KR20220088367A - 매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통한 유산균의 동결건조 생존율, 열 저항성, 저장 안정성 및 체내 안정성이 향상된 캡슐화 프로바이오틱스의 논스톱 제조 공정 - Google Patents

매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통한 유산균의 동결건조 생존율, 열 저항성, 저장 안정성 및 체내 안정성이 향상된 캡슐화 프로바이오틱스의 논스톱 제조 공정 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알긴산 염, 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염, 바람직하게는 불용성 탄산염, 및 선택적으로 캡슐화 증강제를 포함하는 배지에서 프로바이오틱스를 배양하는 간단한 공정만으로도, 알긴산 염 하이드로겔이 자발적으로 형성되고 이에 프로바이오틱스가 포획될 수 있도록 함으로써, 프로바이오틱스의 캡슐화 공정을 획기적으로 개선시킬 수 있을 뿐 아니라, 프로바이오틱스의 동결건조 생존율, 열 저항성, 저장 안정성 및 체내 안정성(내산성, 내담즙성)이 현저하게 개선된 캡슐화 프로바이오틱스의 논스톱 제조 공정에 관한 것이다.

Description

매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통한 유산균의 동결건조 생존율, 열 저항성, 저장 안정성 및 체내 안정성이 향상된 캡슐화 프로바이오틱스의 논스톱 제조 공정 {A non-stop production process for improving freeze-drying survival, heat tolerance, shelf stability and digestive stability of probiotics using spontaneous matrix-encapsulation technique}
본 발명은 매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통한 캡슐화 프로바이오틱스의 논스톱 제조 공정에 관한 것으로, 더 상세하게는 알긴산 염, 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염 및 선택적으로 캡슐화 증강제를 포함하는 배지에서 프로바이오틱스를 배양하여 자연적으로 생성된 알긴산염 하이드로겔에 프로바이오틱스가 포집되어 있는 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법에 관한 것이다.
프로바이오틱스란 체내에서 건강에 유리한 효과를 주는 살아있는 균을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균들이며 일부 Bacillus 등을 포함하고 있다. 러시아의 과학자 Elie Mechinikoff가 불가리아 사람들이 장수를 누리는 이유가 Lactobacillus로 발효된 발효유의 섭취 때문이라는 것을 밝혀내어 노벨상을 받은 이래로 유산균, 프로바이오틱스의 기능성은 오랫동안 연구되어 오고 있다 (Mercenier A et al., Curr Pharm Des 9(2):175-191, 2003).
프로바이오틱스의 대표적인 효능으로는 항균 활성, 항생제 관련 설사 개선, 유당불내증 경감, 항암 효과, 혈중 콜레스테롤 저하, 위 내 헬리코박터 파이로리 (Helicobacter pylori) 균 억제, 과민성 대장염, 크론병, 궤양성 대장염 경감, 면역 기능 조절 등이 알려져 있다. 프로바이오틱스는 인체 의약품인 정장제나 유산균 제제, 사료첨가제로서의 생균제 및 건강식품의 일종인 유산균 식품으로 구분할 수 있다. 유산균 식품은 유산간균, 유산구균, 비피더스균 등의 생균을 배양하여 식품에 혼합한 것을 안정적이고 섭취가 용이하도록 분말, 과립, 정제, 캡슐 등으로 만든 것으로 유산균 발효식품, 유산균 발효유, 유산균 음료 이외의 것을 말한다.
유산균은 발효에 의해 생장하는 세균 중 발효 결과 유산을 주된 산물로 생산하는 세균들을 의미한다. 유산균은 미생물 산업에서 가장 중요한 비중을 차지하는 미생물군의 하나로, 김치, 요거트, 치즈, 버터밀크, 사우어크라우트(sauerkraut)와 같은 발효식품을 제조하는데 주로 이용되고 건강을 증진시키는 기능성 프로바이오틱스로도 널리 이용된다.
현재 유산균은 12개 속(Lactobacillus, Carnobacterium, Atopobium, Lactococcus, Pediococcus, Tetragenococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus, Enterococcus, Streptococcus, Vagococcus)으로 분류되며 일반적으로 우리가 사용하고 있는 유산균은 간균인 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.), 구균인 락토코커스 속(Lactococcus spp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus spp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc spp.), 그리고 페디오코커스 속(Pediococcus spp.) 균 등이다 (강태진, BioWave, 2009, Vol 11, No 7, pp 1-20).
유산균을 식품으로 제조하는 공정은 크게 유산균 배양, 균체 회수, 동결건조, 분쇄, 제품화 등으로 구분되는데 이 과정에서 유산균은 다양한 물리화학적인 스트레스에 노출된다. 즉, 균체 회수 시에는 농축에 따른 삼투압 영향을 받으며, 동결건조 과정에서는 급격한 온도 변화에 따른 세포질 내 얼음결정이 형성되거나 세포 외부에 생성되는 얼음 결정 및 탈수(dehydration) 현상으로 인하여 온도와 삼투압 영향을 동시에 받게 된다. 또한, 분쇄 및 제품화 과정에서 고온, 고압에 노출되거나 공기 중의 수분에 의하여 수화(hydration)될 경우 유산균의 안정성이 떨어지게 되며, 단기간 보관되는 유산균 발효식품, 유산균 발효유, 유산균 음료와 같은 액상 제품뿐만 아니라 장기 보관을 목적으로 분말 형태로 제조되는 제품에 있어서도 산소에 노출될 경우 세포막을 구성하고 있는 지방산이 산화되어 생존율이 감소하게 되는 문제점이 지적되어 왔다 (한국 등록특허 제10-1605516호 참조)
한편, 유산균을 비롯한 세균들이 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 위산과 담즙산에서 살아남아 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착하여야 하며 장관 내에서 유용한 효과를 나타내어야 하고 독성이 없으며 비병원성이어야 한다. 그러나 위장에서는 pH가 3 이하로 떨어지는 산성 환경에 노출되고 소장에서는 담즙산의 영향을 받아 유산균을 비롯한 다양한 유익균들의 생존율이 크게 감소된다.
따라서 이들 유익균을 동결건조하는 과정에서 안정성을 증진시키고 체내에서 장까지 도달하는 과정에서 유익균의 생존율을 증가시키기 위하여 다양한 세균 캡슐화 방법이 개발되었는데, 예컨대 한국 공개특허 제2003-0009268호에서는 유산균을 배양 완료한 후에 알긴산과 CaCO3를 유산균과 함께 교반하여 마이크로 캡슐 형성용 조성물과 유산균의 혼합물을 준비하고, 미량의 아세트산(CH3COOH)과 CaCl2를 첨가한 응고액에 상기 마이크로 캡슐 형성용 조성물과 유산균 혼합물에 분사하여 경화시키고 CaCl2에 2차 경화시키는 마이크로 캡슐 제조방법을 개시하고 있다.
그러나, 이와 같은 캡슐화 공정은 균체 표면을 완전히 코팅하지 못하여 여전히 균주의 내열성, 내산성 및 내담즙성이 충분히 개선되지 못하고, 통상의 방법으로 배양된 균체를 회수한 다음 코팅제 조성물을 혼합하여 교반하는 다단계 공정을 수행하여야 하기 때문에 생균제로서 무균 조작이 어렵다는 문제점이 있으며, 특히 산업적인 대량 생산에 있어 경제성이 떨어진다는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 종래 프로바이오틱스 캡슐화 공정에 비해 프로바이오틱스의 체내 안정성이 개선되고 공정이 단순화된 새로운 캡슐화 공정 개발을 위해 예의 노력한 결과, 프로바이오틱스의 배양 생산시 배지에 알긴산 염과 탄산염을 일정 농도로 첨가하여 배양하는 경우 프로바이오틱스의 동결건조 생존율, 열저항성(내열성)및 체내 안정성(내산성 및 내담즙성)이 현저히 향상되고 단기 및 장기 보관 안정성이 현저히 개선될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국 등록특허 제10-1605516호 한국 공개특허 제2003-0009268호
강태진, BioWave, 2009, Vol 11, No 7, pp 1-20 Mercenier A et al., Curr Pharm Des 9(2):175-191, 2003
본 발명의 목적은, 기존의 캡슐화 프로바이오틱스의 제조공정에 비해 현저히 간단한 공정을 수행하는 매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통하여 유산균의 동결건조 생존율, 열 저항성, 저장 안정성 및 체내 안정성이 향상된 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 캡슐화 프로바이오틱스의 용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 알긴산염 하이드로겔에 프로바이오틱스가 포집되어 있는 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법을 제공한다:
(a) 프로바이오틱스를 알긴산 염 및 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염을 함유하는 배지에서 배양하여 알긴산 염-하이드로겔을 자발적으로 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 자발적으로 생성된 알긴산 염-하이드로겔에 의해 캡슐화된 프로바이오틱스를 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 제조방법으로 제조된 캡슐화 프로바이오틱스 및 이를 포함하는 조성물, 식품, 건강기능식품, 화장품 및 의약품을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스의 조성물, 식품, 건강기능식품, 화장품 및/또는 의약품의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스의 질병의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스를 투여하는 것을 특징으로 하는 질병의 완화, 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법은, 알긴산 염 및 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성할 수 있는 추가의 염을 첨가한 배양 배지에서 프로바이오틱스를 배양함으로써, 프로바이오틱스 배양 과정에서 생성되는 산에 의하여 매우 균일하고 미세한 구조의 알긴산 염-하이드로겔을 자발적으로 생성시킬 수 있고, 생성된 알긴산 염-하이드로겔을 프로바이오틱스와 동시에 회수하는 공정에 의하여, 별도의 추가적인 캡슐화 단계를 거치지 않고 훨씬 간소화된 공정으로 알긴산 염 하이드로겔에 프로바이오틱스가 포집되어 있는 캡슐화 프로바이오틱스의제조가 가능하며, 이에 의해 제조된 캡슐화 프로바이오틱스는 종래 기술로 생산된 캡슐화 프로바이오틱스에 비해 동결건조 후 생존율, 열 안정성, 저장 안정성 및 체내 안정성이 향상되는 특징을 가진다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시양태에 따른 캡슐화 프로바이오틱스의 제조공정을 나타낸다.
도 2는 기존의 알긴산염 캡슐화 방법 및 본 발명의 캡슐화 방법으로 제조된 프로바이오틱스 캡슐의 입자크기를 나타낸 것이다.
도 3은 캡슐화를 적용하지 않은 균체 건조물(A) 캡슐화제(알긴산염)만 적용한 건조물(B)과 캡슐화제(알긴산염)와 캡슐화 증강제(전분)를 모두 적용한 건조물(C)의 SEM 촬영 사진이다(스케일바 1 μm).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 프로바이오틱스 배양 과정에서 배지에 알긴산 염과 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염을 함께 첨가하면, 프로바이오틱스가 증식하며 생성되는 산의 작용으로 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염으로부터 2가 양이온이 유리되어 배지 내의 알긴산과 결합함으로써 알긴산-2가 양이온 하이드로겔이 자발적으로 생성되며, 이후 자발적으로 생성된 알긴산-2가 양이온 하이드로겔을 균체와 함께 회수하는 단계를 거쳐, 기존의 공정에 비해 월등히 간단한 공정으로 프로바이오틱스가 포획(encapsulation)된 캡슐을 생산할 수 있음을 확인하였다.
예를 들어 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염으로 탄산칼슘을 사용할 경우, 프로바이오틱스 배양 과정에서 생성된 산에 의해 탄산칼슘으로부터 칼슘이 유리되고, 유리된 칼슘이 알긴산염과 결합하여 자발적으로 칼슘-알긴산 염 하이드로겔을 형성하게 된다.
이에 따라 본 발명은 다음 단계를 포함하는 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 알긴산 염 및 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염을 함유하는 배지에서 프로바이오틱스를 배양하여 알긴산 염-하이드로겔을 자발적으로 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 자발적으로 생성된 알긴산 염-하이드로겔에 의해 캡슐화된 프로바이오틱스를 회수하는 단계.
본 발명의 용어, “캡슐화”란 캡슐화제로 원료물질을 코팅하거나, 캡슐화제의 내부에 원료 물질을 포집시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 캡슐화제로 구성된 캡슐 껍질 내부에 프로바이오틱스가 존재하는 레저부아타입(Reservoir type) 또는 캡슐화제로 구성된 매트릭스 내부에 프로바이오틱스가 포집되는 매트릭스 타입(Matrix type)의 캡슐화가 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(Zuidam and Nedovic, (2010) Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and Food Processing, Springer). 본 발명에 있어서, 상기 캡슐화에 의해 프로바이오틱스를 안정화하거나, 외부환경, 체내 환경으로부터 보호할 수 있다.
본 발명의 용어, '캡슐화 프로바이오틱스'는 탄수화물, 시럽, 검, 하이드로겔 등과 같은 다양한 캡슐화제에 의해 코팅되거나 매트릭스 내부에 포집되어 있는 형태의 프로바이오틱스를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 캡슐화 프로바이오틱스는 '프로바이오틱스 캡슐'과 동일한 의미에서 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캡슐화 프로바이오틱스는 캡슐화제로 구성된 캡슐 껍질 내부에 프로바이오틱스가 존재하는 레저부아타입(Reservoir type) 또는 캡슐화제로 구성된 매트릭스 내부에 프로바이오틱스가 포집되는 매트릭스 타입(Matrix type)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 캡슐화 프로바이오틱스는 알긴산 염 하이드로겔에 의해 프로바이오틱스가 포집되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “포집”은 본 발명의 알긴산 염 하이드로겔의 구조가 포함하는 공간 또는 기공(pore)에 프로바이오틱스가 포획되어 있는 것을 의미한다. 상기 공간 또는 기공에는 프로바이오틱스와 함께, 배지, 물, 영양소 등의 배양 조성물이 함께 포획될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 알긴산 염은 물에 대한 용해도가 0.1 g/L이상인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1 g/L 내지 10 g/L일 수 있으며, 알긴산 나트륨, 알긴산 칼륨, 알긴산 마그네슘, 알긴산 칼슘, 알긴산 리튬 및 알긴산 암모늄으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 모든 알긴산 염이라면 제한없이 사용 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 포함되는 알긴산 염의 함량은 0.1 내지 40 g/L, 바람직하게는 0.2 내지 15 g/L, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 2 g/L, 가장 바람직하게는 0.8 내지 1.2 g/L일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명에 따른 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염은 물에 대한 용해도가 0.1 g/L 이하, 바람직하게는 0.00001 g/L 내지 0.1 g/L인 2가 양이온의 염일 수 있으며, 바람직하게는 2가 양이온을 포함하는 염기성 염일 수 있다. 예컨대, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염은 2가 양이온을 포함하는 탄산염 또는 질산염일 수 있다.
예를 들어, 상기 2가 양이온을 포함하는 탄산염으로는 탄산칼슘, 탄산바륨, 탄산망간, 탄산구리, 탄산아연, 탄산납, 탄산카드뮴, 탄산코발트, 탄산니켈, 및 탄산스트론튬으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예를 들어, 상기 2가 양이온을 포함하는 질산염으로는 질산칼슘, 질산바륨, 질산망간, 질산구리, 질산아연, 질산납, 질산카드뮴, 질산코발트, 질산니켈 및 질산스트론튬으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염의 함량은 0.5 내지10 g/L, 바람직하게는 1 내지 9 g/L, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 8 g/L, 가장 바람직하게는 2 내지 7 g/L일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염은 프로바이오틱스의 배양으로 발생하는 산에 의해 양이온이 해리되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로바이오틱스의 배양으로 발생하는 산은 프로바이오틱스의 대사과정에서 생산되는 유기산을 의미한다. 예를 들어 상기 프로바이오틱스의 배양으로 발생하는 산은 젖산, 아세트산, 시트르산, 말산, 숙신산 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 프로바이오틱스의 배양으로 발생하는 산에 의해 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염으로부터 양이온이 해리되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염으로부터 해리된 양이온과 알긴산이 결합하여 알긴산 염-하이드로겔이 생성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 배양에 의해 프로바이오틱스가 증식되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 자발적으로 생성된 알긴산 염-하이드로겔 내부에 배양된 프로바이오틱스의 전부 또는 일부가 포집되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 배지는 캡슐화 증강제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 캡슐화 증강제는 알긴산 염 하이드로겔 캡슐의 견고함을 향상시키기 위한 것으로, 불용성인 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어, 상기 캡슐화 증강제로는 전분, 결정 셀룰로오스, 키토산, 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 탈지분유로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 캡슐화 증강제로 전분을 예로 들어 설명하면, 전분이 배지에 추가로 포함되는 경우, 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염이 결합하여 생성된 하이드로겔과 전분이 프로바이오틱스와 함께 혼합되어, 더욱 견고한 구조의 프로바이오틱스 캡슐을 생산할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 캡슐화 증강제는 배지 내에 1 내지 20 g/L, 바람직하게는 2 내지 10 g/L, 더욱 바람직하게는 3 내지 5 g/L, 가장 바람직하게는 5 g/L로 배지에 함유되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 동결보호제를 처리하지 않고 본 발명의 캡슐화 방법으로 제조된 프로바이오틱스 캡슐이 탄산칼슘 및 동결보호제를 처리하여 제조된 제형보다 현저히 뛰어난 동결건조 생존율, 열 저항성, 위장관 모사 용액 생존율, 및 장기/단기 보관안정성을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 배지는 기존의 배지와 같이 동결보호제를 포함할 수 있으나, 동결보호제의 처리 없이도 뛰어난 동결건조 생존율, 열 저항성, 위장관 모사 용액 생존율, 및 장기/단기 보관안정성을 나타내는 바, 보다 바람직하게는 동결보호제를 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 프로바이오틱스를 배양하는 과정에서 프로바이오틱스에 의해 분비되는 산에 의해 2가 양이온 염, 예를 들어 탄산 칼슘이 칼슘 이온으로 해리되는 과정에서 배양액의 pH가 지나치게 감소하는 것을 억제하여, 배양 단계에서 추가의 pH 조정 단계가 없어도 프로바이오틱스 배양이 원활하게 진행되는 것을 확인하였다.
이에 따라 본 발명에 있어서, 알긴산 염 및 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염을 함유하는 배지에서 프로바이오틱스를 배양함에 있어, 추가적인 pH 조절 단계 또는 공정을 포함하지 않거나, 기존의 배양 공정에 비해 최소화된 pH 조절 단계 또는 고정을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
해당 공정에서, 프로바이오틱스 균주의 접종 농도와 배양시간은 균주에 따라 적절히 변형실시가 가능함은 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 이 경우, 접종 후 균주 초기농도는 1×104 ~ 5×109 CFU/mL, 바람직하게는 5×105 ~ 4×108 CFU/mL일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 한편, 프로바이오틱스 균주의 배양시간은 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염, 예컨대 탄산염이 충분히 해리될 수 있도록 4시간 이상이 바람직하고, 6시간 이상이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 자발적으로 생성된 알긴산 염-하이드로겔 및 배양된 프로바이오틱스를 전부 또는 일부 회수하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 회수되는 캡슐화 프로바이오틱스는 (a) 단계에서 자발적으로 생성된 알긴산염 하이드로겔에 자연히 포집된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 회수 과정에서 (a) 단계에서 자발적으로 생성된 알긴산염 하이드로겔에 포집되지 않은 일부 프로바이오틱스가 알긴산염 하이드로겔에 추가로 포집되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 (a) 단계의 배지에 캡슐화 증강제가 추가로 포함되는 경우, 알긴산 염-하이드로겔, 캡슐화 증강제 및 프로바이오틱스를 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 (a) 단계의 배양물을 냉각하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 냉각은 배양온도 이하, 바람직하게는 37℃ 이하 더욱 바람직하게는 약 20℃ 이하에서 냉각되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 약 20℃에서 배양물을 냉각하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 원심분리를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 생성된 알긴산 염-하이드로겔 및 프로바이오틱스를 동시에 회수하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 회수와 동시에 또는 회수 전에 (a) 단계의 배양액을 교반 또는 혼합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 균체를 회수하는 탱크에 교반시설을 함께 구비하여 상기 알긴산 염-하이드로겔 및 프로바이오틱스, 또는 알긴산 염-하이드로겔, 캡슐화 증강제 및 프로바이오틱스가 회수되는 동시에 혼합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혼합에 의해 (a) 단계에서 생성된 알긴산 염-하이드로겔에 자연적으로 포집되지 않은 일부 프로바이오틱스가 추가로 포집되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, (c) 상기 회수된 캡슐화 프로바이오틱스를 동결건조시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, (c) 회수된 캡슐화 프로바이오틱스를 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는 경우, (c) 단계에서도 동결건조기에 상기 회수된 물질을 분주하는 과정에서 교반을 수반할 수 있으며, 자연스럽게 혼합이 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계 이후, (c) 단계 이전에 별도의 교반 또는 혼합 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉 알긴산 염-하이드로겔과 프로바이오틱스는 회수와 동시에 혼합이 이루어질 수도 있고, 회수 이후에 추가적으로 혼합이 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.) 및 웨이셀라 속(Weissella sp.) 균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 본 발명의 기술적 특징이, 인간을 포함한 동물이 섭취 시 이로운 유익균의 생산 공정, 유통 과정 및 체내 안정성을 향상시키기 위한 방안으로 상기 균주의 배양 공정에서 우수한 알긴산 염 하이드로겔 코팅이 가능함을 규명함에 있는 바, 상기 기재된 균 이외의 유익균에도 본 발명이 적용 가능함은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 예를 들어 하기 표 1에 개시된 균주 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
Genus Species Genus Species
Lactobacillus Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium Bifidobacterium adolescentis
Lactobacillus brevis Bifidobacterium animalis subsp. animalis
Lactobacillus casei Bifidobacterium animalis subsp. lactis
Lactobacillus crispatus Bifidobacterium bifidum
Lactobacillus cuvatus Bifidobacterium breve
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus Bifidobacterium dentium
Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii Bifidobacterium longum subsp. infantis
Lactobacillus fermentum Bifidobacterium longum subsp. longum
Lactobacillus gasseri Lactococcus Lactococcus lactis subsp. cremoris
Lactobacillus helveticus Lactococcus lactis subsp. lactis
Lactobacillus jensenii Streptococcus Streptococcus diacetylactis
Lactobacillus johnsonii Streptococcus salivarius
Lactobacillus paracasei Streptococcus thermophilus
Lactobacillus pentosus Leuconostoc Leuconostoc citreum
Lactobacillus plantarum Leuconostoc kimchii
Lactobacillus reuteri Leuconostoc mesenteroides
Lactobacillus rhamnosus Leuconostoc paramesenteroides
Lactobacillus sakei Weissella Weissella cibaria
Lactobacillus salivarius Weissella confusa
Pediococcus Pediococcus acidilactici Weissella koreensis
Pediococcus halophilus Enterococcus Enterococcus faecium
Pediococcus parvulus Enterococcus lactis
Pediococcus pentosaceus Saccharomyces Saccharomyces boulardii
본 발명의 명세서에서 사용된 균주의 속명 또는 종명은 Zheng et al. (Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020; 70)에 의해 재정립된 속명(genus name)에 의해 다르게 명칭될 수 있으며, 통상의 기술자는 해당 문헌의 기재를 통해 쉽게 균주의 속/종을 이해할 수 있다.
한편, 본 발명에서는, 프로바이오틱스 캡슐화 방법에 있어서 프로바이오틱스 배양이 완료된 후 별도의 캡슐화 단계를 도입하는 종래 기술에 비하여, 상술한 바와 같이 공정이 간소화되어 생산 경제면에서 유리할 뿐만 아니라 별도의 캡슐화 단계를 도입하여 야기될 수 있는 오염의 염려나 품질 관리에서의 편의성이 증진될 수 있고, 생산된 프로바이오틱스의 동결건조 후 생존율, 열 안정성, 저장 안정성 및 체내 안정성이 종래 기술에 의해 생산된 프로바이오틱스 캡슐에 비해 현저히 향상됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법에 의해 제조된 캡슐화 프로바이오틱스에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 '캡슐화' 및 '캡슐화 프로바이오틱스'는 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법에서 설명된 것과 동일하게 이해될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캡슐화 프로바이오틱스는 캡슐화제로 구성된 캡슐 껍질 내부에 프로바이오틱스가 존재하는 레저부아타입(Reservoir type) 또는 캡슐화제로 구성된 매트릭스 내부에 프로바이오틱스가 포집되는 매트릭스 타입(Matrix type)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 매트릭스 타입인 것을 특징으로 할 수 있으나(Zuidam and Nedovic, (2010) Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and Food Processing, Springer), 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 캡슐화 프로바이오틱스는 알긴산 염 하이드로겔에 의해 프로바이오틱스가 포집되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캡슐화 프로바이오틱스는 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 음료, 기능성 식품, 일반식품, 의약품, 화장품 등에 포함되는 원료, 바람직하게는 기능성 원료로 활용될 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여용 건강기능식품의 유효성분으로 활용될 수 있다.
이에 따라 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 조성물과, 이를 포함하는 식품, 건강기능 식품 및 의약품에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스 또는 이를 포함하는 조성물의 식품 및/또는 건강기능식품의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 및 건강식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있으며, 본 발명에 따른 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태일 수 있다.
상기 건강식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강 유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.
상기 식품조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 본 발명의 방법으로 제조된 캡슐화 프로바이오틱스와 함께 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 식품은 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품 및 일반적인 식품의 형태로 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며,
또한 본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 음료, 차, 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품 및 비타민 복합제로 구성된 군에서 선택된 형태인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 약학적 조성물 및 의약품에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스 또는 이를 포함하는 조성물의 약학적 조성물 및/또는 의약품의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "예방" 및 "치료"는 최광의의 개념으로 해석되어야 하며, "예방"이란, 질환에 노출되거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있으나 질환의 증상을 아직 경험하거나 드러내지 아니한 환자에게서 질환의 임상적 증상 중 하나 이상이 진행되지 아니하도록 하는 것을 의미한다. "치료"란, 질환 또는 이의 하나 이상의 임상적 증상의 발달을 저지 또는 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학 조성물은 유효성분인 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스를 함유하는 것 이외에 통상적으로 약학 조성물에 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비제한적으로 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형이 바람직하며 이 중에서도, 과립, 분말 펠렛의 제형이 가장 바람직하다. 길경 추출물을 포함하는 경구형 의약품의 예로 용각산 등이 있다. 이외의 제형으로, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들면, 경구 복용될 수 있다. 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 약학적 조성물 및 의약품은 소화기 질환의 치료 또는 예방 용도로 사용될 수 있으며, 특히 위장, 대장 및 소장의 기능을 개선하는 효과를 발휘할 수 있고,
구체적으로는 (i) 소화불량, 식욕감퇴, 식욕부진, 과식, 체함, 소화불량으로 인한 위부팽만감, 변비, 묽은 변, 설사 및 복부팽만감으로 구성된 군에서 선택되는 증상의 개선, 예방 또는 치료; (ii) 장내이상발효의 억제 및/또는 (iii) 소화 촉진 또는 정장작용의 강화 용도로 사용될 수 있지만, 이에 한정되지는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스의 질병의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 질병의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 질병은 소화기 질환인 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로는 (i) 소화불량, 식욕감퇴, 식욕부진, 과식, 체함, 소화불량으로 인한 위부팽만감, 변비, 묽은 변, 설사 및 복부팽만감으로 구성된 군에서 선택되는 증상의 개선, 예방 또는 치료; (ii) 장내이상발효의 억제 및/또는 (iii) 소화 촉진 또는 정장작용의 강화방법에 사용될 수 있지만, 이에 한정되지는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스의 화장료 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 캡슐화 프로바이오틱스가 갖는 효능에 따라, 다양한 기능 및 용도로 사용될 수 있으며, 예를 들어 피부 보습용, 피부 장벽 강화용, 피부 진정, 피부 손상 예방 또는 개선용, 또는 피부장벽 강화용, 노화 예방 또는 개선용, 또는 피부 상태 개선용 등으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 피부 상태 개선은 관찰되는 피부 상태의 개선을 포함할 뿐만 아니라, 피부 건강에 직접 및 간접적으로 영향을 주는 요소를 포함하는 포괄적 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있으며, 예를 들어, 제형에 따라 각종 공지의 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 담체, 유화제, 보습제, 계면활성제, 킬레이팅제, 산화방지제, 살균제, 안정화제, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 담체는 예를 들어, 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연, 락토오스, 실리카, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트, 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세라이드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 리놀린 유도체, 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 유화제는 예를 들어, 유동 파라핀, 세틸올타노에이트, 스테아린산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 보습제는 예를 들어, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 솔비톨 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 킬레이팅제는 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산나트륨(EDTA), α-하이드록시 지방산, 락토페린, α-하이드록시산, 시트르산, 락트산, 말산, 빌리루빈, 빌리버딘(biliverdin) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 산화 방지제는 예를 들어, 부틸히드록시아니솔, 디부틸히드록시톨루엔 또는 프로필 갈레이트 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스 외의 1종 이상의 유효성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 사용 용도 및 용법에 따라 공지된 다양한 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장수, 훼이셜 로션, 바디 로션, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일, 클렌징 폼, 비누 또는 바디 워시 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 피부 개선용 화장료 조성물에서, 피부가 두피 또는 모발인 경우, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어 에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처 크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발 건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물의 유효성분인 캡슐화 프로바이오틱스 및 첨가제는 화장품학적으로 허용가능한 용량으로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 각 국가에서 정하는 규제의 범위 내, 예를 들어, 중국 정부에서 정하는 「화장품 안전·기술 규범」에 규정된 최대 사용량을 초과하지 않는 범위 내에서 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 기능성 화장품에 포함될 수 있다. 상기 기능성화장품의 기준은 한국 「식품의약품안전처고시 기능성화장품 기준 및 시험방법」에 따른 것일 수 있으며, 예를 들어 미백, 주름개선, 모발의 색상변화, 자외선 보호, 여드름 완화, 탈모 완화 등의 기능을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 대만 정부에서 정하는 「화장품 의료 혹은 독제약품 함유기준, 化粧品含有醫療或毒劇藥品基準」에 규정된 함약 화장품 또는 일반 화장품에 포함될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 및 비교예
실험예 1. 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법으로 제조된 프로바이오틱스 캡슐의 특성 확인
실험예 1에서 사용된 비교예와 실시예는 표 2와 같다.
조건 배지 첨가 균액 처리 조건
비교예 1 탄산칼슘 -
비교예 2 탄산칼슘 동결보호제
실시예 1 탄산칼슘 + 알긴산나트륨 -
실시예 2 탄산칼슘 + 알긴산나트륨 + 전분 -
비교예 1
7.5 L 자(jar) 발효기(fermentor)에 탄산칼슘 3 g/L를 첨가한 프로바이오틱스 배양 배지 (포도당 (Daesang) 30 g/L, 효모추출물 (BioSpringer) 10 g/L, 가수분해대두단백 (Tatua) 15 g/L, 황산마그네슘 (Kali) 0.1 g/L) 4 L를 제조하여 121℃에서 25분 간 멸균하였다. 락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP), 락토바실러스 루테리 IDCC 3701 (Lactobacillus reuteri IDCC 3701) 또는 엔테로코커스 패슘 IDCC 2102 (Enterococcus faecium IDCC 2102) 균주의 초기 생균수가 약 1 × 108 CFU/mL이 되도록 제조된 배지에 접종하여 37℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 배양 종료액은 20℃로 냉각한 다음 원심분리하여 균체를 수거 후 그대로 동결건조 하였다.
비교예 2
7.5 L 자(jar)발효기(fermentor)에 탄산칼슘 3 g/L를 첨가한 프로바이오틱스 배양 배지 (포도당 (Daesang) 30 g/L, 효모추출물 (BioSpringer) 10 g/L, 가수분해대두단백 (Tatua) 15 g/L, 황산마그네슘 (Kali) 0.1 g/L) 4 L를 제조하여 121℃에서 25분 간 멸균하였다. 락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP), 락토바실러스 루테리 IDCC 3701 (Lactobacillus reuteri IDCC 3701) 또는 엔테로코커스 패슘 IDCC 2102 (Enterococcus faecium IDCC 2102) 균주의 초기 생균수가 약 1 × 108 CFU/mL이 되도록 제조된 배지에 접종하여 37℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 배양 종료액은 20℃로 냉각한 다음 균체를 원심분리하고 동결보호제(말토덱스트린 100 g/L + 프락토올리고당 50 g/L)를 균액과 동량 혼합(v/w)하여 동결건조 하였다.
실시예 1
7.5 L 자(jar) 발효기(fermentor)에 탄산칼슘 3 g/L와 알긴산나트륨 1 g/L 첨가한 프로바이오틱스 배양 배지 (포도당 (Daesang) 30 g/L, 효모추출물 (BioSpringer) 10 g/L, 가수분해대두단백 (Tatua) 15 g/L, 황산마그네슘 (Kali) 0.1 g/L) 4 L를 제조하여 121℃에서 25분 간 멸균하였다. 락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP), 락토바실러스 루테리 IDCC 3701 (Lactobacillus reuteri IDCC 3701) 또는 엔테로코커스 패슘 IDCC 2102 (Enterococcus faecium IDCC 2102) 균주의 초기 생균수가 약 1 × 108 CFU/mL이 되도록 제조된 배지에 접종하여 37℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 배양 종료액은 20℃로 냉각한 다음 6,700g, 20℃, 15분의 조건으로 원심분리하여 균체를 수거 후 그대로 동결건조 하였다.
실시예 2
7.5 L 자(jar) 발효기(fermentor)에 탄산칼슘 3 g/L, 알긴산나트륨 1 g/L 및 옥수수전분 5 g/L 첨가한 프로바이오틱스 배양 배지 (포도당 (Daesang) 30 g/L, 효모추출물 (BioSpringer) 10 g/L, 가수분해대두단백 (Tatua) 15 g/L, 황산마그네슘 (Kali) 0.1 g/L) 4 L를 제조하여 121℃에서 25분 간 멸균하였다. 락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP), 락토바실러스 루테리 IDCC 3701 (Lactobacillus reuteri IDCC 3701) 또는 엔테로코커스 패슘 IDCC 2102 (Enterococcus faecium IDCC 2102) 균주의 초기 생균수가 약 1 × 108 CFU/mL이 되도록 제조된 배지에 접종하여 37℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 배양 종료액은 20℃로 냉각한 다음 원심분리하여 균체를 수거 후 그대로 동결건조 하였다.
실험예 1-1. 동결건조 생존율 평가
동결건조 된 원료는 mesh 크기가 425 μm인 체망으로 분쇄하여 무게를 측정하고 원말 무게의 절반만큼의 말토덱스트린과 혼합하였다. 배양 종료액과 제조 원료의 생균수를 측정하기 위해 완충용액(Phosphate-citratebuffer, Sigma-Aldrich, P4809)으로 다단 희석하여 MRS 한천 배지에 도말한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양하고 생성된 집락을 계수하였다. 동결건조 생존율을 배양액에 포함된 총 생균수에 대한 원료에 포함된 총 생균수의 비율의 백분율로 나타내었다.
각 균주의 동결건조 분말의 생균수를 분석한 결과는 표 3과 같다. IDCC 3501 균주의 배양액 생균수 대비 생존율은 비교예 1과 2에서 각각 23.5%와 48.8% 였던 반면 실시예 1과 2에서는 각각 60.6%와 83.8%로 캡슐화 적용 원료에서 높은 동결건조 생존율을 보였다. 특히 캡슐화제에 캡슐화 증강제를 함께 처리한 실시예 2는 균체를 별도로 처리하지 않은 비교예 1에 비해서는 3.7배, 비교예 2에 비해서는 1.8배의 생존율을 나타내었다.
IDCC 3701 및 IDCC 2102 균주의 동결 건조 분말의 생균수를 분석한 결과에서도, 배양액 대비 동결건조후 생존률이 IDCC 3501 균주에서와 마찬가지로 현저히 향상됨을 확인하였다. 이는 별도의 동결건조 보호제 없이도 자연적으로 생성된 캡슐화제 및 캡슐화 증강제가 동결건조 보호제로서 역할을 효과적으로 발휘할 수 있음을 확인하였다.
조건 균주 별 동결건조 후 배양액 대비 생존율(%)
IDCC 3501 IDCC 3701 IDCC 2102
비교예 1 23.5 34.1 57.3
비교예 2 48.8 46.4 82.0
실시예 1 60.6 64.6 91.3
실시예 2 83.8 81.3 94.8
실험예 1-2. 열 저항성 (Heat tolerance) 평가
프로바이오틱스 캡슐은 각종 섭취 제형으로 가공될 때 여러 가지 사멸에 처할 수 있는 환경을 겪는데, 특히 정제로 타정 시에는 순간적으로 높은 열과 압력에 노출되게 된다. 균주 생육의 범위를 벗어난 높은 온도에서의 캡슐화에 의한 생균 보호 효과를 확인하기 위하여 상기 동결건조시킨 각각의 균주에 대한 생균 분말 0.1 g을 완충용액 10 mL에 현탁 후 60℃로 중탕하여 1시간 동안 처리한 다음 생존율을 확인하였다. 열처리 프로바이오틱스 현탁액을 다단 희석하여 MRS 한천 배지에 도말한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양하고 생성된 집락을 계수하였으며, 열 저항성 결과는 생균수가 1/10로 감소하는 데까지 걸린 시간(min)인 D값으로 나타내었다. D값은 생균수가 1/10로 감소될 때까지 걸리는 시간을 계산한 값이므로 수치가 클수록 60℃에서 더 높은 열 저항성을 가지고 있다고 할 수 있다. D 값을 비교한 결과, 모든 균주에서 실시예 1과 2에서 비교예 1과 2에 비해 현저히 높은 열 저항성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다 (표 4 참조).
조건 열 저항성 (1 h; D값(min))
IDCC3501 IDCC 3701 IDCC 2102
비교예 1 11.7 11.1 13.9
비교예 2 14.2 12.6 14.3
실시예 1 15.3 14.6 16.4
실시예 2 15.5 15.4 16.3
실험예 1-3. 위장관 모사 용액 생존율 (Survival in simulated gastro-intestinal tract)
인체 내로 섭취된 프로바이오틱스는 살아있는 상태로 장에 도달하기까지 여러 생존에 어려움을 주는 환경에 처하게 되며 이는 위산과 십이지장에서 분비되는 담즙산이 대표적이다. 따라서 프로바이오틱스생균의 섭취 안정성을 확인하기 위해 음식물을 섭취했을 때의 위장관 조건을 모사한 용액에서의 생존율을 확인하였다.
위 모사 용액을 제조하기 위해 MRS Broth 55 g/L을 증류수에 용해시킨 후 pH 3.0으로 조정한 다음 121℃에서 15분 간 멸균하여 산성 MRS 배지를 만들었다. 상기 동결건조시킨 각 균주의 생균 분말 0.1 g을 MRS 배지 10 mL에 현탁하여 1시간 동안 37℃에서 100 rpm으로 교반하며 배양하였다. 현탁액 1mL을 취하여 다단 희석한 다음 MRS 한천 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양 후 생성된 집락을 계수하였다.
장 모사 용액을 제조하기 위해 담즙(Oxgall,Sigma-Aldrich)을 증류수에 4g/L의 농도로 용해시킨 다음 pH 7.4로 보정하였다. 상기 위 모사 용액 처리 현탁액에 장 모사 용액을 90 mL 첨가하고 37℃에서 100 rpm으로 교반하며 2시간 동안 배양하며 1시간 간격으로 시료를 취하여 다단 희석한 다음 MRS 한천 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양 후 생성된 집락을 계수하였다.
프로바이오틱스 분말을 위장관 모사 용액에서 처리한 결과, IDCC 3501 균주의 경우 비교예 1과 2가 각각 0.3%와 15.0%의 생존율을, 실시예 1과 2에서는 각각 24.9% 및 59.8%의 생존율을 나타내었다. 특히 실시예 2는 위 모사 용액에서 90% 이상의 내산성을 나타냈으며, 최종적으로 3시간 처리 후에는 비교예 1에 비해 721배, 비교예 2에 비해 7.2배의 높은 생존율을 나타내었다 (표 5).
IDCC 3701 및 IDCC 2102 균주에서 또한 비교예 1 및 2에 비해 실시예 1, 2에서 최소 1.6배에서 최대 60배 향상된 생존율을 나타내었다(표 6).
이는 본 발명의 프로바이오틱스 동결건조 제형에서, 자연적으로 생성된 캡슐화제 및 캡슐화 증강제가 실제 위장관에서 균체를 효과적으로 보호할 수 있음을 의미한다.
조건 Lactobacillus plantarum IDCC 3501 균주의 생균수 (CFU/g) 최종 생존율(%)
0 h
(초기값)		 1 h
(위 모사 용액)		 2 h
(장 모사 용액)		 3 h
(장 모사 용액)
비교예 1 1.10E+11 1.14E+09 3.29E+08 3.40E+08 0.3
비교예 2 2.28E+11 4.13E+10 3.57E+10 3.41E+10 15.0
실시예 1 2.84E+11 1.47E+11 7.69E+10 7.08E+10 24.9
실시예 2 4.10E+11 3.95E+11 2.37E+11 2.45E+11 59.8
조건 위장관 모사 용액 3시간 처리 후 생존율(%)
IDCC 3501 IDCC 3701 IDCC 2102
비교예 1 0.3 1.2 8.3
비교예 2 15.0 19.7 33.9
실시예 1 24.9 32.6 56.8
실시예 2 59.8 61.8 83.0
실험예 1-4. 보관 안정성 (Shelf stability)
건조된 프로바이오틱스 원료는 유통 및 저장 과정에서 처해지는 온도, 산소, 수분 등의 요인에 의해 생균 활성이 점차 감소된다. 캡슐화와 같은 물리적 장벽은 이러한 사멸 요인들로부터 프로바이오틱스 균체를 보호하여 보관 안정성 향상에 기여할 수 있다. 원료 배합 및 포장 단계에서 항산화제, 탈산소제의 적용이나 방습 처리에 의해 산소와 수분에 대한 보호능을 갖게 할 수는 있지만, 노출되는 온도에 대해서는 원료 자체의 내구성이 필요하다. 따라서 상기 동결건조시킨 각각의 프로바이오틱스 분말에 원료 흡습성을 억제하기 위해 건조된 옥수수 전분을 부형제로서 1배 내지 10배 범위에서 혼합한 다음 산소 및 수분의 접촉을 억제하기 위해 알루미늄 파우치에 개별 포장하였다. 포장된 원료는 40
Figure pat00001
, 50℃?의 가혹조건에서 각각 7 일 간 보관한 다음 단기 생존율을 확인하고, 25
Figure pat00002
, 30℃?에서 각각 90일 간 보관한 다음 장기 생존율을 확인하였다. 보관 원료를 완충용액으로 다단 희석하여 MRS 한천 배지에 도말한 다음 37
Figure pat00003
에서 24시간 동안 배양하고 생성된 집락을 계수하였다.
프로바이오틱스 분말을 가혹한 온도 조건에서 7일 간 보관 후 생존율을 확인한 결과, IDCC 3501 균주의 경우 40
Figure pat00004
에서는 비교예 1과 2가 각각 1.1%와 14.7%의 생존율을, 실시예 1과 2에서는 각각 40.1% 및 87.2%의 생존율을 나타내었다. 50
Figure pat00005
에서는 비교예 1과 2가 각각 0.03%와 0.2%의 생존율을, 실시예 1과 2에서는 각각 5.4% 및 14.3%의 생존율을 나타내었다. 결과적으로 캡슐화 공정을 적용한 원료에서는 아무런 후처리 없이 균체만 건조한 비교예 1과 동결보호제를 처리하여 건조한 비교예 2에 비해 훨씬 높은 단기 보관 안정성을 나타내었다. 또한, 캡슐화를 적용한 실시예 1에 비해 캡슐화 증강제를 함께 첨가하여 배양한 실시예 2에서 2 배 이상의 높은 가혹조건 안정성을 나타내었다 (표 7 및 표 8 참조).
IDCC 3701 및 IDCC 2102 균주 또한 마찬가지로 비교예와 비교하여 현저하게 높은 가혹조건 안정성을 나타내어, 본 발명의 매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통하여 제조된 유산균의 동결건조 제형이 매우 높은 보관 안정성을 가지고 있음을 확인하였다.
조건 40℃ 7일 생존율(%) 50℃ 7일 생존율(%)
IDCC 3501 IDCC 3701 IDCC 2102 IDCC 3501 IDCC 3701 IDCC 2102
비교예 1 3.8 4.8 31.3 0.03 0.07 3.8
비교예 2 14.7 16.3 83.7 0.9 3.0 11.2
실시예 1 40.1 51.3 97.5 5.4 7.9 26.6
실시예 2 87.2 86.2 98.6 14.3 14.2 29.3
조건 25℃ 90일 생존율(%) 30℃ 90일 생존율(%)
IDCC 3501 IDCC 3701 IDCC 2102 IDCC 3501 IDCC 3701 IDCC 2102
비교예 1 3.8 4.8 31.3 0.03 0.07 3.8
비교예 2 14.7 16.3 83.7 0.9 3.0 11.2
실시예 1 40.1 51.3 97.5 5.4 7.9 26.6
실시예 2 87.2 86.2 98.6 14.3 14.2 29.3
프로바이오틱스 분말을 25
Figure pat00006
및 30
Figure pat00007
에서 90일 보관 후 생존율을 확인한 결과, IDCC 3501 균주의 경우 25
Figure pat00008
에서는 비교예 1과 2가 각각 1.9%와 17.8%의 생존율을, 실시예 1과 2에서는 각각 56.0% 및 95.7%의 생존율을 나타내었다. 한편, 30
Figure pat00009
에서는 비교예 1과 2가 각각 0.09%와 8.3%의 생존율을, 실시예 1과 2에서는 각각 35.0% 및 86.5%의 생존율을 나타내었다. 가혹조건 결과와 마찬가지로 비교예 1 <비교예 2 < 실시예 1 < 실시예 2 순의 보관 안정성을 나타냈으며, 특히 본 발명의 바람직한 실시 양태인 실시예 2는 25
Figure pat00010
에서는 90% 이상의 높은 안정성을 보여주었다.
IDCC 3701 및 IDCC 2102 균주 또한 마찬가지로 비교예와 비교하여 현저하게 높은 가혹조건 안정성을 나타내어, 본 발명의 매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통하여 제조된 유산균의 동결건조 제형이 단기간 뿐만 아니라 90일 이상의 장기 보관에서도 현저히 높은 보관 안정성을 가지고 있음을 확인하였다(표 7 및 표 8).
실험예 2. 본 발명의 캡슐화 방법 또는 기존 알긴산염 캡슐화 방법으로 제조된 프로바이오틱스 캡슐의 특성 비교
실험예 2에서 사용된 비교예(통상적 알긴산 칼슘 원료 제조방법)와 실시예는 다음과 같이 준비되었다.
비교예 1
7.5 L 자(jar) 발효기(fermentor)에 탄산칼슘 3 g/L를 첨가한 프로바이오틱스 배양 배지 (포도당 (Daesang) 30 g/L, 효모추출물 (BioSpringer) 10 g/L, 가수분해대두단백 (Tatua) 15 g/L, 황산마그네슘 (Kali) 0.1 g/L) 4 L를 제조하여 121
Figure pat00011
에서 25분 간 멸균하였다. 락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP)의 초기 생균수가 약 1 × 108 CFU/mL이 되도록 제조된 배지에 접종하여 37
Figure pat00012
에서 150 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 배양 종료액은 20
Figure pat00013
로 냉각한 다음 원심분리하여 균액을 400 mL 수거하였다. 수거된 원심분리 균액에 대해, 증류수 10 mL에 알긴산나트륨 0.4 g과 옥수수전분 2 g을 첨가한 현탁액을 균액에 혼합하여 균질화 한 다음 1% 염화칼슘 수용액에 점적하여 비드 형태로 제조하여 동결건조한 뒤 건조원말을 그대로 수거하였다.
비교예 2
비교예 1과 동일한 방법으로 제조된 원심분리 균액에 대해 증류수 100 mL에 알긴산나트륨 0.4 g, 옥수수전분 2 g 및 탄산칼슘 1.2 g을 첨가하고 200 rpm으로 교반하면서 10% 젖산 용액을 pH가 4.00이 될 때까지 초당 0.1 mL 속도로 첨가함으로써 생성된 하이드로겔을 균체에 첨가하여 균질화한 뒤 동결건조하였다. 동결건조된 균체를 크기가 425 μm인 체망으로 분쇄한 다음 각각의 무게를 측정하고 원말 무게의 절반만큼의 말토덱스트린과 혼합하였다.
실시예 1
7.5 L 자(jar) 발효기(fermentor)에 탄산칼슘 3 g/L, 알긴산나트륨 1 g/L 및 옥수수전분 5 g/L 첨가한 프로바이오틱스 배양 배지 (포도당 (Daesang) 30 g/L, 효모추출물 (BioSpringer) 10 g/L, 가수분해대두단백 (Tatua) 15 g/L, 황산마그네슘 (Kali) 0.1 g/L) 4 L를 제조하여 121
Figure pat00014
에서 25분 간 멸균하였다. 락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP)의 초기 생균수가 약 1 × 108 CFU/mL이 되도록 제조된 배지에 접종하여 37
Figure pat00015
에서 150 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 배양 종료액은 20℃로 냉각한 다음 원심분리하여 균체를 수거 후 그대로 동결건조 하였다.
실험예 2-1. 동결건조 생존율 평가
비교예 및 실시예의 배양 종료액과 제조 원료에서 생균수를 측정하기 위해 실험예 1-1과 동일한 방법으로 동결건조 생존율을 평가하였다.
동결건조 분말의 생균수를 분석하여 배양액 생균수 대비 생존율을 확인한 결과, 비교예 1과 2에서 각각 68.7%와 43.1%였던 반면 실시예에서는 84.1%로 상대적으로 높은 동결건조 생존율을 보였다. 이는 캡슐화제를 배양 단계에서 생성시키는 것이 균체에 후처리 하는 것보다 동결건조 보호제로서 역할을 더 효과적으로 수행할 수 있음을 확인하였다(표 9).
조건 원료 생균수 배양액 대비 생존율(%)
비교예 1 3.21E+11 68.7
비교예 2 2.01E+11 43.1
실시예 1 4.19E+11 84.1
실험예 2-2. 열 저항성 (Heat tolerance) 평가
실험예 1-2와 동일한 방법으로 비교예 및 실시예의 생균 분말의 열 저항성을 평가한 결과, 비교예 1과 2의 D값은 각각 14.8분과 14.2분이었으나 실시예의 D값은 15.7분으로 상대적으로 더 높은 D값을 보였다. 따라서 본 발명의 캡슐화 배양 공정으로 제조된 원료가 현저히 높은 열 저항성을 나타냄을 확인하였다(표 10).
조건 열 저항성 (1 h; D값(min))
IDCC 3501
비교예 1 14.8
비교예 2 14.2
실시예 1 15.7
실험예 2-3: 위장관 모사 용액 생존율 (Survival in simulated gastro-intestinal tract)
제조된 각 원료에 대해 위장관 모사 용액에서의 생존율과 붕해율을 확인하였다. 위장관 모사용액 생존율은 실험예 1-3과 동일한 방법으로 확인하였으며, 장 모사 용액 2시간 처리 후 분석 시 희석수로 생리식염수(0.9% 염화나트륨)로도 추가 분석하여 완충용액(Citrate-phosphate buffer)으로 알긴산염을 완전히 용해시켜 분석한 결과와의 비율을 통해 위장관 모사 용액 내에서의 붕해율을 파악하였다.
실시예와 비교예 1 간의 최종 생존율 차이는 약 2.1%로 유사한 수준이었으나, 붕해율 면에서 실시예가 4배 이상 높은 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 비교예 1과 같이 비드 형태로 캡슐화 한 경우 위장관 모사 용액으로부터 보호하는 능력은 뛰어나지만 실시예와 같이 위장관 내에서 프로바이오틱스가 효과적으로 붕해되어 증식하기는 어렵다는 것을 암시한다. 비교예 2는 붕해율이 실시예와 유사한 수준이긴 하였으나 생존율에서 실시예보다 상대적으로 낮아 위장관 모사 용액에 대한 보호능이 충분하지 않았다(표 11 및 표 12). 따라서, 본 발명의 캡슐화 방법이 기존의 알긴산염 캡슐화 방법에 비해 실제 위장관에서 뛰어난 붕해도와 안정성을 나타냄을 확인하였다.
조건 생균수 (CFU/g) 3 h 생존율(%)
0 h (초기값) 1 h
(위 모사 용액)		 2 h
(장 모사 용액)		 3 h
(장 모사 용액)
비교예 1 3.21E+11 2.92E+11 1.83E+11 1.80E+11 56.1
비교예 2 2.01E+11 1.32E+11 6.92E+11 6.77E+11 33.6
실시예 4.19E+11 3.96E+11 2.46E+11 2.44E+11 58.2
조건 생균수 (CFU/g) 붕해율(%)
3 h (장 모사 용액, 생리식염수 희석)
비교예 1 4.09E+10 22.8
비교예 2 6.53E+10 96.5
실시예 2.39E+11 97.8
실험예 2-4. 보관 안정성 (Shelf stability)
실험예 1-4와 동일한 방법으로 제조된 각 원료를 포장하고, 포장된 원료는 40
Figure pat00016
, 50℃?의 가혹조건에서 각각 7일 간 보관한 다음 단기 생존율을 확인하고 25
Figure pat00017
, 30℃?에서 각각 90일 간 보관한 다음 장기 생존율을 확인하였다. 보관 원료를 완충용액으로 다단 희석하여 MRS 한천 배지에 도말한 다음 37
Figure pat00018
에서 24시간 동안 배양하고 생성된 집락을 계수하였다.
프로바이오틱스 분말을 가혹한 온도 조건에서 7일 간 보관 후 생존율을 확인한 결과, 40℃에서는 비교예 1과 2가 각각 72.5%와 36.1%의 생존율을 보였으나 실시예에서는 88.1%로 상대적으로 높은 생존율을 나타냈다. 50℃에서는 비교예 1과 2가 각각 10.2%와 4.3%의 생존율을 보였으나 실시예에서는 15.4%로 비교예 대비 높은 생존율을 나타냈다. 결과적으로 배양 단계에서 캡슐화 공정을 적용한 실시예의 원료에서는 후처리 단계에서 알긴산염을 적용한 비교예 원료들에 비해 높은 단기 보관 안정성을 나타냈다(표 13).
프로바이오틱스 분말의 90일 보관 후 온도 별 생존율을 확인한 결과, 25℃에서는 비교예 1과 2가 각각 76.3%와 49.1%의 생존율을 보였으나 실시예에서는 97.2%로 상대적으로 높은 생존율을 나타냈다. 30℃에서는 비교예 1과 2가 각각 58.2%와 31.0%의 생존율을 보였으나 실시예에서는 86.5%로 역시 상대적으로 생존율을 나타냈다. 단기 보관 안정성 결과와 마찬가지로 실시예는 비교예 1, 2에 비해 높은 장기 보관 안정성을 나타냈으며, 특히 25℃에서는 95% 이상의 매우 높은 생존율을 보여주었다(표 14).
조건 40℃ 7일 생존율(%) 50℃ 7일 생존율(%)
생균수(CFU/g) 생존율(%) 생균수(CFU/g) 생존율(%)
비교예 1 2.32E+11 72.5 3.26E+10 10.2
비교예 2 7.27E+10 36.1 8.73E+9 4.3
실시예 1 3.69E+11 88.1 6.46E+10 15.4
조건 25℃90일 생존율(%) 30℃7일 생존율(%)
생균수(CFU/g) 생존율(%) 생균수(CFU/g) 생존율(%)
비교예 1 2.45E+11 76.3 1.87E+11 58.2
비교예 2 9.88E+10 49.1 6.23E+10 31.0
실시예 1 4.07E+11 97.2 3.63E+11 86.5
실험예 2-5. 캡슐화제의 입자 크기 분석
배양 단계에서 캡슐화제 자연 생성을 진행한 실시예와 시험관 상에서 인위적으로 캡슐화제를 생성시킨 비교예 2 간의 입자 크기를 비교하였다. 실시예의 공정의 원심분리 단계에서 얻은 균액을 생리식염수로 풀어준 다음 셀룰로스 여과지(1004047, Whatman)로 3회 필터하고 펠렛 부분을 수거하여 동결건조 하였다. 건조된 실시예와 비교예 2의 캡슐화제를 각각 생리식염수에 풀어 입도 분석기(LS-I3-320, Beckman Coulter)를 사용하여 입자 크기를 분석하였다.
건조된 캡슐화제의 입자 크기를 분석한 결과 실시예에서는 평균 82.45 μm, 비교예 2에서는 평균 146.09 μm로 실시예의 캡슐화제가 세밀한 입자 크기를 보였다(도 2). 따라서 배양 단계에서 캡슐화제를 자연 생성한 실시예에서 균체 캡슐화 시 더 작은 간극을 메울 수 있어 안정성 향상에 기여할 수 있음을 확인하였다.
상기 실험예들의 결과는 알긴산염 비드 형태로 캡슐화 한 비교예 1, 및 실시예와 동일한 원리를 이용하여 알긴산염을 별도로 제조한 다음 균액에 섞어준 비교예 2의 공정보다 알긴산염 캡슐화제를 자연적으로 생성시켜 균액과 혼합시키는 본 발명의 캡슐화제 제조방법이 현저히 뛰어난 동결건조 생존율, 열 저항성, 위장관 모사 용액 생존율, 단기/장기 보관 안정성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히, 본 발명의 방법으로 제조된 캡슐화제는 매우 미세한 입자로서 균체 간의 간극을 메움으로써 프로바이오틱스 생존에 악영향을 주는 각종 인자로부터 보호 효과를 발휘할 수 있음을 확인하였다. 따라서 프로바이오틱스 균주를 본 발명의 방법을 통해 캡슐화할 경우 일반적으로 알긴산염의 캡슐화에 사용되는 공정에 비해 높은 균체 보호능을 갖는다는 것을 확인하였다.
실험예 3. 프로바이오틱스 캡슐의 구조적 특성
락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP)의 캡슐화 원료에 대한 SEM 사진을 촬영하였다. 본 발명의 캡슐화 공정을 적용하지 않은 균체 건조물, 캡슐화제만 적용한 건조물(실험예 1의 실시예 1과 동일), 캡슐화제와 캡슐화 증강제를 모두 적용한 건조물(실험예 1의 실시예 2과 동일)을 FE-SEM (S-4700, Hitachi)을 사용하여 25,000X 배율로 촬영하였다.
캡슐화를 적용하지 않은 균체 건조물(A)에서는 균체 간 간극이 상당히 존재하였지만 캡슐화제만 적용한 건조물(B)과 캡슐화제와 캡슐화 증강제를 모두 적용한 건조물(C)에서는 균체가 캡슐화제에 의해 둘러싸고 간극을 메우고 있음을 확인했다. 또한, 균체 군집이 이루고 있는 3차원 구조의 모습을 볼 때 캡슐화 증강제를 적용한 건조물은 캡슐화제만 적용한 것에 비해 상대적으로 표면적이 적어 프로바이오틱스의 생존을 위협하는 환경에 상대적으로 덜 노출되는 구조를 형성하였다(도 3).
따라서, 본 발명의 캡슐화 방법으로 제조된 프로바이오틱스 캡슐이 구조적으로 매우 안정함을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (23)

  1. 다음 단계를 포함하는 알긴산 염-하이드로겔로 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법:
    (a) 프로바이오틱스를 알긴산 염 및 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염을 함유하는 배지에서 배양하여 프로바이오틱스 증식과 동시에 알긴산 염-하이드로겔을 자발적으로 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 자발적으로 생성된 알긴산 염-하이드로겔에 의해 캡슐화된 프로바이오틱스를 회수하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 캡슐화 프로바이오틱스는 알긴산 염 하이드로겔에 프로바이오틱스가 포집되어 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 캡슐화 프로바이오틱스는 매트릭스 타입(Matrix type)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 프로바이오틱스의 배양으로 발생하는 산에 의해, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염으로부터 양이온이 해리되고,
    상기 해리된 양이온과 알긴산이 결합하여 자발적으로 알긴산 염-하이드로겔이 생성되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 알긴산 염은 물에 대한 용해도가 0.1 g/L 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 알긴산 염은 알긴산 나트륨, 알긴산 칼륨, 알긴산 마그네슘, 알긴산 칼슘, 알긴산 리튬 및 알긴산 암모늄으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염은 물에 대한 용해도가 0.1 g/L 이하인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염은 2가 양이온의 탄산염 또는 질산염인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 탄산염은 탄산칼슘, 탄산바륨, 탄산망간, 탄산구리, 탄산아연, 탄산납, 탄산카드뮴, 탄산코발트, 탄산니켈, 및 탄산스트론튬으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 질산염은 질산칼슘, 질산바륨, 질산망간, 질산구리, 질산아연, 질산납, 질산카드뮴, 질산코발트, 질산니켈 및 질산스트론튬으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 알긴산 염은 0.1 내지 40 g/L, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염은 0.5 내지 10 g/L로 배지에 함유되는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 배지는 캡슐화 증강제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 캡슐화 증강제는 전분, 결정 셀룰로오스, 키토산, 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 탈지분유로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 캡슐화 증강제는 1 내지 20 g/L로 배지에 함유되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.) 및 웨이셀라 속(Weissella sp.) 균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제1항에 있어서,
    (c) 회수된 알긴산 염-하이드로겔로 캡슐화 프로바이오틱스를 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는 캡슐화 프로바이오틱스.
  18. 제17항에 있어서, 알긴산 하이드로겔에 의해 프로바이오틱스가 포집되어 있는 것을 특징으로 하는 캡슐화 프로바이오틱스.
  19. 제17항의 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 식품 또는 건강기능식품.
  20. 제17항의 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 약학적 조성물 또는 의약품.
  21. 제20항에 있어서, 소화기 질환의 치료 또는 예방 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물 또는 의약품.
  22. 제20항에 있어서,
    (i) 소화불량, 식욕감퇴, 식욕부진, 과식, 체함, 소화불량으로 인한 위부팽만감, 변비, 묽은 변, 설사 및 복부팽만감으로 구성된 군에서 선택되는 증상의 개선, 예방 또는 치료;
    (ii) 장내이상발효의억제 및/또는
    (iii) 소화 촉진 또는 정장작용의 강화;
    용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물 또는 의약품.
  23. 제17항의 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 화장료 조성물.
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