菌、第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元的质量比例关系为：0.1∶1∶0.8∶0.4∶2。

该微胶囊的对菌体作用见表7与表8。

表格7唾液乳杆菌Li01在模拟人胃液中的存活率

表格8唾液乳杆菌Li01在模拟人肠液中的存活率

实施例5

(1)取益生菌为唾液乳杆菌Li01(11log10CFU/mL，CGMCC 7045)，离心处理其发酵液，收集湿菌体；用生理盐水洗涤2～3遍后，配置成浓度为11log₁₀CFU/mL的益生菌混悬液；

(2)取第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元，一并加入纯净水中配置成混合溶液；混合溶液中各组分的质量百分比浓度分别为：第一壁材0.4％，第二壁材4％，缓冲盐0.4％，益生元2％；

(3)将步骤(1)中的益生菌混悬液按体积比1∶50加入到步骤(2)中的混合溶液中混合均匀，然后用微胶囊发生器滴入摩尔浓度为0.2M的氯化钙溶液中，钙化形成益生菌微胶囊颗粒；微胶囊发生器的喷头孔径为200μm。静置固化1h后用生理盐水洗涤，再经冷冻干燥，得到益生菌微胶囊干粉，其颗粒直径在400μm～600μm之间。

上述益生菌微胶囊产品中，包括益生菌和作为第一壁材的海藻酸钠；以及第二壁材、缓冲盐和益生元，并由位于外层的海藻酸钠与二价金属离子钙交联形成稳定胶球；所述第二壁材是果胶；缓冲盐是缓冲盐形式的CaCO₃；所述益生元是乳果糖。其中，益生菌、第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元的质量比例关系为：0.1∶0.4∶4∶0.4∶2。

该微胶囊的对菌体作用见表7与表8。

表格7唾液乳杆菌Li01在模拟人胃液中的存活率

表格8唾液乳杆菌Li01在模拟人肠液中的存活率

实施例6

(1)取益生菌为唾液乳杆菌Li01(11log10CFU/mL，CGMCC 7045)，离心处理其发酵液，收集湿菌体；用生理盐水洗涤2～3遍后，配置成浓度为10log₁₀CFU/mL的益生菌混悬液；

(2)取第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元，一并加入纯净水中配置成混合溶液；混合溶液中各组分的质量百分比浓度分别为：第一壁材1％，第二壁材1％，缓冲盐0.3％，益生元3％；

(3)将步骤(1)中的益生菌混悬液按体积比1∶50加入到步骤(2)中的混合溶液中混合均匀，然后用微胶囊发生器滴入摩尔浓度为0.1M的氯化钙溶液中，钙化形成益生菌微胶囊颗粒；微胶囊发生器的喷头孔径为100μm。静置固化0.8h后用生理盐水洗涤，再经冷冻干燥，得到益生菌微胶囊干粉，其颗粒直径在200μm～400μm之间。

上述益生菌微胶囊产品中，包括益生菌和作为第一壁材的海藻酸钠；以及第二壁材、缓冲盐和益生元，并由位于外层的海藻酸钠与二价金属离子钙交联形成稳定胶球；所述第二壁材是阿拉伯胶和PVP混合物，比例为1：1(w/w)；缓冲盐是缓冲盐形式的Mg(OH)₂；所述益生元是高直链玉米淀粉粉末。其中，益生菌、第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元的质量比例关系为：0.1∶1∶1∶0.3∶3。

该微胶囊的对菌体作用见表7与表8。

表格7唾液乳杆菌Li01在模拟人胃液中的存活率

表格8唾液乳杆菌Li01在模拟人肠液中的存活率

实施例7

(1)取益生菌为唾液乳杆菌Li01(11log10CFU/mL，CGMCC 7045)，离心处理其发酵液，收集湿菌体；用生理盐水洗涤2～3遍后，配置成浓度为10log₁₀CFU/mL的益生菌混悬液；

(2)取第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元，一并加入纯净水中配置成混合溶液；混合溶液中各组分的质量百分比浓度分别为：第一壁材1％，第二壁材2％，缓冲盐0.5％，益生元2％；

(3)将步骤(1)中的益生菌混悬液按体积比1∶50加入到步骤(2)中的混合溶液中混合均匀，然后用微胶囊发生器滴入摩尔浓度为0.2M的氯化钙溶液中，钙化形成益生菌微胶囊颗粒；微胶囊发生器的喷头孔径为200μm。静置固化1h后用生理盐水洗涤，再经冷冻干燥，得到益生菌微胶囊干粉，其颗粒直径在400μm～600μm之间。

上述益生菌微胶囊产品中，包括益生菌和作为第一壁材的海藻酸钠；以及第二壁材、缓冲盐和益生元，并由位于外层的海藻酸钠与二价金属离子钙交联形成稳定胶球；所述第二壁材是HPMCP、交叉菜胶和PVAP混合物，混合比例为1：0.5：0.5(w/w/w)；缓冲盐是缓冲盐形式的Mg(OH)₂；所述益生元是乳果糖和低聚寡糖混合物，比例为1：1(w/w)。其中，益生菌、第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元的质量比例关系为：0.1∶1∶2∶0.5∶2。

该微胶囊的对菌体作用见表7与表8。

表格7唾液乳杆菌Li01在模拟人胃液中的存活率

表格8唾液乳杆菌Li01在模拟人肠液中的存活率

Claims (5)

1.一种靶向肠道的益生菌微胶囊，包括益生菌和作为第一壁材的海藻酸钠；其特征在于，该益生菌微胶囊中还包括第二壁材、缓冲盐和益生元，并由位于外层的海藻酸钠与二价金属离子钙交联形成稳定胶球；

所述第二壁材是明胶、果胶、角叉菜胶、壳聚糖、黄原胶、阿拉伯胶、抗性淀粉、蛋白粉、聚氯乙烯、醋酸纤维素钛酸酯、羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯或聚乙烯醇钛酸酯中的一种或多种；所述缓冲盐是纳米或微米颗粒形式的碳酸钙、氢氧化镁、氧化锌或氧化镁；所述益生元是乳果糖、菊粉、高直链玉米淀粉粉末或低聚寡糖中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的益生菌微胶囊，其特征在于，在所述益生菌微胶囊中，益生菌、第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元的质量比例关系为：0.1～0.5∶0.4～4∶0.4～4∶0.1～1∶0.5～3。

3.根据权利1要求所述的益生菌微胶囊，其特征在于，所述益生菌微胶囊的颗粒直径在200μm～800μm之间。

4.权利要求1所述益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)离心处理益生菌发酵液，收集湿菌体；用生理盐水洗涤2～3遍后，配置成浓度为9～11log₁₀CFU/mL的益生菌混悬液；

(2)取第一壁材、第二壁材、缓冲盐和益生元，一并加入纯净水中配置成混合溶液；混合溶液中各组分的质量百分比浓度分别为：第一壁材0.4～4％，第二壁材0.4～4％，缓冲盐0.1～1％，益生元0.5～3％；

(3)将步骤(1)中的益生菌混悬液按体积比1∶50加入到步骤(2)中的混合溶液中混合均匀，然后用微胶囊发生器滴入摩尔浓度为0.1～0.2M的氯化钙溶液中，钙化形成益生菌微胶囊颗粒；静置固化0.5～1h后用生理盐水洗涤，再经冷冻干燥，得到益生菌微胶囊干粉。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，微胶囊发生器的喷头孔径为100～300μm。