KR20110007102A

KR20110007102A - 미생물 복합체

Info

Publication number: KR20110007102A
Application number: KR1020107020501A
Authority: KR
Inventors: 요시오 카타쿠라; 시린 타라홈죠; 스테아키 시오야
Original assignee: 메이지 데어리스 코포레이션
Priority date: 2007-12-17
Filing date: 2008-12-17
Publication date: 2011-01-21
Also published as: JPWO2009078438A1; WO2009078438A1; CN102016003A; CN102016003B; JP5693849B2; HK1155200A1

Abstract

미생물에 대하여 유전자 공학적 수법을 이용하지 않고, 간편한 방법으로 미생물을 살아 있는 상태로 장관까지 도달시킨다. 이 때문에, 유산균과 같은 미생물과, 다당류와, 상기 미생물의 표면에 결합하는 능력을 갖는 펩티드 및 상기 다당류에 결합하는 능력을 갖는 펩티드를 연결한 융합 펩티드, 예컨대 펩티도글리칸 가수분해 효소의 펩티도글리칸 결합 도메인과 아밀라아제의 전분 결합 도메인의 융합 단백질로 이루어지는 복합체(응집체)를 형성시킨다. 또한, 바람직하게는, 이 복합체를 아밀로오스나 전분으로 코팅한다.

Description

미생물 복합체{MICROBE COMPLEX}

본 발명은 미생물 복합체, 구체적으로는, 미생물과 다당류 및 상기 미생물과 상기 다당류에 결합 가능한 펩티드로 이루어지는 복합체, 더 상세히 말하면, 미생물과 다당류 및 상기 미생물의 표면에 결합하는 능력을 갖는 펩티드 및 상기 다당류에 결합하는 능력을 갖는 펩티드를 연결한 융합 펩티드로 이루어지는 복합체에 관한 것이다.

최근, 프로바이오틱스에 관한 연구가 활발히 행해지고 있다. 프로바이오틱스란, 일반적으로는 장내 세균 구성(장내 세균총)의 밸런스를 개선함으로써, 숙주에 유익한 작용을 가져오는 살아 있는 미생물이라고 정의되어 있다. 프로바이오틱스가 갖는 기능으로서, 면역 활성화 작용, 변비·설사의 방지, 혈중 콜레스테롤의 저하 작용, 혈압 강하 작용 등이 보고되어 있다. 그리고, 프로바이오틱스의 섭취가 병원(病原) 미생물의 침입을 방지하여, 생활 습관병을 예방하는 것이 기대되고 있다. 현재, 실용되고 있는 대표적인 프로바이오틱스로서 유산균을 들 수 있다. 프로바이오틱스로서 이용되는 미생물에 요구되는 조건으로서, 숙주의 장내 플로라(flora)의 일원인 것, 저렴하고 또한 용이하게 취급할 수 있는 것, 위액이나 담즙산 등에 견뎌 상부 소화관(GIT)을 살아 있는 상태로 통과하여 장내에 도달할 수 있는 것, 증식 부위인 하부 소화관(소장 하부, 대장)에서 증식 가능한 것, 식품 등의 형태로 유효한 균수를 유지할 수 있는 것 등을 들 수 있다.

일본 특허 공표 제2002-511403호 공보에는, 유산균 등의 미생물이 살아 있는 채로 하부 소화관까지 도달 가능한 전분 캡슐이 개시되어 있다. 이 전분 캡슐은, α-아밀라아제 등의 효소에 의한 가수 분해에 의해 내부가 다공질 구조로 된 전분 과립을 미생물로 충전하고, 또한, 그 전분 과립을 아밀로오스에 의해 피복화한 것이다. 이러한 전분 캡슐은, 장기간 실온에서 보존할 수 있음과 아울러, 활성을 유지하면서 장관에까지 도달한다.

일본 특허 공표 제2002-511403호 공보

그러나, 상기 전분 캡슐에서는, 전분에 미생물이 피착하지 않으면, 다공질로 된 전분 입자에 미생물을 받아들이는 것이 곤란하여, 전분의 다공질 구조에 받아들여진 미생물이 새어나올 가능성이 있다. 저pH나 담즙산하에서의 미생물의 생존은 전분과의 결착에 의존하는 것으로 생각되지만, 모든 미생물이 바람직한 전분과의 결착능을 갖고 있는 것도 아니다. 또한, 전분에의 결합능을 부여하기 위해, 미생물에 대하여 유전자 공학적 수법을 이용하는 것도 고려되지만, 소비자의 관심으로부터는 바람직한 방법이 아니다.

본 발명은 상기한 배경 기술을 감안하여 이루어진 것으로, 미생물에 대하여 유전자 공학적 수법을 이용하지 않고, 간편한 방법으로 생균을 장관에까지 도달시킬 수 있는 복합체를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이며, 본 발명의 미생물 복합체는, 미생물과 다당류와 상기 미생물과 상기 다당류에 결합 가능한 펩티드, 예컨대, 미생물과 다당류와 상기 미생물의 펩티도글리칸과 상기 전분의 양자에 결합 가능한 펩티드로 구성된다.

본 발명에 따르면, 미생물에 위산이나 담즙산에 대한 내성을 부여하여, 미생물을 살아 있는 상태로 장관까지 도달시킬 수 있다. 또한, 미생물의 종류에 상관없이 복합체를 형성할 수 있다. 또한, 펩티드와 미생물과 다당류를 혼합한다고 하는 매우 간단한 방법에 의해 얻을 수 있다.

도 1은 벡터 pQCPH의 구축을 도시하는 도면이다.
도 2는 벡터 pQCA의 구축을 도시하는 도면이다.
도 3은 벡터 pQCLS의 구축을 도시하는 도면이다.
도 4는 융합 단백질의 발현 카세트의 구조도이다.
도 5는 정제한 융합 단백질 및 전분과 융합 단백질의 결합을 해석한 SDS-PAGE의 결과이다. 레인 1은 니켈 킬레이트 칼럼에 의해 정제한 융합 단백질, 레인 2는 전분과 반응시킨 후의 상등액, 레인 3은 그 대조로서 전분을 제거한 경우를, 레인 4는 이온 교환 수지에 의해, 더 정제한 융합 단백질이며, 레인 M은 분자 사이즈 마커이다.
도 6은 L actobacillus casei 세포와 융합 단백질의 결합을 나타내는 SDS-PAGE의 결과이다. 레인 M은 분자 사이즈 마커(도 5와 동일한 마커임)를, 레인 1은 융합 단백질과 인큐베이트한 세포, 레인 2은 융합 단백질을 첨가하고 있지 않은 세포이다.
도 7은 융합 단백질을 결합시킨 Lb. casei 세포와 전분이 응집체를 형성하고 있는 것을 나타내는 사진이다.
도 8은 인공적인 위의 상태에 있어서의 Lb. casei 세포의 생존율의 경시 변화를 도시하는 그래프이다. △와 ▲는, 각각 pH3.0에서의 세포 단독의 경우와 아밀로오스로 코팅한 복합체의 경우를 나타내고, □와 ■는, 각각 pH2.0에서의 세포 단독의 경우와 아밀로오스로 코팅한 복합체의 경우를 나타내고 있다.

본 발명의 미생물 복합체는, 미생물과 다당류와 상기 미생물과 상기 다당류에 결합 가능한 펩티드로 이루어진다.

본 발명에서 이용되는 다당류는, 1종류 또는 복수 종류의 단당을 구성 단위로 하는 유기 화합물을 가리킨다. 그 종류는 특별히 한정되는 것은 아니며, 예컨대, 전분 외에, 글리코겐, 펙틴, 아밀로오스, 셀룰로오스, 만난, 키틴 등이 예시된다. 이용하는 다당류에서는, 미생물이 장내에 도달했을 때, 미생물이 복합체로부터 해방되도록, 그 분해 효소가 장관에 존재하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 소장의 아밀라아제로 분해되는 전분이나 글리코겐, 펙틴, 아밀로오스가 예시된다. 이들 다당류를 이용하면, 상부 소화관을 통과한 후, 복합체가 소화되어, 미생물이 복합체로부터 해방된다. 또한, 입수의 용이성을 고려하면 전분이 바람직하게 이용된다.

전분의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니며, 천연물 유래에 의한 전분 뿐만 아니라, 천연 전분을 화학적으로 처리하여, 화학 수식을 행한 화학 수식 다당류 전분의 어떠한 것이어도 된다. 본 발명의 복합체는, 식품이나 의약의 형태로서 섭취되는 것이기 때문에, 바람직하게는 천연의 전분이 이용된다.

천연의 전분으로서는, 옥수수 전분, 감자 전분, 고구마 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 타피오카 전분, 수수 전분 등 각종 식물로부터 얻어지는 전분이 예시되며, 기원이 되는 식물은 한정되지 않는다. 또한, 전분 중에 포함되는 아밀로오스, 아밀로펙틴 함량도 특별히 문제되는 것도 아니며, 고아밀로오스옥수수 전분과 같이 아밀로오스 함량을 높인 전분을 이용해도 된다. 또한, 글리코겐, 펙틴, 아밀로오스에 대해서도, 그 기원은 한정되지 않고, 글리코겐이면 굴 유래의 것을 이용해도 된다. 또한, 본 발명에서는 단일의 다당류 뿐만 아니라, 2종 이상의 다당류를 이용해도 된다.

전분으로서는, 과립형의 것이 바람직하게 이용된다. 과립형의 전분은, 상기한 각종 전분을 물에 현탁하고, 현탁액으로부터 침강 분리함으로써 얻어진다. 그 입자 직경은 특별히 제약을 받는 것은 아니지만, 바람직하게는 정립(整粒)된 것을 이용하는 것이 좋다. 그 입자 직경은 대략 0.1 ㎛∼100 ㎛ 정도이다. 더 바람직하게는 입자 직경이 0.5 ㎛∼5 ㎛ 정도인 전분 입자를 이용하는 것이 바람직하다. 미생물 균체에 비해서 상대적으로 지나치게 작으면 전분 주위에 미생물이 결합할 수 없어진다고 생각된다. 또한, 입자 직경이 미생물의 균체에 비해서 상대적으로 지나치게 크면, 펩티드를 통해 미생물이 결착한 복합체끼리의 응집이 곤란해져, 사멸하는 균체가 많아진다고 생각되며, 어떻든 충분한 내성을 갖는 복합체를 제공할 수 없게 될 우려가 강해진다.

본 발명에서 이용되는 미생물도 특별히 제약되는 것은 아니지만, 프로바이오틱스로서 바람직한 유산균이나 비피더스균이 예시된다. 이 유산균으로서는, 유산간균속, 연쇄 구균속, 락토코커스속, 류코노스톡속, 코리네박테리움속, 엔테로코커스속, 비피도박테리움속, 스트렙토코커스속에 속하는 균, 보다 구체적으로는, Lactobacillus casei 등이 예시된다. 단, 프로바이오틱스로서 이용할 수 있는 미생물 뿐만 아니라, 저pH 환경하에서의 보존에만 한하지 않고, 그 외 살아 있는 상태로 보존할 필요성이 있으면, 이들 미생물을 대상으로 할 수도 있다. 유산균 이외에는, 예컨대, 바실러스속의 미생물, 효모 등이 예시된다.

본 발명에서는, 펩티드를 개재시켜 다당류와 미생물을 결착시키고 있기 때문에, 이 펩티드와의 부착성이 중요해진다. 즉, 본 발명에 따른 융합 펩티드가 다당류와 미생물의 접착제의 역할을 수행한다. 이 펩티드는, 구체적으로는, 미생물에 결합하는 능력을 갖는 펩티드(미생물 부착 펩티드)와, 다당류와 결합 가능한 펩티드(다당류 결합 펩티드)를 융합시킨 것이다. 본 발명에 있어서 미생물 부착 펩티드란, 미생물의 세포의 표면에 존재, 또는 그 일부가 노출되어 존재하는 세포막의 구성 성분, 예컨대, 막 단백질, 세포벽에 국재하는 단백질, 세포벽을 구성하는 펩티도글리칸이나 만난 등을 인식하고, 그것과 결착할 수 있는 펩티드를 의미하며, 대상이 되는 미생물의 표면에 부착할 수 있는 펩티드이면, 어떠한 미생물 부착 펩티드여도 된다. 예컨대, 유산균의 세포벽에 국재하는, 펩티도글리칸 가수 분해 효소(예컨대, "Cell Wall Attachment of a Widely Distributed Peptidoglycan Bindging Domain Is Hindered by Cell Wall Constituents", A. Steen et al., Journal of Biological Chemistry, Vol.278, No.26, 23874-23881(2003) 참조)나 S-layer protein(SlpA)("Surface Display of the Receptor-Binding Region of the Lactobacillus brevis S-Layer Protain in Lactococccus lactis Provides Nonadhesive Lactococci with the Ability To Adhere to Intestinal Epithelial Cells", silja Avall-Jaaslelainen et al., Applied and Environmental Microbiology, Vol.69, No.4, 2230-2236(2003) 참조)을 들 수 있다. 또한, 융합 펩티드에서는, 미생물 부착 펩티드의 전부가 필요해지는 것은 아니며, 적어도 미생물의 세포 표면에 부착할 수 있는 본질적인 부위, 즉, 그 펩티드의 표면 부착에 관여하는 도메인을 갖고 있으면 된다. 이 도메인으로서, 예컨대, 유산균의 세포막을 구성하는 펩티도글리칸에 부착되는 펩티도글리칸 가수 분해 효소의 C-말단에 있는 반복 영역(예컨대, 앞과 동일)이나 SlpA의 N말단 영역이 예시된다. 또, 본 발명에 있어서 펩티드란, 수개의 아미노산이 펩티드 결합한 협의의 펩티드만을 의미하는 것이 아니고, 십수개로부터 수십의 아미노산이 결합한 올리고펩티드 뿐만 아니라, 수백 정도의 아미노산이 결합한 단백질 레벨의 것도 포함하는 넓은 개념으로 이용된다. 즉, 본 발명의 펩티드는, 상기 기능을 발휘할 수 있을 정도의 아미노산이 펩티드 결합한 것이면 된다.

한편, 본 발명에서는, 다당류와의 결착에 의해 미생물을 보호할 필요가 있기 때문에, 융합 펩티드에는 다당류와의 결합을 가능하게 하는 펩티드가 필요해진다. 이 융합 펩티드에는, 미생물 부착 펩티드와 마찬가지로, 다당류와 결합 가능한 펩티드의 전부가 필요해지는 것은 아니며, 적어도 다당류를 인식할 수 있는 도메인이 있으면 된다. 이러한 다당류와 결합 가능한 펩티드로서 예컨대, 셀룰로오스에 결합하는 셀룰로오스 결합 도메인(셀룰라아제류 등), 전분에 결합하는 아밀라아제류의 전분 결합 도메인이 예시된다.

이들 미생물 부착 펩티드와 다당류 결합 펩티드는 임의로 조합할 수 있고, 복합체를 형성시키는 미생물이나 다당류의 종류 등에 따라 여러 가지 조합이 생각된다. 융합 펩티드는 일반적인 유전자 공학적 수법에 의해 얻어진다. 즉, 미생물 부착 펩티드, 바람직하게는 그 표면 부착 도메인과, 다당류에 결합하는 능력을 갖는 펩티드, 바람직하게는 그 다당류 결합 도메인의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 발현 벡터에 편입시키고, 그것을 대장균 등의 적당한 숙주로 발현시킴으로써 얻어진다. 또한, 융합 펩티드는 유전자 공학적 수법을 이용하지 않아도, 상기한 미생물 부착능과 다당류 결합능을 겸비하는 천연의 단백질을 선택하고, 그 전체 또는 그 일부를 이용해도 된다.

본 발명의 복합체는, 얻어진 융합 펩티드와 다당류와 미생물을 혼합하는 것만으로 간단하게 얻을 수 있다. 다당류나 융합 펩티드, 미생물의 농도는 다당류의 입자 직경, 미생물의 종류, 목적으로 하는 복합체에 포함되는 균수 등에 의해 적절하게 조정된다. 그 일례를 들면, 1×10⁹ cfu/㎖의 균체에 대하여, 0.1 mg/㎖∼100mg/㎖, 바람직하게는 2 mg/㎖∼7 mg/㎖의 전분 및 0.01 mg/㎖∼10 mg/㎖의 융합 펩티드를 혼합한다.

복합체의 제작은, 융합 펩티드와 다당류와 미생물을 용액 또는 분산액상(分散液狀)으로 동시에 혼합해도 되지만, 우선 미생물(균체의 표면)에 융합 펩티드를 결합시킨 후에 다당류를 결합시키고, 그리고 융합 펩티드가 결합한 미생물과 다당류의 혼합 비율을 조정함으로써 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다. 이에 따라 미생물과 다당류가 교대로 집합하여, 생균을 받아들인 응집체가 형성될 것으로 기대되기 때문이다. 융합 펩티드와 미생물의 혼합이나 그 후의 전분 용액과의 혼합은 미생물이 생존할 수 있는 온도이면, 어떠한 온도여도 되지만, 결합력이 높아지는 4℃ 정도의 저온에서 행하는 것이 바람직하다.

얻어진 복합체의 응집체는, 그대로 식품이나 의약품으로서 섭취할 수 있는 것 외에, 적절한 부형제를 이용하여 정제나 과립제 등의 임의의 제형으로 가공하거나, 치즈나 요구르트, 청량 음료수 등의 식품 원료로서 이용할 수 있다.

또한, 얻어진 응집체는, 전분, 아밀로오스, 펙틴, 셀룰로오스, 만난, 아밀로오스, 단백질 등, 응집체(응집 입자)를 피복할 수 있는 적당한 1종 또는 2종 이상의 피복 성분에 의해 적절하게 코팅되는 경우도 있다. 이들 중, 피복 성분으로서는, 전분 및 α-아밀로오스가 바람직하다. 전분이나 α-아밀로오스는 위액 중에 있어서 소화를 받기 어려운 한편, 장관에 있어서 용이하게 효소 처리되기 때문에, 응집체로부터 미생물의 방출이 신속하게 행해진다. 코팅은, 예컨대, 얻어진 응집체에 상기 성분의 수용액이나 에탄올 등의 유기 용매에 의한 용액을 스프레이하여 행해진다. 피복 성분의 용액 농도는 적절하게 조정되지만, 바람직하게는 0.1％∼5％ 정도이다. 이 결과, 위액이나 담즙산에 의한 내성이 더 부여된다. 또한, 전분이나 아밀로오스를 물에 현탁해서 높은 온도에서 처리하여, 높은 농도로 용해시킨 용액을 조제하고, 이 속에 응집체를 넣어 저온으로 유지하여, 용해도를 초과한 전분이나 아밀로오스를 응집체의 표면에 침착시킬 수도 있다.

얻어진 복합체는, pH2∼3의 저pH 환경하에서도 생존하며, 내산성이 부여된다. 따라서, 이들 복합체를 식품이나 의약품의 형태로서 섭취함으로써, 미생물이 생균의 상태로 하부 소화관에까지 도달하는 것이 기대된다.

[융합 단백질의 조제]

융합 단백질을 발현시키는 숙주로서, 대장균 Escherichia coli XL1-Blue를 이용하고, 이 대장균을 LB(Luria-Bertani) 배지 또는 LB 한천 배지에서 37℃에서 배양하였다.

(벡터의 구축)

미생물의 표면과 전분에 결합 가능한 융합 펩티드(융합 단백질)를 발현시키기 위해, T5 프로모터를 갖는 벡터 pQE31(Qiagen사)에, Lactococcus lactis IL1403주(Agricultural Research Service Culture Collection, NRRL)의 펩티도글리칸 가수 분해 효소(EMBL: AE006264)의 펩티도글리칸 결합 도메인(CPH)을 코딩하는 유전자와, Streptococcus bovis 148주의 α-아밀라아제의 링커 서열 및 전분 결합 도메인을 코딩하는 유전자를 삽입하였다.

융합 단백질 발현을 위한 벡터는 다음의 3개의 단계에 따라 구축하였다. 우선 Lc. lactis IL1403의 염색체 DNA로부터 CPH 유전자를 pQE31에 내장한 pQCPH를 구축하였다(도 1 참조). 다음으로 그것에 Streptococcus bovis 148주의 α-아밀라아제(EMBL: AB000830)의 링커 서열 및 전분 결합 도메인을 코딩하는 유전자를 편입시킨 pQCA를 구축하였다(도 2 참조). 그리고, pQCA로부터 최종 목적인 융합 단백질을 발현시키기 위한 유전자 카세트(도 4)를 편입시킨 발현 벡터 pQCLS를 구축하였다(도 3 참조).

1. pQCPH의 구축

게놈 정보가 공개되어 있는 Lc. lactis IL1403주의 염색체 DNA를 템플릿으로서, 5'-tgcgcgccatgggtacttctaattccggtggttcaacagc의 염기 서열로 표시되는 cph-F(포워드: 서열 번호 1) 및 5'-gcggatccttatttaatacgaagatattgacc의 염기 서열로 표시되는 cph-R(리버스: 서열 번호 2)을 프라이머로 하는 PCR에 의해, CPH를 코딩하는 DNA 단편을 조제하였다. NcoI와 BamHI로 소화한, 이 단편을, 동일하게 NcoI와 BamHI로 소화한 pQE31(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)에 클로닝하여, pQCPH를 구축하였다.

2. pQCA의 구축

5'-tctctcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcg의 염기 서열로 표시되는 pch-NF(포워드: 서열 번호 3)와 5'-aaggatcccctttaatacgaagatattgaccaattaaaatgg의 염기 서열로 표시되는 cph-NR(리버스: 서열 번호 4)을 프라이머로 하는 PCR에 의해, pQCPH의 T5 프로모터 중에 있는 XhoI사이트로부터 CPH 유전자의 3' 말단까지를 증폭하고, XhoI와 BamHI로 소화하였다. pQE31에 Streptococcus bovis 148주의 α-아밀라아제가 클로닝된 pQEAmy31[도쿄노교다이카쿠 사토 에이이치 박사로부터 제공: Direct Production of Ethanol from Raw Corn Starch via Fermentation by Use of a Novel Surface-engineered Yeast Strain Codisplaying Glucoamylase and α-Amylase, Hasayori Shigechi, Eiichi Satoh et al., Applied and Environmental Microbiology, Vol.70, No.8, 5037-5040 (2004) 참조]을 XhoI와 BamHI로 소화하고, PCR에서 얻은 단편을 연결하였다. 또한 3' 말단측의 프라이머는, CPH 유전자의 종결 개시 코돈이 제거되고, α-아밀라아제 유전자에 BamHI 사이트를 통해 접속했을 때, 프레임이 맞도록 제작하였다.

3. pQCLS의 구축

pQE31Amy를 주형으로 하여, 5'-aaggatccgggccaagctagccaagcagctc의 염기 서열로 표시되는 프라이머 Link-F(포워드: 서열 번호 5)와 5'-gcgccaattatctgggttttgg의 염기 서열로 표시되는 프라이머 Link-R(리버스: 서열 번호 6)을 이용하여, α-아밀라아제의 촉매 도메인과 전분 결합 도메인(이하, SBD) 사이의 링커 서열 부분을 코딩하는 유전자를 PCR에 의해 조제하였다. pQCA를 BamHI와 BstXI로 소화하여 CD 영역과 링커 서열 부분을 코딩하는 유전자를 제거하고, 대신에 pQE31Amy를 주형으로 하여 PCR로 조제한 linker 서열 부분을 코딩하는 단편을 삽입하여, pQCLS를 구축하였다. 융합 단백질을 발현시키기 위한 유전자 카세트의 염기 서열을 서열 번호 7에 표시한다.

pQCLS가 도입된 대장균은, 100 ㎍/㎖의 암피실린 및 15 ㎍/㎖의 테트라사이클린을 가한 LB 배지에서 37℃에서 하룻밤, 배양하고, 원심 분리에 의해 집균하였다. 다음으로, 항생 물질을 포함하는 신선한 상기 LB 배지에 균체를 옮기고, 660nm에서의 탁도(OD₆₆₀)가 0.5가 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 그 후, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드를 1 mM가 되도록 상기 배지에 첨가하여, 융합 단백질의 발현을 유도하였다. 플라스미드의 유지를 위해, 배지에는 최종 농도 400 ㎍/㎖의 암피실린을 첨가하였다. 4시간 이상, 배양한 후, 집균하였다.

[융합 단백질의 정제]

융합 단백질의 N 말단의 히스티딘 태그와 니켈 킬레이트 컬럼[Ni-NTA superflow column (1.5 ㎖), Qiagen사]과의 상호 작용을 이용한, 금속 친화성 크로마토그래피에 의해, 융합 단백질을 정제하였다. 상기 배양 배지 100 ㎖로부터 모은 대장균의 균체를, 결합용 완충액[50 mM NaH₂PO₄(pH8), 300 mM NaCl, 10 mM imidazole]에 현탁하고, 최종 농도가 1 mg/㎖가 되도록 리소자임을 첨가하여, 1시간, 빙상에서 인큐베이트하였다.

세포를 초음파에 의해 파쇄하고, 원심 분리한 상등액을, 상기 결합용 완충액에 의해 평형화한 Ni-NTA 컬럼에 어플라이하였다. 컬럼을 결합용 완충액[50 mM NaH₂PO₄(pH 8), 300 mM NaCl, 20 mM imidazole]으로 세정한 후, 용출용 완충액[250 mM NaH₂PO₄(pH 8), 300 mM NaCl, 20 mM imidazole]으로 흡착한 단백질을 용출하였다. 용출액은 한외 여과에 의해 20 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)으로 치환하고, 20 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)으로 평형화한 음이온 교환 수지 Super Q 5PW에 어플라이하여, 0∼1 M NaCl의 직선 농도 구배에 의해 용출시켰다. 융합 단백질이 포함되는 분획을 모아 한외 여과에 의해 농축하고, 탈염하였다. 정제된 융합 단백질의 순도는 12％ SDS-PAGE를 행하고, Coomasie Brilliant Blue R250으로 염색하여 확인하였다.

(세포 표면과의 부착 분석)

얻어진 융합 단백질과 세포의 부착(결합)을 확인하기 위해 다음 분석을 행하였다. Lactobacillus casei NRRL B-441을, MRS 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에서 37℃에서, OD₆₆₀이 1이 될 때까지 배양하였다. 세포를 원심 분리에 의해 집균하고, OD₆₆₀가 1.5가 되도록, 0.12 mg/㎖의 상기 융합 단백질을 포함하는 MRS 배지에 현탁하며, 37℃에서 2시간, 약하게 진탕하였다. 세포를 0.1 M의 인산나트륨 완충액(pH 7.0)(PB)으로 세정한 후, SDS-PAGE용 완충액[20％(w/v) glycerol, 125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4％ SDS, 5％(v/v) β-mercaptoethanol, 0.01％ bromophenol blue]에 분산시켜, 5분간 자비시켰다. 세포에 결합한 융합 단백질은, 상기와 같은 방법으로써 SDS-PAGE법으로써 검출하였다.

(전분과의 결합 분석)

또한, 얻어진 융합 단백질과 전분의 결합을 확인하기 위해 다음의 분석을 행하였다. Ni-NTA 컬럼에 의해 정제한 융합 단백질 용액(PB 중 0.06 mg/㎖) 200 ㎕를, 등량의 전분 과립 현탁액(PB 중 10 mg/㎖)과 혼합하고, 37℃에서 3시간, 약하게 진탕하였다. 원심 분리한 후, SDS-PACE에 의해 상등액 중 미결합의 융합 단백질을 검출하였다.

[복합체의 형성과 마이크로 캡슐화]

다음으로, 유산균과 융합 단백질과 전분과의 복합체를 형성시켰다. 복합체의 형성은, 우선, 유산균과 융합 단백질을 상기 부착 분석과 동일한 조건으로 부착시키고, 그 후, 전분 현탁액과 혼합하여 전분과 결합시켰다. 즉, MRS 배지에서 OD₆₆₀이 1이 될 때까지 배양한 유산균 배양액의 1.5 ㎖를 원심 분리하고, 얻어진 균체를 0.12 mg/㎖의 융합 단백질을 포함하는 MRS 배지에 현탁하며, 30℃에서 2시간, 인큐베이트하였다. 원심 분리한 후, PB를 첨가하여 현탁하는 조작을 2회, 반복하여 세정하고, 미부착의 융합 단백질을 제거하였다. 그리고, 세포 농도가 1×10⁹ cells/㎖(OD₆₀₀=1)가 되도록 PB에 현탁하였다.

등량의 상기 세포 현탁액과 PB에 분산된 전분 입자 현탁액을 혼합하고, 실온에서 30분간, 약하게 교반한 후 1시간, 방치하였다. 대조로서, 전분을 첨가하지 않는 경우, 및 상기 세포 현탁액을 첨가하지 않는 경우에서도 실험하였다. 복합체의 형성은, 육안과 위상차 현미경에 의한 관찰에 의해 확인하였다. 또한, 전분에의 세포 결합률을, Crittenden 등의 방법[Crittenden, R., et al., Adhesion of bifidobacteria to granular starch and its implications in probiotic technologies. Applied and Environmental Microbiology, Vol.67, No.8, 3469-3475(2001) 참조]에 의해 계측하였다.

아밀로오스에 의한 코팅(마이크로 캡슐화)은, 복합체를 1％의 감자 유래의 아밀로오스 용액(아밀로오스는 시그마사 제조)을 이용하여 행하였다. 즉, 10 mg/㎖의 아밀로오스 현탁액을, 내압 용기에 넣어 180℃에서 1시간, 가열하고, 실온까지 방랭함으로써 아밀로오스를 용해하며, 이 용액의 0.5 ㎖를 복합체와 서서히 혼합하고, 4℃에서 하룻밤, 겔화시킴으로써 행하였다.

[인공 위액중에서의 세포의 생존율의 측정]

펩신을 0.5％의 생리식염수에 3 mg/㎖가 되도록 용해하고, 12 M HCl로 pH를 2.0 또는 3.0으로 조정하여 인공 위액을 조제하였다. 인공 위액은 여과한 후, 멸균하였다. 미생물 복합체(5×10⁷cells)를 1 ㎖의 인공 위액에 혼합하고, 37℃에서 인큐베이트하였다. 일정 시간의 간격으로, 원심 분리에 의해 인공 위액을 제거하고, 복합체를 PB로 세정하며, 생리식염수로 2회, 더 세정하였다. 그리고, 복합체를 30 units/㎖의 α-아밀라아제(Megazyme, Bray, Ireland)를 포함하는 PB에 현탁하고, 40℃에서 20분간, 인큐베이트하여 복합체로부터 세포를 방출시켰다. 생균수는, MRS 한천 배지 상에서 37℃에서 24시간, 배양하여 계측하였다.

[결과 및 고찰]

(융합 단백질의 발현과 그 정제)

대장균의 배양액의 1 L로부터 융합 단백질의 약 0.3 g이 얻어지고, 그 75％는 가용성 분획에 존재하였다. SDS-PAGE로 측정한 분자 사이즈는, 56 kDa로, 이론값과 일치하였다. 또한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제한 시료에는, 56 kDa 이외에도, 71 kDa 및 73 kDa의 단백질도 포함되어 있었다(도 5, 레인 1). 또한, 융합 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 8에 표시한다.

옥수수 유래의 전분과의 결합 실험에서는, 원하는 융합 단백질에 더하여, 이들 2개의 단백질도, 어느 정도, 전분에 결합하였다(도 5, 레인 2). 원하는 융합 단백질만을 얻기 위해, 상기와 같이 음이온 크로마토그래피를 이용하였다(도 5, 레인 4). 음이온 크로마토그래피에 의해 정제한 융합 단백질은, 전분과 결합했기 때문에(도 5, 레인 2), 전분과 결합능을 갖는 활성체인 것을 알 수 있었다. 또한, 도시하지는 않지만, 정제한 융합 단백질은, 옥수수 전분뿐만 아니라, 감자 전분에도 결합하는 것을 확인하였다.

(융합 단백질과 세포의 부착)

Lb. casei NRRL B-441주의 세포를 정제한 융합 단백질과 인큐베이트하고, 그 상청에 잔존하는 융합 단백질을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다(도 6). 융합 단백질은, 세포에 부착되어 있는 것이 확인되고, Crittenden 등의 방법에 따르면, 각 세포에 6×10⁴분자의 융합 단백질이 부착되어 있었다.

(복합체의 형성)

융합 단백질을 부착시킨 세포의 일정량에 대하여, 전분의 농도를 바꿔, 전분과의 결합을 조사하였다. 응집체의 크기를 육안으로 대조와 비교한 결과를 표 1에 나타낸다. 융합 단백질을 결합시키고 있지 않은 세포를 이용한 경우의 응집의 정도는, 전분만을 이용한 대조와 같은 정도였다. 이에 비하여, 세포에 융합 단백질을 부착시킨 세포를 이용한 경우, 전분 농도가 2 mg/㎖에서의 응집의 정도는 대조보다 강해지고, 5 mg/㎖에서는 분명히 대조보다 강해졌다. 이 때의 세포의 전분에의 결합률은, 융합 단백질을 첨가하지 않는 경우는 4.4％인 것에 대하여, 첨가한 경우는 32％였다. 융합 단백질을 첨가한 경우의 유산균과 전분의 응집물의 현미경 사진을 도 7에 도시한다.

(인공 위액 중에서의 세포의 생존율)

Lb. casei NRRL B-441주의 세포를 융합 단백질에 의해 전분과 결합시키고, 또한 아밀로오스로 코팅한 복합체를 인공 위액으로 처리했을 때의 생존율을 표 2 및 도 8에 도시한다. 유리의 세포를 pH2.0과 3.0에서 1시간 처리한 경우의 생존율은, 각각 0.002％와 0.74％인 것에 비하여, 융합 단백질에 의해 전분과 결합시켜 아밀로오스로 코팅한 경우, PH2.0와 3.0에서 1시간 처리한 경우의 생존율은, 각각 6％와 64％로 상승하였다. 또한, 표 2에 나타내는 바와 같이, 아밀로오스에 의한 코팅을 행하지 않는 경우, PH3.0의 인공 위액으로 1시간 처리한 경우의 생존율은 11％였다.

이상과 같이, 융합 단백질을 이용하여 유산균에 전분과의 복합체(응집체)를 형성시키면, 인공 위액에서의 생존율을 현저히 상승시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 표 2에서는, 융합 단백질을 첨가하지 않고도 생존율이 상승하고 있지만, 이것은, 이미 Wang et al.,등이 보고한 바와 같이, 저pH의 환경하에서 전분이 존재하고 있는 것, 및 전분 과립과 혼재하고 있는 것에 의한 것으로 생각된다. 또한, 융합 단백질을 이용하지 않고 전분과의 복합체를 아밀로오스로 코팅한 경우에도, 생존율이 상승하고 있지만, Lb. casei NRRL B-441주가 원래, 어느 정도, 전분 및 아밀로오스에 결합하는 능력을 가지고 있기 때문이라고 생각된다.

본 발명에 따르면, 저PH 환경하에서의 미생물의 생존율을 상승시킬 수 있다. 이 때문에, 저pH 환경하에 있는 상부 소화관을 통과하여, 살아 있는 상태로 하부 소화관에 균체를 보낼 수 있고, 본 발명의 이용이 유산균 등의 프로바이오틱스의 응용 범위를 넓힌다.

Claims

미생물과, 다당류와, 상기 미생물과 상기 다당류에 결합 가능한 펩티드로 이루어지는 것인 미생물 복합체.
미생물과, 다당류와, 상기 미생물의 표면에 결합하는 능력을 갖는 펩티드 및 상기 다당류에 결합하는 능력을 갖는 펩티드를 연결한 융합 펩티드로 이루어지는 것인 미생물 복합체.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물의 표면에 결합하는 능력을 갖는 펩티드가, 펩티도글리칸에 결합하는 능력을 갖는 펩티드인 것인 미생물 복합체.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물의 표면에 결합하는 능력을 갖는 펩티드가, 펩티도글리칸 가수 분해 효소의 펩티도글리칸 결합 도메인인 것인 미생물 복합체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다당류가, 전분, 아밀로오스, 펙틴, 셀룰로오스, 만난, 글리코겐 중 1종 또는 2종 이상인 것인 미생물 복합체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다당류가, 전분, 아밀로오스, 펙틴 중 1종 또는 2종 이상이며, 다당류에 결합하는 펩티드가, 아밀라아제의 전분 결합 도메인을 포함하는 펩티드인 것인 미생물 복합체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 유산균인 것인 미생물 복합체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체가, 다당류 및/또는 단백질의 코팅층을 갖는 것인 미생물 복합체.
제8항에 있어서, 상기 다당류가, 전분, 아밀로오스, 펙틴, 셀룰로오스, 만난, 아밀로오스 중 어느 1종 또는 2종 이상인 것인 미생물 복합체.
미생물의 표면에 결합하는 능력을 갖는 펩티드 및 다당류에 결합하는 능력을 갖는 펩티드를 연결한 것인 융합 펩티드.
제10항에 있어서, 상기 미생물의 표면에 결합하는 능력을 갖는 펩티드가, 펩티도글리칸 가수 분해 효소인 것인 펩티드.
제10항에 있어서, 상기 미생물의 표면에 결합하는 능력을 갖는 펩티드가, 펩티도글리칸 가수 분해 효소의 펩티도글리칸 결합 도메인인 것인 펩티드.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류에 결합하는 능력을 갖는 펩티드가 아밀라아제인 것인 펩티드.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류에 결합하는 능력을 갖는 펩티드가, 아밀라아제의 전분 결합 도메인인 것인 펩티드.