WO2022131847A1 - 매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통한 유산균의 동결건조 생존율, 열 저항성, 저장 안정성 및 체내 안정성이 향상된 캡슐화 프로바이오틱스의 논스톱 제조 공정 - Google Patents

매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통한 유산균의 동결건조 생존율, 열 저항성, 저장 안정성 및 체내 안정성이 향상된 캡슐화 프로바이오틱스의 논스톱 제조 공정 Download PDF

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김형은
한치영
서한솔
김태윤
이성희
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Definitions

  • the present invention relates to a non-stop manufacturing process of encapsulated probiotics through a matrix capsule protective film natural production technology, and more particularly, probiotics in a medium containing an alginic acid salt, a salt that combines with alginic acid to form a hydrogel, and optionally an encapsulation enhancer It relates to a method for producing encapsulated probiotics in which probiotics are captured in alginate hydrogels naturally produced by culturing.
  • Probiotics are live microorganisms that have beneficial effects on health in the body. Most of the probiotics known so far are lactic acid bacteria, and some include Bacillus. Since Russian scientist Elie Mechinikoff won the Nobel Prize for discovering that the reason Bulgarians enjoy a long life is due to the consumption of fermented milk fermented with Lactobacillus, the functions of lactic acid bacteria and probiotics have been studied for a long time (Mercenier A et al., Curr Pharm). Des 9(2):175-191, 2003).
  • probiotics include antibacterial activity, antibiotic-related diarrhea improvement, lactose intolerance, anticancer effect, blood cholesterol lowering, inhibition of Helicobacter pylori in the stomach, irritable colitis, Crohn's disease, ulcerative colitis relief, immune function regulation etc. are known.
  • Probiotics can be divided into intestinal medicines or lactic acid bacteria preparations, which are human medicines, probiotics as feed additives, and lactic acid bacteria foods, which are a kind of health food.
  • Lactobacillus food is produced by culturing live bacteria such as lactobacilli, lactobacilli, and bifidobacteria and mixing it with food into powder, granules, tablets, and capsules for stable and easy intake.
  • Lactic acid bacteria means bacteria that produce lactic acid as a main product as a result of fermentation among bacteria grown by fermentation.
  • Lactobacillus is one of the most important microbial groups in the microbial industry. It is mainly used to manufacture fermented foods such as kimchi, yogurt, cheese, buttermilk, and sauerkraut, and is also widely used as functional probiotics that promote health. .
  • lactic acid bacteria are classified into 12 genera (Lactobacillus, Carnobacterium, Atopobium, Lactococcus, Pediococcus, Tetragenococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus, Enterococcus, Streptococcus, Vagococcus). spp.), Lactococcus spp., Streptococcus spp., Leuconostoc spp., and Pediococcus spp. BioWave, 2009, Vol 11, No 7, pp 1-20).
  • lactic acid bacteria are exposed to various physical and chemical stresses. That is, during cell recovery, osmotic pressure is affected by concentration, and in the freeze-drying process, ice crystals are formed in the cytoplasm due to rapid temperature change or ice crystals generated outside the cell and dehydration are affected by temperature and osmotic pressure. at the same time receive
  • osmotic pressure is affected by concentration
  • freeze-drying process ice crystals are formed in the cytoplasm due to rapid temperature change or ice crystals generated outside the cell and dehydration are affected by temperature and osmotic pressure. at the same time receive
  • the stability of lactic acid bacteria decreases. Even in products manufactured in powder form for the purpose of storage, it has been pointed out that, when exposed to oxygen, the fatty acids constituting the cell membrane are oxidized and the survival rate is reduced (refer to Korean Patent No. 10-1605516)
  • bacteria including lactic acid bacteria
  • they must survive gastric acid and bile acid, reach the small intestine, multiply and settle in the intestine, and must exhibit useful effects in the intestine and be non-toxic and non-pathogenic.
  • the stomach is exposed to an acidic environment where the pH drops to 3 or less, and in the small intestine, the survival rate of various beneficial bacteria including lactic acid bacteria is greatly reduced by the influence of bile acids.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a new encapsulation process that has improved in vivo stability and simplified the process compared to the conventional probiotic encapsulation process.
  • the present invention was completed by confirming that the freeze-drying survival rate, heat resistance (heat resistance) and in vivo stability (acid resistance and bile resistance) of probiotics can be significantly improved, and short-term and long-term storage stability can be significantly improved.
  • Patent Document 1 Korean Patent Registration No. 10-1605516
  • Patent Document 2 Korean Patent Publication No. 2003-0009268
  • Non-Patent Document 1 Taejin Kang, BioWave, 2009, Vol 11, No 7, pp 1-20
  • Non-Patent Document 2 Mercenier A et al., Curr Pharm Des 9(2):175-191, 2003
  • An object of the present invention is a method for producing encapsulated probiotics with improved freeze-drying viability, heat resistance, storage stability and in vivo stability of lactic acid bacteria through a matrix capsule protective film natural generation technology that performs a significantly simpler process compared to the existing manufacturing process of encapsulated probiotics And to provide the use of the encapsulated probiotics prepared by the above method.
  • the present invention provides a method for producing encapsulated probiotics in which probiotics are encapsulated in an alginate hydrogel, comprising the following steps:
  • the present invention also provides encapsulated probiotics prepared by the above manufacturing method, and compositions, foods, health functional foods, cosmetics and pharmaceuticals containing the same.
  • the present invention also provides a composition of the encapsulated probiotic of the present invention, a use for the manufacture of food, nutraceuticals, cosmetics and/or pharmaceuticals.
  • the present invention also provides the use of the encapsulated probiotics of the present invention for the prevention or treatment of diseases.
  • the present invention also provides a method for alleviating, preventing or treating a disease characterized by administering the encapsulated probiotics of the present invention.
  • FIG. 1 shows a manufacturing process of encapsulated probiotics according to a preferred embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the particle size of the probiotic capsules prepared by the conventional alginate encapsulation method and the encapsulation method of the present invention.
  • FIG. 3 is an SEM photograph of a dried cell material to which encapsulation is not applied (A), a dry material to which only an encapsulating agent (alginate) is applied (B), and a dry material to which both an encapsulant (alginate) and an encapsulation enhancer (starch) are applied (C). (Scale bar 1 ⁇ m).
  • the probiotics when a salt that forms a hydrogel by binding with alginic acid and alginic acid is added to the medium in the process of culturing probiotics, the probiotics proliferate and form a hydrogel by combining with alginic acid by the action of the acid to form a hydrogel.
  • the cations are released and combined with alginic acid in the medium to spontaneously generate an alginic acid divalent cation hydrogel, and then through a step of recovering the spontaneously generated alginic acid divalent cation hydrogel together with the cells, compared to the conventional process It was confirmed that capsules in which probiotics are encapsulated can be produced with an extremely simple process.
  • calcium carbonate when used as a salt that forms a hydrogel by binding with alginic acid, calcium is liberated from calcium carbonate by the acid generated during the probiotic culture process, and the liberated calcium is spontaneously combined with alginate to form calcium- Alginate hydrogels are formed.
  • the present invention relates to a process for the preparation of encapsulated probiotics comprising the steps of:
  • the term “encapsulation” refers to coating a raw material with an encapsulating agent or collecting the raw material inside the encapsulating agent.
  • encapsulation of a reservoir type in which probiotics are present inside a capsule shell composed of an encapsulant or a matrix type in which probiotics are collected in a matrix composed of an encapsulant may be performed, but is limited thereto (Zuidam and Nedovic, (2010) Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and Food Processing, Springer).
  • probiotics can be stabilized by the encapsulation, or protected from the external environment and the internal environment.
  • encapsulated probiotics refers to probiotics in the form of being coated with various encapsulating agents such as carbohydrates, syrups, gums, hydrogels, or encapsulated in a matrix.
  • the encapsulated probiotics may be used interchangeably in the same meaning as 'probiotic capsules'.
  • the encapsulated probiotics may be a reservoir type in which probiotics are present inside a capsule shell composed of an encapsulant or a matrix type in which probiotics are collected in a matrix composed of an encapsulant, but is limited thereto. it is not going to be
  • the encapsulated probiotics may be characterized in that the probiotics are captured by the alginate hydrogel.
  • the term “capture” means that probiotics are trapped in the space or pores included in the structure of the alginate hydrogel of the present invention. In the space or pores, along with probiotics, a culture composition such as a medium, water, and nutrients may be captured together.
  • the alginic acid salt preferably has a solubility in water of 0.1 g/L or more, more preferably 0.1 g/L to 10 g/L, and sodium alginate, potassium alginate, magnesium alginate, alginic acid It is preferably selected from the group consisting of calcium, lithium alginate and ammonium alginate, but is not limited thereto, and any alginate salts meeting the purpose of the present invention may be used without limitation.
  • the content of the alginic acid salt contained in the medium is 0.1 to 40 g / L, preferably 0.2 to 15 g / L, more preferably 0.5 to 2 g / L, most preferably 0.8 to 1.2 g It may be /L, but is not limited thereto.
  • the salt forming a hydrogel by combining with alginic acid according to the present invention may be a salt of a divalent cation having a solubility in water of 0.1 g/L or less, preferably 0.00001 g/L to 0.1 g/L, preferably may be a basic salt containing a divalent cation.
  • the salt forming a hydrogel by binding with the alginic acid may be a carbonate or nitrate containing a divalent cation.
  • the carbonate containing the divalent cation one selected from the group consisting of calcium carbonate, barium carbonate, manganese carbonate, copper carbonate, zinc carbonate, lead carbonate, cadmium carbonate, cobalt carbonate, nickel carbonate, and strontium carbonate More than one species may be used, but is not limited thereto.
  • the nitrate containing the divalent cation is selected from the group consisting of calcium nitrate, barium nitrate, manganese nitrate, copper nitrate, zinc nitrate, lead nitrate, cadmium nitrate, cobalt nitrate, nickel nitrate and strontium nitrate.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the content of the salt to form a hydrogel by binding with the alginic acid is 0.5 to 10 g/L, preferably 1 to 9 g/L, more preferably 1.5 to 8 g/L, most preferably It may be 2 to 7 g/L, but is not limited thereto.
  • the salt that forms a hydrogel by binding with the alginic acid may be characterized in that the cation is dissociated by the acid generated by culturing the probiotics.
  • the acid generated by culturing the probiotic means an organic acid produced in the metabolic process of the probiotic.
  • the acid generated by culturing the probiotics may be lactic acid, acetic acid, citric acid, malic acid, succinic acid, etc., but is not limited thereto.
  • the step (a) may be characterized in that the cation is dissociated from the salt to form a hydrogel by binding with the alginic acid by the acid generated by the culturing of the probiotics.
  • the alginic acid salt-hydrogel is produced by combining the cation and alginic acid dissociated from the salt to form a hydrogel by combining with the alginic acid.
  • the step (a) may be characterized in that probiotics are proliferated by culturing.
  • step (a) may be characterized in that all or part of the probiotics cultured inside the spontaneously generated alginate-hydrogel are collected.
  • the medium of step (a) may further include an encapsulation enhancer.
  • the encapsulation enhancer is for improving the firmness of the alginate hydrogel capsule, and may be characterized in that it is insoluble, for example, the encapsulation enhancer includes starch, crystalline cellulose, chitosan, carboxymethylcellulose (CMC) and At least one selected from the group consisting of skim milk powder may be used, but is not limited thereto.
  • the encapsulation enhancer includes starch, crystalline cellulose, chitosan, carboxymethylcellulose (CMC) and At least one selected from the group consisting of skim milk powder may be used, but is not limited thereto.
  • the hydrogel and starch produced by binding of a salt that binds to alginic acid to form a hydrogel are mixed with probiotics, resulting in a more robust structure. It was confirmed that probiotic capsules can be produced.
  • the encapsulation enhancer is added to the medium at 1 to 20 g/L, preferably 2 to 10 g/L, more preferably 3 to 5 g/L, most preferably 5 g/L in the medium. It may be characterized in that it contains.
  • the probiotic capsule prepared by the encapsulation method of the present invention without treating the cryoprotectant is significantly superior to the formulation prepared by treating the calcium carbonate and the cryoprotectant, the freeze-drying survival rate, heat resistance, the gastrointestinal mimic solution survival rate, and It was confirmed that long-term/short-term storage stability was shown.
  • the medium may contain a cryoprotectant like the conventional medium, but it shows excellent freeze-drying survival rate, heat resistance, gastrointestinal imitation solution survival rate, and long-term/short-term storage stability without treatment with a cryoprotectant.
  • a cryoprotectant like the conventional medium, but it shows excellent freeze-drying survival rate, heat resistance, gastrointestinal imitation solution survival rate, and long-term/short-term storage stability without treatment with a cryoprotectant.
  • it may be characterized in that it does not contain a cryoprotectant.
  • the pH of the culture medium is suppressed from excessively decreasing in the process of dissociation of a divalent cation salt, for example, calcium carbonate, into calcium ions by the acid secreted by the probiotics, the culturing step It was confirmed that the probiotic culture proceeded smoothly even without an additional pH adjustment step.
  • a divalent cation salt for example, calcium carbonate
  • the present invention in culturing probiotics in a medium containing an alginic acid salt and a salt that forms a hydrogel by binding with alginic acid, it does not include an additional pH adjustment step or process, or is minimized compared to the conventional culture process It may be characterized by the use of a pH adjustment step or fixation.
  • the inoculation concentration and culture time of the probiotic strain can be appropriately modified depending on the strain.
  • the initial concentration of the strain after inoculation may be 1 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 9 CFU/mL, preferably 5 ⁇ 10 5 to 4 ⁇ 10 8 CFU/mL, but is not limited thereto.
  • the incubation time of the probiotic strain is preferably 4 hours or more, more preferably 6 hours or more so that salts, such as carbonates, which combine with alginic acid to form a hydrogel can be sufficiently dissociated, but is not limited thereto.
  • step (b) may be performed by recovering all or part of the alginate-hydrogel and cultured probiotics spontaneously generated in step (a).
  • the encapsulated probiotics recovered in step (b) may be naturally collected in the alginate hydrogel spontaneously generated in step (a).
  • step (b) in the recovery process of step (b), some probiotics not captured in the alginate hydrogel spontaneously generated in step (a) may be additionally collected in the alginate hydrogel.
  • step (b) when the encapsulation enhancer is additionally included in the medium of step (a), the alginate-hydrogel, the encapsulation enhancer, and the probiotics may be recovered.
  • step (b) may include cooling the culture of step (a).
  • the cooling may be characterized in that the cooling is at or below the culture temperature, preferably at or below 37°C, more preferably at or below about 20°C, and in one embodiment of the present invention, the culture at about 20°C Although cooled, it is not limited thereto.
  • the step (b) may be characterized in that it comprises the step of performing centrifugation.
  • step (b) may be characterized in that the produced alginic acid salt-hydrogel and probiotics are simultaneously recovered and performed.
  • step (b) may be characterized in that the culture solution of step (a) is stirred or mixed simultaneously with or before recovery.
  • the alginate-hydrogel and probiotics, or the alginate-hydrogel, the encapsulation enhancer, and the probiotics may be recovered and mixed at the same time by providing a stirring facility in the tank for recovering the cells.
  • the present invention may be characterized in that some probiotics that are not naturally captured in the alginate-hydrogel generated in step (a) are additionally collected by the mixing.
  • it may further comprise the step of (c) freeze-drying the recovered encapsulated probiotics.
  • stirring may be accompanied in the process of dispensing the recovered material in the freeze dryer even in step (c), and mix naturally This may be done.
  • step (b) after step (b), it may be characterized in that it further comprises a separate stirring or mixing step before step (c). That is, the alginate-hydrogel and probiotics may be mixed at the same time as recovery, or may be mixed additionally after recovery.
  • the probiotics are Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp., Streptococcus sp., Lactococcus sp., Enterococcus sp. Enterococcus sp.), Leuconostoc sp., Pediococcus sp. and Weissella sp.
  • the probiotic may be, for example, any one or more of the strains disclosed in Table 1 below, but is not limited thereto.
  • the genus or species name of the strain used in the specification of the present invention is Zheng et al. (Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020; 70) may be named differently by the re-established genus name, and those skilled in the art can easily understand the genus / species of the strain through the description of the document. can
  • the process is simplified as described above, which is advantageous in terms of production economy as well as introducing a separate encapsulation step. It was confirmed that concerns about possible contamination or convenience in quality control can be improved, and the viability, thermal stability, storage stability and in vivo stability of the produced probiotics after freeze-drying are significantly improved compared to the probiotic capsules produced by the prior art. did
  • the present invention relates to encapsulated probiotics prepared by the method for producing encapsulated probiotics of the present invention.
  • 'encapsulation' and 'encapsulated probiotics' used in the present invention may be understood the same as those described in the method for producing encapsulated probiotics of the present invention.
  • the encapsulated probiotics may be a reservoir type in which probiotics are present inside a capsule shell composed of an encapsulant or a matrix type in which probiotics are collected in a matrix composed of an encapsulant, more preferably It may be characterized as a matrix type (Zuidam and Nedovic, (2010) Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and Food Processing, Springer), but is not limited thereto.
  • the encapsulated probiotics may be characterized in that the probiotics are captured by the alginate hydrogel.
  • the encapsulated probiotics can be used as raw materials, preferably functional raw materials, included in fermented milk, processed milk, soy sauce fermented food, kimchi fermented food, functional drink, functional food, general food, pharmaceutical, cosmetic, etc. It can be used as an active ingredient in health functional food for oral administration.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising the encapsulated probiotics according to the present invention, and to a food, a health functional food, and a pharmaceutical including the composition.
  • the present invention relates to the use of the encapsulated probiotics of the present invention or a composition comprising the same for the production of food and/or health functional food.
  • the term “food” refers to meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, There are vitamin complexes, health functional foods, and health foods, and includes all foods in the ordinary sense.
  • the functional food is the same term as food for special health use (FoSHU), and in addition to supplying nutrients, it is processed to efficiently exhibit bioregulatory functions and has high medical effects.
  • function (sex) means to obtain a useful effect for health purposes such as regulating nutrients or physiological action with respect to the structure and function of the human body.
  • the food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and at the time of manufacture, it can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the art.
  • the formulation of the food may be manufactured without limitation as long as it is a formulation recognized as a food, and the health functional food according to the present invention may be in the form of powder, granule, tablet, capsule or beverage.
  • the health food means a food having an active health maintenance or promotion effect compared to general food
  • the health supplement food means a food for the purpose of health supplementation.
  • the terms health functional food, health food, and dietary supplement are used interchangeably.
  • the food composition may further include a physiologically acceptable carrier, the type of carrier is not particularly limited and any carrier commonly used in the art may be used.
  • the composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve odor, taste, vision, and the like.
  • vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, pantothenic acid, and the like may be included.
  • it may include minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu), and chromium (Cr).
  • it may include amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, and valine.
  • the composition includes a preservative (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.), a disinfectant (bleaching powder and high bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.), an antioxidant (butylhydroxyanisole (BHA), butylhydroxy Toluene (BHT), etc.), coloring agents (tar pigments, etc.), coloring agents (sodium nitrite, sodium nitrite, etc.), bleach (sodium sulfite), seasonings (MSG, etc.), sweeteners (dulcin, cyclimate, saccharin, sodium, etc.) ), flavorings (vanillin, lactones, etc.), swelling agents (alum, D-potassium hydrogen tartrate, etc.), strengthening agents, emulsifiers, thickeners (foams), film agents, gum base agents, foam inhibitors, solvents, food additives such as improving agents additives).
  • the additive may be selected according to the type of food and used
  • the food may further include a food pharmaceutically acceptable food supplement additive together with the encapsulated probiotics prepared by the method of the present invention, and may be used together with other foods or food ingredients, and according to a conventional method can be used appropriately.
  • the mixed amount of the active ingredient may be suitably determined according to the purpose of its use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the food containing the encapsulated probiotics according to the present invention may be used in the form of fermented milk, processed milk, fermented soy sauce, fermented kimchi, and general food, but is not limited thereto,
  • the health functional food containing the encapsulated probiotics according to the present invention is preferably in a form selected from the group consisting of powder, granules, tablets, capsules, beverages, tea, fermented milk, processed milk, soy sauce fermented food, kimchi fermented food, and vitamin complex.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition and a medicament comprising the encapsulated probiotics according to the present invention.
  • the present invention relates to the use of the encapsulated probiotic of the present invention or a composition comprising the same for the manufacture of a pharmaceutical composition and/or a medicament.
  • prevention and treatment of the present invention should be interpreted in the broadest sense, and “prevention” refers to the clinical treatment of a disease in a patient who may be exposed to a disease or susceptible to a disease, but has not yet experienced or revealed symptoms of the disease. It means that one or more of the symptoms do not progress. “Treatment” means any action that arrests or reduces the development of a disease or one or more clinical symptoms thereof.
  • the pharmaceutical composition may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in pharmaceutical compositions in addition to containing the encapsulated probiotics of the present invention as an active ingredient.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxy benzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • a diluent or excipient such as a filler, extender, binder, wetting agent, disintegrant, surfactant, etc. commonly used.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated and used in various forms according to conventional methods.
  • Suitable dosage forms include oral dosage forms such as tablets, pills, powders, granules, dragees, hard or soft capsules, solutions, suspensions or emulsions, injections, and aerosols. This is most preferable.
  • oral pharmaceuticals containing Gilgyeong extract include Yonggaksan.
  • Other formulations include, but are not limited to, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared in a suitable dosage form using a pharmaceutically inert organic or inorganic carrier. That is, when the formulation is a tablet, a coated tablet, a dragee, and a hard capsule, it may contain lactose, sucrose, starch or a derivative thereof, talc, calcium carbonate, gelatin, stearic acid or a salt thereof. In addition, when the formulation is a soft capsule, it may contain vegetable oils, waxes, fats, semi-solid and liquid polyols. In addition, when the formulation is in the form of a solution or syrup, water, polyol, glycerol, and vegetable oil may be included.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include a preservative, a stabilizer, a wetting agent, an emulsifier, a solubilizing agent, a sweetener, a colorant, an osmotic pressure regulator, an antioxidant, and the like, in addition to the carrier described above.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type, severity, and drug activity of the patient. , can be determined according to factors including sensitivity to drug, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to an individual by various routes.
  • the mode of administration may be, for example, oral administration. It may be administered by subcutaneous, intravenous, intramuscular or intrauterine intrathecal or intracerebrovascular injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient, along with several related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient, and the severity of the disease.
  • Pharmaceutical compositions and medicines that can be used for the treatment or prevention of digestive diseases in particular, can exert the effect of improving the functions of the stomach, large intestine and small intestine,
  • the present invention relates to the use of the encapsulated probiotics of the present invention for the prevention or treatment of diseases.
  • the present invention relates to a method for treating a disease comprising administering to a subject the encapsulated probiotics of the present invention.
  • the disease may be characterized as a digestive disease, specifically (i) indigestion, loss of appetite, anorexia, overeating, body weight, stomach bloating due to indigestion, constipation, loose stool, diarrhea and improvement, prevention or treatment of symptoms selected from the group consisting of bloating; (ii) inhibition of intestinal abnormal fermentation and/or (iii) digestion promotion or enhancement of intestinal function, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a cosmetic composition comprising the encapsulated probiotics according to the present invention.
  • the present invention relates to the use of an encapsulated probiotic according to the present invention for the preparation of a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition can be used for various functions and uses according to the efficacy of encapsulated probiotics, for example, for moisturizing the skin, strengthening the skin barrier, soothing the skin, preventing or improving skin damage, or skin It may be used for barrier strengthening, aging prevention or improvement, or skin condition improvement, but is not limited thereto.
  • skin condition improvement includes not only the observed improvement of the skin condition, but also includes factors that directly and indirectly affect skin health, and is used in a comprehensive sense.
  • the cosmetic composition may further include a cosmetically acceptable excipient or carrier, for example, may further include various well-known additives according to the formulation, for example, a carrier, an emulsifier , a moisturizer, a surfactant, a chelating agent, an antioxidant, a bactericide, a stabilizer, and any combination thereof.
  • a cosmetically acceptable excipient or carrier for example, may further include various well-known additives according to the formulation, for example, a carrier, an emulsifier , a moisturizer, a surfactant, a chelating agent, an antioxidant, a bactericide, a stabilizer, and any combination thereof.
  • the carrier is, for example, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tragacanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide, lactose, silica, aluminum Hydroxide, calcium silicate, polyamide powder, water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol, liquid thinner , ethoxylated isostearyl alcohol, suspending agents such as polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tragacanth, aliphatic alcohol sulfates, aliphatic alcohol ethers Sulfate, sulfo
  • the emulsifier may include, for example, liquid paraffin, cetyloltanoate, stearic acid, and the like, but is not limited thereto.
  • the moisturizing agent includes, for example, glycerin, butylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, pentylene glycol, hexylene glycol, polyethylene glycol, sorbitol, and the like, but is not limited thereto.
  • the chelating agent is, for example, ethylenediaminetetrasodium acetate (EDTA), ⁇ -hydroxy fatty acid, lactoferrin, ⁇ -hydroxy acid, citric acid, lactic acid, malic acid, bilirubin, biliverdin ) and the like, but is not limited thereto.
  • EDTA ethylenediaminetetrasodium acetate
  • the antioxidant includes, for example, butylhydroxyanisole, dibutylhydroxytoluene, or propyl gallate, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition may further include one or more active ingredients other than the encapsulated probiotics of the present invention.
  • the cosmetic composition may be prepared and used in a variety of known formulations according to the intended use and usage.
  • the cosmetic composition according to the present invention is a lotion, facial lotion, body lotion, nourishing cream, moisture cream, eye cream, essence, cosmetic ointment, spray, gel, pack, sunscreen, makeup base, foundation, powder, cleansing It may be a cream, cleansing lotion, cleansing oil, cleansing foam, soap or body wash formulation, but is not limited thereto.
  • the skin is scalp or hair, hair tonic, hair conditioner, hair essence, hair lotion, hair nutrition lotion, hair shampoo, hair rinse, hair treatment, hair cream, hair nutrition Cream, Hair Moisture Cream, Hair Massage Cream, Hair Wax, Hair Aerosol, Hair Pack, Hair Nutrient Pack, Hair Soap, Hair Cleansing Foam, Hair Oil, Hair Dryer, Hair Preservative, Hair Dye, Wave Agent, Hair Decolorant, Hair Gel , hair glaze, hair dresser, hair lacquer, hair moisturizer, hair mousse or hair spray formulation, but is not limited thereto.
  • the encapsulated probiotics and additives which are the active ingredients of the cosmetic composition, may be characterized in that they are included in a cosmetically acceptable amount, preferably within the scope of regulations set by each country, for example, in China. It can be included within the range that does not exceed the maximum amount stipulated in the ⁇ Cosmetics Safety and Technical Code ⁇ set by the government.
  • the cosmetic composition may be included in functional cosmetics.
  • the standard of the functional cosmetics may be in accordance with the Korean ⁇ Ministry of Food and Drug Safety Announcement of Functional Cosmetics Standards and Test Methods ⁇ , for example, functions such as whitening, wrinkle improvement, hair color change, UV protection, acne relief, hair loss relief, etc. It may be characterized as having, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition may be included in the cosmetic or general cosmetics defined in "Cosmeceutical or toxic drug content standards, ⁇ " prescribed by the Taiwanese government.
  • Probiotic culture medium (glucose (Daesang) 30 g/L, yeast extract (BioSpringer) 10 g/L, hydrolyzed soy protein (Tatua)) in a 7.5 L jar fermentor with 3 g/L of calcium carbonate added 15 g/L, magnesium sulfate (Kali) 0.1 g/L) 4 L was prepared and sterilized at 121° C. for 25 minutes.
  • Lactobacillus plantarum IDCC 3501 Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC accession number: 13586BP
  • Lactobacillus reuteri IDCC 3701 Lactobacillus reuteri IDCC 3701
  • Enterococcus faecium IDCC 2102 Enterococcus faecium IDCC 2102
  • ⁇ 10 8 CFU/mL was inoculated into the prepared medium and cultured at 37° C. at 150 rpm for 16 hours. The cultured solution was cooled to 20° C. and then centrifuged to collect the cells and freeze-dried.
  • Probiotic culture medium (glucose (Daesang) 30 g/L, yeast extract (BioSpringer) 10 g/L, hydrolyzed soy protein (Tatua)) 15 g/L, magnesium sulfate (Kali) 0.1 g/L) 4 L was prepared and sterilized at 121° C. for 25 minutes.
  • Lactobacillus plantarum IDCC 3501 Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC accession number: 13586BP
  • Lactobacillus reuteri IDCC 3701 Lactobacillus reuteri IDCC 3701
  • Enterococcus faecium IDCC 2102 Enterococcus faecium IDCC 2102
  • ⁇ 10 8 CFU/mL was inoculated into the prepared medium and cultured at 37° C. at 150 rpm for 16 hours.
  • the cultured solution was cooled to 20°C, the cells were centrifuged, and a cryoprotectant (maltodextrin 100 g/L + fructooligosaccharide 50 g/L) was mixed (v/w) with the bacterial solution in the same amount and lyophilized.
  • a cryoprotectant maltodextrin 100 g/L + fructooligosaccharide 50 g/L
  • Probiotic culture medium (glucose (Daesang) 30 g/L, yeast extract (BioSpringer) 10 g/L, water Degraded soy protein (Tatua) 15 g/L and magnesium sulfate (Kali) 0.1 g/L) 4 L were prepared and sterilized at 121° C. for 25 minutes.
  • Lactobacillus plantarum IDCC 3501 Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC accession number: 13586BP
  • Lactobacillus reuteri IDCC 3701 Lactobacillus reuteri IDCC 3701
  • Enterococcus faecium IDCC 2102 Enterococcus faecium IDCC 2102
  • ⁇ 10 8 CFU/mL was inoculated into the prepared medium and cultured at 37° C. at 150 rpm for 16 hours.
  • the cultured solution was cooled to 20 °C and then centrifuged at 6,700 g, 20 °C, for 15 minutes to collect the cells and freeze-dried as it is.
  • Probiotic culture medium glucose (Daesang) 30 g/L, yeast extract (BioSpringer) with 3 g/L of calcium carbonate, 1 g/L of sodium alginate and 5 g/L of corn starch added to a 7.5 L jar fermentor)
  • 10 g/L hydrolyzed soy protein (Tatua) 15 g/L
  • magnesium sulfate (Kali) 0.1 g/L) 4 L were prepared and sterilized at 121°C for 25 minutes.
  • Lactobacillus plantarum IDCC 3501 Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC accession number: 13586BP
  • Lactobacillus reuteri IDCC 3701 Lactobacillus reuteri IDCC 3701
  • Enterococcus faecium IDCC 2102 Enterococcus faecium IDCC 2102
  • ⁇ 10 8 CFU/mL was inoculated into the prepared medium and cultured at 37° C. at 150 rpm for 16 hours. The cultured solution was cooled to 20° C. and then centrifuged to collect the cells and freeze-dried.
  • the freeze-dried raw material was pulverized with a sieve with a mesh size of 425 ⁇ m, weighed, and mixed with maltodextrin half the weight of the raw material.
  • multi-stage dilution with buffer solution Phosphate-citratebuffer, Sigma-Aldrich, P4809 is spread on MRS agar medium, then cultured at 37°C for 24 hours and the resulting colonies are counted. did The freeze-dried viability was expressed as a percentage of the ratio of the total number of viable cells contained in the raw material to the total number of viable cells contained in the culture medium.
  • Example 2 in which the encapsulation agent was treated with the encapsulation enhancer, showed a survival rate of 3.7 times and 1.8 times that of Comparative Example 2 compared to Comparative Example 1 in which the cells were not separately treated.
  • Probiotic capsules are subjected to various conditions of death when processed into various dosage forms, and particularly when compressed into tablets, they are momentarily exposed to high heat and pressure.
  • 0.1 g of the live cell powder for each of the lyophilized strains was suspended in 10 mL of a buffer solution, and then treated by bathing at 60° C. for 1 hour. Then, the survival rate was confirmed.
  • the heat-treated probiotic suspension was diluted in multiple steps and spread on MRS agar medium, then cultured at 37°C for 24 hours and the resulting colonies were counted.
  • Probiotics ingested into the human body are in an environment that makes it difficult to survive until they reach the intestine in a live state. Therefore, in order to confirm the ingestion stability of live probiotics, the survival rate in a solution simulating the gastrointestinal conditions when food was ingested was confirmed.
  • bile (Oxgall, Sigma-Aldrich) was dissolved in distilled water at a concentration of 4 g/L and then corrected to pH 7.4.
  • Add 90 mL of intestinal imitation solution to the above imitation solution-treated suspension incubate for 2 hours at 37°C with 100 rpm agitation, take samples at 1-hour intervals, dilute multi-stage, and then smear on MRS agar medium for 24 hours at 37°C. After incubation for a while, the resulting colonies were counted.
  • Comparative Examples 1 and 2 showed a survival rate of 0.3% and 15.0%, respectively, and Examples 1 and 2 showed a survival rate of 24.9% and 59.8%, respectively.
  • Example 2 exhibited 90% or more acid resistance in the simulated gastric solution, and finally, after 3 hours of treatment, 721 times higher than Comparative Example 1 and 7.2 times higher than Comparative Example 2 survival rate (Table 5).
  • IDCC 3701 and IDCC 2102 strains also exhibited a survival rate of at least 1.6 times and up to 60 times improved in Examples 1 and 2 compared to Comparative Examples 1 and 2 (Table 6).
  • the naturally produced encapsulating agent and encapsulation enhancer can effectively protect the cells in the actual gastrointestinal tract.
  • the probiotic activity gradually decreases due to factors such as temperature, oxygen, and moisture.
  • a physical barrier such as encapsulation, can contribute to improving storage stability by protecting the probiotic cells from these killing factors.
  • it is possible to have protection against oxygen and moisture by applying antioxidants and deoxidizers or moisture-proofing in the raw material mixing and packaging stage the durability of the raw material itself is required for the temperature to which it is exposed. Therefore, dried corn starch was mixed as an excipient in the range of 1 to 10 times to suppress the hygroscopicity of the raw material in each of the freeze-dried probiotic powders, and then individually packaged in an aluminum pouch to suppress contact with oxygen and moisture.
  • the packaged raw materials were stored for 7 days under the harsh conditions of 40°C and 50°C, respectively, and then the short-term viability was checked, and the long-term viability was checked after storing them at 25°C and 30°C for 90 days, respectively.
  • the stock material was diluted in multiple steps with a buffer solution, spread on MRS agar medium, and cultured at 37° C. for 24 hours, and the resulting colonies were counted.
  • Comparative Examples 1 and 2 showed survival rates of 1.1% and 14.7%, respectively, and 40.1% in Examples 1 and 2 at 40 ° C. and a survival rate of 87.2%.
  • Comparative Examples 1 and 2 showed viability of 0.03% and 0.2%, respectively, and Examples 1 and 2 showed viability of 5.4% and 14.3%, respectively.
  • the raw material to which the encapsulation process was applied showed much higher short-term storage stability than Comparative Example 1, in which only the cells were dried without any post-treatment, and Comparative Example 2, which was dried by treatment with a cryoprotectant.
  • Example 1 to which encapsulation was applied it exhibited high stability under harsh conditions more than twice as high in Example 2, which was cultured with the addition of an encapsulation enhancer (see Tables 7 and 8).
  • IDCC 3701 and IDCC 2102 strains also showed significantly higher stability under harsh conditions compared to Comparative Examples, confirming that the freeze-dried formulation of lactic acid bacteria prepared through the natural production technology of the matrix capsule protective film of the present invention has very high storage stability did
  • Comparative Examples 1 and 2 showed survival rates of 1.9% and 17.8%, respectively, and 56.0 in Examples 1 and 2, respectively, at 25 ° C. % and survival rates of 95.7%.
  • Comparative Examples 1 and 2 showed survival rates of 0.09% and 8.3%, respectively, and Examples 1 and 2 showed survival rates of 35.0% and 86.5%, respectively.
  • the storage stability of Comparative Example 1 ⁇ Comparative Example 2 ⁇ Example 1 ⁇ Example 2 was shown, and in particular, Example 2, a preferred embodiment of the present invention, showed high stability of 90% or more at 25 ° C. gave.
  • IDCC 3701 and IDCC 2102 strains also exhibit remarkably high stability under harsh conditions compared to Comparative Examples, so that the freeze-dried formulation of lactic acid bacteria produced through the natural production technology of the matrix capsule protective film of the present invention is not only short-term but also long-term storage of more than 90 days. It was confirmed that it had a remarkably high storage stability (Table 7 and Table 8).
  • Comparative Examples common method for producing calcium alginate raw material
  • Examples used in Experimental Example 2 were prepared as follows.
  • Probiotic culture medium (glucose (Daesang) 30 g/L, yeast extract (BioSpringer) 10 g/L, hydrolyzed soy protein (Tatua)) in a 7.5 L jar fermentor with 3 g/L of calcium carbonate added 15 g/L, magnesium sulfate (Kali) 0.1 g/L) 4 L was prepared and sterilized at 121° C. for 25 minutes.
  • the initial number of viable cells of Lactobacillus plantarum IDCC 3501 Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC accession number: 13586BP was about 1 ⁇ 10 8 CFU/mL. .
  • the culture solution was cooled to 20 °C and then centrifuged to collect 400 mL of the bacterial solution.
  • a suspension of 0.4 g of sodium alginate and 2 g of corn starch added to 10 mL of distilled water is mixed with the broth to homogenize, and then dropwise into 1% calcium chloride aqueous solution to form beads, freeze-dried, and dried raw was collected as is.
  • Probiotic culture medium (glucose (Daesang) 30 g/L, yeast extract (BioSpringer) with 3 g/L of calcium carbonate, 1 g/L of sodium alginate and 5 g/L of corn starch added to a 7.5 L jar fermentor) ) 10 g/L, hydrolyzed soy protein (Tatua) 15 g/L, magnesium sulfate (Kali) 0.1 g/L) 4 L were prepared and sterilized at 121°C for 25 minutes.
  • the initial number of viable cells of Lactobacillus plantarum IDCC 3501 Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC accession number: 13586BP
  • the cultured solution was cooled to 20 °C and then centrifuged to collect the cells and then freeze-dried.
  • freeze-drying viability was evaluated in the same manner as in Experimental Example 1-1.
  • Comparative Examples 1 and 2 were 68.7% and 43.1%, respectively, whereas the Example showed a relatively high freeze-dried survival rate of 84.1%. It was confirmed that generating the encapsulant in the culture step can more effectively serve as a freeze-drying protectant than post-treatment on the cells (Table 9).
  • the survival rate and disintegration rate in the gastrointestinal tract mimic solution were confirmed.
  • the survival rate of the gastrointestinal imitation solution was confirmed in the same manner as in Experimental Example 1-3, and after 2 hours of treatment with the intestinal imitation solution, it was further analyzed with physiological saline (0.9% sodium chloride) as diluted water and alginic acid was used as a citrate-phosphate buffer.
  • physiological saline 0.9% sodium chloride
  • alginic acid was used as a citrate-phosphate buffer.
  • the disintegration rate in the gastrointestinal tract simulated solution was determined through the ratio with the analysis result by completely dissolving the salt.
  • Example 2 had a disintegration rate similar to that of the Example, but the survival rate was relatively lower than that of the Example, and thus the protective ability against the gastrointestinal imitation solution was not sufficient (Tables 11 and 12). Therefore, it was confirmed that the encapsulation method of the present invention exhibits superior disintegration and stability in the actual gastrointestinal tract compared to the existing alginate encapsulation method.
  • Each raw material prepared in the same manner as in Experimental Example 1-4 was packaged, and the packaged raw material was stored for 7 days under severe conditions of 40 ° C and 50 ° C, respectively, and then short-term viability was checked and 90 ° C at 25 ° C and 30 ° C, respectively. After storage for one day, the long-term survival rate was checked.
  • the stock material was diluted in multiple steps with a buffer solution, spread on MRS agar medium, and cultured at 37° C. for 24 hours, and the resulting colonies were counted.
  • Comparative Examples 1 and 2 showed a survival rate of 72.5% and 36.1%, respectively, at 40° C., but the Example showed a relatively high survival rate of 88.1%.
  • Comparative Examples 1 and 2 showed survival rates of 10.2% and 4.3%, respectively, but in Example 15.4%, which was higher than that of Comparative Examples.
  • the raw materials of Examples to which the encapsulation process was applied in the culture step showed high short-term storage stability compared to the raw materials of Comparative Examples to which alginate was applied in the post-treatment step (Table 13).
  • Comparative Examples 1 and 2 showed a survival rate of 76.3% and 49.1%, respectively, at 25° C., whereas the Example showed a relatively high survival rate of 97.2%. At 30° C., Comparative Examples 1 and 2 showed survival rates of 58.2% and 31.0%, respectively, but in Examples, 86.5%, which also showed relatively survival rates. Similar to the short-term storage stability results, the Examples exhibited high long-term storage stability compared to Comparative Examples 1 and 2, and in particular, showed a very high survival rate of 95% or more at 25°C (Table 14).
  • the particle size was compared between the Example in which the natural production of the encapsulant was performed in the culture step and Comparative Example 2 in which the encapsulant was artificially produced in a test tube. After dissolving the bacterial solution obtained in the centrifugation step of the process of Example with physiological saline, it was filtered three times with cellulose filter paper (1004047, Whatman), and the pellet was collected and freeze-dried. The particle size was analyzed using a particle size analyzer (LS-I3-320, Beckman Coulter) by dissolving the encapsulant of the dried Example and Comparative Example 2 in physiological saline, respectively.
  • a particle size analyzer LS-I3-320, Beckman Coulter
  • the average particle size of the encapsulant of Example was 82.45 ⁇ m in Example and 146.09 ⁇ m in Comparative Example 2 ( FIG. 2 ). Therefore, it was confirmed that in the example in which the encapsulant was naturally generated in the culture step, a smaller gap could be filled during cell encapsulation, thereby contributing to the improvement of stability.
  • the encapsulant prepared by the method of the present invention can exert a protective effect from various factors that adversely affect the survival of probiotics by filling the gaps between the cells as very fine particles. Therefore, it was confirmed that when the probiotic strain is encapsulated through the method of the present invention, it has a higher cell protection ability compared to the process generally used for encapsulation of alginate.
  • Lactobacillus plantarum IDCC 3501 Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC accession number: 13586BP was taken SEM pictures of the encapsulation raw material.
  • the dried product to which the encapsulation enhancer is applied has a relatively small surface area compared to that to which only the encapsulation agent is applied, thus forming a structure that is relatively less exposed to the environment that threatens the survival of probiotics ( 3).
  • the probiotic capsule prepared by the encapsulation method of the present invention is structurally very stable.

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Abstract

본 발명은 알긴산 염, 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염, 바람직하게는 불용성 탄산염, 및 선택적으로 캡슐화 증강제를 포함하는 배지에서 프로바이오틱스를 배양하는 간단한 공정만으로도, 알긴산 염 하이드로겔이 자발적으로 형성되고 이에 프로바이오틱스가 포획될 수 있도록 함으로써, 프로바이오틱스의 캡슐화 공정을 획기적으로 개선시킬 수 있을 뿐 아니라, 프로바이오틱스의 동결건조 생존율, 열 저항성, 저장 안정성 및 체내 안정성(내산성, 내담즙성)이 현저하게 개선된 캡슐화 프로바이오틱스의 논스톱 제조 공정에 관한 것이다.

Description

매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통한 유산균의 동결건조 생존율, 열 저항성, 저장 안정성 및 체내 안정성이 향상된 캡슐화 프로바이오틱스의 논스톱 제조 공정
본 발명은 매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통한 캡슐화 프로바이오틱스의 논스톱 제조 공정에 관한 것으로, 더 상세하게는 알긴산 염, 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염 및 선택적으로 캡슐화 증강제를 포함하는 배지에서 프로바이오틱스를 배양하여 자연적으로 생성된 알긴산염 하이드로겔에 프로바이오틱스가 포집되어 있는 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법에 관한 것이다.
프로바이오틱스란 체내에서 건강에 유리한 효과를 주는 살아있는 균을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균들이며 일부 Bacillus 등을 포함하고 있다. 러시아의 과학자 Elie Mechinikoff가 불가리아 사람들이 장수를 누리는 이유가 Lactobacillus로 발효된 발효유의 섭취 때문이라는 것을 밝혀내어 노벨상을 받은 이래로 유산균, 프로바이오틱스의 기능성은 오랫동안 연구되어 오고 있다 (Mercenier A et al., Curr Pharm Des 9(2):175-191, 2003).
프로바이오틱스의 대표적인 효능으로는 항균 활성, 항생제 관련 설사 개선, 유당불내증 경감, 항암 효과, 혈중 콜레스테롤 저하, 위 내 헬리코박터 파이로리 (Helicobacter pylori) 균 억제, 과민성 대장염, 크론병, 궤양성 대장염 경감, 면역 기능 조절 등이 알려져 있다. 프로바이오틱스는 인체 의약품인 정장제나 유산균 제제, 사료첨가제로서의 생균제 및 건강식품의 일종인 유산균 식품으로 구분할 수 있다. 유산균 식품은 유산간균, 유산구균, 비피더스균 등의 생균을 배양하여 식품에 혼합한 것을 안정적이고 섭취가 용이하도록 분말, 과립, 정제, 캡슐 등으로 만든 것으로 유산균 발효식품, 유산균 발효유, 유산균 음료 이외의 것을 말한다.
유산균은 발효에 의해 생장하는 세균 중 발효 결과 유산을 주된 산물로 생산하는 세균들을 의미한다. 유산균은 미생물 산업에서 가장 중요한 비중을 차지하는 미생물군의 하나로, 김치, 요거트, 치즈, 버터밀크, 사우어크라우트(sauerkraut)와 같은 발효식품을 제조하는데 주로 이용되고 건강을 증진시키는 기능성 프로바이오틱스로도 널리 이용된다.
현재 유산균은 12개 속(Lactobacillus, Carnobacterium, Atopobium, Lactococcus, Pediococcus, Tetragenococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus, Enterococcus, Streptococcus, Vagococcus)으로 분류되며 일반적으로 우리가 사용하고 있는 유산균은 간균인 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.), 구균인 락토코커스 속(Lactococcus spp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus spp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc spp.), 그리고 페디오코커스 속(Pediococcus spp.) 균 등이다 (강태진, BioWave, 2009, Vol 11, No 7, pp 1-20).
유산균을 식품으로 제조하는 공정은 크게 유산균 배양, 균체 회수, 동결건조, 분쇄, 제품화 등으로 구분되는데 이 과정에서 유산균은 다양한 물리화학적인 스트레스에 노출된다. 즉, 균체 회수 시에는 농축에 따른 삼투압 영향을 받으며, 동결건조 과정에서는 급격한 온도 변화에 따른 세포질 내 얼음결정이 형성되거나 세포 외부에 생성되는 얼음 결정 및 탈수(dehydration) 현상으로 인하여 온도와 삼투압 영향을 동시에 받게 된다. 또한, 분쇄 및 제품화 과정에서 고온, 고압에 노출되거나 공기 중의 수분에 의하여 수화(hydration)될 경우 유산균의 안정성이 떨어지게 되며, 단기간 보관되는 유산균 발효식품, 유산균 발효유, 유산균 음료와 같은 액상 제품뿐만 아니라 장기 보관을 목적으로 분말 형태로 제조되는 제품에 있어서도 산소에 노출될 경우 세포막을 구성하고 있는 지방산이 산화되어 생존율이 감소하게 되는 문제점이 지적되어 왔다 (한국 등록특허 제10-1605516호 참조)
한편, 유산균을 비롯한 세균들이 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 위산과 담즙산에서 살아남아 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착하여야 하며 장관 내에서 유용한 효과를 나타내어야 하고 독성이 없으며 비병원성이어야 한다. 그러나 위장에서는 pH가 3 이하로 떨어지는 산성 환경에 노출되고 소장에서는 담즙산의 영향을 받아 유산균을 비롯한 다양한 유익균들의 생존율이 크게 감소된다.
따라서 이들 유익균을 동결건조하는 과정에서 안정성을 증진시키고 체내에서 장까지 도달하는 과정에서 유익균의 생존율을 증가시키기 위하여 다양한 세균 캡슐화 방법이 개발되었는데, 예컨대 한국 공개특허 제2003-0009268호에서는 유산균을 배양 완료한 후에 알긴산과 CaCO3를 유산균과 함께 교반하여 마이크로 캡슐 형성용 조성물과 유산균의 혼합물을 준비하고, 미량의 아세트산(CH3COOH)과 CaCl2를 첨가한 응고액에 상기 마이크로 캡슐 형성용 조성물과 유산균 혼합물에 분사하여 경화시키고 CaCl2에 2차 경화시키는 마이크로 캡슐 제조방법을 개시하고 있다.
그러나, 이와 같은 캡슐화 공정은 균체 표면을 완전히 코팅하지 못하여 여전히 균주의 내열성, 내산성 및 내담즙성이 충분히 개선되지 못하고, 통상의 방법으로 배양된 균체를 회수한 다음 코팅제 조성물을 혼합하여 교반하는 다단계 공정을 수행하여야 하기 때문에 생균제로서 무균 조작이 어렵다는 문제점이 있으며, 특히 산업적인 대량 생산에 있어 경제성이 떨어진다는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 종래 프로바이오틱스 캡슐화 공정에 비해 프로바이오틱스의 체내 안정성이 개선되고 공정이 단순화된 새로운 캡슐화 공정 개발을 위해 예의 노력한 결과, 프로바이오틱스의 배양 생산시 배지에 알긴산 염과 탄산염을 일정 농도로 첨가하여 배양하는 경우 프로바이오틱스의 동결건조 생존율, 열저항성(내열성)및 체내 안정성(내산성 및 내담즙성)이 현저히 향상되고 단기 및 장기 보관 안정성이 현저히 개선될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
선행기술문헌
특허문헌
(특허문헌 1) 한국 등록특허 제10-1605516호
(특허문헌 2) 한국 공개특허 제2003-0009268호
비특허문헌
(비특허문헌 1) 강태진, BioWave, 2009, Vol 11, No 7, pp 1-20
(비특허문헌 2) Mercenier A et al., Curr Pharm Des 9(2):175-191, 2003
발명의 요약
본 발명의 목적은, 기존의 캡슐화 프로바이오틱스의 제조공정에 비해 현저히 간단한 공정을 수행하는 매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통하여 유산균의 동결건조 생존율, 열 저항성, 저장 안정성 및 체내 안정성이 향상된 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 캡슐화 프로바이오틱스의 용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 알긴산염 하이드로겔에 프로바이오틱스가 포집되어 있는 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법을 제공한다:
(a) 프로바이오틱스를 알긴산 염 및 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염을 함유하는 배지에서 배양하여 알긴산 염-하이드로겔을 자발적으로 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 자발적으로 생성된 알긴산 염-하이드로겔에 의해 캡슐화된 프로바이오틱스를 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 제조방법으로 제조된 캡슐화 프로바이오틱스 및 이를 포함하는 조성물, 식품, 건강기능식품, 화장품 및 의약품을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스의 조성물, 식품, 건강기능식품, 화장품 및/또는 의약품의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스의 질병의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스를 투여하는 것을 특징으로 하는 질병의 완화, 예방 또는 치료방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시양태에 따른 캡슐화 프로바이오틱스의 제조공정을 나타낸다.
도 2는 기존의 알긴산염 캡슐화 방법 및 본 발명의 캡슐화 방법으로 제조된 프로바이오틱스 캡슐의 입자크기를 나타낸 것이다.
도 3은 캡슐화를 적용하지 않은 균체 건조물(A) 캡슐화제(알긴산염)만 적용한 건조물(B)과 캡슐화제(알긴산염)와 캡슐화 증강제(전분)를 모두 적용한 건조물(C)의 SEM 촬영 사진이다(스케일바 1 μm).
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 프로바이오틱스 배양 과정에서 배지에 알긴산 염과 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염을 함께 첨가하면, 프로바이오틱스가 증식하며 생성되는 산의 작용으로 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염으로부터 2가 양이온이 유리되어 배지 내의 알긴산과 결합함으로써 알긴산-2가 양이온 하이드로겔이 자발적으로 생성되며, 이후 자발적으로 생성된 알긴산-2가 양이온 하이드로겔을 균체와 함께 회수하는 단계를 거쳐, 기존의 공정에 비해 월등히 간단한 공정으로 프로바이오틱스가 포획(encapsulation)된 캡슐을 생산할 수 있음을 확인하였다.
예를 들어 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염으로 탄산칼슘을 사용할 경우, 프로바이오틱스 배양 과정에서 생성된 산에 의해 탄산칼슘으로부터 칼슘이 유리되고, 유리된 칼슘이 알긴산염과 결합하여 자발적으로 칼슘-알긴산 염 하이드로겔을 형성하게 된다.
이에 따라 본 발명은 다음 단계를 포함하는 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 알긴산 염 및 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염을 함유하는 배지에서 프로바이오틱스를 배양하여 알긴산 염-하이드로겔을 자발적으로 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 자발적으로 생성된 알긴산 염-하이드로겔에 의해 캡슐화된 프로바이오틱스를 회수하는 단계.
본 발명의 용어, “캡슐화”란 캡슐화제로 원료물질을 코팅하거나, 캡슐화제의 내부에 원료 물질을 포집시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 캡슐화제로 구성된 캡슐 껍질 내부에 프로바이오틱스가 존재하는 레저부아타입(Reservoir type) 또는 캡슐화제로 구성된 매트릭스 내부에 프로바이오틱스가 포집되는 매트릭스 타입(Matrix type)의 캡슐화가 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(Zuidam and Nedovic, (2010) Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and Food Processing, Springer). 본 발명에 있어서, 상기 캡슐화에 의해 프로바이오틱스를 안정화하거나, 외부환경, 체내 환경으로부터 보호할 수 있다.
본 발명의 용어, ‘캡슐화 프로바이오틱스’는 탄수화물, 시럽, 검, 하이드로겔 등과 같은 다양한 캡슐화제에 의해 코팅되거나 매트릭스 내부에 포집되어 있는 형태의 프로바이오틱스를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 캡슐화 프로바이오틱스는 ‘프로바이오틱스 캡슐’과 동일한 의미에서 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캡슐화 프로바이오틱스는 캡슐화제로 구성된 캡슐 껍질 내부에 프로바이오틱스가 존재하는 레저부아타입(Reservoir type) 또는 캡슐화제로 구성된 매트릭스 내부에 프로바이오틱스가 포집되는 매트릭스 타입(Matrix type)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 캡슐화 프로바이오틱스는 알긴산 염 하이드로겔에 의해 프로바이오틱스가 포집되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “포집”은 본 발명의 알긴산 염 하이드로겔의 구조가 포함하는 공간 또는 기공(pore)에 프로바이오틱스가 포획되어 있는 것을 의미한다. 상기 공간 또는 기공에는 프로바이오틱스와 함께, 배지, 물, 영양소 등의 배양 조성물이 함께 포획될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 알긴산 염은 물에 대한 용해도가 0.1 g/L이상인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1 g/L 내지 10 g/L일 수 있으며, 알긴산 나트륨, 알긴산 칼륨, 알긴산 마그네슘, 알긴산 칼슘, 알긴산 리튬 및 알긴산 암모늄으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 모든 알긴산 염이라면 제한없이 사용 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 포함되는 알긴산 염의 함량은 0.1 내지 40 g/L, 바람직하게는 0.2 내지 15 g/L, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 2 g/L, 가장 바람직하게는 0.8 내지 1.2 g/L일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명에 따른 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염은 물에 대한 용해도가 0.1 g/L 이하, 바람직하게는 0.00001 g/L 내지 0.1 g/L인 2가 양이온의 염일 수 있으며, 바람직하게는 2가 양이온을 포함하는 염기성 염일 수 있다. 예컨대, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염은 2가 양이온을 포함하는 탄산염 또는 질산염일 수 있다.
예를 들어, 상기 2가 양이온을 포함하는 탄산염으로는 탄산칼슘, 탄산바륨, 탄산망간, 탄산구리, 탄산아연, 탄산납, 탄산카드뮴, 탄산코발트, 탄산니켈, 및 탄산스트론튬으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예를 들어, 상기 2가 양이온을 포함하는 질산염으로는 질산칼슘, 질산바륨, 질산망간, 질산구리, 질산아연, 질산납, 질산카드뮴, 질산코발트, 질산니켈 및 질산스트론튬으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염의 함량은 0.5 내지10 g/L, 바람직하게는 1 내지 9 g/L, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 8 g/L, 가장 바람직하게는 2 내지 7 g/L일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염은 프로바이오틱스의 배양으로 발생하는 산에 의해 양이온이 해리되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로바이오틱스의 배양으로 발생하는 산은 프로바이오틱스의 대사과정에서 생산되는 유기산을 의미한다. 예를 들어 상기 프로바이오틱스의 배양으로 발생하는 산은 젖산, 아세트산, 시트르산, 말산, 숙신산 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 프로바이오틱스의 배양으로 발생하는 산에 의해 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염으로부터 양이온이 해리되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염으로부터 해리된 양이온과 알긴산이 결합하여 알긴산 염-하이드로겔이 생성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 배양에 의해 프로바이오틱스가 증식되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 자발적으로 생성된 알긴산 염-하이드로겔 내부에 배양된 프로바이오틱스의 전부 또는 일부가 포집되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 배지는 캡슐화 증강제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 캡슐화 증강제는 알긴산 염 하이드로겔 캡슐의 견고함을 향상시키기 위한 것으로, 불용성인 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어, 상기 캡슐화 증강제로는 전분, 결정 셀룰로오스, 키토산, 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 탈지분유로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 캡슐화 증강제로 전분을 예로 들어 설명하면, 전분이 배지에 추가로 포함되는 경우, 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염이 결합하여 생성된 하이드로겔과 전분이 프로바이오틱스와 함께 혼합되어, 더욱 견고한 구조의 프로바이오틱스 캡슐을 생산할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 캡슐화 증강제는 배지 내에 1 내지 20 g/L, 바람직하게는 2 내지 10 g/L, 더욱 바람직하게는 3 내지 5 g/L, 가장 바람직하게는 5 g/L로 배지에 함유되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 동결보호제를 처리하지 않고 본 발명의 캡슐화 방법으로 제조된 프로바이오틱스 캡슐이 탄산칼슘 및 동결보호제를 처리하여 제조된 제형보다 현저히 뛰어난 동결건조 생존율, 열 저항성, 위장관 모사 용액 생존율, 및 장기/단기 보관안정성을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 배지는 기존의 배지와 같이 동결보호제를 포함할 수 있으나, 동결보호제의 처리 없이도 뛰어난 동결건조 생존율, 열 저항성, 위장관 모사 용액 생존율, 및 장기/단기 보관안정성을 나타내는 바, 보다 바람직하게는 동결보호제를 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 프로바이오틱스를 배양하는 과정에서 프로바이오틱스에 의해 분비되는 산에 의해 2가 양이온 염, 예를 들어 탄산 칼슘이 칼슘 이온으로 해리되는 과정에서 배양액의 pH가 지나치게 감소하는 것을 억제하여, 배양 단계에서 추가의 pH 조정 단계가 없어도 프로바이오틱스 배양이 원활하게 진행되는 것을 확인하였다.
이에 따라 본 발명에 있어서, 알긴산 염 및 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염을 함유하는 배지에서 프로바이오틱스를 배양함에 있어, 추가적인 pH 조절 단계 또는 공정을 포함하지 않거나, 기존의 배양 공정에 비해 최소화된 pH 조절 단계 또는 고정을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
해당 공정에서, 프로바이오틱스 균주의 접종 농도와 배양시간은 균주에 따라 적절히 변형실시가 가능함은 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 이 경우, 접종 후 균주 초기농도는 1×104 ~ 5×109 CFU/mL, 바람직하게는 5×105 ~ 4×108 CFU/mL일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 한편, 프로바이오틱스 균주의 배양시간은 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염, 예컨대 탄산염이 충분히 해리될 수 있도록 4시간 이상이 바람직하고, 6시간 이상이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 자발적으로 생성된 알긴산 염-하이드로겔 및 배양된 프로바이오틱스를 전부 또는 일부 회수하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 회수되는 캡슐화 프로바이오틱스는 (a) 단계에서 자발적으로 생성된 알긴산염 하이드로겔에 자연히 포집된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 회수 과정에서 (a) 단계에서 자발적으로 생성된 알긴산염 하이드로겔에 포집되지 않은 일부 프로바이오틱스가 알긴산염 하이드로겔에 추가로 포집되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 (a) 단계의 배지에 캡슐화 증강제가 추가로 포함되는 경우, 알긴산 염-하이드로겔, 캡슐화 증강제 및 프로바이오틱스를 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 (a) 단계의 배양물을 냉각하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 냉각은 배양온도 이하, 바람직하게는 37℃ 이하 더욱 바람직하게는 약 20℃ 이하에서 냉각되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 약 20℃에서 배양물을 냉각하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 원심분리를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 생성된 알긴산 염-하이드로겔 및 프로바이오틱스를 동시에 회수하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 회수와 동시에 또는 회수 전에 (a) 단계의 배양액을 교반 또는 혼합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 균체를 회수하는 탱크에 교반시설을 함께 구비하여 상기 알긴산 염-하이드로겔 및 프로바이오틱스, 또는 알긴산 염-하이드로겔, 캡슐화 증강제 및 프로바이오틱스가 회수되는 동시에 혼합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혼합에 의해 (a) 단계에서 생성된 알긴산 염-하이드로겔에 자연적으로 포집되지 않은 일부 프로바이오틱스가 추가로 포집되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, (c) 상기 회수된 캡슐화 프로바이오틱스를 동결건조시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, (c) 회수된 캡슐화 프로바이오틱스를 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는 경우, (c) 단계에서도 동결건조기에 상기 회수된 물질을 분주하는 과정에서 교반을 수반할 수 있으며, 자연스럽게 혼합이 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계 이후, (c) 단계 이전에 별도의 교반 또는 혼합 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉 알긴산 염-하이드로겔과 프로바이오틱스는 회수와 동시에 혼합이 이루어질 수도 있고, 회수 이후에 추가적으로 혼합이 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.) 및 웨이셀라 속(Weissella sp.) 균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 본 발명의 기술적 특징이, 인간을 포함한 동물이 섭취 시 이로운 유익균의 생산 공정, 유통 과정 및 체내 안정성을 향상시키기 위한 방안으로 상기 균주의 배양 공정에서 우수한 알긴산 염 하이드로겔 코팅이 가능함을 규명함에 있는 바, 상기 기재된 균 이외의 유익균에도 본 발명이 적용 가능함은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 예를 들어 하기 표 1에 개시된 균주 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
Figure PCTKR2021019274-appb-img-000001
본 발명의 명세서에서 사용된 균주의 속명 또는 종명은 Zheng et al. (Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020; 70)에 의해 재정립된 속명(genus name)에 의해 다르게 명칭될 수 있으며, 통상의 기술자는 해당 문헌의 기재를 통해 쉽게 균주의 속/종을 이해할 수 있다.
한편, 본 발명에서는, 프로바이오틱스 캡슐화 방법에 있어서 프로바이오틱스 배양이 완료된 후 별도의 캡슐화 단계를 도입하는 종래 기술에 비하여, 상술한 바와 같이 공정이 간소화되어 생산 경제면에서 유리할 뿐만 아니라 별도의 캡슐화 단계를 도입하여 야기될 수 있는 오염의 염려나 품질 관리에서의 편의성이 증진될 수 있고, 생산된 프로바이오틱스의 동결건조 후 생존율, 열 안정성, 저장 안정성 및 체내 안정성이 종래 기술에 의해 생산된 프로바이오틱스 캡슐에 비해 현저히 향상됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법에 의해 제조된 캡슐화 프로바이오틱스에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 ‘캡슐화’ 및 ‘캡슐화 프로바이오틱스'는 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법에서 설명된 것과 동일하게 이해될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캡슐화 프로바이오틱스는 캡슐화제로 구성된 캡슐 껍질 내부에 프로바이오틱스가 존재하는 레저부아타입(Reservoir type) 또는 캡슐화제로 구성된 매트릭스 내부에 프로바이오틱스가 포집되는 매트릭스 타입(Matrix type)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 매트릭스 타입인 것을 특징으로 할 수 있으나(Zuidam and Nedovic, (2010) Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and Food Processing, Springer), 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 캡슐화 프로바이오틱스는 알긴산 염 하이드로겔에 의해 프로바이오틱스가 포집되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캡슐화 프로바이오틱스는 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 음료, 기능성 식품, 일반식품, 의약품, 화장품 등에 포함되는 원료, 바람직하게는 기능성 원료로 활용될 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여용 건강기능식품의 유효성분으로 활용될 수 있다.
이에 따라 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 조성물과, 이를 포함하는 식품, 건강기능 식품 및 의약품에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스 또는 이를 포함하는 조성물의 식품 및/또는 건강기능식품의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 및 건강식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있으며, 본 발명에 따른 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태일 수 있다.
상기 건강식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강 유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.
상기 식품조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 본 발명의 방법으로 제조된 캡슐화 프로바이오틱스와 함께 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 식품은 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품 및 일반적인 식품의 형태로 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며,
또한 본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 음료, 차, 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품 및 비타민 복합제로 구성된 군에서 선택된 형태인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 약학적 조성물 및 의약품에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스 또는 이를 포함하는 조성물의 약학적 조성물 및/또는 의약품의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "예방" 및 "치료"는 최광의의 개념으로 해석되어야 하며, "예방"이란, 질환에 노출되거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있으나 질환의 증상을 아직 경험하거나 드러내지 아니한 환자에게서 질환의 임상적 증상 중 하나 이상이 진행되지 아니하도록 하는 것을 의미한다. "치료"란, 질환 또는 이의 하나 이상의 임상적 증상의 발달을 저지 또는 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학 조성물은 유효성분인 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스를 함유하는 것 이외에 통상적으로 약학 조성물에 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비제한적으로 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형이 바람직하며 이 중에서도, 과립, 분말 펠렛의 제형이 가장 바람직하다. 길경 추출물을 포함하는 경구형 의약품의 예로 용각산 등이 있다. 이외의 제형으로, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들면, 경구 복용될 수 있다. 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 약학적 조성물 및 의약품은 소화기 질환의 치료 또는 예방 용도로 사용될 수 있으며, 특히 위장, 대장 및 소장의 기능을 개선하는 효과를 발휘할 수 있고,
구체적으로는 (i) 소화불량, 식욕감퇴, 식욕부진, 과식, 체함, 소화불량으로 인한 위부팽만감, 변비, 묽은 변, 설사 및 복부팽만감으로 구성된 군에서 선택되는 증상의 개선, 예방 또는 치료; (ii) 장내이상발효의 억제 및/또는 (iii) 소화 촉진 또는 정장작용의 강화 용도로 사용될 수 있지만, 이에 한정되지는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스의 질병의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 질병의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 질병은 소화기 질환인 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로는 (i) 소화불량, 식욕감퇴, 식욕부진, 과식, 체함, 소화불량으로 인한 위부팽만감, 변비, 묽은 변, 설사 및 복부팽만감으로 구성된 군에서 선택되는 증상의 개선, 예방 또는 치료; (ii) 장내이상발효의 억제 및/또는 (iii) 소화 촉진 또는 정장작용의 강화방법에 사용될 수 있지만, 이에 한정되지는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 본 발명에 따른 캡슐화 프로바이오틱스의 화장료 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 캡슐화 프로바이오틱스가 갖는 효능에 따라, 다양한 기능 및 용도로 사용될 수 있으며, 예를 들어 피부 보습용, 피부 장벽 강화용, 피부 진정, 피부 손상 예방 또는 개선용, 또는 피부장벽 강화용, 노화 예방 또는 개선용, 또는 피부 상태 개선용 등으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 피부 상태 개선은 관찰되는 피부 상태의 개선을 포함할 뿐만 아니라, 피부 건강에 직접 및 간접적으로 영향을 주는 요소를 포함하는 포괄적 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있으며, 예를 들어, 제형에 따라 각종 공지의 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 담체, 유화제, 보습제, 계면활성제, 킬레이팅제, 산화방지제, 살균제, 안정화제, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 담체는 예를 들어, 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연, 락토오스, 실리카, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트, 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세라이드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 리놀린 유도체, 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 유화제는 예를 들어, 유동 파라핀, 세틸올타노에이트, 스테아린산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 보습제는 예를 들어, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 솔비톨 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 킬레이팅제는 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산나트륨(EDTA), α-하이드록시 지방산, 락토페린, α-하이드록시산, 시트르산, 락트산, 말산, 빌리루빈, 빌리버딘(biliverdin) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 산화 방지제는 예를 들어, 부틸히드록시아니솔, 디부틸히드록시톨루엔 또는 프로필 갈레이트 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스 외의 1종 이상의 유효성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 사용 용도 및 용법에 따라 공지된 다양한 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장수, 훼이셜 로션, 바디 로션, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일, 클렌징 폼, 비누 또는 바디 워시 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 피부 개선용 화장료 조성물에서, 피부가 두피 또는 모발인 경우, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어 에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처 크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발 건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물의 유효성분인 캡슐화 프로바이오틱스 및 첨가제는 화장품학적으로 허용가능한 용량으로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 각 국가에서 정하는 규제의 범위 내, 예를 들어, 중국 정부에서 정하는 「화장품 안전·기술 규범」에 규정된 최대 사용량을 초과하지 않는 범위 내에서 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 기능성 화장품에 포함될 수 있다. 상기 기능성화장품의 기준은 한국 「식품의약품안전처고시 기능성화장품 기준 및 시험방법」에 따른 것일 수 있으며, 예를 들어 미백, 주름개선, 모발의 색상변화, 자외선 보호, 여드름 완화, 탈모 완화 등의 기능을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 대만 정부에서 정하는 「화장품 의료 혹은 독제약품 함유기준, 化粧品含有醫療或毒劇藥品基準」에 규정된 함약 화장품 또는 일반 화장품에 포함될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 및 비교예
실험예 1. 본 발명의 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법으로 제조된 프로바이오틱스 캡슐의 특성 확인
실험예 1에서 사용된 비교예와 실시예는 표 2와 같다.
Figure PCTKR2021019274-appb-img-000002
비교예 1
7.5 L 자(jar) 발효기(fermentor)에 탄산칼슘 3 g/L를 첨가한 프로바이오틱스 배양 배지 (포도당 (Daesang) 30 g/L, 효모추출물 (BioSpringer) 10 g/L, 가수분해대두단백 (Tatua) 15 g/L, 황산마그네슘 (Kali) 0.1 g/L) 4 L를 제조하여 121℃에서 25분 간 멸균하였다. 락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP), 락토바실러스 루테리 IDCC 3701 (Lactobacillus reuteri IDCC 3701) 또는 엔테로코커스 패슘 IDCC 2102 (Enterococcus faecium IDCC 2102) 균주의 초기 생균수가 약 1 × 108 CFU/mL이 되도록 제조된 배지에 접종하여 37℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 배양 종료액은 20℃로 냉각한 다음 원심분리하여 균체를 수거 후 그대로 동결건조 하였다.
비교예 2
7.5 L 자(jar)발효기(fermentor)에 탄산칼슘 3 g/L를 첨가한 프로바이오틱스 배양 배지 (포도당 (Daesang) 30 g/L, 효모추출물 (BioSpringer) 10 g/L, 가수분해대두단백 (Tatua) 15 g/L, 황산마그네슘 (Kali) 0.1 g/L) 4 L를 제조하여 121℃에서 25분 간 멸균하였다. 락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP), 락토바실러스 루테리 IDCC 3701 (Lactobacillus reuteri IDCC 3701) 또는 엔테로코커스 패슘 IDCC 2102 (Enterococcus faecium IDCC 2102) 균주의 초기 생균수가 약 1 × 108 CFU/mL이 되도록 제조된 배지에 접종하여 37℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 배양 종료액은 20℃로 냉각한 다음 균체를 원심분리하고 동결보호제(말토덱스트린 100 g/L + 프락토올리고당 50 g/L)를 균액과 동량 혼합(v/w)하여 동결건조 하였다.
실시예 1
7.5 L 자(jar) 발효기(fermentor)에 탄산칼슘 3 g/L와 알긴산나트륨 1 g/L 첨가한 프로바이오틱스 배양 배지 (포도당 (Daesang) 30 g/L, 효모추출물 (BioSpringer) 10 g/L, 가수분해대두단백 (Tatua) 15 g/L, 황산마그네슘 (Kali) 0.1 g/L) 4 L를 제조하여 121℃에서 25분 간 멸균하였다. 락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP), 락토바실러스 루테리 IDCC 3701 (Lactobacillus reuteri IDCC 3701) 또는 엔테로코커스 패슘 IDCC 2102 (Enterococcus faecium IDCC 2102) 균주의 초기 생균수가 약 1 × 108 CFU/mL이 되도록 제조된 배지에 접종하여 37℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 배양 종료액은 20℃로 냉각한 다음 6,700g, 20℃, 15분의 조건으로 원심분리하여 균체를 수거 후 그대로 동결건조 하였다.
실시예 2
7.5 L 자(jar) 발효기(fermentor)에 탄산칼슘 3 g/L, 알긴산나트륨 1 g/L 및 옥수수전분 5 g/L 첨가한 프로바이오틱스 배양 배지 (포도당 (Daesang) 30 g/L, 효모추출물 (BioSpringer) 10 g/L, 가수분해대두단백 (Tatua) 15 g/L, 황산마그네슘 (Kali) 0.1 g/L) 4 L를 제조하여 121℃에서 25분 간 멸균하였다. 락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP), 락토바실러스 루테리 IDCC 3701 (Lactobacillus reuteri IDCC 3701) 또는 엔테로코커스 패슘 IDCC 2102 (Enterococcus faecium IDCC 2102) 균주의 초기 생균수가 약 1 × 108 CFU/mL이 되도록 제조된 배지에 접종하여 37℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 배양 종료액은 20℃로 냉각한 다음 원심분리하여 균체를 수거 후 그대로 동결건조 하였다.
실험예 1-1. 동결건조 생존율 평가
동결건조 된 원료는 mesh 크기가 425 μm인 체망으로 분쇄하여 무게를 측정하고 원말 무게의 절반만큼의 말토덱스트린과 혼합하였다. 배양 종료액과 제조 원료의 생균수를 측정하기 위해 완충용액(Phosphate-citratebuffer, Sigma-Aldrich, P4809)으로 다단 희석하여 MRS 한천 배지에 도말한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양하고 생성된 집락을 계수하였다. 동결건조 생존율을 배양액에 포함된 총 생균수에 대한 원료에 포함된 총 생균수의 비율의 백분율로 나타내었다.
각 균주의 동결건조 분말의 생균수를 분석한 결과는 표 3과 같다. IDCC 3501 균주의 배양액 생균수 대비 생존율은 비교예 1과 2에서 각각 23.5%와 48.8% 였던 반면 실시예 1과 2에서는 각각 60.6%와 83.8%로 캡슐화 적용 원료에서 높은 동결건조 생존율을 보였다. 특히 캡슐화제에 캡슐화 증강제를 함께 처리한 실시예 2는 균체를 별도로 처리하지 않은 비교예 1에 비해서는 3.7배, 비교예 2에 비해서는 1.8배의 생존율을 나타내었다.
IDCC 3701 및 IDCC 2102 균주의 동결 건조 분말의 생균수를 분석한 결과에서도, 배양액 대비 동결건조후 생존률이 IDCC 3501 균주에서와 마찬가지로 현저히 향상됨을 확인하였다. 이는 별도의 동결건조 보호제 없이도 자연적으로 생성된 캡슐화제 및 캡슐화 증강제가 동결건조 보호제로서 역할을 효과적으로 발휘할 수 있음을 확인하였다.
Figure PCTKR2021019274-appb-img-000003
실험예 1-2. 열 저항성 (Heat tolerance) 평가
프로바이오틱스 캡슐은 각종 섭취 제형으로 가공될 때 여러 가지 사멸에 처할 수 있는 환경을 겪는데, 특히 정제로 타정 시에는 순간적으로 높은 열과 압력에 노출되게 된다. 균주 생육의 범위를 벗어난 높은 온도에서의 캡슐화에 의한 생균 보호 효과를 확인하기 위하여 상기 동결건조시킨 각각의 균주에 대한 생균 분말 0.1 g을 완충용액 10 mL에 현탁 후 60℃로 중탕하여 1시간 동안 처리한 다음 생존율을 확인하였다. 열처리 프로바이오틱스 현탁액을 다단 희석하여 MRS 한천 배지에 도말한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양하고 생성된 집락을 계수하였으며, 열 저항성 결과는 생균수가 1/10로 감소하는 데까지 걸린 시간(min)인 D값으로 나타내었다. D값은 생균수가 1/10로 감소될 때까지 걸리는 시간을 계산한 값이므로 수치가 클수록 60℃에서 더 높은 열 저항성을 가지고 있다고 할 수 있다. D 값을 비교한 결과, 모든 균주에서 실시예 1과 2에서 비교예 1과 2에 비해 현저히 높은 열 저항성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다 (표 4 참조).
Figure PCTKR2021019274-appb-img-000004
실험예 1-3. 위장관 모사 용액 생존율 (Survival in simulated gastro-intestinal tract)
인체 내로 섭취된 프로바이오틱스는 살아있는 상태로 장에 도달하기까지 여러 생존에 어려움을 주는 환경에 처하게 되며 이는 위산과 십이지장에서 분비되는 담즙산이 대표적이다. 따라서 프로바이오틱스생균의 섭취 안정성을 확인하기 위해 음식물을 섭취했을 때의 위장관 조건을 모사한 용액에서의 생존율을 확인하였다.
위 모사 용액을 제조하기 위해 MRS Broth 55 g/L을 증류수에 용해시킨 후 pH 3.0으로 조정한 다음 121℃에서 15분 간 멸균하여 산성 MRS 배지를 만들었다. 상기 동결건조시킨 각 균주의 생균 분말 0.1 g을 MRS 배지 10 mL에 현탁하여 1시간 동안 37℃에서 100 rpm으로 교반하며 배양하였다. 현탁액 1mL을 취하여 다단 희석한 다음 MRS 한천 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양 후 생성된 집락을 계수하였다.
장 모사 용액을 제조하기 위해 담즙(Oxgall,Sigma-Aldrich)을 증류수에 4g/L의 농도로 용해시킨 다음 pH 7.4로 보정하였다. 상기 위 모사 용액 처리 현탁액에 장 모사 용액을 90 mL 첨가하고 37℃에서 100 rpm으로 교반하며 2시간 동안 배양하며 1시간 간격으로 시료를 취하여 다단 희석한 다음 MRS 한천 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양 후 생성된 집락을 계수하였다.
프로바이오틱스 분말을 위장관 모사 용액에서 처리한 결과, IDCC 3501 균주의 경우 비교예 1과 2가 각각 0.3%와 15.0%의 생존율을, 실시예 1과 2에서는 각각 24.9% 및 59.8%의 생존율을 나타내었다. 특히 실시예 2는 위 모사 용액에서 90% 이상의 내산성을 나타냈으며, 최종적으로 3시간 처리 후에는 비교예 1에 비해 721배, 비교예 2에 비해 7.2배의 높은 생존율을 나타내었다 (표 5).
IDCC 3701 및 IDCC 2102 균주에서 또한 비교예 1 및 2에 비해 실시예 1, 2에서 최소 1.6배에서 최대 60배 향상된 생존율을 나타내었다(표 6).
이는 본 발명의 프로바이오틱스 동결건조 제형에서, 자연적으로 생성된 캡슐화제 및 캡슐화 증강제가 실제 위장관에서 균체를 효과적으로 보호할 수 있음을 의미한다.
Figure PCTKR2021019274-appb-img-000005
Figure PCTKR2021019274-appb-img-000006
실험예 1-4. 보관 안정성 (Shelf stability)
건조된 프로바이오틱스 원료는 유통 및 저장 과정에서 처해지는 온도, 산소, 수분 등의 요인에 의해 생균 활성이 점차 감소된다. 캡슐화와 같은 물리적 장벽은 이러한 사멸 요인들로부터 프로바이오틱스 균체를 보호하여 보관 안정성 향상에 기여할 수 있다. 원료 배합 및 포장 단계에서 항산화제, 탈산소제의 적용이나 방습 처리에 의해 산소와 수분에 대한 보호능을 갖게 할 수는 있지만, 노출되는 온도에 대해서는 원료 자체의 내구성이 필요하다. 따라서 상기 동결건조시킨 각각의 프로바이오틱스 분말에 원료 흡습성을 억제하기 위해 건조된 옥수수 전분을 부형제로서 1배 내지 10배 범위에서 혼합한 다음 산소 및 수분의 접촉을 억제하기 위해 알루미늄 파우치에 개별 포장하였다. 포장된 원료는 40℃, 50℃의 가혹조건에서 각각 7 일 간 보관한 다음 단기 생존율을 확인하고, 25℃, 30℃에서 각각 90일 간 보관한 다음 장기 생존율을 확인하였다. 보관 원료를 완충용액으로 다단 희석하여 MRS 한천 배지에 도말한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양하고 생성된 집락을 계수하였다.
프로바이오틱스 분말을 가혹한 온도 조건에서 7일 간 보관 후 생존율을 확인한 결과, IDCC 3501 균주의 경우 40℃에서는 비교예 1과 2가 각각 1.1%와 14.7%의 생존율을, 실시예 1과 2에서는 각각 40.1% 및 87.2%의 생존율을 나타내었다. 50℃에서는 비교예 1과 2가 각각 0.03%와 0.2%의 생존율을, 실시예 1과 2에서는 각각 5.4% 및 14.3%의 생존율을 나타내었다. 결과적으로 캡슐화 공정을 적용한 원료에서는 아무런 후처리 없이 균체만 건조한 비교예 1과 동결보호제를 처리하여 건조한 비교예 2에 비해 훨씬 높은 단기 보관 안정성을 나타내었다. 또한, 캡슐화를 적용한 실시예 1에 비해 캡슐화 증강제를 함께 첨가하여 배양한 실시예 2에서 2 배 이상의 높은 가혹조건 안정성을 나타내었다 (표 7 및 표 8 참조).
IDCC 3701 및 IDCC 2102 균주 또한 마찬가지로 비교예와 비교하여 현저하게 높은 가혹조건 안정성을 나타내어, 본 발명의 매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통하여 제조된 유산균의 동결건조 제형이 매우 높은 보관 안정성을 가지고 있음을 확인하였다.
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Figure PCTKR2021019274-appb-img-000008
프로바이오틱스 분말을 25℃ 및 30℃에서 90일 보관 후 생존율을 확인한 결과, IDCC 3501 균주의 경우 25℃에서는 비교예 1과 2가 각각 1.9%와 17.8%의 생존율을, 실시예 1과 2에서는 각각 56.0% 및 95.7%의 생존율을 나타내었다. 한편, 30℃에서는 비교예 1과 2가 각각 0.09%와 8.3%의 생존율을, 실시예 1과 2에서는 각각 35.0% 및 86.5%의 생존율을 나타내었다. 가혹조건 결과와 마찬가지로 비교예 1 <비교예 2 < 실시예 1 < 실시예 2 순의 보관 안정성을 나타냈으며, 특히 본 발명의 바람직한 실시 양태인 실시예 2는 25℃에서는 90% 이상의 높은 안정성을 보여주었다.
IDCC 3701 및 IDCC 2102 균주 또한 마찬가지로 비교예와 비교하여 현저하게 높은 가혹조건 안정성을 나타내어, 본 발명의 매트릭스 캡슐 보호막 자연 생성 기술을 통하여 제조된 유산균의 동결건조 제형이 단기간 뿐만 아니라 90일 이상의 장기 보관에서도 현저히 높은 보관 안정성을 가지고 있음을 확인하였다(표 7 및 표 8).
실험예 2. 본 발명의 캡슐화 방법 또는 기존 알긴산염 캡슐화 방법으로 제조된 프로바이오틱스 캡슐의 특성 비교
실험예 2에서 사용된 비교예(통상적 알긴산 칼슘 원료 제조방법)와 실시예는 다음과 같이 준비되었다.
비교예 1
7.5 L 자(jar) 발효기(fermentor)에 탄산칼슘 3 g/L를 첨가한 프로바이오틱스 배양 배지 (포도당 (Daesang) 30 g/L, 효모추출물 (BioSpringer) 10 g/L, 가수분해대두단백 (Tatua) 15 g/L, 황산마그네슘 (Kali) 0.1 g/L) 4 L를 제조하여 121℃에서 25분 간 멸균하였다. 락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP)의 초기 생균수가 약 1 × 108 CFU/mL이 되도록 제조된 배지에 접종하여 37℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 배양 종료액은 20℃로 냉각한 다음 원심분리하여 균액을 400 mL 수거하였다. 수거된 원심분리 균액에 대해, 증류수 10 mL에 알긴산나트륨 0.4 g과 옥수수전분 2 g을 첨가한 현탁액을 균액에 혼합하여 균질화 한 다음 1% 염화칼슘 수용액에 점적하여 비드 형태로 제조하여 동결건조한 뒤 건조원말을 그대로 수거하였다.
비교예 2
비교예 1과 동일한 방법으로 제조된 원심분리 균액에 대해 증류수 100 mL에 알긴산나트륨 0.4 g, 옥수수전분 2 g 및 탄산칼슘 1.2 g을 첨가하고 200 rpm으로 교반하면서 10% 젖산 용액을 pH가 4.00이 될 때까지 초당 0.1 mL 속도로 첨가함으로써 생성된 하이드로겔을 균체에 첨가하여 균질화한 뒤 동결건조하였다. 동결건조된 균체를 크기가 425 μm인 체망으로 분쇄한 다음 각각의 무게를 측정하고 원말 무게의 절반만큼의 말토덱스트린과 혼합하였다.
실시예 1
7.5 L 자(jar) 발효기(fermentor)에 탄산칼슘 3 g/L, 알긴산나트륨 1 g/L 및 옥수수전분 5 g/L 첨가한 프로바이오틱스 배양 배지 (포도당 (Daesang) 30 g/L, 효모추출물 (BioSpringer) 10 g/L, 가수분해대두단백 (Tatua) 15 g/L, 황산마그네슘 (Kali) 0.1 g/L) 4 L를 제조하여 121℃에서 25분 간 멸균하였다. 락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP)의 초기 생균수가 약 1 × 108 CFU/mL이 되도록 제조된 배지에 접종하여 37℃에서 150 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 배양 종료액은 20℃로 냉각한 다음 원심분리하여 균체를 수거 후 그대로 동결건조 하였다.
실험예 2-1. 동결건조 생존율 평가
비교예 및 실시예의 배양 종료액과 제조 원료에서 생균수를 측정하기 위해 실험예 1-1과 동일한 방법으로 동결건조 생존율을 평가하였다.
동결건조 분말의 생균수를 분석하여 배양액 생균수 대비 생존율을 확인한 결과, 비교예 1과 2에서 각각 68.7%와 43.1%였던 반면 실시예에서는 84.1%로 상대적으로 높은 동결건조 생존율을 보였다. 이는 캡슐화제를 배양 단계에서 생성시키는 것이 균체에 후처리 하는 것보다 동결건조 보호제로서 역할을 더 효과적으로 수행할 수 있음을 확인하였다(표 9).
Figure PCTKR2021019274-appb-img-000009
실험예 2-2. 열 저항성 (Heat tolerance) 평가
실험예 1-2와 동일한 방법으로 비교예 및 실시예의 생균 분말의 열 저항성을 평가한 결과, 비교예 1과 2의 D값은 각각 14.8분과 14.2분이었으나 실시예의 D값은 15.7분으로 상대적으로 더 높은 D값을 보였다. 따라서 본 발명의 캡슐화 배양 공정으로 제조된 원료가 현저히 높은 열 저항성을 나타냄을 확인하였다(표 10).
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실험예 2-3: 위장관 모사 용액 생존율 (Survival in simulated gastro-intestinal tract)
제조된 각 원료에 대해 위장관 모사 용액에서의 생존율과 붕해율을 확인하였다. 위장관 모사용액 생존율은 실험예 1-3과 동일한 방법으로 확인하였으며, 장 모사 용액 2시간 처리 후 분석 시 희석수로 생리식염수(0.9% 염화나트륨)로도 추가 분석하여 완충용액(Citrate-phosphate buffer)으로 알긴산염을 완전히 용해시켜 분석한 결과와의 비율을 통해 위장관 모사 용액 내에서의 붕해율을 파악하였다.
실시예와 비교예 1 간의 최종 생존율 차이는 약 2.1%로 유사한 수준이었으나, 붕해율 면에서 실시예가 4배 이상 높은 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 비교예 1과 같이 비드 형태로 캡슐화 한 경우 위장관 모사 용액으로부터 보호하는 능력은 뛰어나지만 실시예와 같이 위장관 내에서 프로바이오틱스가 효과적으로 붕해되어 증식하기는 어렵다는 것을 암시한다. 비교예 2는 붕해율이 실시예와 유사한 수준이긴 하였으나 생존율에서 실시예보다 상대적으로 낮아 위장관 모사 용액에 대한 보호능이 충분하지 않았다(표 11 및 표 12). 따라서, 본 발명의 캡슐화 방법이 기존의 알긴산염 캡슐화 방법에 비해 실제 위장관에서 뛰어난 붕해도와 안정성을 나타냄을 확인하였다.
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Figure PCTKR2021019274-appb-img-000012
실험예 2-4. 보관 안정성 (Shelf stability)
실험예 1-4와 동일한 방법으로 제조된 각 원료를 포장하고, 포장된 원료는 40℃, 50℃의 가혹조건에서 각각 7일 간 보관한 다음 단기 생존율을 확인하고 25℃, 30℃에서 각각 90일 간 보관한 다음 장기 생존율을 확인하였다. 보관 원료를 완충용액으로 다단 희석하여 MRS 한천 배지에 도말한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양하고 생성된 집락을 계수하였다.
프로바이오틱스 분말을 가혹한 온도 조건에서 7일 간 보관 후 생존율을 확인한 결과, 40℃에서는 비교예 1과 2가 각각 72.5%와 36.1%의 생존율을 보였으나 실시예에서는 88.1%로 상대적으로 높은 생존율을 나타냈다. 50℃에서는 비교예 1과 2가 각각 10.2%와 4.3%의 생존율을 보였으나 실시예에서는 15.4%로 비교예 대비 높은 생존율을 나타냈다. 결과적으로 배양 단계에서 캡슐화 공정을 적용한 실시예의 원료에서는 후처리 단계에서 알긴산염을 적용한 비교예 원료들에 비해 높은 단기 보관 안정성을 나타냈다(표 13).
프로바이오틱스 분말의 90일 보관 후 온도 별 생존율을 확인한 결과, 25℃에서는 비교예 1과 2가 각각 76.3%와 49.1%의 생존율을 보였으나 실시예에서는 97.2%로 상대적으로 높은 생존율을 나타냈다. 30℃에서는 비교예 1과 2가 각각 58.2%와 31.0%의 생존율을 보였으나 실시예에서는 86.5%로 역시 상대적으로 생존율을 나타냈다. 단기 보관 안정성 결과와 마찬가지로 실시예는 비교예 1, 2에 비해 높은 장기 보관 안정성을 나타냈으며, 특히 25℃에서는 95% 이상의 매우 높은 생존율을 보여주었다(표 14).
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실험예 2-5. 캡슐화제의 입자 크기 분석
배양 단계에서 캡슐화제 자연 생성을 진행한 실시예와 시험관 상에서 인위적으로 캡슐화제를 생성시킨 비교예 2 간의 입자 크기를 비교하였다. 실시예의 공정의 원심분리 단계에서 얻은 균액을 생리식염수로 풀어준 다음 셀룰로스 여과지(1004047, Whatman)로 3회 필터하고 펠렛 부분을 수거하여 동결건조 하였다. 건조된 실시예와 비교예 2의 캡슐화제를 각각 생리식염수에 풀어 입도 분석기(LS-I3-320, Beckman Coulter)를 사용하여 입자 크기를 분석하였다.
건조된 캡슐화제의 입자 크기를 분석한 결과 실시예에서는 평균 82.45 μm, 비교예 2에서는 평균 146.09 μm로 실시예의 캡슐화제가 세밀한 입자 크기를 보였다(도 2). 따라서 배양 단계에서 캡슐화제를 자연 생성한 실시예에서 균체 캡슐화 시 더 작은 간극을 메울 수 있어 안정성 향상에 기여할 수 있음을 확인하였다.
상기 실험예들의 결과는 알긴산염 비드 형태로 캡슐화 한 비교예 1, 및 실시예와 동일한 원리를 이용하여 알긴산염을 별도로 제조한 다음 균액에 섞어준 비교예 2의 공정보다 알긴산염 캡슐화제를 자연적으로 생성시켜 균액과 혼합시키는 본 발명의 캡슐화제 제조방법이 현저히 뛰어난 동결건조 생존율, 열 저항성, 위장관 모사 용액 생존율, 단기/장기 보관 안정성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히, 본 발명의 방법으로 제조된 캡슐화제는 매우 미세한 입자로서 균체 간의 간극을 메움으로써 프로바이오틱스 생존에 악영향을 주는 각종 인자로부터 보호 효과를 발휘할 수 있음을 확인하였다. 따라서 프로바이오틱스 균주를 본 발명의 방법을 통해 캡슐화할 경우 일반적으로 알긴산염의 캡슐화에 사용되는 공정에 비해 높은 균체 보호능을 갖는다는 것을 확인하였다.
실험예 3. 프로바이오틱스 캡슐의 구조적 특성
락토바실러스 플란타룸 IDCC 3501 (Lactobacillus plantarum IDCC 3501, KCTC 수탁번호: 13586BP)의 캡슐화 원료에 대한 SEM 사진을 촬영하였다. 본 발명의 캡슐화 공정을 적용하지 않은 균체 건조물, 캡슐화제만 적용한 건조물(실험예 1의 실시예 1과 동일), 캡슐화제와 캡슐화 증강제를 모두 적용한 건조물(실험예 1의 실시예 2과 동일)을 FE-SEM (S-4700, Hitachi)을 사용하여 25,000X 배율로 촬영하였다.
캡슐화를 적용하지 않은 균체 건조물(A)에서는 균체 간 간극이 상당히 존재하였지만 캡슐화제만 적용한 건조물(B)과 캡슐화제와 캡슐화 증강제를 모두 적용한 건조물(C)에서는 균체가 캡슐화제에 의해 둘러싸고 간극을 메우고 있음을 확인했다. 또한, 균체 군집이 이루고 있는 3차원 구조의 모습을 볼 때 캡슐화 증강제를 적용한 건조물은 캡슐화제만 적용한 것에 비해 상대적으로 표면적이 적어 프로바이오틱스의 생존을 위협하는 환경에 상대적으로 덜 노출되는 구조를 형성하였다(도 3).
따라서, 본 발명의 캡슐화 방법으로 제조된 프로바이오틱스 캡슐이 구조적으로 매우 안정함을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (23)

  1. 다음 단계를 포함하는 알긴산 염-하이드로겔로 캡슐화 프로바이오틱스의 제조방법:
    (a) 프로바이오틱스를 알긴산 염 및 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염을 함유하는 배지에서 배양하여 프로바이오틱스 증식과 동시에 알긴산 염-하이드로겔을 자발적으로 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 자발적으로 생성된 알긴산 염-하이드로겔에 의해 캡슐화된 프로바이오틱스를 회수하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 캡슐화 프로바이오틱스는 알긴산 염 하이드로겔에 프로바이오틱스가 포집되어 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 캡슐화 프로바이오틱스는 매트릭스 타입(Matrix type)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 프로바이오틱스의 배양으로 발생하는 산에 의해, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염으로부터 양이온이 해리되고,
    상기 해리된 양이온과 알긴산이 결합하여 자발적으로 알긴산 염-하이드로겔이 생성되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 알긴산 염은 물에 대한 용해도가 0.1 g/L 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 알긴산 염은 알긴산 나트륨, 알긴산 칼륨, 알긴산 마그네슘, 알긴산 칼슘, 알긴산 리튬 및 알긴산 암모늄으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염은 물에 대한 용해도가 0.1 g/L 이하인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염은 2가 양이온의 탄산염 또는 질산염인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 탄산염은 탄산칼슘, 탄산바륨, 탄산망간, 탄산구리, 탄산아연, 탄산납, 탄산카드뮴, 탄산코발트, 탄산니켈, 및 탄산스트론튬으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 질산염은 질산칼슘, 질산바륨, 질산망간, 질산구리, 질산아연, 질산납, 질산카드뮴, 질산코발트, 질산니켈 및 질산스트론튬으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 알긴산 염은 0.1 내지 40 g/L, 상기 알긴산과 결합하여 하이드로겔을 형성하는 염은 0.5 내지 10 g/L로 배지에 함유되는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 배지는 캡슐화 증강제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 캡슐화 증강제는 전분, 결정 셀룰로오스, 키토산, 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 탈지분유로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 캡슐화 증강제는 1 내지 20 g/L로 배지에 함유되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.) 및 웨이셀라 속(Weissella sp.) 균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제1항에 있어서,
    (c) 회수된 알긴산 염-하이드로겔로 캡슐화 프로바이오틱스를 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는 캡슐화 프로바이오틱스.
  18. 제17항에 있어서, 알긴산 하이드로겔에 의해 프로바이오틱스가 포집되어 있는 것을 특징으로 하는 캡슐화 프로바이오틱스.
  19. 제17항의 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 식품 또는 건강기능식품.
  20. 제17항의 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 약학적 조성물 또는 의약품.
  21. 제20항에 있어서, 소화기 질환의 치료 또는 예방 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물 또는 의약품.
  22. 제20항에 있어서,
    (i) 소화불량, 식욕감퇴, 식욕부진, 과식, 체함, 소화불량으로 인한 위부팽만감, 변비, 묽은 변, 설사 및 복부팽만감으로 구성된 군에서 선택되는 증상의 개선, 예방 또는 치료;
    (ii) 장내이상발효의억제 및/또는
    (iii) 소화 촉진 또는 정장작용의 강화;
    용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물 또는 의약품.
  23. 제17항의 캡슐화 프로바이오틱스를 포함하는 화장료 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115286119A (zh) * 2022-07-20 2022-11-04 西南科技大学 一种以矿物/生物质为载体用于去除六价铬的微生物强化药剂及其制备方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240046025A (ko) * 2022-09-30 2024-04-08 국립한국해양대학교산학협력단 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스 및 이의 제조방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030009268A (ko) 2002-12-30 2003-01-29 주식회사 퓨전비티 마이크로 캡슐 형성용 조성물 및 그를 이용한 안정성 및견고성이 높은 유산균 함유 마이크로 캡슐의 제조방법
KR101605516B1 (ko) 2015-06-11 2016-03-23 주식회사 종근당바이오 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성을 증가시키는 방법
KR20170072825A (ko) * 2015-12-17 2017-06-27 씨제이제일제당 (주) 장내 생존율이 증대된 유산균의 코팅 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105567669B (zh) * 2016-01-08 2019-01-04 魏永刚 益生菌微胶囊制剂及其制备方法
CN109700781A (zh) * 2019-02-25 2019-05-03 绍兴同创生物科技有限公司 一种靶向肠道的益生菌微胶囊及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030009268A (ko) 2002-12-30 2003-01-29 주식회사 퓨전비티 마이크로 캡슐 형성용 조성물 및 그를 이용한 안정성 및견고성이 높은 유산균 함유 마이크로 캡슐의 제조방법
KR101605516B1 (ko) 2015-06-11 2016-03-23 주식회사 종근당바이오 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성을 증가시키는 방법
KR20170072825A (ko) * 2015-12-17 2017-06-27 씨제이제일제당 (주) 장내 생존율이 증대된 유산균의 코팅 방법

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOEKSUNGUR Y, GUNDUZ M, HARSA S: "Optimization of lactic acid production from whey by casei NRRL B-441 immobilized in chitosan stabilized Ca-alginate beads", JOURNAL OF CHEMICAL TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, WILEY, HOBOKEN, USA, vol. 80, no. 11, 1 November 2005 (2005-11-01), Hoboken, USA, pages 1282 - 1290, XP001548694, ISSN: 0268-2575, DOI: 10.1002/jctb.1326 *
LI YANG; FENG CHAO; LI JING; MU YUZHI; LIU YA; KONG MING; CHENG XIAOJIE; CHEN XIGUANG: "Construction of multilayer alginate hydrogel beads for oral delivery of probiotics cells", INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES, ELSEVIER BV, NL, vol. 105, 1 January 1900 (1900-01-01), NL , pages 924 - 930, XP085237612, ISSN: 0141-8130, DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2017.07.124 *
MERCENIER A. ET AL., CURR. PHARM. DES., vol. 9, no. 2, 2003, pages 175 - 191
NUNAMAKER ELIZABETH A., PURCELL ERIN K., KIPKE DARYL R.: "In vivo stability and biocompatibility of implanted calcium alginate disks", JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH PART A, JOHN WILEY & SONS, US, vol. 83A, no. 4, 15 December 2007 (2007-12-15), US , pages 1128 - 1137, XP055942712, ISSN: 1549-3296, DOI: 10.1002/jbm.a.31275 *
TAEJIN KANG, BIOWAVE, vol. 11, no. 7, 2009, pages 1 - 20
YU W-K, ET AL: "High cell density cultivation of Bifidobacterium longum using a calcium carbonate-alginate beads system", JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, HAN'GUG MI'SAENGMUL SAENGMYEONG GONG HAGHOE,KOREAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, KOREA, vol. 12, no. 3, 1 June 2002 (2002-06-01), Korea, pages 444 - 448, XP009050099, ISSN: 1017-7825 *
ZHENG ET AL., INT. J. SYST. EVOL. MICROBIOL., 2020, pages 70

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115286119A (zh) * 2022-07-20 2022-11-04 西南科技大学 一种以矿物/生物质为载体用于去除六价铬的微生物强化药剂及其制备方法
CN115286119B (zh) * 2022-07-20 2023-09-12 西南科技大学 一种以矿物/生物质为载体用于去除六价铬的微生物强化药剂及其制备方法

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