JPWO2009078438A1 - 微生物複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
融合タンパク質を発現させる宿主として、大腸菌Escherichia coli XL1-Blue を用い、この大腸菌をLB(Luria-Bertani)培地又はLB寒天培地にて37℃で培養した。
微生物の表面とデンプンに結合可能な融合ペプチド(融合タンパク質)を発現させるため、T5プロモーターを持つベクターpQE31(Qiagen社)に、Lactococcus lactis IL1403株(Agricultural Research Service Culture Collection、NRRL)のペプチドグリカン加水分解酵素(EMBL:AE006264)のペプチドグリカン結合ドメイン(CPH)をコードする遺伝子と、Streptococcus bovis 148株のα−アミラーゼのリンカー配列およびデンプン結合ドメインをコードする遺伝子を挿入した。
ゲノム情報が公開されているLc. lactis IL1403株の染色体DNAをテンプレートとして、5'-tgcgcgccatgggtacttctaattccggtggttcaacagcの塩基配列で示されるcph-F(フォワード:配列番号1)及び5'-gcggatccttatttaatacgaagatattgaccの塩基配列で示されるcph-R(リバース:配列番号2)をプライマーとするPCRにより、CPHをコードするDNA断片を調製した。NcoIとBamHIで消化した、この断片を、同じくNcoIとBamHI で消化したpQE31(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)にクローニングし、pQCPHを構築した。
5'-tctctcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcgの塩基配列で示されるpch-NF(フォワード:配列番号3)と5'-aaggatcccctttaatacgaagatattgaccaattaaaatggの塩基配列で示されるcph-NR(リバース:配列番号4)をプライマーとするPCRにより、pQCPHのT5プロモーター中にあるXhoIサイトからCPH遺伝子の3´末端までを増幅し、XhoIとBamHIで消化した。pQE31にStreptococcus bovis 148株のα−アミラーゼがクローニングされたpQEAmy31(東京農業大学 佐藤英一博士から提供:Direct Production of Ethanol from Raw Corn Starch via Fermentation by Use of a Novel Surface-engineered Yeast Strain Codisplaying Glucoamylase and α-Amylase, Hasayori Shigechi, Eiichi Satoh et al., Applied and Environmental Microbiology, Vol.70, No.8, 5037-5040 (2004) 参照)をXhoIとBamHIで消化し、PCRで得た断片を連結した。なお、3´末端側のプライマーは、CPH遺伝子の終始コドンが取り除かれ、α−アミラーゼ遺伝子にBamHIサイトを介して接続した時、フレームが合うように作製した。
pQE31Amyを鋳型として、5'-aaggatccgggccaagctagccaagcagctcの塩基配列で示されるプライマーLink-F(フォワード:配列番号5)と5'-gcgccaattatctgggttttggの塩基配列で示されるプライマーLink-R(リバース:配列番号6)を用い、α−アミラーゼの触媒ドメインとデンプン結合ドメイン(以下、SBD)の間のリンカー配列部分をコードする遺伝子をPCRによって調製した。pQCAをBamHIとBstXIで消化してCD領域とリンカー配列部分をコードする遺伝子を除去し、代わりにpQE31Amyを鋳型としてPCRで調製したリンカー配列部分をコードする断片を挿入し、pQCLSを構築した。融合タンパク質を発現させるための遺伝子カセットの塩基配列を配列番号7に示す。
融合タンパク質のN末端のヒスチジンタグとニッケルキレートカラム(Ni-NTA superflow column (1.5ml), Qiagen社)との相互作用を利用した、金属アフィニティクロマトグラフィにより、融合タンパク質を精製した。上記培養培地100mlから集めた大腸菌の菌体を、結合用緩衝液(50mM NaH2PO4(pH8), 300mM NaCl, 10mM imidazole)に懸濁し、終濃度が1mg/mlとなるようにリゾチームを添加して、1時間、氷上でインキュベートした。
得られた融合タンパク質と細胞の付着(結合)を確認すべく次のアッセイを行った。Lactobacillus casei NRRL B-441 を、MRS培地(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)にて37℃で、OD660が1となるまで培養した。細胞を遠心分離により集菌し、OD660が1.5となるよう、0.12mg/mlの前記融合タンパク質を含むMRS培地に懸濁し、37℃で2時間、穏やかに振とうした。細胞を0.1 Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)(PB)で洗浄した後、SDS-PAGE用緩衝液(20%(w/v) glycerol, 125mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 5%(v/v) β-mercaptoethanol, 0.01% bromophenol blue)に分散させ、5分間、煮沸した。細胞に結合した融合タンパク質は、前記と同様の方法にてSDS-PAGE法にて検出した。
また、得られた融合タンパク質とデンプンの結合を確認すべく次のアッセイを行った。Ni-NTAカラムによって精製した融合タンパク質溶液(0.06mg/ml in PB) 200μlを、等量のデンプン顆粒懸濁液(10mg/ml in PB)と混合し、37℃で3時間、穏やかに振とうした。遠心分離した後、SDS-PAGEにより上澄液中の未結合の融合タンパク質を検出した。
次に、乳酸菌と融合タンパク質とデンプンとの複合体を形成させた。複合体の形成は、まず、乳酸菌と融合タンパク質を上記付着アッセイと同じ条件にて付着させ、その後、デンプン懸濁液と混合してデンプンと結合させた。すなわち、MRS培地にてOD660が1となるまで培養した乳酸菌培養液の1.5 mlを遠心分離して、得られた菌体を0.12mg/mlの融合タンパク質を含むMRS培地に懸濁し、30℃で2時間、インキュベートした。遠心分離した後、PBを加えて懸濁する操作を2回、繰り返して洗浄し、未付着の融合タンパク質を除去した。そして、細胞濃度が1×109 cells/ml(OD600=1)となるようにPBに懸濁した。
ペプシンを0.5%の生理食塩水に3mg/mlとなるように溶解し、12M HClでpHを2.0又は3.0に調整して人工胃液を調製した。人工胃液は濾過した後、滅菌した。微生物複合体(5×107cells)を1mlの人工胃液に混合し、37℃でインキュベートした。一定時間の間隔で、遠心分離により人工胃液を除去して、複合体をPBで洗浄し、さらに生理食塩水で2回、洗浄した。そして、複合体を30units/mlのα−アミラーゼ(Megazyme, Bray, Ireland)を含むPBに懸濁し、40℃で20分間、インキュベートして複合体から細胞を放出させた。生菌数は、MRS寒天培地上にて37℃で、24時間、培養して計測した。
(融合タンパク質の発現とその精製)
大腸菌の培養液の1Lから融合タンパク質の約0.3gが得られ、その75%は可溶性画分に存在した。SDS-PAGEで測定した分子サイズは、56kDaであり、理論値と一致した。なお、アフィニティクロマトグラフィにより精製した試料には、56kDa以外にも、71kDaおよび73kDaのタンパク質も含まれていた(図5、レーン1)。また、融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号8に示す。
Lb. casei NRRL B-441株の細胞を精製した融合タンパク質とインキュベートし、その上清に残存する融合タンパク質をSDS-PAGEによって確認した(図6)。融合タンパク質は、細胞に付着していることが確認され、Crittendenらの方法によれば、各細胞に6×104分子の融合タンパク質が付着していた。
融合タンパク質を付着させた細胞の一定量に対し、デンプンの濃度を変えて、デンプンとの結合を調べた。凝集体の大きさを目視で対照と比較した結果を表1に示す。融合タンパク質を結合させていない細胞を用いた場合の凝集の程度は、デンプンのみを用いた対照と同程度であった。これに対して、細胞に融合タンパク質を付着させた細胞を用いた場合、デンプン濃度が2mg/mlでの凝集の程度は対照よりも強くなり、5mg/mlでは明らかに対照よりも強くなった。このときの細胞のデンプンへの結合率は、融合タンパク質を添加しない場合は4.4%であったのに対し、添加した場合は32%であった。融合タンパク質を添加した場合の乳酸菌とデンプンの凝集物の顕微鏡写真を図7に示す。
Lb. casei NRRL B-441株の細胞を融合タンパク質によってデンプンと結合させ、さらにアミロースでコーティングした複合体を人工胃液で処理した時の生存率を表2及び図8に示す。遊離の細胞をpH2.0と3.0で1時間処理した場合の生残率は、それぞれ0.002%と0.74%であったのに対して、融合タンパク質によってデンプンと結合させアミロースでコーティングした場合、pH2.0と3.0で1時間処理した場合の生残率は、それぞれ6%と64%に上昇した。また、表2に示すように、アミロースによるコーティングを行わない場合、pH3.0の人工胃液で1時間処理した場合の生存率は11%であった。
Claims (14)
- 微生物と、多糖類と、前記微生物と前記多糖類に結合可能なペプチドとからなる微生物複合体。
- 微生物と、多糖類と、前記微生物の表面に結合する能力を有するペプチド及び前記多糖類に結合する能力を有するペプチドを連結した融合ペプチドとからなる微生物複合体。
- 微生物の表面に結合する能力を有するペプチドが、ペプチドグリカンに結合する能力を有するペプチドである請求項1又は2の何れか1項に記載の微生物複合体。
- 微生物の表面に結合する能力を有するペプチドが、ペプチドグリカン加水分解酵素のペプチドグリカン結合ドメインである請求項1又は2の何れか1項に記載の微生物複合体。
- 前記多糖類が、デンプン、アミロース、ペクチン、セルロース、マンナン、グリコーゲンの何れか1種又は2種以上である請求項1〜4の何れか1項に記載の微生物複合体。
- 前記多糖類が、デンプン、アミロース、ペクチンの何れか1種又は2種以上であり、多糖類に結合するペプチドが、アミラーゼのデンプン結合ドメインを含むペプチドである請求項1〜4の何れか1項に記載の微生物複合体。
- 前記微生物が、乳酸菌である請求項1〜6の何れか1項に記載の微生物複合体。
- 前記複合体が、多糖類及び/又はタンパク質のコーティング層を有する請求項1〜7の何れか1項に記載の微生物複合体。
- 前記多糖類が、デンプン、アミロース、ペクチン、セルロース、マンナン、アミロースの何れか1種又は2種以上である請求項8に記載の微生物複合体。
- 微生物の表面に結合する能力を有するペプチド及び多糖類に結合する能力を有するペプチドを連結した融合ペプチド。
- 前記微生物の表面に結合する能力を有するペプチドが、ペプチドグリカン加水分解酵素である請求項10に記載のペプチド。
- 前記微生物の表面に結合する能力を有するペプチドが、ペプチドグリカン加水分解酵素のペプチドグリカン結合ドメインである請求項10に記載のペプチド。
- 多糖類に結合する能力を有するペプチドが、アミラーゼである請求項10〜12の何れか1項に記載のペプチド。
- 多糖類に結合する能力を有するペプチドが、アミラーゼのデンプン結合ドメインである請求項10〜12の何れか1項に記載のペプチド。
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