CN103458709A - 微囊化益生菌物质及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

含有益生菌微生物的冻干粉固体颗粒及其运载相，其特征在于所述益生菌微生物被包封，所述运载相还包括至少一种营养源，所述冻干粉固体颗粒具有尺寸分布在n和(n+400)μm之间的颗粒，其中n包含于100和10000μm之间，优选300和5000μm之间，更优选400和1000μm之间。

Description

微囊化益生菌物质及其制造方法
本发明涉及微囊化益生菌物质，具体地涉及包括含有活益生菌微生物的固体颗粒和包封所述活益生菌微生物的运载相的干粉组合物，所述运载相还包含至少一种营养源和肠溶组合物。
这类微囊化益生菌物质是本领域已知的。美国专利2010/0189767揭示的微囊化益生菌物质包括至少一种益生菌物质和第一种包衣，包括例如玻璃状基质形式的蜡、虫胶、抗性淀粉、玉米醇溶蛋白、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸邻苯二甲酸淀粉酶(amylase acetatephthalate)、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基甲基邻苯二甲酸纤维素(hydroxyl propyl methyl cellulose phthalate)、丙烯酸乙酯、和甲基丙烯酸甲酯。这里的玻璃状基质指的是在室温下呈固体并且具有刚性构造，展现出高的弹性模量和强度的基质。颗粒的尺寸至少为20微米。该文件另外揭示了细菌和其他玻璃状基质干组分的重量比在0.5至30％的范围之间。
美国专利2005/0266069揭示了活的和稳定的益生菌制剂。这些制剂包含一种或多种益生菌细菌的核，一种纤维素赋形剂(例如微晶纤维素)和一种或多种添加剂如崩解剂(羟乙酸淀粉钠、海藻酸、淀粉……)和稳定剂(甘油、抗坏血酸……)。核用非肠溶衣包衣(聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素……)并且另外用肠溶衣包衣(甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物、乙酸邻苯二甲酸纤维素……)。该文件中揭示的核具有100至1000微米的直径并且包括相对低百分比(核的总干重重量百分比)的从1至10％的益生菌、50至90％的微晶纤维素、0.1至30％的稳定剂和0.1至5％的崩解剂。
美国专利文件2005/0153018涉及一种具有至少100微米尺寸的颗粒的益生菌递送系统，更具体地涉及具有至少0.02cm3的体积并且包含活微生物和其他如填料、聚糖粘合剂如水胶体、增塑剂和营养成分的压缩的颗粒。按照该文件，细菌制剂与其他成分混合，通常占总湿重的0.1至5％。
按照本技术状态的微囊化益生菌物质存在缺陷，在生理温度下，益生菌物质的活力仅仅能保持几天。另外，尽管在这些现技术文件宣称益生菌细菌具有高的存活率，但是存活的益生菌减少了。研究和消费者的主观感受显示摄入益生菌具有一些能够感受到的健康益处。益生菌药物必须在冷藏条件下制备、运输和储存，冷冻链上的一个中断不仅降低活性，而且导致冷冻链的巨大的运输和监督成本。本发明的焦点在于提高储存过程中的活力，尤其是集中于长期和温度稳定性。
按照Fuller(1989)的定义，益生菌是活的微生物食用补充剂，通过改善宿主的肠道微生物平衡影响宿主，世界卫生组织(WHO)定义益生菌是活的微生物(细菌或酵母)，当摄入或局部使用足够量时赋予宿主一种或多种特定的已被证实的健康益处。这个已经被广泛知晓的知识产生市场上了大量的益生菌产品，从含有益生菌的营养饮料到消化辅助剂、抗痤疮制剂到其他应用。然而，药物制剂有共同的问题，它们不是“消费者友好的”，与食物产品相反，人们广泛认为它们必须在冰箱中保存，而药物制剂不能被接受放在家里的冰箱中，因为这是“应该放食物的地方”。
大多数制剂开发集中于其应用方法，因为尽管事实上益生菌自身产生乳酸，但它们不能耐受人或动物的胃中的强酸。
本发明的目的在于通过提供一种微囊化益生菌物质解决上述至少一些缺陷，所述微囊化益生菌物质能够确保微囊化的益生菌物质具有强化的稳定性，即使在生理或更高的温度下，微囊化的益生菌物质以高活力达到延长的保质期。
为了解决这个问题，如开头提到的那样，本发明提供了一种微囊化益生菌物质，其中，所述干粉组合物的粒径分布在n和(n+400)μm之间，其中n为100-10000μm之间，优选300和5000μm之间，更优选400和1000μm之间，并且在所述固体颗粒中是含有50至80％所述活益生菌微生物的球形颗粒。
因此，本发明提供了干粉固体颗粒组合物，其甚至在室温下，在生产、运输、储存和使用中稳定。这种新型的包封方法显示微囊化益生菌菌株以高活力确保延长的保存时间。另外也显示在最高达55℃的温度下活力增加，以正确的构造，益生菌株能够耐受甚至80℃的峰值温度。事实上，层流滴注法(laminar flow drip casting)提供了较窄的固体颗粒粒径分布，其有助于维持对高温具有更强耐受性的益生菌微生物的活力。
但是在生产中，益生菌也是敏感的，因为它们通常在溶液中保持较长的时间，操作和贮存能够惹激它们。
作为一种非常柔性的生产方法，使用层流液滴产生方法，以避免喷雾干燥中的强压力降低活力。本发明显示层流滴注，优选联用振动支持，产生的颗粒具有大量活微生物并且相比喷雾干燥具有更高存活率，所得球体尺寸范围非常规则，其表面是完美均匀的(“圆”)。小的尺寸偏差和球形颗粒的圆度已经显示改善释放特性，由此改善益生菌的整体效果，与更大尺寸或大分布的尺寸和非均匀表面的球形颗粒相比，该球形颗粒有更长的释放。
这个效果通过干粉固体颗粒的均匀分布的颗粒尺寸而实现，其与已有的产生大尺寸分布的微生物微囊化技术相比有更高的存活率，大的尺寸分布产生对珠的不同保护和存活率测试的错误结果。惊讶地发现振荡滴注方法能够实现单模态紧窄分布的颗粒，它们的性质显示整体的稳定性高于已知。振荡滴注方法用预定的振动振幅和预定的振动频率，在低的预定压力下实施，该压力决定了液流的预定速度。这些参数允许得到具有均匀圆度的球形颗粒。这是特别具有优势的，因为按照本发明的使用方法得到的圆度确保每个球形颗粒精确含有相同的量的益生菌微生物和运载相。另外，呈现完美球形的球形颗粒显示出对外界因素如氧化较低的敏感性并且在接触时不会聚集。在生产后，益生菌在微囊化物质的基质中包埋，但是，依旧能够降解和分解。因此需要进一步稳定化，通过例如干燥、冻干、不同的贮存介质、喷雾干燥等等可能实现。本发明显示通过使用正确的营养剂，与未稳定化的益生菌相比，在冻干中益生菌的稳定性和活力增加。
较佳地，干粉固体颗粒的粒径分布d80在n和(n+200)μm之间，其中n包含于100和10000μm之间，优选300和5000μm之间，更优选400和1000μm之间。
优选地，每个固体颗粒呈现出均匀的组成，其意味着每个颗粒含有相同的量的益生菌微生物和运载相。
在一个优选的实施方式中，运载相包括至少一种选自下组的物质：藻酸盐、壳聚糖、果胶、支链淀粉、明胶、角叉菜胶、琼脂。
除了所得颗粒的胃通过性外，颗粒也应该在肠中崩解释放并完成它们的健康使命。因而，必须使用正确的衣壳材料组合。在本发明中，选择的材料使得微球在通过胃部和胆汁后在肠中释放，因此存活率对于具有临床效果来说足够高。
优选地，所述的至少一种物质是水胶体。选择水胶体作为第一种包衣的优势包括：无毒性，形成温和的胶捕捉敏感材料如益生菌物质，在包封保存期间的益生菌物质的活性和固定的可逆性，由于胶能溶解，这会释放包封的益生菌物质。
较佳地，所述的营养源包括至少一个选自下组的化合物：单糖、多糖、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、酵母提取物、碱金属或碱土金属的卤盐、抗氧化剂、甘油、乙酸锌、氯化锌、乳酸锌、抗坏血酸、柠檬酸或植物油和乳脂。
在某个优选的实施方式中，所述的营养源的含量相对于微球干燥前的总重量为0.1至10wt％，优选1至5wt％。
更优选地，本发明的干粉固体颗粒包括选自下组的外衣壳：藻酸盐、壳聚糖、果胶、支链淀粉、明胶、角叉菜胶、琼脂、纤维素、半纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素及其混合物。
本发明的干粉固体颗粒的其他实施方式在所附的权利要求中揭示。
本发明也涉及包含在合适载剂中的本发明所述干粉固体颗粒的肠溶组合物。
如前所述，在生产、贮存中的活性被保存并且益生菌被保护免受温度变化和pH攻击的事实使得干粉固体颗粒适用于高效率生产肠溶组合物。
较佳地，所述合适的载剂是选自下组的肠溶包衣：乙基纤维素、羟丙基纤维素(hydroxyphropylcellulose)、羧甲基纤维素、Eudragit
Figure BDA00003530392500041
从而赋予肠溶组合物对胃部环境的耐受性，为了在肠部区域产生效果。
优选地，肠溶组合物以软胶或硬胶凝胶胶囊、片剂、囊剂等形式存在。
本发明的肠溶组合物的其他实施方式在所附的权利要求中提及。
本发明也涉及制造包括固体颗粒的干粉组合物的方法。
制造微囊化益生菌的方法是现有技术已知的。
例如，美国专利文件2005/0266069描述了制备益生菌制剂的方法，该方法包括下述步骤：
-干燥掺混微晶纤维素(MCC)和崩解剂，
-MCC和崩解剂所谓混合物与包括冻干益生菌粉末、稳定剂和纯化水的水性分散体混合，为了形成可挤出糊料，
-分部分形式挤出所述的可挤出糊料，
-球体化该部分以形成微球核，
-干燥核至残留含水量，和
-包衣所述的核以得到微球。
可挤出相用单螺杆挤出机、双螺杆挤出机、柱塞式挤出机或振荡制粒机操作。
美国专利文件2010/0189767也描述了制备包括益生菌微生物和糖基质的干微胶囊的方法，该方法包括：
-提供益生菌微生物的悬浮液，
-提供包括至少一种糊精和至少一种任意二糖或寡糖的糖，
-用基质包封益生菌微生物的悬浮液以得到微胶囊，和
-用包衣组合物包衣微胶囊。
所述的包封可包括流化床气/N2悬浮和/或超声真空喷雾干燥和/或喷雾冻干的步骤。
美国专利文件2005/0153018描述了得到含有活的微生物的粒料的方法，其包括下述步骤：
-微生物制剂与另外的成分混合，
-干燥混合物，
-在压力下压实混合物以得到粒料，和
-包衣粒料。
不幸的是，这些方法显著降低了益生菌微生物的活力，其在挤出步骤中通常在高压下受到挤压。另外，按照这些方法，很难得到相同圆度和均匀表面的微球。
为了克服这些问题，本发明的另一个目标是制造包括以球体颗粒形式存在的固体颗粒的干粉组合物的方法，其包括以下步骤：
-活的益生菌微生物制剂与包含至少一种营养源的运载相混合，
-挤出所述活的益生菌微生物和所述运载相的混合物以产生微球，和
-在含有固化溶液的浴中收集所述微球。
这个工艺的特征在于，所述挤出步骤以0.2至5m/s的预定液流速度通过在层流滴注中的至少一个振动喷嘴得到所述球体颗粒形式的干粉颗粒，所述振动喷嘴的振动频率范围为1至20000Hz并且振幅为至少0.5μm。
该方法构成基于层流液滴产生的非常柔性的生产方法，以避免会减少益生菌微生物的活力的在挤出步骤中的强压力。液流的速度为0.2至5m/s，与BRACE球粒产生(BRACE Spherisator)装置的操作压力200至800mBar相应。该方法提供了固体颗粒尺寸窄的分布，其有助于维持益生菌微生物的活力，具有对高温更高的耐受性。同时，该方法提供了含有均匀圆度的球体颗粒。
优选地，按照本发明，来自至少一个振动喷嘴的层流滴注与振动支持一起得到。
较佳地，振动喷嘴的振动相对于产生液滴的流动在轴向或横向方向。
优选地，按照本发明，产生的球体颗粒具有100至10000μm范围内的直径。
较佳地，按照本发明，用一个或多个包括内侧喷嘴和外侧喷嘴的双喷嘴系统以层流方式挤出两种液体。在这种情况下，用至少一个包括内侧喷嘴和外侧喷嘴的双喷嘴系统以层流方式挤出两种液体，所述外侧喷嘴具有至少与内侧喷嘴相同的直径。然后内侧液体形成核而外侧液体后来形成外壳。这种喷嘴的使用是具有优势的，因为其允许产生核-壳包封(或微制粒或基质-包封)：核物质完全与周围的环境分离，得到完美的保护。外壳物质，例如，能够具有气体阻隔层、扩散阻挡层或着色剂。
优选地，按照本发明，制造包括固体颗粒的干粉组合物的方法包括挤出混合物包封的另外步骤。
较佳地，本发明的制造包括固体颗粒的干粉组合物的方法包括外包衣的另外步骤。
其他本发明的微囊化益生菌的细节和优势通过本发明非限制性的例子的优选实施方式的描述而明显。
实施例1
藻酸盐-EC珠和益生菌糊料
藻酸盐基质中的鼠李糖乳杆菌(L.Rhamnosus)的微球和乙基纤维素外部包衣通过下述方案制备：
150g的鼠李糖乳杆菌糊料(5x1010cfu)在150g的无菌NaCl溶液(0.85％w/wNaCl)中分散以制备鼠李糖乳杆菌悬浮液。
对150g的5％w/w无菌藻酸盐溶液中加入300g的鼠李糖乳杆菌悬浮液。
用层流破碎单元滴注，通过在4％w/w CaCl2溶液中固化产生800μm的微球。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
在400g的1％w/w溶于乙醇中的乙基纤维素溶液中搅拌400g的微球1分钟，得到乙基纤维素包衣(EC包衣)。包衣的微球的分离与洗涤在0.85％w/wNaCl溶液中进行。在5％w/w无菌葡萄糖水溶液中冻干前，380g的微球在380g所述的葡萄糖保存液中保存。得到了干燥的自由流动的直径为700-900μm的微球的干粉。
实施例2
藻酸盐-明胶珠和益生菌糊料
在藻酸盐基质中的鼠李糖乳杆菌微球和明胶包衣通过下述的方案制作：
200g的鼠李糖乳杆菌糊料(5x1010cfu)在200g的无菌NaCl溶液(0.85％w/wNaCl)中分散以制备鼠李糖乳杆菌悬浮液。
200g的5％w/w无菌藻酸盐溶液中加入400g的鼠李糖乳杆菌悬浮液。
用层流破碎单元滴注，通过在5％w/w乳酸钙溶液中固化产生500μm的微球。
微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
550g的微球在550g的5％w/w明胶溶液中搅拌1小时产生交联的明胶包衣。
微球然后在550g的10％w/w戊二醛溶液中搅拌2分钟。包衣的微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
在10％w/w无菌麦芽糖糊精水溶液中冻干前，550g的微球在550g所述的麦芽糖糊精保存液中保存。
得到了干燥的自由流动的直径为400-600μm的微球的干粉。
实施例3
含有益生菌糊料的藻酸盐-CMC-明胶珠
在藻酸盐中的鼠李糖乳杆菌微球和羧甲基纤维素包衣和凝胶交联包衣如下制备：
300g的鼠李糖乳杆菌糊料(5x1010cfu)在150g的无菌NaCl溶液(0.85％w/w NaCl)中分散以制备鼠李糖乳杆菌悬浮液。
75g的10％w/w无菌藻酸盐溶液中加入450g的鼠李糖乳杆菌悬浮液。
用层流破碎单元滴注，通过在3％w/w葡萄糖酸钙溶液中固化产生1000μm的微球。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
500g的微球在500g的2％羧甲基纤维素溶液中搅拌10分钟。包衣的微球进一步用0.85％w/w NaCl溶液分离和洗涤。
500g的微球另外在500g的5％w/w明胶溶液中搅拌1小时产生包衣在微球表面的交联的明胶。
微球然后在500g的10％戊二醛溶液中搅拌2分钟并且在0.85％w/w NaCl溶液中分离和洗涤。
500g的微球在500g的10％w/w无菌甘油水溶液保存并在所述的甘油保存液中冻干。
得到了干燥的自由流动的直径为800-1200μm的微球的干粉。
实施例4
含有益生菌糊料的明胶-瓜耳胶-CMC-珠
在明胶基质中的乳双歧杆菌(Bifidobacterium Lactis)微球，用瓜耳胶和羧甲基纤维素包衣，如下制备：
200g的乳双歧杆菌(Bifidobacterium Lactis)糊料(5x1010cfu)在100g的无菌NaCl溶液(0.85％w/wNaCl)中分散以制备乳双歧杆菌悬浮液。
在37℃下，150g的30％无菌明胶溶液加入到300g的乳双歧杆菌悬浮液中。
在5℃下，用层流破碎单元滴注，通过在癸酸/辛酸甘油三酯中固化产生1000μm的微球。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
400g的微球在400g的5％w/w瓜耳胶水溶液中搅拌10分钟产生瓜耳胶包衣的微球。包衣的微球然后用0.85％w/w NaCl溶液分离和洗涤。
400g的微球在400g的2％羧甲基纤维素溶液中搅拌10分钟以构建CMC包衣。微球然后用0.85％w/w NaCl溶液分离和洗涤。
在4％w/w无菌甘油水溶液中冻干前，400g的微球在400g所述的甘油保存液中保存。
得到了干燥的自由流动的直径为800-1200μm的微球的干粉。
实施例5
含有益生菌糊料的藻酸盐-壳聚糖-明胶珠
藻酸盐基质中的鼠李糖乳杆菌微球和壳聚糖包衣和进一步明胶包衣如下制备：
400g的鼠李糖乳杆菌糊料(5x1010cfu)在200g的无菌NaCl溶液(0.85％w/w NaCl)中分散以制备鼠李糖乳杆菌悬浮液。
100g的10％无菌藻酸盐溶液中加入600g的鼠李糖乳杆菌悬浮液。
用层流破碎单元滴注，通过在2％w/w CaCl2溶液中固化产生1000μm的微球。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
600g的微球在1200g的1％w/w壳聚糖溶液中搅拌10分钟以产生壳聚糖包衣的微球。包衣的微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
600g的微球在1200g的5％w/w明胶溶液中搅拌1小时以进一步用明胶包衣微球。包衣的微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
在4％w/w无菌甘油水溶液中冻干前，600g的微球在600g所述的甘油保存液中保存。
得到了干燥的自由流动的直径为800-1200μm的微球的干粉。
实施例6
含有益生菌糊料的藻酸盐珠
在藻酸盐基质中的鼠李糖乳杆菌微球如下制备：
200g的鼠李糖乳杆菌糊料(5x1010cfu)在150g的6.7％w/w无菌多糖和0.85％w/w NaCl溶液中分散以形成鼠李糖乳杆菌悬浮液。
230g的3％w/w无菌藻酸盐溶液中加入350g的鼠李糖乳杆菌悬浮液。
用层流破碎单元滴注，通过在2％w/w CaCl2溶液中固化产生1000μm的微球。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
550g的微球在550g的5％w/w葡萄糖和3％w/w甘油无菌水溶液中保存并在甘油保存液中冻干。
得到了干燥的自由流动的直径为400-900μm的微球的干粉。
在微球中的活细胞的计数如下操作：
用藻酸盐鼠李糖乳杆菌微球制备两份样品，一份来自干粉，另一份来自湿态：
样品1：鼠李糖乳杆菌微球，直径约400-900微米，与葡萄糖/甘油，干燥。
样品2：鼠李糖乳杆菌微球，直径约800-1200微米，与葡萄糖/甘油，湿态。
该微球必须在活细菌计数前溶解。溶解过程根据微球的干燥状态的不同而调整：
样品1在无菌条件下通过在15ml无菌锥形管中称量100mg干微球，然后加入2.9ml 0.1M柠檬酸钠。混合物涡旋15分钟(稀释30倍)。
样品2通过用无菌筛(Whatman滤纸)从保存液(葡萄糖/甘油溶液)中第一次分离微球制备。100mg湿微球和1.9ml 0.1M柠檬酸钠加入15ml无菌锥形管中。混合物涡旋3分钟(稀释20倍)。
两个样品的样品溶解重复进行两次。
约15ml的MRS胶倒在每块平板上，并且在室温下在冷的水平表面上固化。
无菌的管中加入9ml 0.1％蛋白胨空白稀释，用1ml移液管将1ml的第一次稀释的样品(来自锥形管)加入到9ml的稀释液中得到10-1稀释。重复该操作指导得到需要的稀释系列。稀释管按照乳制品检测的标准方法所述振荡。实验重复三次。0.1ml的每个适当稀释物转移至标记的无菌的含有15ml的MRS胶营养基质的皮氏(Petri)平板中。在35℃下，平板孵育最少72小时至144小时。
计算MRS胶平板上的菌落数并记录为每克计算的活鼠李糖乳杆菌细胞数，根据计数平板的稀释因素考虑。只有含有25和250之间的菌落个数的平板被计数。(参见乳制品检测标准方法“Standard methods for theexamination of dairy products”，第16版，213-246页)。
结果
初始重量：
样品1：复管1：100mg  复管2：103mg 平均值：101.5mg。
样品2：复管1：102mg  复管2：99mg 平均值：100.5mg
初始稀释比率：
样品1：101.5mg于2.9ml＝稀释29.6倍。
样品2：100.5mg于1.9ml＝稀释19.9倍。
计算cfu(菌落形成单位)：
Figure BDA00003530392500111
Figure BDA00003530392500121
计数结果如下：
样品1：192x103×29.6＝5.68x106cfu/g微球(干重)
样品2：635x103×19.9＝1.26x107cfu/g微球(湿重)
可以看出，正确地选择直径和营养剂能够在所有的过程中实现1∶1000的存活率。虽然较大的直径在过程中保持较高数量的活细胞，但是大于1x107cfus的活微生物的量足够产生益生菌效果。
实施例7
含有冻干益生菌的藻酸盐-CMC-明胶珠
在藻酸盐基质中的鼠李糖乳杆菌微球，由羧甲基纤维素和明胶包衣，如下制备：
150g的冻干鼠李糖乳杆菌(8.8x1011cfu/g)在300g的无菌NaCl溶液(0.85％w/w NaCl)中分散以制备鼠李糖乳杆菌悬浮液。因而提供的鼠李糖乳杆菌在150g中为1.32x1014cfu。
75g的10％w/w无菌藻酸盐溶液中加入450g的鼠李糖乳杆菌悬浮液。
用层流破碎单元滴注，通过在3％w/w葡萄糖酸钙溶液中固化产生1000μm的微球。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
500g的微球在500g的2％羧甲基纤维素溶液中搅拌10分钟以得到CMC包衣。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
另外，500g的微球在500g的5％w/w明胶溶液中搅拌1小时，然后微球在500g的10％w/w戊二醛溶液中搅拌2分钟达到交联的明胶包衣。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
在10％w/w无菌甘油水溶液中冻干前，500g的微球在500g所述的甘油保存液中保存。在两次包衣和交联之后，其没有吸收所有的包衣物质，仅仅吸收了很小的0.1-1％的量，球体干燥并加入50g的甘油(500g的10％w/w甘油)，产生203.93的干物质，在形成干燥的自由流动的直径为800-1200μm的微球下得到2.9x1011cfu/g的细胞数。这意味着从冻干的鼠李糖乳杆菌得到的1.32x1014cfu，还剩余0.61x1014cfu(203.93g，2.9x1011)。结果，活益生菌的产率为约50％，其显著高于现有技术的方法。
实施例8
含有冻干益生菌的藻酸盐-EC珠
在藻酸盐基质中的鼠李糖乳杆菌微球由乙基纤维素包衣，其制造如下：
67.5g的冻干鼠李糖乳杆菌(8.8x1011cfu/g)在217.5g的无菌NaCl溶液(0.85％w/w NaCl)中分散以制备鼠李糖乳杆菌悬浮液。
150g的5％无菌藻酸盐溶液中加入300g的鼠李糖乳杆菌悬浮液；
用层流破碎单元滴注，通过在4％w/w CaCl2溶液中固化产生800μm的微球。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
另外，400g的微球在1％w/w的溶于乙醇中的乙基纤维素溶液中搅拌1分钟以制备EC包衣的微球，其在0.85％w/w NaCl溶液中分离和洗涤微球。
在5％w/w无菌葡萄糖水溶液中冻干前，380g的微球在380g的葡萄糖保存液中保存。
96.32g的干燥的自由流动的直径为700-900μm的微球所得的细胞数为1.9x1011cfu。这意味着第一步中得到的5.94x1013cfu，这里还剩余1.83x1013cfu(8.8x1011×67.5)的活益生菌(96.32×1.9x1011)，相对约31％的益生菌存活。
实施例9
含有冻干益生菌的藻酸盐-明胶珠
在藻酸盐基质中的鼠李糖乳杆菌微球，由明胶包衣，如下制备：
100g的冻干鼠李糖乳杆菌(8.8x1011cfu)在300g的无菌NaCl溶液(0.85％w/w NaCl)中分散以形成鼠李糖乳杆菌悬浮液。因而制备藻酸盐明胶珠的益生菌是8.81013cfu。
200g的5％w/w无菌藻酸盐溶液中加入400g的鼠李糖乳杆菌悬浮液。
用层流破碎单元滴注，通过在5％w/w乳酸钙溶液中固化产生500μm的微球。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
550g的微球在550g的5％w/w明胶溶液中搅拌1小时得到交联的明胶包衣。
微球然后在550g的10％w/w戊二醛溶液中搅拌2分钟。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
在10％w/w无菌麦芽糖糊精水溶液中冻干前，550g的微球在550g所述的麦芽糖糊精保存液中保存。
168.25g的干燥的自由流动的直径为400-600μm的微球所得的细胞数为8.5x1010cfu，相对于在168.25g中为1.43x1013cfu。
结论是，含有交联包衣的藻酸盐-明胶微胶囊有基本高数量的存活微生物，大致具有工业可行的方法，因为存活的益生菌比率是16.25，产生的粉末含有8.9x1010cfu(远高于要求的107cfu)。
实施例10
明胶-瓜耳胶-CMC珠-冻干益生菌
在明胶基质中的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)微球，用瓜耳胶和羧甲基纤维素包衣，如下制备：
100g的冻干乳双歧杆菌(Bifidobacterium Lactis)粉末在200g的无菌NaCl溶液(0.85％w/w NaCl)中分散以制备乳双歧杆菌悬浮液。
在37℃下，150g的30％无菌明胶溶液加入到300g的乳双歧杆菌悬浮液中。
在5℃下用层流破碎单元滴注，通过在癸酸/辛酸甘油三酯中固化产生1000μm的微球。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
400g的微球在400g的5％w/w瓜耳胶水溶液中搅拌10分钟以包衣瓜耳胶，并且微球的分离和洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
400g的微球在400g的2％w/w羧甲基纤维素水溶液中搅拌10分钟以包衣CMC，并且微球的分离和洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
在4％w/w无菌甘油水溶液中冻干前，400g的微球在400g所述的甘油保存液中保存。
得到了干燥的自由流动的直径为800-1200μm的微球的干粉，其得到的细胞计数为2.9x1011cfu，高于该应用中要求的107的值。
结果显示在冻干中羧甲基纤维素包衣和甘油作为营养源在肠溶微球中产生了很高的存活率。
实施例11
含有冻干益生菌的藻酸盐-壳聚糖-明胶珠
在藻酸盐基质中的鼠李糖乳杆菌微球，由壳聚糖和明胶包衣，如下制备：
200g的冻干鼠李糖乳杆菌(8.8x1011cfu)在400g的无菌NaCl溶液(0.85％w/w NaCl)中分散以形成鼠李糖乳杆菌悬浮液(1.76x1014cfu的鼠李糖乳杆菌)。
100g的10％无菌藻酸盐溶液中加入600g的鼠李糖乳杆菌悬浮液。
用层流破碎单元滴注，通过在2％w/w CaCl2溶液中固化产生1000μm的微球。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
600g的微球在1200g的1％w/w壳聚糖水溶液中搅拌10分钟，并且微球的分离和洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
600g的微球另外在1200g的5％w/w明胶水溶液中搅拌1小时，并且微球的分离和洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
在4％w/w无菌甘油水溶液中冻干前，600g的微球在600g所述的甘油保存液中保存。
238.8g的干燥的自由流动的直径为800-1200μm的微球所得的细胞数为2.9x1011cfu，相对于总的0.69x1014cfu(活益生菌的产率＝39.3％)。
结果显示在冻干中壳聚糖包衣和甘油作为营养源在肠溶微球中产生了很高的存活率。
实施例12
含有冻干益生菌的藻酸盐珠
75g的冻干鼠李糖乳杆菌粉末在250g的3.6％w/w无菌多糖和0.85％w/w NaCl溶液中分散以形成鼠李糖乳杆菌悬浮液。
175g的5％w/w无菌藻酸盐溶液中加入325g的鼠李糖乳杆菌悬浮液。
用层流破碎单元滴注，通过在2％w/w CaCl2溶液中固化产生1100μm的微球。微球的分离与洗涤在0.85％w/w NaCl溶液中进行。
450g微球在450g的5％w/w葡萄糖无菌水溶液中保存。
如前述的计数显示8.1x109cfu/g微球湿重。在冻干粉中的含量为1.87x1011cfu/g，而不是宣称的45x1011。初始的冻干粉占湿微球总重的15％，该成分相当于(8.1x109×100)％15＝5.4x1010cfu/g等量粉末。
实施例13
含有冻干乳双歧杆菌的藻酸盐珠
制备以下混合物：
7.5％的乳双歧杆菌(双歧300B-冻干的益生菌粉末乳双歧杆菌)
1.5％藻酸盐浓度为5％w/w
89.5％NaCl溶液浓度为0.85％w/w
1.5％的用作载体的下述添加剂
Brace Mix＝支链淀粉
淀粉1
淀粉2
糊精
Na CML纤维素(CMC)
羟丙基甲基纤维素(HPMC)
微晶纤维素(MC)
用层流破碎单元滴注，通过在4％w/w CaCl2溶液中固化产生1100μm的微球。微球的分离与洗涤在0.9％w/w NaCl溶液中进行。
微球然后直接涂布平板(新鲜珠)用于CFU计数或在涂布平板(冻干珠)用于CFU计数之前在-196℃的液氮中冷冻然后在-50℃冻干。在37℃下孵育72小时后，如前述测定新鲜珠和冻干珠的CFU。
下表显示了结果。
Figure BDA00003530392500171
如前述的CFU计数显示用作载体(占混合物的1.5％)的Brace Mix(新鲜和冻干状态)、HPMC(新鲜和冻干状态)、CMC(新鲜状态)、MC(新鲜状态)、淀粉1(新鲜状态)、和淀粉2(新鲜状态)确保了乳双歧杆菌(占混合物的7.5％)的活性为至少1009CFU/克。

Claims (18)

1.包括固体颗粒的干粉组合物，所述固体颗粒含有：
a)活的益生菌微生物，
b)运载相，其中所述活的益生菌微生物被包封，所述运载相还包含至少一种营养源以及肠溶组合物，
其特征在于，所述干粉组合物的粒径分布为n和(n+400)μm之间，其中n为100-10000μm，优选300和5000μm之间，更优选400和1000μm之间，所述固体颗粒为包含50至80％所述活的益生菌微生物的球形颗粒。
2.如权利要求1所述的干粉固体颗粒，其特征在于，所述粒径分布d80在n和(n+200)μm之间，其中n为100和10000μm之间，优选300和5000μm之间，更优选400和1000μm之间。
3.如权利要求1和2所述的干粉固体颗粒，其特征在于，每个固体颗粒是均匀组合物。
4.如权利要求1-3所述的干粉固体颗粒，其特征在于，所述运载相包括至少一种选自下组的物质：藻酸盐、壳聚糖、果胶、支链淀粉、明胶、角叉菜胶、琼脂。
5.如权利要求4所述的干粉固体颗粒，其特征在于，所述至少一种物质是水胶体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的干粉固体颗粒，其特征在于，所述营养源包括至少一个选自下组的化合物：单糖、多糖、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、酵母提取物、碱金属或碱土金属的卤盐、抗氧化剂、甘油、乙酸锌、氯化锌、乳酸锌、抗坏血酸、柠檬酸或植物油和乳脂。
7.如权利要求1-6所述的干粉固体颗粒，其特征在于，所述营养源含量相对于干粉固体颗粒的总重为0.1至10wt％，优选1至5wt％。
8.如权利要求1-7中任一项所述的干粉固体颗粒，还包括选自下组的外衣壳：藻酸盐、壳聚糖、果胶、支链淀粉、明胶、角叉菜胶、琼脂、纤维素、半纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素及其混合物。
9.包括在合适载剂中的权利要求1-8中任一项所述的干粉固体颗粒的肠溶组合物。
10.如权利要求9所述的肠溶组合物，其特征在于，所述合适的载剂是选自下组的肠溶包衣：乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、Eudragit
Figure FDA00003530392400021
11.如权利要求9或10所述的肠溶组合物，所述肠溶组合物以软胶或硬胶凝胶胶囊、片剂、囊剂等形式存在。
12.制造含有球形颗粒形式的固体颗粒的干粉组合物的方法，该方法包括以下步骤：
-将活的益生菌微生物制剂与包含至少一种营养源的运载相混合，
-挤出所述活的益生菌微生物和所述运载相的混合物以产生微球，和
-在含有固化溶液的浴中收集所述微球，
其特征在于，所述挤出步骤以0.2至5m/s的预定液流速度通过在层流滴注中的至少一个振动喷嘴以得到所述球体颗粒形式的干粉颗粒，所述振动喷嘴的振动频率范围为1至20000Hz并且振幅为至少0.5μm。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述来自至少一个振动喷嘴的层流滴注与振动支持一起得到。
14.如权利要求12和13所述的方法，其特征在于，所述振动喷嘴的振动相对于产生液滴的流动在轴向或横向方向。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述产生的球体颗粒具有100至10000μm范围内的直径。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，用一个或多个包括内侧喷嘴和外侧喷嘴的双喷嘴系统以层流方式挤出两种液体。
17.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括包封挤出的混合物的另外步骤。
18.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的方法包括外包衣的另外步骤。
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