CN113736769A - 一种MOFs固载酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种MOFs固载酶及其制备方法和应用,属于材料与生物工程交叉技术领域。MOFs固载酶的制备方法,包括:将等量的红霉素降解酶与MOFs材料溶解于tris‑HCl,调整溶液pH为6.0~8.0,25~35℃搅拌2~3小时,冷冻干燥得到MOFs固载酶ereB@Cu‑BTC。MOFs固定化酶具有显著的稳定性和可回收性,可以有效降解含红霉素的菌渣、污水、环境中的水体,有利于在产业化中的放大应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种MOFs固载酶及其制备方法和应用,属于材料与生物工程交叉技术领域。
背景技术
近几年来,由于红霉素产量的不断增加,红霉素菌渣的含量也不断增加,对人类的危害也日益增加,首先就是菌渣中过剩的营养物质会使微生物过度繁殖,其次就是会导致耐药性微生物的富集,改变原有的环境的菌群结构,所以迫切需要更多安全的方法来处理抗生素菌渣。目前红霉素菌渣处理方法大致有:焚烧处理、厌氧消化技术处理、饲料化处理、肥料化处理、菌渣提纯、能源化处理,这些处理方法往往处理成本高,同时也产生另外的环境问题。而生物法处理红霉素菌渣有着处理成本低,无二次污染等优点。
目前,大多生物处理研究集中在红霉素降解菌的筛选和分离,而对红霉素降解酶的研究较少。红霉素通常由内酯环、红霉糖和氧氨基糖组成。在红霉素降解过程中,内酯环的水解是由红霉素酯酶催化的,酶催化起着关键作用,红霉素酯酶活性是直接关系到红霉素降解效率的因素。而现有红霉素降解酶ereB可以在温和的条件下有效地降解红霉素,但是由于酶的不可回收导致应用成本较高,从而限制了其推广应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷,提供一种MOFs固载酶及其制备方法和应用,MOFs固载酶具有显著的稳定性和可回收性,可以有效降解含红霉素的菌渣、污水、环境中的水体,有利于在产业化中的放大应用。
为解决上述技术问题,本发明提供一种MOFs固载酶的制备方法,包括:将等量的红霉素降解酶与MOFs材料溶解于tris-HCl,调整 pH为6.0~8.0,25~35℃搅拌2~3小时,冷冻干燥得到MOFs固载酶ereB@Cu-BTC。
优选地,所述MOFs为Cu-BTC。
优选地,所述红霉素降解酶为ereB酶。
优选地,所述冷冻干燥温度为-65~-45℃。
优选地,采用HCl和tris调整溶液 pH为6.0~8.0。
优选地,所述MOFs材料的具体制备方法为:
将三水合硝酸铜、冰醋酸、三甲胺溶于乙醇中用磁力搅拌机室温搅拌1个小时;
将均苯三甲酸加入到上述溶液中,用磁力搅拌机30℃搅拌1个小时,所述三水合硝酸铜、冰醋酸、三甲胺、均苯三甲酸的摩尔比为3:3:1:1;
加入反应釜,85℃加热24小时;
将上述产物离心回收固定,并用乙醇洗涤3次;
将上述产物用乙醇30℃处理12小时;
将上述产物-65~-45℃冷冻干燥得到最终产物。
本发明还提供上述的方法制备得到的MOFs固载酶。
本发明还提供上述的MOFs固载酶在降解含红霉素的菌渣、污水、环境中的水体中的应用。
本发明所达到的有益效果:
金属有机框架(Metal-Organic Frameworks,MOFs)具有比表面积大、孔隙率可调、功能性可设计、稳定性好等特点,作为酶固定化的基质材料有着非常好的前景。MOFs固定化酶具有显著的稳定性和可回收性,可以有效降解含红霉素的菌渣、污水、环境中的水体,有利于在产业化中的放大应用。
附图说明
图1是制备得到的Cu-BTC材料;
图2是ereB@Cu-BTC在不同温度下的酶活;
图3是ereB@Cu-BTC在不同pH下的酶活;
图4是ereB@Cu-BTC应用在红霉素发酵菌渣中的降解率;
图5是ereB@Cu-BTC应用在含红霉素水体中的降解率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案,而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本发明提供一种MOFs固载酶的制备方法,包括以下步骤:
1.制备Cu-BTC材料
在室温下将Cu(NO3)2·3H2O(0.435g,1.8mmol)、冰醋酸(0.62mL,10.8mmol)、三甲胺0.50mL溶于12mL乙醇中。室温搅拌1h后,将H3BTC(0.210g,1.0mmol)加入深蓝色溶液中。将混合物再搅拌2小时,形成均匀的溶液。然后将混合物转移到内衬特氟龙的高压釜中。将混合物在85℃下加热24小时。通过离心回收固体,用乙醇洗涤三次。最后,将产物用30℃的乙醇处理12h。-65~-45℃冷冻干燥,得到了Cu-BTC产物(如图1)。
2.ereB酶的固定化
等量的红霉素降解酶ereB酶与MOFs材料溶解于tris-HCl,采用HCl和tris调整溶液pH为8.0,30℃搅拌2h,-65~-45℃冷冻干燥得到最终产物ereB@Cu-BTC。
实施例2
MOFs固载酶酶活的测定:
1.不同温度下的酶活
向100mL的超纯水中加入1mL浓度为10g/L的红霉素甲醇溶液,配置成100mg/L的红霉素溶液;然后加入0.1g已制备的ereB@Cu-BTC,分别置于25、35、45、55、65℃水浴摇床中反应10分钟;测定上述不同温度下的酶活(如图2)。
由图2可知,ereB@Cu-BTC的最适反应温度在55℃。
2.不同pH条件下的酶活
分别向100mL的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH=7、7.5、8)、Tris-HCl(pH=8、8.5、9)、Gly-NaOH(pH=9、9.5、10)中加入1mL浓度为10g/L的红霉素甲醇溶液,配置成100mg/L的不同pH的红霉素溶液;然后加入0.1g已制备的ereB@Cu-BTC,置于55℃水浴摇床中反应10分钟;测定上述不同pH下的酶活(如图3)。
由图3可知,ereB@Cu-BTC的最适反应pH在8.0,且Tris-HCl更优。
实施例3
ereB@Cu-BTC在菌渣里的应用:
取100mL红霉素菌渣,经测定红霉素浓度为650mg/L左右;然后加入0.65g已制备的ereB@Cu-BTC,置于常温常压下反应30min。搅拌促进催化,15min降解率达到80%(如图4),离心收集ereB@Cu-BTC,重复以上步骤再次利用回收率达70%。
对照组为在相同体系中加入等量的未负载的ereB酶。
由图4可知,ereB@Cu-BTC在菌渣中15分钟左右降解率大于80%,效果较好,且与游离的酶相比降解效率与速率更优。
实施例4
ereB@Cu-BTC在含红霉素废水里的应用:
取100mL的药厂污水,经测定红霉素浓度为350mg/L左右;然后加入0.35g已制备的ereB@Cu-BTC,置于常温常压下反应30min,搅拌促进催化,20min降解率达到80%(如图5),离心收集ereB@Cu-BTC,回收率达85%。
对照组为在相同体系中加入等量的未负载的ereB酶,且与游离的酶相比降解效率与速率更优。
由图5可知,ereB@Cu-BTC在水体中降解效果不如在菌渣中,在25分钟时达到83%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变形,这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种MOFs固载酶的制备方法,其特征在于,包括:将等量的红霉素降解酶与MOFs材料溶解于tris-HCl,调整溶液 pH为6.0~8.0,25~35℃搅拌2~3小时,冷冻干燥得到MOFs固载酶ereB@Cu-BTC。
2.根据权利要求1所述的MOFs固载酶的制备方法,其特征在于,所述MOFs为Cu-BTC。
3.根据权利要求1所述的MOFs固载酶的制备方法,其特征在于,所述红霉素降解酶为ereB酶。
4.根据权利要求1所述的MOFs固载酶的制备方法,其特征在于,采用HCl和tris调整溶液 pH为6.0~8.0。
5.根据权利要求1所述的MOFs固载酶的制备方法,其特征在于,所述MOFs材料的具体制备方法为:
将三水合硝酸铜、冰醋酸、三甲胺溶于乙醇中用磁力搅拌机室温搅拌1个小时;
将均苯三甲酸加入到上述溶液中,用磁力搅拌机30℃搅拌1个小时,所述三水合硝酸铜、冰醋酸、三甲胺、均苯三甲酸的摩尔比为3:3:1:1;
加入反应釜,85℃加热24小时;
将上述产物离心回收固定,并用乙醇洗涤3次;
将上述产物用乙醇30℃处理12小时;
将上述产物-65~ -45℃冷冻干燥得到最终产物。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法制备得到的MOFs固载酶。
7.权利要求6所述的MOFs固载酶在降解含红霉素的菌渣、污水、环境中的水体中的应用。
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