JP5950938B2 - マイクロカプセル化プロバイオティクス物質および製造方法 - Google Patents

マイクロカプセル化プロバイオティクス物質および製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、マイクロカプセル化プロバイオティクス物質に関し、特に、生存プロバイオティクス微生物を含んだ固体粒子と、担体相とを含む乾燥粉末組成物に関し、前述の生存プロバイオティクス微生物が封入され、前述の担体相が、少なくとも栄養源と共に腸溶性組成物を更に含む。
かかるマイクロカプセル化プロバイオティクス物質は、当該分野で既知である。米国特許出願公開第２０１０／０１８９７６７号は、プロバイオティクス物質と、たとえば、ワックス、セラック、難消化性澱粉、ゼインタンパク質、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸フタル酸アミラーゼ(amylase acetate phthalate)、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート(hydroxyl propyl methyl cellulose phthalate)、アクリル酸エチル、およびガラス状マトリックスの形状のメタクリル酸メチルを含む、第１のコーティングと、を少なくとも含む、マイクロカプセル化プロバイオティクス物質を開示する。ここで、ガラス状マトリックスとは、室温で固体であり、硬質の形態を有し、かつ、高い弾性係数および強度を示す、マトリックスをいう。粒子サイズは、少なくとも２０マイクロメートルである。この文献は、細菌と光沢のあるマトリックス(glossy matrix)の他の乾燥成分との重量比が０．５〜３０％の範囲内にあることを更に開示する。
生存能力を有し安定しているプロバイオティクス製剤は、文献米国特許出願公開第２００５／０２６６０６９号に開示されている。これらの製剤は、１以上の生物プロバイオティクス細菌のコア、セルロース賦形剤（たとえば、微結晶性セルロース）と、崩壊剤（グリコール酸ナトリウム澱粉、アルギン酸、澱粉、・・・）および安定剤（グリセロール、アスコルビン酸、・・・）などの１以上の添加剤と、を含む。コアは、非腸溶コーティング（ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、・・・）でコーティングされ、腸溶コーティング（メタクリル酸‐アクリル酸エチル共重合体、酢酸フタル酸セルロース、・・・）で更にコーティングされる。この文献に開示されたコアの径は、１００〜１０００マイクロメートルであり、コアは、１〜１０％の比較的低い割合（コアの全乾燥重量を基準にする重量割合）のプロバイオティクス細菌と、５０〜９０％の微結晶性セルロースと、０．１〜３０％の安定剤と、０．１〜５％の崩壊剤と、を含む。
文献米国特許出願公開第２００５／０１５３０１８号は、少なくとも１００マイクロメートルの大きさを有する粒子、特に、少なくとも０．０２ ｃｍ３の容積を有し、かつ、生存能力を有する微生物を、たとえば、充填剤、ハイドロコロイドなどの多糖バインダー、可塑剤、および栄養成分などの他の成分と組み合わせて含む、圧縮ペレットのプロバイオティクス送達システムに関する。この文献によれば、細菌調製物は、通常全湿重量に対して０．１〜５％で、他の成分と混合される。
最先端技術によるマイクロカプセル化プロバイオティクス物質は、生理学的温度で保存される場合、プロバイオティクス物質の生存能力が数日に制限されるという短所を抱えている。さらに、プロバイオティクス細菌の高い生残率が、これらの先行技術文献に発表されているにもかかわらず、生残プロバイオティクス細菌の数は減少する。プロバイオティクスの消費が、多くの認識された健康上の利益を有することは、研究および消費者の主観的認識により示されている。冷蔵条件下で、プロバイオティクス医薬を製造し、輸送し、保存する必要があり、この一連の冷蔵を中断することは、活性を低下させるだけでなく、一連の冷蔵の輸送および管理に対する巨大なコストをもたらす。本発明の焦点は、保存中の生存能力を増加させることであり、特に、長期安定性および温度安定性に焦点を置いた。
Ｆｕｌｌｅｒ（１９８９）の定義によれば、プロバイオティクスは、宿主の腸管微生物のバランスを改善することによって、宿主に有益な影響を与える、生きた微生物の添加物であるが、世界健康機構（ＷＨＯ）は、プロバイオティクスを、十分な数で摂取されるか、または局所的に適用される場合、宿主に対し一以上の特定の実証された健康上の利益を与える、生きた微生物（細菌または酵母）と定義する。この十分に認められている知識によって、摂取の助力者たるプロバイオティクスを含む栄養飲料、抗ニキビ製剤から他の用途に及ぶ、多くのプロバイオティクス市販製品が存在する。しかしながら、医薬製剤には、概して、食品とは反対に、「消費者にやさしくない」という問題がある。食品が冷蔵庫に保存する必要が十分に受け容れられているのに対し、医薬製剤は、「食品がある場所」である家庭の冷蔵庫に受容されない。
ほとんどの製剤開発は、用途自体に集中し、プロバイオティクスも同様であり、プロバイオティクスは、乳酸を自ら発生するという事実にもかかわらず、ヒトまたは動物の胃内の強酸に耐性を有さない。
本発明は、マイクロカプセル化プロバイオティクス物質の安定性の向上を保証し、生理学的温度でも高温であっても、封入されたプロバイオティクス物質が高い生存能力を有した状態で保存期間がより長くなったマイクロカプセル化プロバイオティクス物質を提供することによって、これらの短所のうちの少なくとも一部を軽減することを目的とする。
この課題を解決するために、本発明は、最初に言及されたようなマイクロカプセル化プロバイオティクス物質を提供するものであり、ここで前述の乾燥粉末組成物が、ｎ〜（ｎ＋４００）μｍの粒度分布を示し、ここでｎが、１００〜１００００ μｍ、好ましくは３００〜５０００ μｍ、より好ましくは４００〜１０００ μｍであり、また、前述の固体粒子が、５０〜８０％の前述の生存プロバイオティクス微生物を含む球状粒子である。
したがって、本発明は、室温であっても、製造、輸送、保存および使用時に安定している、乾燥粉末固体粒子組成物を提供する。封入されたプロバイオティクス菌株の高い生存能力により、この新規な封入法が長期化された保存期間を保証することを示した。また、生存能力が最大５５℃の高温においても増しており、８０℃のピーク温度であっても、適切な形態にあるプロバイオティクス菌株によって抵抗できることも示し得る。実際に、層流ドリップキャスティング法(laminar flow drip casting method)が、固体粒子の狭い粒度分布を提供することが明らかになり、この粒度分布は、高温に対して大きな抵抗を有するプロバイオティクス微生物の生存能力を維持するのに有用である。
しかしながら、製造時に、プロバイオティクスは非常に感受性が高く、プロバイオティクスが長期間溶液中に保存されることが多いので、取扱いおよび保存によって、プロバイオティクスにストレスが発生する場合がある。
非常に温和な製造方法として層流液滴の発生を用い、生存能力を減少させる噴霧乾燥時の強いストレス付加を回避している。本発明は、好ましくは振動支持体を用いた、層流ドリップキャスティングが、生存能力を有する微生物を多数有し且つ噴霧乾燥のような工程よりもはるかに高い生残率を有する粒子、ならびに、表面が完全に均一である（「丸さを有する(roundness)」）、非常に寸法範囲の限定された球体を製造することを示す。偏差がわずかであり丸い球状粒子であると、放出特性が向上し、ひいてはプロバイオティクスの全体効果が向上すること、ここで該放出は、より大きいサイズまたは広く分布したサイズおよび非均一表面を示す球状粒子と比較して、かかる球状粒子でより長いことが示されている。
この効果は、ビーズの異なった保護、および誤った生残試験結果を生じる広い粒度分布につながる、既存のマイクロカプセル化技術に反して、乾燥粉末固体粒子が、良好な生残率を可能にする均一な粒度分布を示すという事実によって達成される。驚くべきことに、振動ドリップキャスティング法によって、単一様式（monomodal）でおよびタイトに分布した粒子であり、その特性においても、公知のものよりも高い全体安定性を示す物が得られることが分かった。振動ドリップキャスティング法は、所定速度の液体流れに対して、低い所定圧力における所定の振幅および所定の振動数によって行われる。これらのパラメーターによって、均一の丸さを有する球状粒子を得ることができる。このことは特に有利である。それは、本発明によって用いられる方法による丸さが、球状粒子がそれぞれ、同じ量のプロバイオティクス微生物と担体相とを正確に含むことを保証するからである。さらに、完全に球状である球状粒子は、酸化などの外部要因にそれほど敏感ではなく、接触時に凝集しないという利点を示す。製造後、プロバイオティクスは、封入材料のマトリックスに封入されるが、それにもかかわらず、劣化し分解する。したがって、更なる安定化がなされる必要があろう。これは、たとえば、乾燥、凍結乾燥、種々の保存媒体、噴霧乾燥などによって可能である。本発明は、適切な栄養剤の使用によって、凍結乾燥時のプロバイオティクスの安定性および生存能力が、安定化されていないものとは対照的に、増加することを示す。
乾燥粉末固体粒子は、ｎ〜（ｎ＋２００）μｍの前述の粒度分布ｄ８０を示し、ｎが、１００〜１００００ μｍ、好ましくは３００〜５０００ μｍ、より好ましくは４００〜１０００ μｍであることが有利である。
固体粒子はそれぞれ、粒子がそれぞれ、同じ量のプロバイオティクス微生物と担体相とを含むことを意味する、均質な組成を示すことが好ましい。
好ましい実施形態において、担体相は、アルギン酸塩、キトサン、ペクチン、プルラン、ゼラチン、カラギーナン(carageenan)、寒天からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含む。
得られる粒子の胃通過能に加えて、粒子は、腸内で崩壊し放出され、これらの健康使命を遂行する。したがって、適切な組合せのシェル材料を使用する必要がある。本発明において、材料は、臨床的な効果を有する程度に生残率が十分に高くなるよう、胃液および胆汁を通過した後、腸内でマイクロスフィアを放出するように選択される。
前述の少なくとも１つの物質は、ハイドロコロイドであることが好ましい。第１のコーティングにこのようなハイドロコロイドを選択する利点には、次に示すものが含まれる。すなわち、非毒性であり、プロバイオティクス物質などの感受性の高い材料を捕捉する軟らかいゲルを生成すること、封入物の保存期間におけるプロバイオティクス物質の生存能力、および、ゲルが、放出されることによって、封入されたプロバイオティクス物質を可溶化させることができるような、固定の可逆性である。
前述の栄養源は、単糖類、多糖類、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、酵母エキス、アルカリまたはアルカリ土類金属のハロゲン塩、抗酸化剤、グリセロール、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、乳酸亜鉛、アスコルビン酸、クエン酸または植物油、および乳脂肪からなる群より選択される化合物を少なくとも含むことが有利である。
好ましい実施形態において、前述の栄養源は、乾燥前のマイクロスフィアの全重量を基準にして、０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％の量で含まれる。
本発明による乾燥粉末固体粒子は、アルギン酸塩、キトサン、ペクチン、プルラン、ゼラチン、カラギーナン、寒天、セルロース、ヘミセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびこれらの混合物からなる群より選択される外部コーティングを含むことがより好ましい。
本発明による乾燥粉末固体粒子の他の実施形態は、添付の特許請求の範囲に開示される。
また、本発明は、適切な担体に、本発明による前述の乾燥粉末固体粒子を含む腸溶性組成物にも関する。
前述のように、生存能力が製造及び保存の間に保たれるという事実、ならびに、プロバイオティクスが温度変化およびｐＨの影響から保護されるという事実によって、前記乾燥粉末固体粒子は高い効果を有する腸溶性組成物を製造するのに適したものとなる。
適切なビヒクルは、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース(hydroxyphropylcellulose)、カルボキシメチルセルロース、Eudragit（登録商標）からなる群より選択される腸溶コーティングであることが有利であり、これによって、腸溶性組成物を胃の状態に対し耐性にさせ、腸領域に効果をもたらす。
腸溶性組成物は、軟ゲルカプセル剤または硬ゲルゲカプセル剤、錠剤、サシェ剤などの形態であることが好ましい。
本発明による腸溶性組成物の他の実施形態は、添付の特許請求の範囲で言及される。
また、本発明は、固体粒子を含む乾燥粉末組成物の製造方法にも関する。
マイクロカプセル化プロバイオティクスの製造方法は、先行技術により知られている。
たとえば、文献米国特許出願公開第２００５／０２６６０６９号は、プロバイオティクス製剤の製造方法を記載し、この方法は、
微結晶性セルロース（ＭＣＣ）と崩壊剤とを乾式混合する工程と、
ＭＣＣと崩壊剤との混合物を、凍結乾燥プロバイオティクス、安定剤および精製水を含む水性分散剤と共に顆粒化して、押し出し可能なペーストを生成する工程と、
前述の押し出し可能なペーストを断片の形態で押し出す工程と、
前述の断片を球形化して、マイクロスフィアのコアを形成する工程と、
コアの残余の水分を乾燥する工程と、
前述のコアをコーティングして、マイクロスフィアを得る工程と、を含む。
押出段階は、単軸押出機、二軸押出機、ラム押出機、または振動造粒機を使用して行われる。
また、文献米国特許出願公開第２０１０／０１８９７６７号も、プロバイオティクス微生物と炭水化物マトリックスとを含む乾燥マイクロカプセルの製造方法を記載し、この方法は、
プロバイオティクス微生物の懸濁液を準備する工程と、
少なくとも１つのデキストリンを含み、また場合により、少なくとも１つの二糖類またはオリゴ糖を含む、マトリックスを準備する工程と、
プロバイオティクス微生物の懸濁液をマトリックスに封入し、マイクロカプセルを得る工程と、
コーティング組成物でマイクロカプセルをコーティングする工程と、を含む。
封入は、流動層空気／Ｎ２懸濁工程、および／または超音波真空噴霧乾燥工程、および／または噴霧凍結乾燥(spry freeze-drying)工程を含んでいてもよい。
文献米国特許出願公開第２００５／０１５３０１８号は、生存能力を有する微生物を含むペレットを得る方法を記載し、この方法は、
微生物調製物と更なる成分とを混合する工程と、
混合物を乾燥する工程と、
圧力下で混合物を圧縮して、ペレットを得る工程と、
ペレットをコーティングする工程と、を含む。
残念なことに、これらの方法は、一般に高圧下で行われる押出工程時にかかるストレスを受けるプロバイオティクス微生物の生存能力を大きく低減させる。さらに、これらの工程では、同じ丸みおよび均一な表面を示すマイクロスフィアを得ることは困難である。
この問題を克服するために、本発明の別の目的は、球状粒子形の固体粒子を含む乾燥粉末組成物の製造方法に関し、この方法は、
生存プロバイオティクス微生物調製物と、少なくとも栄養源を含む担体相とを混合する工程と、
前述の生存プロバイオティクス微生物と前述の担体相との混合物を押し出して、マイクロスフィアを製造する工程と、
凝固溶液を収容した槽で前述のマイクロスフィアを回収する工程と、を含む。
この方法は、前述の押出工程を、層流ドリップキャスティングの少なくとも１つの振動ノズルを通して、０．２〜５ ｍ／秒の所定の液体流速で行って、球状粒子形の前述の乾燥粉末粒子を得、ここで前述の振動ノズルが、１〜２００００ Ｈｚの範囲の振動数、および少なくとも０．５ μｍの振幅を有することを特徴とする。
この方法は、層流液滴の発生に基づく非常に温和な製造方法を構成して、プロバイオティクス微生物の生存能力を減少させる押出工程時の強力なストレスを回避する。０．２〜５ ｍ／秒の液体流速は、BRACE Spherisatorデバイスに対する２００〜８００ ｍＢａｒの工程圧力に対応する。この方法は、固体粒子の狭い粒度分布を提供し、この粒度分布は、高温に対して大きな抵抗を有するプロバイオティクス微生物の生存能力を維持するのに有用である。また、この方法は、均一の丸さを有する球状粒子も提供する。
本発明によれば、少なくとも１つの振動ノズルからの層流ドリップキャスティングは、振動支持体によって得られることが好ましい。
振動ノズルの振動は、液滴を発生させる流れに対して軸方向または横方向に配向させることが有利である。
本発明によれば、製造された球状粒子の径は、１００〜１００００ μｍの範囲であることが好ましい。
本発明によれば、２つの液体が、内側ノズルと外側ノズルとを備えた、１つかまたは複数の二口ノズルシステム(double nozzle system)によって、層流に押し出されることが有利である。この場合、２つの液体は、内側ノズルと外側ノズルとからなる少なくとも１つの二口ノズルシステムによって、層流に押し出され、前述の外側ノズルの径が、少なくとも内側ノズルと同じ径である。内側の液体から、その後、コアが形成され、外側の液体から、その後、シェルが形成される。かかるノズルによって、コア‐シェル封入（または、マイクロ顆粒化もしくはマトリックス封入）が生じ得るので、かかるノズルの使用が有利である。コア材料は、周囲環境から完全に単離され、完全な保護が提供される。シェル材料には、たとえば、ガス障壁、拡散隔膜、または着色剤があり得る。
本発明によれば、固体粒子を含む乾燥粉末組成物の製造方法は、押し出された混合物を封入する付加的な工程を含むことが好ましい。
本発明による固体粒子を含む乾燥粉末組成物の製造方法は、付加的な外部コーティング工程を含むことが有利である。
本発明によるマイクロカプセル化プロバイオティクスの他の詳細および利点は、非限定的な実施例としての本発明の好適な実施形態から明らかになる。
実施例１
アルギン酸塩‐ＥＣビーズとプロバイオティクスペースト
エチルセルロース外部コーティングを有する、アルギン酸塩から製造されたマトリックス中のＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）のマイクロスフィアを、次に示すプロトコールによって製造した。
１５０ｇのＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）ペースト（５×１０１０ｃｆｕ）を、１５０ｇの無菌ＮａＣｌ溶液（０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ）中で分散させ、Ｌ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液を調製した。
１５０ｇの５ ％ ｗ／ｗ無菌アルギン酸塩溶液を、３００ｇのＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液に加えた。
層流分解ユニットを用いたドリップキャスティングを行って、４％ ｗ／ｗ ＣａＣｌ２溶液中の凝固によって、８００ μｍのマイクロスフィアを製造した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
４００ｇのマイクロスフィアを、エタノール中１％ ｗ／ｗエチルセルロースの４００ｇ溶液中で１分間撹拌して、エチルセルロースコーティング（ＥＣコーティング）を製造した。コーティングされたマイクロスフィアの分離および洗浄を、０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。３８０ｇのマイクロスフィアを、５％ ｗ／ｗグルコースの３８０ｇ無菌水溶液中に保存した後、グルコース保存溶液中で凍結乾燥させた。７００〜９００ μｍの径のマイクロスフィアの乾燥自由流動性粉末を得た。
実施例２
アルギン酸塩‐ゼラチンビーズとプロバイオティクスペースト
ゼラチンコーティングを有する、アルギン酸塩マトリックス中のＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）のマイクロスフィアを、次に言及するプロトコールによって製造した。
２００ｇのＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）ペースト（５×１０１０ｃｆｕ）を、２００ｇの無菌ＮａＣｌ溶液（０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ）中で分散させ、Ｌ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液を調製した。
２００ｇの５ ％ ｗ／ｗ無菌アルギン酸塩溶液を、４００ｇのＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液に加えた。
層流分解ユニットを用いたドリップキャスティングを行って、５％ ｗ／ｗ乳酸カルシウム溶液中の凝固によって、５００ μｍのマイクロスフィアを製造した。
マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
５５０ｇのマイクロスフィアを、５５０ｇの５％ ｗ／ｗゼラチン溶液中で１時間撹拌し、架橋ゼラチンコーティングを製造した。
次いで、マイクロスフィアを、５５０ｇの１０％ ｗ／ｗグルタルアルデヒド溶液中で２分間撹拌した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
５５０ｇのマイクロスフィアを、１０％ ｗ／ｗマルトデキストリンの５５０ｇ無菌水溶液中に保存した後、マルトデキストリン保存溶液中で凍結乾燥させた。
４００〜６００ μｍの径のマイクロスフィアの乾燥自由流動性粉末を得た。
実施例３
アルギン酸塩‐ＣＭＣ‐ゼラチンビーズとプロバイオティクスペースト
カルボキシメチルセルロースコーティングおよびゲル化架橋コーティングを有する、アルギン酸塩マトリックス中のＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）のマイクロスフィアを、次に示すように製造した。
３００ｇのＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）ペースト（５×１０１０ｃｆｕ）を、１５０ｇの無菌ＮａＣｌ溶液（０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ）中で分散させ、Ｌ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液を調製した。
７５ｇの１０ ％ ｗ／ｗ無菌アルギン酸塩溶液を、４５０ｇのＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液に加えた。
層流分解ユニットを用いたドリップキャスティングを行って、３％ ｗ／ｗグルコン酸カルシウム溶液中の凝固によって、１０００ μｍのマイクロスフィアを製造した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
５００ｇのマイクロスフィアを、２％カルボキシメチルセルロースの５００ｇ水溶液中で１０分間撹拌した。コーティングされたマイクロスフィアを、０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で更に分離および洗浄した。
５００ｇのマイクロスフィアを、５００ｇの５％ ｗ／ｗゼラチン溶液中で更に１時間撹拌して、マイクロスフィアをコーティングする架橋ゼラチンを製造した。
次いで、マイクロスフィアを、５００ｇの１０％グルタルアルデヒド溶液中で２分間撹拌し、０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で分離および洗浄した。
５００ｇのマイクロスフィアを、１０％ ｗ／ｗグリセロールの５００ｇ無菌溶液中に保存し、グリセロール保存溶液中で凍結乾燥させた。
８００〜１２００ μｍの径のマイクロスフィアの乾燥自由流動性粉末を得た。
実施例４
ゼラチン‐グアーガムＣＭＣビーズとプロバイオティクスペースト
グアーガムおよびカルボキシメチルセルロースでコーティングされた、ゼラチンマトリックス中のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）のマイクロスフィアを、次に示すように製造した。
２００ｇのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）ペーストを、１００ｇの無菌ＮａＣｌ溶液（０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ）中で分散させ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）の懸濁液を調製した。
１５０ｇの３０％無菌ゼラチン溶液を、３７℃で、３００ｇのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）懸濁液に加えた。
層流分解ユニットを用いたドリップキャスティングを行って、５℃で、カプリル酸トリグリセリド／カプリン酸トリグリセリド中の凝固(soldification)によって、１０００ μｍのマイクロスフィアを製造した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
４００ｇのマイクロスフィアを、５％ ｗ／ｗグアーガムの４００ｇ水溶液中で１０分間撹拌して、グアーガムがコーティングされたマイクロスフィアを製造した。次いで、コーティングされたマイクロスフィアを、０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で分離および洗浄した。
４００ｇのマイクロスフィアを、２％カルボキシメチルセルロースの４００ｇ水溶液中で１０分間撹拌して、ＣＭＣコーティングを製造した。次いで、マイクロスフィアを０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で分離および洗浄した。
４００ｇのマイクロスフィアを、４％ ｗ／ｗグリセロールの４００ｇ無菌水溶液中に保存した後、グリセロール保存溶液中で凍結乾燥させた。
８００〜１２００ μｍの径のマイクロスフィアの乾燥自由流動性粉末を得た。
実施例５
アルギン酸塩‐キトサン‐ゼラチンビーズとプロバイオティクスペースト
キトサンコーティングと、更にゼラチンコーティングとを有する、アルギン酸塩マトリックス中のＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）のマイクロスフィアを、次に示すように製造した。
４００ｇのＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）ペースト（５×１０１０ｃｆｕ）を、２００ｇの無菌ＮａＣｌ溶液（０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ）中で分散させ、Ｌ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液を調製した。
１００ｇの１０ ％ ｗ／ｗ無菌アルギン酸塩溶液を、６００ｇのＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液に加えた。
層流分解ユニットを用いたドリップキャスティングを行って、２％ ｗ／ｗ ＣａＣｌ２溶液中の凝固によって、１０００ μｍのマイクロスフィアを製造した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
６００ｇのマイクロスフィアを、１％キトサンの１２００ｇ水溶液中で１０分間撹拌し、キトサンがコーティングされたマイクロスフィアを製造した。コーティングされたマイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
６００ｇのマイクロスフィアを、１２００ｇの５％ ｗ／ｗゼラチン溶液中で１時間撹拌して、ゼラチンでマイクロスフィアを更にコーティングした。コーティングされたマイクロスフィアの分離および洗浄を、０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
６００ｇのマイクロスフィアを、４％ ｗ／ｗグリセロールの６００ｇ無菌水溶液中に保存した後、グリセロール保存溶液中で凍結乾燥させた。
８００〜１２００ μｍの径のマイクロスフィアの乾燥自由流動性粉末を得た。
実施例６
アルギン酸塩ビーズとプロバイオティクスペースト
アルギン酸塩マトリックス中のＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）のマイクロスフィアを、次に示すように製造した。
２００ｇのＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）ペースト（５×１０１０ｃｆｕ）を、６．７％ ｗ／ｗ多糖および０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌの１５０ｇ無菌溶液中で分散させ、Ｌ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液を生成した。
２３０ｇの３ ％ ｗ／ｗ無菌アルギン酸塩溶液を、３５０ｇのＬ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液に加えた。
層流分解ユニットを用いたドリップキャスティングを行って、２％ ｗ／ｗ ＣａＣｌ２溶液中の凝固によって、１０００ μｍのマイクロスフィアを製造した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
５５０ｇのマイクロスフィアを、５％ ｗ／ｗグルコースおよび３％ ｗ／ｗグリセロールの５５０ｇ無菌水溶液中に保存した後、グリセロール保存溶液中で凍結乾燥させた。
４００〜９００ μｍの径のマイクロスフィアの乾燥自由流動性粉末を得た。
マイクロスフィア中の一般細菌の計数を次に示すように行った。
２つの試料を、アルギン酸塩Ｌ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）マイクロスフィアによって調製した。１つの試料は、乾燥粉末から調製し、もう１つは、湿った状態から調製した。
試料１：グルコース／グリセロールと共に乾燥させたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）マイクロスフィア、径約４００〜９００マイクロメートル。
試料２：グルコース／グリセロール中に湿潤させたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）マイクロスフィア、径約８００〜１２００マイクロメートル。
マイクロスフィアは、一般細菌の計数前に溶解することが必要である。溶解手順を、次に示すように、マイクロスフィアの乾燥段階時の相違に適応させた。
試料１を、１５ ｍｌ円錐無菌管に、１００ ｍｇの乾燥マイクロスフィアを無菌的に秤量し、２．９ ｍｌの０．１Ｍクエン酸Ｎａを加えることによって、調製した。混合物を１５分間撹拌する（３０倍希釈）。
試料２を、最初に無菌ふるい（ワットマン社(whatman)製ろ紙）で保存溶液（グルコース／グリセリン溶液）からマイクロスフィアを分離することによって調製した。１００ ｍｇの湿ったマイクロスフィアを、１．９ ｍｌの０．１Ｍクエン酸Ｎａの入った１５ ｍｌ円錐無菌管に加えた。混合物を３分間撹拌する（２０倍希釈）。
試料溶解を、両試料について２回行った。
約１５ ｍｌのＭＲＳ寒天を各プレートに注入し、冷却レベルの表面上で室温で凝固させた。
０．１％無菌ペプトン希釈液ブランク９ｍｌを充填した無菌管において、（円錐管から）１ ｍｌの第１希釈液を、１ ｍｌピペットを使用して、９ ｍｌの希釈剤に加え、１０−１希釈液を得る。所望の一連の希釈液が得られるまで、この操作を繰り返す。乳製品検査の標準法で明示されるとおりに、希釈管を振盪した。試験を３回繰り返す。０．１ ｍｌの適切な希釈液をそれぞれ、およそ１５ ｍｌのＭＲＳ寒天培地を注入した、標識した無菌ペトリ皿の表面上に移す。プレートを、３５℃で最低７２時間、１４４時間までインキュベートした。
ＭＲＳ寒天プレート上のコロニーを計数し、計数したプレートの希釈係数を考慮し、１グラム当たりの生存能力を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）の細胞数として記録した。２５〜２５０のコロニーのプレートのみを計数する（Standard methods for the examination of dairy products, 第１６版, 第２１３〜２４６頁を参照）。
結果
初期重量：
試料１：２回のうちの１回目：１００ ｍｇ ２回のうちの２回目：１０３ ｍｇ 平均：１０１．５ ｍｇ
試料２：２回のうちの１回目：１０２ ｍｇ ２回のうちの２回目：９９ ｍｇ 平均：１００．５ ｍｇ
初期希釈率：
試料１：２．９ ｍｌ中に１０１．５ ｍｇ＝２９．６倍希釈。
試料２：１．９ ｍｌ中に１００．５ ｍｇ＝１９．９倍希釈。
計数の結果は、次に示すとおりである。
試料１：１９２．１０３×２９．６＝５．６８ １０６ ｃｆｕ／ｇマイクロスフィア（乾燥重量）
試料２：６３５．１０３×１９．９＝１．２６ １０７ ｃｆｕ／ｇマイクロスフィア（湿重量）
この結果から理解することができるように、径および栄養剤の正確な選択によって、１：１０００の生残率を、すべての工程において達成することができる。工程を通して、大きな径によって多数の生存細胞が維持されるが、１．１０７ｃｆｕを超える生きた微生物の収量は、プロバイオティクスの効果として十分である。
実施例７
アルギン酸塩‐ＣＭＣ‐ゼラチンビーズと凍結乾燥プロバイオティクス
カルボキシメチルセルロースおよびゼラチンでコーティングされた、アルギン酸塩マトリックス中のＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）のマイクロスフィアを、次に示すように製造した。
１５０ｇの凍結乾燥Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）粉末（８．８×１０１１ｃｆｕ／ｇ）を、３００ｇの無菌ＮａＣｌ溶液（０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ）中で分散させ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液を生成した。したがって、提供されるＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）は、１５０ｇ中１．３２．１０１４ｃｆｕである。
７５ｇの１０ ％ ｗ／ｗ無菌アルギン酸塩溶液を、４５０ｇのＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液に加えた。
層流分解ユニットを用いたドリップキャスティングを行って、３％ ｗ／ｗ グルコン酸カルシウム溶液中の凝固によって、１０００ μｍのマイクロスフィアを製造した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
５００ｇのマイクロスフィアを、２％ ｗ／ｗカルボキシメチルセルロースの５００ｇ水溶液中で１０分間撹拌して、ＣＭＣコーティングを得た。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
さらに、５００ｇのマイクロスフィアを、５００ｇの５％ ｗ／ｗゼラチン溶液中で１時間撹拌し、次いで、マイクロスフィアを、５００ｇの１０％ ｗ／ｗグルタルアルデヒド溶液中で２分間撹拌し、架橋ゼラチンコーティングを得た。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
５００ｇのマイクロスフィアを、１０％ ｗ／ｗグリセロールの５００ｇ無菌水溶液中に保存した後、保存溶液中で凍結乾燥させた。すべてのコーティング材料ではなく、少量の０．１〜１％のみを吸収する二重コーティングおよび架橋の後に、球体を乾燥させ、５０ｇのグリセロールを加え（５００ｇの１０％ ｗ／ｗグリセロール）、８００〜１２００ μｍの径で、２．９×１０１１ ｃｆｕ／ｇの細胞数を有する、マイクロスフィアの乾燥自由流動性粉末の形態の、２０３．９３ｇの乾燥物を得た。これは、凍結乾燥Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）の持ち込んだ１．３２．１０１４ｃｆｕから、０．６１．１０１４ ｃｆｕ（２０３．９３ｇ、２．９．１０１１）が依然として生残していることを意味する。したがって、生存プロバイオティクスの収率は約５０％であり、これは先行技術の方法よりも劇的に高い。
実施例８
アルギン酸塩‐ＥＣビーズと凍結乾燥プロバイオティクス
エチルセルロースでコーティングされた、アルギン酸塩マトリックス中のＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）のマイクロスフィアを、次に示すように製造した。
６７．５ｇの凍結乾燥Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）粉末（８．８×１０１１ｃｆｕ）を、２１７．５ｇの無菌ＮａＣｌ溶液（０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ）中で分散させ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液を生成した。
１５０ｇの５ ％ ｗ／ｗ無菌アルギン酸塩溶液を、３００ｇのＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液に加えた。
層流分解ユニットを用いたドリップキャスティングを行って、４％ ｗ／ｗ ＣａＣｌ２溶液中の凝固によって、８００ μｍのマイクロスフィアを製造した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
さらに、４００ｇのマイクロスフィアを、４００ｇのエタノール中１％ ｗ／ｗエチルセルロース溶液中で１分間撹拌し、ＥＣコーティングマイクロスフィアを調製した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
３８０ｇのマイクロスフィアを、５％ ｗ／ｗグリセロールの３８０ｇ無菌水溶液中に保存した後、グルコース保存溶液中で凍結乾燥させた。
７００〜９００ μｍの径で、１．９×１０１１ ｃｆｕの細胞数を有する、マイクロスフィアの乾燥自由流動性粉末を９６．３２ｇ得た。これは、第１工程で持ち込まれた５．９４．１０１３ｃｆｕから、生存中のプロバイオティクスの約３１％に相当する生存プロバイオティクス（９６．３２×１．９１０１１）の１．８３１０１３ｃｆｕ（８．８．１０１１×６７．５）が依然として生残していることを意味する。
実施例９
アルギン酸塩‐ゼラチンビーズと凍結乾燥プロバイオティクス
ゼラチンでコーティングされた、アルギン酸塩マトリックス中のＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）のマイクロスフィアを、次に示すように製造した。
１００ｇの凍結乾燥Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）粉末（８．８×１０１１ｃｆｕ）を、３００ｇの無菌ＮａＣｌ溶液（０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ）中で分散させ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液を生成した。したがって、アルギン酸塩ゼラチンビーズを調製するために持ち込まれたプロバイオティクスは、８．８．１０１３ｃｆｕである。
２００ｇの５ ％ ｗ／ｗ無菌アルギン酸塩溶液を、４００ｇのＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液に加えた。
層流分解ユニットを用いたドリップキャスティングを行って、５％ ｗ／ｗ乳酸カルシウム溶液中の凝固によって、５００ μｍのマイクロスフィアを製造した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
５５０ｇのマイクロスフィアを、５５０ｇの５％ ｗ／ｗゼラチン溶液中で１時間撹拌し、架橋ゼラチンコーティングを得た。
次いで、マイクロスフィアを、５５０ｇの１０％ ｗ／ｗグルタルアルデヒド溶液中で２分間撹拌した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
５５０ｇのマイクロスフィアを、１０％ ｗ／ｗマルトデキストリンの５５０ｇ無菌水溶液中に保存した後、マルトデキストリン保存溶液中で凍結乾燥させた。
４００〜６００ μｍの径で、８．５×１０１０ ｃｆｕの細胞数を有する、１６８．２５ｇのマイクロスフィアの乾燥自由流動性粉末を得、１６８．２５ｇは１．４３１０１３ｃｆｕに相当する。
結論として、架橋コーティングを有するアルギン酸塩‐ゼラチンマイクロカプセルは、生存中のプロバイオティクスの割当量が、８．９１０１０ｃｆｕ（要求される１０７ ｃｆｕを大きく超える）を含む粉末に対して１６．２５の収量であるため、商用の生存能力維持工程(viable process）として、実質的に多数の生残微生物を本質的に有する。
実施例１０
ゲル化グアーガムＣＭＣビーズと凍結乾燥プロバイオティクス
グアーガムおよびカルボキシメチルセルロースでコーティングされた、ゼラチンマトリックス中のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）のマイクロスフィアを、次に示すように製造した。
１００ｇの凍結乾燥Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）粉末を、２００ｇの無菌ＮａＣｌ溶液（０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ）中で分散させ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）の懸濁液を調製した。
１５０ｇの３０％無菌ゼラチン溶液を、３７℃で、３００ｇのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）懸濁液に加えた。
層流分解ユニットを用いたドリップキャスティングを行って、５℃で、カプリル酸トリグリセリド／カプリン酸トリグリセリド中の凝固によって、１０００ μｍのマイクロスフィアを製造した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
４００ｇのマイクロスフィアを、５％ ｗ／ｗグアーガムの４００ｇ水溶液中で１０分間撹拌して、グアーガムでマイクロスフィアをコーティングした。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
４００ｇのマイクロスフィアを、２％ ｗ／ｗカルボキシメチルセルロースの４００ｇ水溶液中で１０分間撹拌して、ＣＭＣでマイクロスフィアをコーティングした。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
４００ｇのマイクロスフィアを、４％ ｗ／ｗグリセロールの４００ｇ無菌水溶液中に保存した後、グリセロール保存溶液中で凍結乾燥させた。
８００〜１２００ μｍの径で、２．９×１０１１ ｃｆｕの細胞数を有する、マイクロスフィアの乾燥自由流動性粉末を得、これは、かかる適用に必要な１０７値よりも高かった。
結論として、凍結乾燥時の、栄養源としてのカルボキシメチルセルロースコーティングとグリセロールが、腸溶性マイクロスフィアにおいて非常に高い生残率をもたらすことが示された。
実施例１１
アルギン酸塩‐キトサン‐ゼラチンビーズと凍結乾燥プロバイオティクス
キトサンおよびゼラチンでコーティングされた、アルギン酸塩マトリックス中のＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）のマイクロスフィアを、次に示すように製造した。
２００ｇの凍結乾燥Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）粉末（８．８×１０１１ｃｆｕ）を、４００ｇの無菌ＮａＣｌ溶液（０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ）中で分散させ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液を生成した（１．７６．１０１４ｃｆｕのＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）が使用された）。
１００ｇの１０ ％ ｗ／ｗ無菌アルギン酸塩溶液を、６００ｇのＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液に加えた。
層流分解ユニットを用いたドリップキャスティングを行って、２％ ｗ／ｗ ＣａＣｌ２溶液中の凝固によって、１０００ μｍのマイクロスフィアを製造した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
６００ｇのマイクロスフィアを、１％ ｗ／ｗキトサンの１２００ｇ水溶液中で１０分間撹拌した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
６００ｇのマイクロスフィアを、１２００ｇの５％ ｗ／ｗゼラチン溶液中で１時間更に撹拌した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
６００ｇのマイクロスフィアを、４％ ｗ／ｗグリセロールの６００ｇ無菌水溶液中に保存した後、グリセロール保存溶液中で凍結乾燥させた。
８００〜１２００ μｍの径で、２．９×１０１１ ｃｆｕの細胞数を有する、マイクロスフィアの乾燥自由流動性粉末を２３８．８ｇ得、これは総計で０．６９×１０１４ｃｆｕ（生存プロバイオティクスの収率＝３９．３％）に相当する。
結論として、凍結乾燥時の、栄養源としてのキトサンコーティングとグリセロールが、腸溶性マイクロスフィアにおいて非常に高い生残率をもたらすことが示された。
実施例１２
アルギン酸塩ビーズと凍結乾燥プロバイオティクス
７５ｇの凍結乾燥Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）粉末を、３．６％ ｗ／ｗ多糖および０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌの２５０ｇ無菌溶液中で分散させ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液を生成した。
１７５ｇの５ ％ ｗ／ｗ無菌アルギン酸塩溶液を、３２５ｇのＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノサス）懸濁液に加えた。
層流分解ユニットを用いたドリップキャスティングを行って、２％ ｗ／ｗ ＣａＣｌ２溶液中の凝固によって、１１００ μｍのマイクロスフィアを製造した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．８５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
４５０ｇのマイクロスフィアを、５％ ｗ／ｗグルコースの４５０ｇ無菌水溶液中に保存した。
先に説明するように、行われた計数は、８．１ １０９ ｃｆｕ／ｇのマイクロスフィア湿重量を示す。公表された４５．１０１１ではなく、１，８７． １０１１ｃｆｕ／ｇの含量が凍結乾燥粉末に含まれていた。出発凍結乾燥粉末が湿ったマイクロスフィアの全重量の１５％を表すので、この含量は、（８．１． １０９×１００）％ １５＝５．４×１０１０ ｃｆｕ／ｇの等価物粉末に相当する。
実施例１３
アルギン酸塩ビーズと凍結乾燥Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）
次に示す混合物を調製した。
７．５％のＢ．ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）（Bifido 300 B‐Ｂｉｆ．Ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）の凍結乾燥プロバイオティクス粉末）
５％ ｗ／ｗ濃度のアルギン酸塩を１．５％
０．８５％ ｗ／ｗ濃度のＮａＣｌ溶液を８９．５％
担体として使用される次に示す添加剤のうちの１つを１．５％
・Braceミックス＝プルラン
・澱粉１
・澱粉２
・デキストリン
・ＣＭＬセルロース（ＣＭＣ）Ｎａ
・ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）
・微結晶性セルロース（ＭＣ）
層流分解ユニットを用いたドリップキャスティングを行って、４％ ｗ／ｗ ＣａＣｌ２溶液中の凝固によって、１１００ μｍのマイクロスフィアを製造した。マイクロスフィアの分離および洗浄を０．９％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ溶液中で行った。
次いで、マイクロスフィアを直接平板培養して（未処理ビーズ）、ＣＦＵの計数をするか、または、−１９６℃で窒素中で凍結した。その後、−５０℃で凍結乾燥させ、平板培養し（乾燥ビーズ）、ＣＦＵの計数をした。３７℃、７２時間のインキュベーション後、先に説明したように、未処理および乾燥ビーズのＣＦＵを決定した。
得られた結果を下の表に示す。
先に説明したように、行われたＣＦＵの計数は、担体（混合物の１．５％）として使用される、Braceミックス（未処理形態および乾燥形態）、ＨＰＭＣ（未処理形態および乾燥形態）、ＣＭＣ（未処理形態）、ＭＣ（未処理形態）、澱粉１（未処理形態）、および澱粉２（未処理形態）が、少なくとも１００９ＣＦＵ／グラムのＢ．ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）（混合物の７．５％）の生存能力を保証することを示す。

Claims (18)

  1. 固体粒子を含む乾燥粉末組成物であって、前記固体粒子は、
    ａ）生存プロバイオティクス微生物と、
    ｂ）前記生存プロバイオティクス微生物が封入された担体相であって、前記担体相が、少なくとも栄養源と共に腸溶性組成物を更に含む、前記担体相と、を含み、
    前記乾燥粉末組成物が、ｎ〜（ｎ＋４００）μｍの粒度分布ｄ ８０ を示し、ｎが、１００〜１００００ μｍであり、かつ、前記固体粒子が、５０〜８０％の前記生存プロバイオティクス微生物を含む球状粒子であることを特徴とする前記乾燥粉末組成物。
  2. 前記粒度分布ｄ８０が、ｎ〜（ｎ＋２００）μｍであり、ｎが、１００〜１００００ μｍである請求項１に記載の乾燥粉末固体粒子。
  3. 前記固体粒子がそれぞれ均質な組成を示す請求項１または請求項２に記載の乾燥粉末固体粒子。
  4. 前記担体相が、アルギン酸塩、キトサン、ペクチン、プルラン、ゼラチン、カラギーナン、および寒天からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含む請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の乾燥粉末固体粒子。
  5. 前記少なくとも１つの物質がハイドロコロイドである請求項４に記載の乾燥粉末固体粒子。
  6. 前記栄養源が、単糖類、多糖類、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、酵母エキス、アルカリまたはアルカリ土類金属のハロゲン塩、抗酸化剤、グリセロール、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、乳酸亜鉛、アスコルビン酸、クエン酸または植物油、および乳脂肪からなる群より選択される化合物を少なくとも含む請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の乾燥粉末固体粒子。
  7. 前記栄養源が、乾燥粉末固体粒子の全重量に対して、０．１〜１０重量％の量で含まれる請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の乾燥粉末固体粒子。
  8. アルギン酸塩、キトサン、ペクチン、プルラン、ゼラチン、カラギーナン、寒天、セルロース、ヘミセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびこれらの混合物からなる群より選択される外部コーティングを更に含む請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の乾燥粉末固体粒子。
  9. 適切なビヒクル中に、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の乾燥粉末固体粒子を含む腸溶性組成物。
  10. 前記適切なビヒクルが、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびEudragit（登録商標）からなる群より選択される腸溶コーティングである請求項９に記載の腸溶性組成物。
  11. 軟ゲルカプセル剤、硬ゲルカプセル剤、錠剤、またはサシェ剤の形態である請求項９または請求項１０に記載の腸溶性組成物。
  12. 球状粒子形の固体粒子を含む乾燥粉末組成物の製造方法であって、
    生存プロバイオティクス微生物調製物と、少なくとも栄養源を含む担体相とを混合する工程と、
    前記生存プロバイオティクス微生物調製物と前記担体相との混合物を押し出して、マイクロスフィアを製造する工程と、
    凝固溶液を収容した槽で前記マイクロスフィアを回収する工程と、を含み、
    押出工程を、層流ドリップキャスティングの少なくとも１つの振動ノズルを通して、０．２〜５ ｍ／秒の所定の液体流速で行って、球状粒子形の乾燥粉末粒子を得、ここで前記振動ノズルが、１〜２００００ Ｈｚの範囲の振動数、および少なくとも０．５ μｍの振幅を有することを特徴とする、前記製造方法。
  13. 少なくとも１つの振動ノズルからの層流ドリップキャスティングが、振動支持体によって得られることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 振動ノズルの振動を、液滴を発生させる流れに対して軸方向または横方向に配向させることを特徴とする請求項１２または請求項１３に記載の方法。
  15. 製造された球状粒子の径が、１００〜１００００ μｍの範囲であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  16. ２つの液体が、内側ノズルと外側ノズルとを備えた、１つかまたは複数の二口ノズルシステムによって、層流に押し出されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  17. 押し出された混合物を封入する付加的工程を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  18. 外部コーティングを行う付加的工程を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
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